UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA BÁSICA Y

APLICADA

ESTRUCTURA Y ULTRAESTRUCTURA
MICROSCOPÍA
COLORACIONES
ROBERT DANTE ALMONACID ROMAN
robert.almonacid@unmsm.edu.pe

2019
 ESTRUCTURA CELULAR
Son todas las partes celulares que se pueden observar con el
microscopio óptico.
Las células vegetales tienen mayor tamaño que las células animales
 ULTRAESTRUCTURA CELULAR
•Son estructuras celulares que no se pueden visualizar con el
microscopio óptico.
•La ultraestructura se refiere a todo lo que se ve con el microscopio
electrónico, en el caso de las células, se refiere a las organelas.
•La ultraestructura celular es la ORGANIZACIÓN INTERNA que
presentan todos los organelos celulares vistas al microscopio
electrónico, ya que con el microscopio óptico solamente se
observan la constitución externa, su forma, su color, etc. y con el
electrónico se pueden observar su ultraestructura o constitución
interna.
•Por ejemplo las mitocondrias se observan con el M.O. como si
fueran bastones.
•Con el M.E. se puede observar que tienen una doble membrana y
cámaras internas, además presentan ADN circular procarionte, ARN,
ribosomas, matriz mitocondrial, oxisomas.
 MICROSCOPIO
Es un instrumento destinado a la observación de objetos
muy pequeños que no se pueden ver a simple vista y de los
cuales se obtiene una imagen aumentada.
 TIPOS DE MICROSCOPIO
Dependiendo del sistema de iluminación que utilizan, se pueden distinguir
dos tipos de microscopio:
• MICROSCOPIO ÓPTICO: utiliza la luz como sistema de iluminación.

• MICROSCOPIO ELECTRÓNICO: cuando emplea un haz de electrones.

Microscopio Microscopio
Fotónico Electrónico
La principal diferencia entre ellos, estriba en la mayor potencia que
tienen los microscopios electrónicos.

Fuente Longitud de Poder de

Término Tipos
energética onda Resolución*

Óptico Luz Mayor Menor P.R.

Microscopio
Electrónico Electrones Menor Mayor P.R.

Poder de Resolución*: Es la capacidad del microscopio que

permite distinguir cuán separadas están dos estructuras que se
encuentran muy próximas
MEDICIONES:

EN MACROSCOPÍA

• Se mide en MILÍMETROS (mm)

EN MICROSCOPÍA ÓPTICA

• Se miden en MICRAS (µ)

EN MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

• Se miden e NANÓMETROS (nm)

• Se miden en ANGSTROM (Å)

Tipos de Microscopios ópticos
Utilización de filtros polarizantes y prismas
Barrido Transmisión
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN
(T.E.M.)*

*Transmission Electron
Microscope
El T.E.M. utiliza un haz de electrones para visualizar la muestra a diferencia
de aquellos que utilizan la luz. El haz de electrones posee menor longitud de
onda que el haz de fotones por lo que el M. electrónico posee mayor poder
de resolución.

CARACTERÍSTICAS
El microscopio electrónico de transmisión utiliza
electroimanes (bobinas electromagnéticas) para que el haz
de electrones atraviese la delgada muestra, que pasa por un
proceso de cortado con algunas excepciones (por ejemplo:
macromoléculas aisladas o bacterias)
ESTRUCTURA y PROCESOS
INTERNOS:
Las partes principales en las cuales se
producen procesos y funciones
internas en un microscopio
electrónico de transmisión son:
Cañón de electrones, que emite los
electrones que atraviesan la muestra.
Distintos grupos de lentes
magnéticas para crear campos que
dirigen y enfocan el haz de
electrones, ya que las lentes
convencionales utilizadas en los
microscopios ópticos no funcionan
con los electrones.
Placa fotográfica o pantalla
fluorescente que se coloca detrás del
objeto a visualizar para registrar la
imagen aumentada.
Sistema de registro que muestra la
imagen que producen los electrones,
que suele ser una computadora.
Se forma una corriente de nube de electrones en el
cañón electrónico

Esta es acelerada por un alto voltaje y focalizados por

medio de lentes magnéticas

Esta nube se enfoca en la muestra a través de las

lentes (bobinas electromagnéticas o electroimanes)

Se forma un haz de electrones que se desprenden

del filamento, atraviesan la muestra donde se ve la
imagen en la pantalla.

Este haz de electrones va dirigido hacia el objeto que se

desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son
absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando
una imagen aumentada de la muestra.
 - Fundamentalmente permite ver secciones o cortes de las muestras a
analizar con espesores comprendidos entre
50- 200 nanómetros
- La imagen de los microscopios electrónicos sólo se puede ver en blanco
y negro puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en
el ordenador.

Para que el haz de electrones atraviese la muestra esta tiene que ser
muy delgada y bien preparada (debidamente deshidratada)
-Fijar la estructura con mucha precisión

-Deshidratar la muestra

-Algunas de las muestras tienen la excepción de no pasar por el

proceso de cortado (macromoléculas aisladas y bacterias),
mientras que otras tienen que ser cortadas quedando con un
espesor de 40 a 60 nm.
Para esto se utiliza el ultra micrótomo; con este instrumento
también se usa una resina en la cual se incluye el material para que
tenga la solidez necesaria que nos permita hacer rodajas más finas
denominada araldita.
ULTRAMICRÓTOMO PORTAMUESTRAS
Bacilos en división
Bacteria de forma alargada, que
suele tener carácter patógeno.
MITOCONDRIA
Citoplasma de cianobacterias envueltas en polisacáridos
*Scanning Electron
Microscope
 CARACTERÍSTICAS
El microscopio electrónico de barrido funciona, utilizando un haz de
electrones para formar la imagen, a diferencia de aquellos que utiliza
un haz de luz.
Los microscopios electrónicos sólo pueden ofrecer imágenes en
blanco y negro ya que no utilizan la luz.

Las principales utilidades son:

➢ Alta resolución
➢Una gran profundidad de campo la cual nos permite que enfoquemos
una gran parte de la muestra que le da apariencia tridimensional a las
imágenes
➢Sencilla preparación de las muestras.
Las lentes, tanto la condensadora como la lente objetiva, son lentes electromagnéticas.
 FUNCIONAMIENTO

Los electrones acelerados salen del cañón, y son enfocados

por la lente condensadora y objetiva, cuya función es
reducir la imagen del filamento.

Las bobinas deflectoras barren el fino haz de electrones

sobre la muestra. (al incidir en la muestra un haz de
electrones lo mas pequeño posible se obtiene una mejor
resolución).

Cuando el haz de electrones incide sobre la muestra,

reproducen interacciones entre los electrones del mismo
haz, y los átomos de la muestra, cuando estos interactúan
podemos ver lo que los electrones están recorriendo.

Luego el micro analizador de sonda de electrones analiza

los rayos x de alta energía que produce el objeto al ser
bombardeados con los electrones. Mediante este proceso
podemos averiguar que elementos componen al objeto
analizado y también obtenemos una mayor visión del
mismo.
▪ Muestras biológicas

▪ Paleontología y Arqueología: Caracterización de aspectos

morfológicos, por ejemplo: Trozos de meteoritos.

▪ Odontología: Se pueden observar dientes, para saber con que

sustancias se pueden tratar.

▪ Control de Calidad: En este campo, el microscopio

electrónico de barrido es de gran utilidad para el seguimiento
morfológico de procesos y su aplicación en el control de
calidad de productos de uso y consumo.
▪ Investigación se puede utilizar para detectar fibras de la
ropa, comparar cabellos etc.
Comparación entre una fibra de lana y una especial, señalando con flechas las medidas
de los bordes distales de las células cuticulares (con altura superior a 0,7 micras para la
lana e inferior a 0,5 micras para la fibra especial.
GRANO DE POLEN
GLÓBULO ROJO
GLÓBULO BLANCO
 RESUMEN COMPARATIVO
DE LOS TIPOS DE MICROSCOPIOS

CARACTERÍSTICA MO* SEM* TEM*

Portátil si no no

Aumento x2500 X20.000 X 500.000

Tamaño mínimo
observable 120 nm 10 nm 1 nm

Fotografía B/N Y color B/N B/N

Observación in
vivo si no no
TECNICAS DE OBSERVACIÓN
MICROSCOPICA
 Lunes
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

1. Observación en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:

• La morfología de las bacterias

• Determinar movilidad
• Cambios citológicos durante la división celular
• Algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa.

2. Observación con tinciones

• Para observar las características morfológicas de las bacterias
• Identificación y diferenciación de microbios entre especie y dentro de la
misma especie (tinción diferencial o selectiva).
Procedimiento para un preparado en fresco
("entre porta y cubre")

1. Colocar una gota de SSF o 2.- Tomar la muestra con el asa

agua en un porta de siembra o un gotero

Muestra

Porta objeto
1. Observación en fresco : (SSF)
✓ Parásitos : Trofozoitos, larvas.
✓ Bacterias: Leptospiras, treponemas (M. campo oscuro)
1. Observación en fresco

✓ Hongos: Levaduras ✓ Hongos

✓ NaOH 10% (hifas)
 OBSERVACIONES POST MORTEM
Obtención del material de estudio:
• Biopsias quirúrgicas
• Material de necropsias
• Animales de laboratorio
• Cultivos de tejidos
• Frotis o extendidos
TINCIONES O COLORACIONES
COLORANTE:

• Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por

algún componente.
• Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el
contraste.

Los colorantes tienen las siguientes funciones:

❖ Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y
transparentes.
❖ Revelan su forma y tamaño.
❖ Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
❖ Producen reacciones químicas específicas.
 TIPOS

a) Sales colorantes:
❑ Básicos: son sales en las que la base, normalmente una amina, aporta el color,
mientras que la parte ácida es incolora. Es decir, con colorantes catiónicos. Tienen
apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la
matriz extracelular como los glicosaminoglicanos. La unión es por atracción eléctrica.
• Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+), la tionina, safranina, azul de
toluidina, la hematoxilina.

❑ Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Son derivados de
grupos sulfónicos, carboxilos o hidroxilos fenólicos. Tienen apetencia por
sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma
celular y también por el colágeno de la matriz extracelular. La unión es por
atracción eléctrica.
• Ej: eosinato (-) de sodio (+), la fucsina ácida y el rojo Congo.
b) Colorantes liposolubles
• Se combinan con los componentes lipídicos de la célula, usados para revelar la
localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán B o Sudán Black B.

• Vitales
– Son aquellas que se practican sobre células que están vivas,
mediante la introducción de un colorante en la circulación de un
organismo vivo.
– Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
• Supravitales
– son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que
están aislados del organismo del que proceden.
• No vitales
– se realizan sobre células muertas.
Tinción de células para la observación microscópica

Extensión de una fina capa

de células sobre el porta

Adición del colorante

lavado y secado
Secado al aire

Se coloca una gota de aceite

de inmersión sobre el porta y
se observa con el objetivo de
Fijación por flameado del porta 100X
TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

a) Frotis o película (extensión)

• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
b) La fijación:
Los microorganismos quedan adheridos al portaobjeto ( coagula las
sustancias proteicas)

TIPOS
• CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)
• FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de
Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y éter)

Metanol
c) Coloración SIMPLE : Positiva o negativa
 Lunes

Tinción simple de azul de metileno.

Frotis y fijación

1.- Poner una gota de agua en un 2.- Tomar la muestra con el asa de 3.-Extender sobre el agua y fijar a
porta siembra la llama del mechero

Tinción

1.- Cubrir la preparación con 2.- Lavar con agua, dejar

Azul de Metileno 5’ secar y observar al
microscopio

Micrococcus luteus
 Lunes
Tinción negativa.

1.- Colocar una gota de Nigrosina

en un porta
3.- Mezclar con la Nigrosina
y extender por todo el porta.
2.- Tomar muestra del Secar al aire y observar
microorganismo con el asa,
flamear el tubo y tapar

cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como

cuerpos refringentes y espiroquetas
c) Coloración. Diferencial o compuesta
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos

Tinción diferencial de Tinción Ziehl-Neelsen

Gram