Vous êtes sur la page 1sur 251

Florin Stănică

Microînmulţirea
plantelor horticole

Editura INVEL-Multimedia
Bucureşti, 2004
Referenţi ştiinţifici: Prof. univ. dr. Corneliu Petrescu
Prof. univ. dr. Alexandru Teodorescu

© 2004 Versiune electronicã INVEL-Multimedia


Toate drepturile rezervate.

Nici un fragment din această publicaţie nu poate fi reprodus, stocat într-un


sistem de recuperare a informaţiilor sau transmis sub orice formă sau prin
orice mijloace electronice, mecanice, fotocopiere, înregistrare sau de altă
natură, fără permisiunea prealabilă, în scris, a editurii şi autorului.

INVEL-Multimedia din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL


str. Fabrica de Chibrituri nr. 24-26, sector 5, Bucureşti
Tel./Fax: 021/430.35.42, e-mail: invel_multimedia@pcnet.ro
Colecţia www.teze_de_doctorat.ro

ISBN 973-7753-07-0
Dedic această lucrare
studenţilor şi colaboratorilor mei
Cuvânt înainte

Într-o eră în care progresul ştiinţei şi tehnicii a dus omul în cosmos, în adâncurile
oceanului, i-a permis să atingă viteze supersonice şi să dezvolte inteligenţa artificială, culturile
in vitro de celule şi ţesuturi vegetale au apărut, au evoluat şi s-au dezvoltat în acelaşi ritm.
Pătrunderea în universul celulei, în intimitatea proceselor fiziologice şi manipularea
materialului genetic sunt realizări comparabile cu cele prezentate mai sus, având aceeaşi
importanţă pentru umanitate.
Suntem în prezent în plină revoluţie biotehnologică, materializată printr-un volum
imens de aplicaţii practice ale culturilor in vitro în domeniul ştiinţelor agricole, biologice,
medicale, în farmacologie şi industria alimentară, în industria cosmetică, a coloranţilor naturali
şi a substanţelor bioactive.
Cercetările în biotehnologie vizează rezolvarea unor probleme majore ale omenirii cum
sunt: criza energetică, malnutriţia, valorificarea şi conservarea resurselor genetice, reciclarea
materiei organice, luarea în cultură şi valorificarea terenurilor degradate, reducerea poluării
mediului înconjurător.
Apărută dintr-o necesitate obiectivă, lucrarea “Microînmulţirea plantelor horticole”,
aflată la a doua ediţie, actualizată şi completată, tratează un domeniu care stă la baza oricărui
tip de producţie agricolă: obţinerea de material săditor şi semincer cu înaltă valoare biologică.
Concepută ca un instrument de lucru, “Microînmulţirea plantelor horticole” face în
prima parte, o prezentare amplă a dotărilor laboratorului de culturi in vitro., o trecere în revistă
a componentelor mediilor de cultură, pentru a insista în continuare, asupra modului de
preparare şi sterilizare a acestora.
Un capitol aparte este destinat sterilizării şi asepsiei în culturile in vitro.
Materialul abundă în informaţii utile, tabele ajutătoare, scheme de lucru şi fotografii
sugestive, utile organizării activităţii în domeniul culturilor in vitro.
În a doua parte a lucrării, sunt prezentate pe larg principalele tehnici folosite pentru
microînmulţirea plantelor in vitro. Sunt prezentate, în tabele sintetice, rezultatele cercetărilor
pe tipuri de culturi, la principalele specii horticole.

4
Sunt prezentate, de asemenea alte tehnici de cultură in vitro cu aplicabilitate în
ameliorarea plantelor horticole, conservarea resurselor genetice, fitopatologie. O noutate în
literatura de specialitate românească este capitolul referitor la baby plant, o gamă de produse
decorative obţinute in vitro şi deosebit de apreciate pe piaţă.
Lucrarea se înscrie pe linia continuării tradiţiei învăţământului horticol bucureştean în
domeniul biotehnologiilor aplicate în horticultură şi este un instrument util la îndemâna
specialiştilor, cadrelor didactice, studenţilor, cercetătorilor şi tuturor celor care activează în
acest domeniu de vârf al ştiinţei.
Adresez cu această ocazie mulţumiri, colaboratorilor mei, şef lucrări dr. Monica
Dumitraşcu, şef lucrări dr. Adrian Peticilă, drd. ing. Oana Diaconescu şi drd. ing. Ruxandra
Gâlă, referenţilor ştiinţifici şi Editurii INVEL-Multimedia.
Tuturor celor care se vor apleca asupra acestei lucrări, o vor studia şi analiza critic, le
adresez mulţumirile mele şi invitaţia de a ne transmite opiniile lor la adresa
flstanica@yahoo.co.uk, ajutându-ne astfel, să îmbunătăţim ediţiile viitoare.

Bucureşti, august 2004

Conf. univ. dr. Florin STĂNICĂ

5
CUPRINS
CAPITOLUL 1. Istoricul culturilor in vitro

CAPITOLUL 2. Laboratorul de culturi in vitro


2.1. Aspecte generale
2.2. Zona nesterilă
2.2.1. Camera de păstrare şi pregătire a materialului vegetal
2.2.2. Magazia de materiale
2.2.3. Magazia de substanţe chimice
2.2.4. Camera pentru pregătirea mediilor de cultură
2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultură şi
presterilizarea materialului vegetal
2.2.6. Magazia pentru medii de cultură
2.2.7. Camera de creştere
2.2.8. Camera (spaţiile) de aclimatizare
2.2.9. Sera şi solariile
2.2.10. Spălătorul
2.3. Zona sterilă

CAPITOLUL 3. Mediile de cultură şi prepararea lor.


3.1. Constituenţi cu rol nutritiv
3.1.1. Constituenţi minerali
3.1.1.1. Macroelementele
3.1.1.2. Microelementele
3.1.2. Constituenţi organici
3.1.2.1. Carbohidraţii
3.1.2.2. Aminoacizii
3.1.2.3. Vitaminele
3.2. Constituenţi cu rol fitoregulator.
3.2.1. Auxinele
3.2.2. Citochininele
3.2.3. Giberelinele
3.2.4. Alte substanţe cu rol fitoregulator
3.3. Constituenţi cu rol stabilizator.
3.3.1. Apa
3.3.2. Agenţii de solidificare
3.3.3. Stabilizatorii osmotici şi de pH
3.3.4. Substanţele antioxidante şi absorbante
3.4. Concentraţii. Prepararea soluţiilor stoc.
3.5. Prepararea mediului de cultură
3.6. Probleme care apar la pregătirea şi folosirea mediilor de cultură.

CAPITOLUL 4. Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro.


4.1. Agenţi sterilizanţi
4.2. Sterilizarea vaselor de cultură şi a instrumentarului folosit
4.2.1. Închiderea vaselor de cultură
4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultură
4.2.3. Sterilizarea instrumentarului

6
4.3. Sterilizarea mediului de cultură şi a apei
4.4. Dezinfectarea materialului vegetal
4.5. Contaminările şi detectarea lor

CAPITOLUL 5. Microînmulţirea plantelor horticole


5.1. Consideraţii generale
5.2. Fazele microînmulţirii in vitro
5.2.1. Pregătirea materialului vegetal
5.2.2. Iniţierea şi stabilizarea
5.2.3. Multiplicarea
5.2.4. Înrădăcinarea
5.2.5. Aclimatizarea
5.3. Cultura de meristeme şi apexuri
5.3.1. Clasificarea meristemelor
5.3.2. Cultura de meristeme
5.3.3. Cultura de apexuri
5.4. Cultura de fragmente uninodale
5.5. Cultura de lăstari axilari

CAPITOLUL 6. Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro


6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme
6.2. Microaltoirea
6.2.1. Microaltoirea in vitro
6.2.2. Microaltoirea in vivo
6.2.3. Microaltoirea ex vitro
6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro

CAPITOLUL 7. Organogeneza in vitro


7.1. Organogeneza directă
7.1.1. Organogeneza adventivă de lăstari
7.1.2. Organogeneza adventivă de rădăcini
7.2. Organogeneza indirectă

CAPITOLUL 8. Embriogeneza somatică


8.1. Formarea embrionilor somatici
8.2. Embriogeneza somatică directă
8.3. Embriogeneza indirectă
8.4. Poliembrionia nucelară
8.5. Încapsularea materialului vegetal in vitro
8.5.1. Sămânţa sintetică
8.5.2. Încapsularea unor organe şi ţesuturi in vitro

CAPITOLUL 9. Embriocultura in vitro la plantele horticole

CAPITOLUL 10. Producerea haploizilor


10.1. Aspecte generale
10.2. Androgeneza in vitro
10.3. Fecundarea in vitro

7
CAPITOLUL 11. Cultura de calus in vitro.
11.1. Cultura de calus
11.2. Cultura de protoplaşti şi hibridarea somatică
11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singură celulă

CAPITOLUL 12. Baby plant


12.1. Consideraţii generale
12.2. Tipuri de produse şi materiale folosite la producerea de baby plant
12.2.1. Vase din sticlă
12.2.2. Alte materiale
12.3. Folosirea mediilor de cultură colorate

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

8
CONTENTS
CHAPTER 1. History of in vitro cultures

CHAPTER 2. In vitro culture laboratory


2.1. General aspects
2.2. Unsterile area
2.2.1. Biological material preparation room
2.2.2. Materials storage room
2.2.3. Chemical storage room
2.2.4. Culture media preparation room
2.2.5. Culture media and biological material sterilization room
2.2.6. Culture media storage room
2.2.7. Growth chamber
2.2.8. Acclimation room
2.2.9. Greenhouse and tunnels
2.2.10. Washing room
2.3. Sterile area

CHAPTER 3. Culture media and their preparation


3.1. Nutrients
3.1.1. Mineral compounds
3.1.1.1. Macro elements
3.1.1.2. Microelements
3.1.2. Organic compounds
3.1.2.1. Carbohydrates
3.1.2.2. Amino acids
3.1.2.3. Vitamins
3.2. Growth regulators
3.2.1. Auxins
3.2.2. Cytokinins
3.2.3. Giberellins
3.2.4. Other growth regulators
3.3. Stabilization compounds
3.3.1. Water
3.3.2. Gelling compounds
3.3.3. Osmotic and pH stabilizers
3.3.4. Antioxidants and absorbents
3.4. Concentrations. Preparation of stock solution.
3.5. Culture medium preparation
3.6. Problems connected to the culture media preparation and use

CHAPTER 4. Sterilisation and asepsis for in vitro cultures


4.1. Sterilising agents
4.2. Culture vessels and tools sterilisation
4.2.1. Culture vessels closure
4.2.2. Culture vessels sterilisation
4.2.3. Tools sterilisation
4.3. Culture medium and water sterilisation

9
4.4. Biological material disinfection
4.5. Contamination and their detection

CHAPTER 5. Horticulture plants micropropagation


5.1. General aspects
5.2. In vitro micropropagation stages
5.2.1. Biological material preparation
5.2.2. Initiation and stabilisation
5.2.3. Multiplication
5.2.4. Rooting
5.2.5. Acclimatisation
5.3. Meristem and apex culture
5.3.1. Meristem classification
5.3.2. Meristem culture
5.3.3. Apex culture
5.4. Single node culture
5.5. Axillary shoots culture

CHAPTER 6. Horticultural plants virus elimination using in vitro cultures


6.1. Virus elimination using meristem cultures
6.2. Micrografting
6.2.1. In vitro micrografting
6.2.2. In vivo micrografting
6.2.3. Ex vitro micrografting
6.3. Virus free plant obtaining using other in vitro techniques

CHAPTER 7. In vitro organogenesis


7.1. Direct organogenesis
7.1.1. Adventitious shoot organogenesis
7.1.2. Adventitious root organogenesis
7.2. Indirect organogenesis

CHAPTER 8. Somatic embryogenesis


8.1. Somatic embryo formation
8.2. Direct somatic embryogenesis
8.3. Indirect somatic embryogenesis
8.4. Nucellar poliembriony
8.5. In vitro encapsulation of biological material
8.5.1. Synthetic seed
8.5.2. In vitro encapsulation of tissues and organs

CHAPTER 9. In vitro embrioculture in horticultural plants

CHAPTER 10. Haploid production


10.1. General aspects
10.2. In vitro androgenesis
10.3. Test-tube fertilisation

10
CHAPTER 11. In vitro callus culture
11.1. Callus culture
11.2. Protoplast culture and somatic hybridisation
11.3. Plant regeneration from a single cell

CHAPTER 12. Baby plant


12.1. General considerations
12.2. Products and materials used for baby plant production
12.2.1. Glass ware
12.2.2. Other materials
12.3. Use of coloured culture media

SELECTIVE REFERENCES

11
Capitolul 1
Istoricul culturilor in vitro

Cultivarea in vitro a unor celule şi ţesuturi vegetale este o ramură a ştiinţelor


biologice ale căror începuturi corespunde cu începutul secolului XX.
Evoluţia sa de-a lungul timpului a fost demnă de secolul “vitezei” astfel încât, în
aceşti ultimi ani, vorbim de un ansamblu de tehnici şi metode in vitro grupate generic sub
numele de biotehnologii vegetale.
Teoria care a stat la baza acestei ştiinţe a fost lansată însă cu mult timp înainte. În
1838, Schleiden şi Schwan au afirmat că celulele vegetale sunt, într-o oarecare măsură,
autonome şi capabile să regenereze părţi din plante sau plante întregi. Această proprietate a
fost numită totipotenţă şi a reprezentat o adevărată provocare pentru un mare număr de
oameni de ştiinţă.
Primele încercări nereuşite de a cultiva ţesuturi vegetale in vitro s-au datorat lui
Haberlandt (1902). Au urmat apoi numeroase tentative care au deschis calea spre tot atâtea
domenii noi de cercetare.
Abia în 1939, după descoperirea rolului hormonilor în creşterea şi dezvoltarea
plantelor, Nobecourt, Gautheret şi White au obţinut primele succese reale prin cultivarea in
vitro timp de mai multe subculturi a calusului.
După al doilea război mondial, culturile in vitro s-au dezvoltat rapid datorită
multiplelor domenii de aplicabilitate: înmulţirea industrială a plantelor, genetică,
ameliorarea plantelor, inginerie genetică, conservarea resurselor genetice, producţia
industrială de substanţe utile. Trebuie adăugat şi rolul avut în dezvoltarea unor studii de
anatomie şi fiziologia vegetală, fitopatologie, etc.
Stadiul atins în prezent deschide perspective ample în zorii mileniului III în ceea ce
priveşte manipularea materialului genetic şi dirijarea proceselor de înmulţire, creştere şi
dezvoltare a plantelor în vederea obţinerii unor noi forme productive.
Speranţele umanităţii se îndreaptă spre găsirea unor soluţii pe termen lung pentru
asigurarea necesarului de hrană pentru o populaţie aflată în creştere rapidă.
Aceste soluţii pot fi căutate în multitudinea de posibilităţi pe care biotehnologiile in
vitro le au în ceea ce priveşte valorificarea superioară a resurselor genetice şi modelarea

12
acestora în folosul omului. Pe lângă obiectivul creşterii productivităţii ecosistemelor
agricole, se urmăreşte obţinerea unor plante de cultură care să poată valorifica zonele
neproductive, deşertice, sărăturate, etc.
În acelaşi timp se are în vedere extinderea şi perfecţionarea tehnologiilor de
obţinere a unor noi produse de biosinteză, cu aplicabilitate în industria alimentară,
farmaceutică, în industria coloranţilor, zootehnie.
Cineva spunea parafrazându-l pe Malraux, că: ”Secolul XXI va fi un secol al
biotehnologiei sau nu va fi deloc”.
În tabelul 1.1. sunt prezentate cele mai importante etape din evoluţia
biotehnologiilor vegetale.
Tabelul 1.1.
Istoricul culturilor vegetale in vitro
Anul Ipoteze, teorii, încercări, realizări Autorii
0 1 2
1838 Teoria totipotenţei celulare Schleiden şi
Schwan
1892 Plantele sintetizează substanţe care sunt distribuite polar Sachs
1902 Primele încercări de culturi de ţesuturi vegetale Haberlandt
1904 Prima încercare de embriocultură la crucifere Hönnig
1909 Prima fuziune de protoplaşti nereuşită Kuster
1922 Germinarea seminţelor de orhidee in vitro în absenţa Kundson
simbionţilor
1922 Cultura in vitro a apexurilor de rădăcină Robbins
1925 Embriocultura aplicată în încrucişările interspecifice la Laibach
Linum
1929 Folosirea embrioculturii pentru înlăturarea Laibach
incompatibilităţii la încrucişare
1934 Primele încercări nereuşite de cultivare a ţesutului Gautheret
cambial la arbori şi arbuşti
1934 Cultivarea in vitro a rădăcinilor de tomate White
1936 Embriocultura la diferite gimnosperme La Rue

13
Continuare tabelul 1.1.
0 1 2
1939 Creşterea timp de mai multe subculturi a calusului Nobecourt,
obţinut din ţesuturi vegetale Gautheret, White
1940 Cultivarea ţesutului cambial de Ulmus şi studierea Gautheret
formării lăstarilor adventivi
1941 Folosirea pentru prima dată a laptelui de cocos pentru Van Overbeek
cultivarea embrionilor de Datura
1944 Prima cultură de Nicotiana tabacum pentru studierea Skoog
formării de lăstari adventivi (organogeneza directă)
1945 Cultura unor specii de Asparagus in vitro Loo
1946 Obţinerea primelor plante de Lupinus şi Tropaeolum Ball
1948 Organogeneza directă de lăstari şi rădăcini la tutun sub Skoog şi Tsui
influenţa raportului auxină/adenină
1950 Regenerarea unor organe din calus la Sequoia Ball
sempervirens
1952 Obţinerea de plante de Dhalia devirozate prin culturi de Morel şi Martin
meristeme
1952 Realizarea primelor microaltoiri Morel şi Martin
1953 Obţinerea calusului haploid la Gingko biloba din polen Tulecke
1954 Obţinerea unei plante întregi dintr-o singură celulă Muir şi colab.
1955 Descoperirea chinetinei Miller şi colab.
1956 Realizarea primelor culturi celulare în suspensie pentru Tulecke şi Nickell
obţinerea de produşi secundari
1957 Descoperirea influenţei raportului citochinine/auxine Skoog şi Miller
asupra proceselor de organogeneză
1958 Regenerarea in vitro a unor embrioni somatici din nucelă Maheshwari şi
la Citrus Rangaswamy
1958 Regenerarea de pro-embrioni din calus şi suspensii Reinert şi Steward
celulare la Daucus carota
1959 Publicarea primei cărţi privind cultura de celule şi Gautheret
ţesuturi vegetale
1960 Prima polenizare in vitro la Papaver rhoeas Kanta

14
Continuare tabelul 1.1.
0 1 2
1960 Degradarea pereţilor celulari pentru obţinerea Cocking
protoplaştilor
1960 Înmulţirea vegetativă a orhideelor prin culturi de Morel
meristeme
1962 Formularea şi publicarea reţetei mediului de cultură Murashige & Skoog
Murashige & Skoog
1964 Obţinerea primei plante haploide din grăunciori de polen Guha şi Maheswari
la Datura
1964 Regenerarea de lăstari şi rădăcini din calus de Populus Mathes
tremuloides
1965 Inducerea înfloririi în ţesutul de tutun cultivat in vitro Aghion-Prot
1967 Inducţia florală la Lunaria annua prin vernalizare in vitro Pierik
1969 Obţinerea plantelor haploide de tutun din grăunciori de Bourgin şi Nitsch
polen
1969 Prima izolare reuşită de protoplaşti din suspensii celulare Eriksson şi Jonassen
la Hapopappus gracilis
1970 Selecţia de mutanţi obţinuţi cu agenţi chimici in vitro Carlson
1970 Obţinerea haploizilor la ovăz prin embriocultură Kasha şi Kao
1970 Realizarea cu succes a fuziunii de protoplaşti Power şi colab.
1971 Regenerarea primei plante din protoplaşti Takebe şi colab.
1972 Realizarea hibridării interspecifice prin fuziunea de Carlson şi colab.
protoplaşti la două specii de Nicotiana
1973 Folosirea citochininelor pentru întreruperea dormansului Pierik şi colab.
la explante de capitul la Gerbera
1974 Inducerea lăstăririi axilare prin folosirea citochininelor în Murashige şi colab.
cultura de apexuri la Gerbera
1974 Regenerarea de haploizi din protoplaşti la Petunia Binding
hybrida
1974 Obţinerea de hibrizi prin fuziunea protoplaştilor haploizi Melchers şi Labib
1974 Transformarea genetică în cultura de ţesuturi vegetale Reinhard

15
Continuare tabelul 1.1.
0 1 2
1974 Descoperirea rolului plasmei Ti în formarea tumorilor la Zaenen şi colab.
Agrobacterium tumefaciens Larebeke şi colab.
1975 Selecţia pozitivă în culturi de calus rezistente la Gengenbach şi Green
Helminthosporium maydis
1976 Iniţierea culturilor din apexuri de lăstari crioconservaţi Seibert
la garoafă
1976 Hibridarea somatică interspecifică prin fuziunea de Power şi colab.
protoplaşti între Petunia hybrida şi Petunia parodii
1977 Integrarea plasmidei Ti de la Agrobacterium Chilton şi colab.
tumefaciens în genomul plantelor
1978 Hibridarea somatică între tomate şi cartof Melchers şi colab.
1979 Folosirea co-cultivării pentru transformarea genetică a Marton şi colab.
protoplaştilor vegetali cu Agrobacterium tumefaciens
1981 Introducerea termenului de variaţie somaclonală Larkin şi Scowcroft
1982 Introducerea de ADN pur în protoplaşti. Transformarea Krens şi colab.
cu ADN izolat devine posibilă
1982 Fuziune de protoplaşti prin electrostimulare Zimmermann
1983 Hibridarea citoplasmatică intergenerică între ridiche şi Pelletier şi colab.
rapiţă
1984 Transformarea celulelor vegetale cu plasmida ADN Paszkowski şi colab.
1985 Infecţia şi transformarea discurilor foliare cu Horsch şi colab.
Agrobacterium tumefaciens şi regenerarea de plante
transformate
După Începe Era Organismelor Modificate Genetic
1985 (OMG)

16
Capitolul 2
Laboratorul de culturi in vitro

2.1. Generalităţi
Activitatea în domeniul culturilor in vitro se desfăşoară în laboratoare cu structură
şi dotare specifică.
Mărimea acestor laboratoare variază de la câţiva zeci de metri pătraţi, în cazul
structurilor cu finalitate didactică sau de cercetare, până la suprafeţe de mii de metri pătraţi
în cazul complexelor industriale de microînmulţire (foto 2.1.).

Foto 2.1. Complexul industrial de microînmulţire Vitroplant, Cesena, Italia

Dotarea laboratoarelor diferă în funcţie de volumul de material biologic care este


inoculat şi crescut in vitro. Diferenţele se referă în primul rând la capacitatea unei anumite
structuri din dotare şi nu la funcţiile acesteia.
Una din condiţiile esenţiale ale realizării unui laborator este asigurarea curăţeniei
impecabile. Acest lucru nu se referă doar la pardoseli şi pereţi, dar şi la aer. Acesta trebuie
să fie lipsit pe cât posibil de particule de praf şi bine-nţeles de spori de ciuperci sau
particule bacteriene care pot constitui surse de infecţie.

17
Pentru realizarea unei “curăţiri” a aerului se recomandă folosirea unor instalaţii de
condiţionare prevăzute cu filtre de aer eficiente (ex. filtru HEPA). O soluţie alternativă ar fi
folosirea unor instalaţii de condiţionare a aerului cu presiune pozitivă care sunt însă ceva
mai costisitoare.
O altă grupă de facilităţi se referă la controlul temperaturii în laborator. Acest
lucru se realizează, pentru spaţiile comune, prin folosirea instalaţiilor de încălzire
controlată cu diferite tipuri de agent termic.
O atenţie deosebită se va acorda însă dirijării temperaturii în camerele de creştere,
în camerele de aclimatizare şi în seră. Sistemele care se vor folosi vor fi prevăzute cu
senzori şi sisteme de alarmare în caz de avarie pentru o reducere la minimum posibil riscul
pierderilor.
Laboratoarele industriale trebuie prevăzute şi cu grupuri electrogene care să facă
faţă rapid penelor de curent.
Nu vor lipsi în orice laborator sistemele de dublă protecţie, senzori de gaz, senzori
de temperatură (pentru depistarea incendiilor) şi sistemele de alarmare corespunzătoare,
lămpi de avarie, hidranţi, extinctoare etc.
Laboratoarele vor fi dotate cu truse de prim ajutor şi cu instrucţiuni precise
privind acordarea acestuia în caz de arsuri, intoxicaţii şi alte accidente posibile.
Nu în ultimul rând se vor prevedea sisteme de protecţie antiefracţie şi de protecţie
a datelor, informaţiilor şi tehnologiilor folosite.
Laboratoarele de tip industrial (figura 2.2.) au suprafeţe de lucru mult mai ample,
faţă de laboratoarele de cercetare sau didactice şi bine-nţeles, câteva structuri
caracteristice.
În toate cazurile suprafaţa unui laborator este împărţită în două zone:
- zona nesterilă;
- zona sterilă.

18
cameră
camere aclimatizare cameră repaos
transfer
" în vivo"
sală de
şedinţă

cameră
medii autoclave
spălător
magazie
cameră
seră sterilă cameră rece

laborator
biochimie
virusologie
cameră
culturi
microscopie

birou

cameră ambalare birou birou

rampă livrare

Figura 2.2. Structura unui laborator industrial de microînmulţire


(modificat după Gamborg, 1995)

2.2. Zona nesterilă


Zona nesterilă este reprezentată de totalitatea spaţiilor în care asepsia nu este
obligatorie. Această zonă este împărţită în mai multe încăperi care vor fi prezentate în
continuare.
2.2.1. Camera de păstrare şi pregătire a materialului vegetal
Pentru pregătirea materialului vegetal în vederea inoculării este nevoie de o
încăpere curată, cu pereţi faianţaţi şi pardosiţi cu gresie. Dotările obligatorii se referă la apa
curentă, canalizare şi curent electric (220 V, 50 Hz), iar cele opţionale la frigidere,
dulapuri, mese, etc.
În această încăpere, materialul vegetal iniţial provenit din câmp sau seră, este
sortat, curăţat (prin spălare), fasonat, parafinat, eventual sterilizat superficial prin folosirea
unor fungicide şi bactericide.

19
În cazul păstrării mai îndelungate a materialului vegetal (bulbi, rizomi, tubero-
bulbi, tuberculi, sâmburi, seminţe, ramuri etc.) acesta este ambalat corespunzător şi trecut
în frigider la 3-4° C.

2.2.2. Magazia de materiale


În funcţie de amploarea activităţii desfăşurate în laborator este necesară existenţa,
în anumite situaţii, a unei magazii de materiale.
În această magazie se va păstra o gamă largă de materiale cum ar fi: sticlăria nouă,
folii din aluminiu, din polietilenă, ghivece noi, blocuri de repicat, tifon, vată, ambalaje
pentru livrarea materialului vegetal, etichete etc.

2.2.3. Magazia de substanţe chimice


Substanţele chimice folosite pentru prepararea mediilor de cultură, pentru
sterilizarea materialului vegetal, spaţiilor şi instrumentarului se vor păstra într-o magazie
special amenajată în acest scop.
O astfel de încăpere este dotată cu:
- rafturi pentru substanţele care se păstrează la temperatura camerei;
- dulapuri pentru păstrarea substanţelor la întuneric;
- frigidere şi congelatoare pentru păstrarea unor hormoni, vitamine, soluţii stoc
etc.
- balanţe şi inventar specific: scafe, spatule, vase pentru cântărire etc.
Foarte important este ca fiecare recipient cu substanţe să fie bine închis, corect
etichetat şi asigurat împotriva răsturnării, spargerii, deteriorării, etc.
Pentru a uşura căutarea unei anumite substanţe se recomandă numerotarea
recipienţilor şi anexarea pe uşa fiecărui dulap sau frigider a unui opis cu numerele de
identificare şi conţinutul acestora.
În acelaşi timp, substanţele puternic toxice, corozive, cancerigene, inflamabile,
într-un cuvânt, periculoase, vor fi amplasate separat în locuri marcate corespunzător cu
indicatoare de avertizare.
Acidul clorhidric concentrat (HCl) şi hidroxidul de amoniu (NH4OH) nu trebuie
păstrate în acelaşi loc, datorită riscului formării de NH4Cl toxic, prin combinarea vaporilor
de clor şi amoniac.

20
Substanţele higroscopice trebuie păstrate în recipiente ermetic închise şi uneori în
esicatore.
Pentru a putea fi folosite substanţele păstrate în congelator se vor introduce de
asemenea în esicatoare până vor atinge temperatura camerei. Măsura este obligatorie
pentru enzime şi alte proteine şi are ca efect eliminarea condensării apei şi reducerea
pierderilor de substanţă activă.
Pentru cazurile când se lucrează cu substanţe volatile sau care emană gaze iritante
sau toxice se recomandă ca în această magazie să existe şi o nişă cu ventilaţie forţată a
aerului.

2.2.4. Camera pentru pregătirea mediilor de cultură


Pregătirea mediilor de cultură este o operaţie foarte importantă care presupune
existenţa unei camere prevăzută cu dotări specifice (Foto 2.3.)

Foto 2.3. Camera pentru prepararea mediilor de cultură la Vitroplant Cesena

În ceea ce priveşte dotările şi instalaţiile de bază, trebuie precizat că încăperea


trebuie să fie faianţată şi pardosită cu gresie sau materiale uşor lavabile. Mesele, de regulă
una aşezată central şi celelalte lângă pereţi, trebuie să fie faianţate şi prevăzute cu
minirafturi pentru sticlărie, etc. În cameră vor mai exista dulapuri pentru păstrarea sticlăriei
curate.

21
Camera trebuie prevăzută cu instalaţii de apă curentă rece şi caldă (eventual cu un
boiler), chiuvete antiacid, canalizare, instalaţie de gaz natural sau butelie, instalaţie de
curent electric (220 V, 50 Hz). Toate instalaţiile de mai sus trebuie prevăzute cu sisteme de
protecţie, robinete suplimentare, vane, circuite de împământare, tablouri cu siguranţe
fuzibile, etc. conform normelor în vigoare.
Din inventarul camerei pentru pregătirea mediilor de cultură nu trebuie să
lipsească un aparat pentru distilat apă, un deionizator, plite cu agitator magnetic, plite
diverse, eventual becuri cu gaze, cuptor de microunde, sisteme de filtrare (Millipore etc.),
balanţă analitică cu patru zecimale, balanţă cu două zecimale, mixere, micropipete, pH-
metru, distribuitoare de mediu, cronometru de laborator etc.
Distribuitoarele de mediu pot fi simple de tipul unor seringi cu limitator gradat,
pentru volume de mediu cuprinse între 1 şi 10-15 ml (foto 2.4. şi 2.5.), sau de dimensiuni
mai mari de tipul unor cuve încălzite electric prevăzute cu pompe aspiro-respingătoare,
pentru volume de mediu cuprinse între 25-200 ml (foto 2.6.).

Foto 2.4. Distribuitor-dozator pentru mediul de cultură (volume reduse)

Foto 2.5. Seringă pentru repartizarea mediului de cultură

22
Foto 2.6. Repartizarea mediului de cultură în vase mari,
în flux industrial (Vitroplant)

De asemenea, se foloseşte sticlărie specifică; pahare Berzelius, pahare


Erlenmayer, baloane cotate, cilindri gradaţi, pipete, biurete, vase pentru apă distilată.
După preparare mediul se repartizează în diferite tipuri de recipiente din sticlă sau
mase plastice speciale. Pentru volume reduse de mediu se folosesc fie eprubetele, fie
vasele Petri.
Pentru cantităţi mai mari de mediu se folosesc recipiente din sticlă sau material
plastic de forme şi mărimi diferite. Închiderea lor se face folosind diferite materiale şi
soluţii tehnice (vezi subcapitolul 4.2.1.).

2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultură şi presterilizarea


materialului vegetal
După prepararea mediului de cultură şi repartizarea în vase acesta este trecut în
camera de autoclavare. Această încăpere este dotată cu instalaţie de curent electric
(recomandabil 380 V), instalaţie de gaz, instalaţie de alimentare cu apă şi autoclave.

23
Autoclavele sunt instalaţii complexe, prevăzute cu instrumente pentru controlul
temperaturii şi presiunii, temporizatoare şi dispozitive de siguranţă folosite pentru
sterilizare în mediu umed (autoclavare).
Parametrii de lucru a unui autoclav sunt în general 121°C, pentru temperatură şi
1,1 atmosfere, pentru presiune.
După sursa de energie autoclavele sunt de două feluri: electrice şi cu gaz, iar după
tipul constructiv sunt verticale sau orizontale (foto 2.7. şi 2.8.). Volumul util al unui
autoclav variază de la câţiva litri până la câteva sute de litri, în funcţie de cantitatea de
mediu care se autoclavează în mod uzual.

Foto 2.7. Autoclav orizontal Foto 2.8. Autoclav vertical


de capacitate redusă de capacitate medie

În complexele industriale de microînmulţire se folosesc autoclave orizontale de


mare capacitate prevăzute cu două uşi:
- una pentru umplere din camera pentru pregătirea mediului de cultură;
- una pentru golire din camera pentru păstrarea mediului sau din zona sterilă.
În autoclave, vasele cu mediu se introduc în coşuri speciale sau în pupinele.
În anumite situaţii în camera de autoclavare care se află în vecinătatea zonei
sterile se face şi o presterilizare a materialului vegetal pregătit pentru inoculare.
Presterilizarea se face prin imersarea acestuia în soluţii de fungicide şi/sau
bactericide urmând apoi sterilizarea propriu-zisă sub hota cu filtru laminar.

24
2.2.6. Magazia pentru medii de cultură
După autoclavare, mediile de cultură trebuie să fie păstrate cel puţin 24 de ore
înainte de a fi folosite. Acest lucru se poate face într-o încăpere perfect curată situată în
vecinătatea camerei de inoculare.
Păstrarea trebuie făcută la întuneric pentru a preveni degradarea compuşilor
fotolabili sub influenţa luminii. În acelaşi timp, temperatura de păstrare se recomandă să
fie cât mai scăzută (ideal 3-4°C). Unele laboratoare industriale folosesc camere frigorifice
special amenajate pentru păstrarea mediului de cultură, dar şi pentru păstrarea vaselor cu
explante pentru eşalonarea producţiei de material vegetal în funcţie de cerinţe, comenzi,
anotimp, etc.
În laboratoarele mici păstrarea vaselor cu mediul de cultură se poate face în
dulapuri bine închise în apropierea camerei sterile.
Păstrarea mediului de cultură nu trebuie făcută pe o perioadă mai mare de 14 zile
întru-cât creşte riscul deteriorării caracteristicilor acestuia.

2.2.7. Camera de creştere


După inocularea explantelor pe mediul de cultură vasele sunt trecute în camera de
creştere. Ca şi celelalte încăperi ale laboratorului, aceasta trebuie să fie perfect curată,
faianţată şi să fie totodată dotată cu instalaţii specifice (Foto 2.9.).

Foto 2.9. Una din camerele de culturi ale firmei Vitroplant Cesena, Italia

25
Întreaga cameră este ocupată cu rafturi pe care se aşează vasele de cultură.
Distanţa dintre două poliţe pe verticală este de minimum 40-50 cm, iar înălţimea totală în
jur de 2 m. Lăţimea unei poliţe este de 1-2 m.
Poliţele se realizează din materiale care să permită circulaţia aerului printre vase
evitându-se astfel supraîncălzirea mediului de cultură.
Pentru aşezarea eprubetelor pe rafturi se folosesc suporţi, de regulă înclinaţi, care
permit o mai bună iluminare a explantelor.
Un alt element important în camera de creştere este reprezentat de instalaţia de
iluminat. Realizată în general din tuburi fluorescente distanţate la 15-20 cm unele de altele,
această instalaţie trebuie să aibă nişte caracteristici tehnice bine stabilite.
Astfel, intensitatea luminoasă trebuie să fie de 3000-4000 de lucşi. Se cunosc
situaţii când se recurge la intensităţi mai reduse sau chiar la lipsa totală a luminii:
- timp de 3-4 zile după inocularea meristemelor pentru reducerea oxidărilor;
- în anumite culturi de calus;
- în embriogeneza somatică la conifere;
- în faza de inducţie înaintea fazei de organogeneză directă din limb foliar;
Frecvent este nevoie de lumină diferit colorată pentru obţinerea unor rezultate mai
bune la diverse tipuri de culturi.
Interesează apoi lungimea ciclurilor lumină-întuneric. De regulă durata “zilei”
este stabilită la 6-12 ore, restul până la 24 fiind ocupate de întuneric. Rezultatele obţinute
de Teodorescu Al. şi colab. (1994, 1995) la ICPP Piteşti-Mărăcineni au dovedit că prin
reducerea lungimii ciclurilor de lumină se realizează importante economii de energie. Pe
baza rezultatelor obţinute, autorii recomandă reducerea duratei de iluminare cu 4-6 ore pe
zi, respectiv realizarea unui fotoperiodism de 12-10 ore.
Un alt parametru care trebuie controlat este nivelul temperaturii în camera de
creştere. În general, temperatura folosită este 22-24°C±1°C, Trebuie precizat că în funcţie
de specie, tipul de cultură şi scopul urmărit temperatura poate să varieze între 10 şi 32°C.
În general, speciile provenite din zonele calde cresc bine la temperaturi mai ridicate (26-
28°C).
Umiditatea este un alt factor esenţial. Valoarea optimă a umidităţii aerului în
camere de creştere este de 80-85%, Scăderea umidităţii sub această valoare duce la
deshidratarea rapidă a mediului de cultură cu consecinţe grave asupra explantelor.

26
Controlul factorilor de mediu în camera de creştere trebuie să fie făcut riguros,
acest lucru influenţând direct mersul culturilor. Pentru a urmări evoluţia temperaturii şi
umidităţii în camerele de creştere acestea sunt prevăzute cu termohigrometre.
Orice avarie trebuie semnalată imediat prin intermediul unor sisteme de avertizare
luminoase şi sonore.

2.2.8. Camera (spaţiile) de aclimatizare


Aclimatizarea este etapa cea mai dificilă în desfăşurarea procesului de
microînmulţire. Pentru reuşita acestei operaţii trebuie să se dispună de spaţii prevăzute cu
instalaţii eficiente de iluminare, încălzire şi umidificare a aerului.
În mod frecvent, în complexele industriale, aclimatizarea se face în solarii sau sere
speciale (Foto 2.10.).

Foto 2.10. Sera cu dubla protecţie, folosită la aclimatizarea


materialului microînmulţit (Vitroplant)

Cu cât controlul factorilor de mediu este mai bun, cu atât se reduc riscurile
pierderii de material în procesul aclimatizării. Dirijarea factorilor de mediu pe parcursul
fazei de aclimatizare este prezentată în subcapitolul 5.2.5.

27
2.2.9. Sera şi solariile
Materialul aclimatizat este trecut apoi în solarii sau sere pentru a-şi desfăşura
primele faze de creştere înainte de livrare sau înainte de a fi folosit în câmp. Acest proces,
numit fortificare, are loc în structuri prevăzute cu sisteme de control al factorilor de
vegetaţie, în special umiditate şi temperatură (foto 2.11. şi 2.12.).
Mărimea suprafeţelor ocupate cu sere şi solarii depinde de cantitatea de material
înmulţit.

Foto 2.11. Seră folosită pentru fortificarea materialului aclimatizat (Vitroplant)

Foto 2.11. Viţă de vie în container fortificată într-un solar (Vitroplant)

28
O soluţie economică de realizare a unei sere de dimensiuni mai reduse este
amplasarea acestei pe partea de sud a construcţiei care găzduieşte laboratorul. Acoperişul
se poate construi cu o singură pantă, unul din pereţi fiind reprezentaţi de peretele clădirii
(figura 2.2.).

2.2.10. Spălătorul
Spălătorul este o încăpere prezentă în orice fel de laborator de microînmulţire.
Aşa cum spuneam mai devreme de gardul de curăţenie depinde în bună măsură
sănătatea culturilor şi bunul mers al activităţii.
În spaţiul reprezentat de spălător se curăţă sticlăria şi celelalte componente ale
instrumentarului folosit pentru realizarea culturilor in vitro.
Încăperea trebuie să fie faianţată şi prevăzută cu instalaţii specifice de alimentare
cu apă, canalizare, alimentare cu curent electric şi eventual gaze.
În spălător trebuie să existe mai multe chiuvete (unele cu scurgător) alimentate cu
apă caldă sau rece. În lipsa unei instalaţii de apă caldă aceasta se poate obţine cu ajutorul
unui boiler electric sau cu gaze (tip Vaillant).
Pentru spălarea sticlăriei mai sunt necesare vase din plastic de diferite dimensiuni,
perii şi detergenţi.
Din spălător sunt nelipsite scurgătoarele de tot felul pentru vase mari, pentru vase
de cultură, pentru eprubete. Vor fi prezente şi recipiente cu amestec cromic folosit la
spălarea sticlăriei (atenţie, este puternic toxic şi coroziv, vezi subcapitolul 4.2.) şi
recipiente cu apă distilată folosită la clătire.
În laboratoarele de mari dimensiuni se folosesc perii electrice pentru uşurarea
spălării, sau chiar maşini şi instalaţii pentru spălat care efectuează toate operaţiile de
spălare, clătire şi uscare a sticlăriei.
După înlăturarea mediului de cultură din vase acestea se spală superficial în curent
de apă fierbinte şi se trec apoi într-un vas cu apă caldă cu detergenţi.
În cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea să fie autoclavate înainte
de a fi deschise pentru a se evita răspândirea infecţiei în laborator.
Vasele folosite pentru topirea mediului sau pentru distribuirea mediului cu agar
vor fi spălate imediat cu apă fierbinte pentru a se evita răcirea agarului şi fixarea pe pereţii
acestuia.

29
Tehnologia modernă presupune şi existenţa unor maşini de spălat cu ultrasunete,
extrem de eficiente (foto 2.12.).

Foto 2.12. Maşină de spălat cu ultrasunete

După spălarea propriu-zisă, sticlăria se clăteşte în apă curentă şi este trecută într-
un alt vas cu apă distilată unde va fi lăsată timp de mai mult ore. Urmează apoi zvântarea
pe scurgătoare şi depozitarea în dulapuri speciale destinate acestui scop, până în momentul
folosirii.
Mediul de cultură şi celelalte resturi se vor colecta în pungi din plastic care se vor
lega şi duce în spaţii de colectare a gunoiului.
Pentru laboratoarele mici uneori spălătorul face parte integrată din camera de
pregătire a mediului de cultură
În aceleaşi situaţii, în spălător se poate face şi pregătirea materialului vegetal
pentru inoculare. Este vorba, în special de operaţiile de spălare, presterilizare şi eventual
fasonare a materialului.
În ceea ce priveşte organizarea activităţii de spălare a sticlăriei şi instrumentarului
în laborator trebuie precizat că în micile laboratoare nu există personal angajat special
pentru acest scop. De aceea trebuie instituită regula potrivit căreia fiecare din cei care
lucrează în laborator trebuie să lase în urma sa aşa cum a găsit, adică curat.
Fiecare îşi va spăla sticlăria folosită, o va depozita în locurile special destinate, în
ordine şi va curăţa spălătorul la terminarea activităţii.

30
Tot în ansamblul de reguli după care trebuie organizată activitatea în laboratoarele
didactice şi de cercetare se înscrie şi planificarea acţiunilor pe zile şi persoane, realizându-
se astfel un flux continuu fără suprapuneri sau goluri.

2.3. Zona sterilă


"Inima" laboratorul de culturi in vitro este reprezentată de camera sterilă. În acest
spaţiu se execută toate operaţiile de sterilizare, inoculare şi transferuri pe mediul de cultură
în condiţii sterile.
Camera sterilă trebuie să fie ferită de orice sursă de praf şi murdărie. În acest sens
ferestrele vor fi prevăzute cu un sistem de filtrare iar dacă este posibil încăperea va avea la
intrare o cameră tampon.
Laboratoarele mai sofisticate au instalaţii de climatizare cu presiune pozitivă de
aer steril care împiedică pătrunderea prafului, sporilor sau altor forme ale agenţilor
patogeni din exterior.
În trecut sterilizarea spaţiului interior se realiza cu ajutorul unor lămpi cu
ultraviolete. Era apoi obligatorie aerisirea încăperii pentru eliminarea ozonului care se
formează. Cu această ocazie era posibil ca în încăpere să pătrundă din nou spori de
ciuperci, bacterii şi alte microorganisme, iar operaţia era ineficientă. În plus, ozonul este
toxic şi puternic mutagen şi creşte astfel riscurile expunerii personalului la accidente.
Componenta de bază a camerei sterile este hota (nişa) sterilă. Folosind un sistem
de filtrare complex hota creează, într-un spaţiu închis, un flux de aer steril care se
deplasează cu o anumită viteză spre operator.
Există mai multe tipuri constructive de hote care funcţionează pe acelaşi principiu:
împingerea cu ajutorul unor ventilatoare a aerului printr-o baterie de filtre, reţinerea
particulelor de praf şi a microorganismelor şi formarea unui flux de aer steril care iese din
incinta sterilă, "împiedicând în acelaşi timp pătrunderea aerului nesteril din exterior.
Cele mai folosite hote sterile sunt hotele cu flux laminar orizontal. Ele pot avea un
post de lucru, două sau mai multe (foto 2.13.)

31
Foto 2.13. Hota sterilă cu flux laminar orizontal

Pentru lucrări în care se folosesc agenţi patogeni sau transformări cu


Agrobacterium tumefaciens se recomandă să se folosească hote sterile cu flux vertical care
împiedică răspândirea acestor microorganisme în exterior (foto 2.14.).

Foto 2.14. Hota sterilă cu flux vertical

În general, o hotă este alcătuită dintr-o baterie de ventilatoare în partea din spate,
prefiltre care reţin particulele de praf mai grosiere şi bateria de filtre bacteriologice care
reţine particule mai mari de 0,2 µm.
În partea din faţă hota prezintă o minicameră cu un perete liber alcătuit dintr-o
masă de lucru, acoperită cu tablă din inox, doi pereţi laterali transparenţi şi un sistem de
iluminare cu tuburi din neon în partea de sus.
Hotele de construcţie mai veche erau prevăzute şi cu lămpi de U.V. folosite pentru
sterilizare.

32
În acelaşi timp hota prezintă una sau mai multe prize electrice pentru a asigura
sursa de curent pentru microscoape, lupe binocular, minibalanţe, incineratoare (Bacti-
Cinerator) sau sterilizatoare electrice pentru instrumentar (foto 2.15.).

Foto 2.15. Hotă modernă pentru lucrări de cercetare (Vitroplant)

Acolo unde există instalaţie cu gaz la hotă se ataşează 1-2 becuri Münsen cu gaz
pentru flambarea instrumentarului (foto 2.16.). Hota mai este dotată cu întrerupătoare
precum şi eventual cu un regulator de turaţie a ventilatorului care modifică viteza fluxului
de aer.
În timpul lucrului în hotă se vor găsi de asemenea, suporţi pentru instrumentar
steril, (ace, spatule, pense, bisturie etc.), un pulverizator cu alcool pentru dezinfecţia
exteriorului vaselor de cultură, a masei şi a mâinilor operatorului precum şi materiale
pentru închiderea vaselor de cultură (folie de aluminiu, folie autosigilantă, etc.).

Foto 2.16. Dotare minimală într-o hotă cu flux laminar steril

33
În camera sterilă trebuie să mai existe scaune (eventual rotative, ergonomice, etc.)
măsuţe pentru depunerea vaselor cu medii, a vaselor folosite la sterilizarea materialului, a
sticlelor cu agenţi sterilizanţi şi apă, a materialului vegetal pregătit pentru sterilizare).
Foarte practice sunt măsuţele multietajate cu rotile care se pot deplasa uşor dintr-un loc în
altul (foto 2.17).
Foarte importante sunt lucrările de întreţinere a hotei. Acestea constau în primul
rând în curăţirea prefiltrelor cu ajutorul unor aspiratoare. Cele mai eficiente sunt cele care
funcţionează fără sac de praf, cu colectarea impurităţilor în apă (tip Rainbow).
În cazul folosirii intense, bateria de filtre trebuie schimbată anual.

Foto 2.17. Măsuţă multietajată cu rotile

În acelaşi timp, se va acorda o atenţie deosebită curăţeniei în camera sterilă. Zilnic


se va spăla podeaua cu apă şi detergenţi specifici, se vor şterge pereţii şi în general, se vor
înlătura orice surse posibile de praf.
La intrarea în camera sterilă se va schimba îmbrăcămintea şi încălţămintea,
aceasta din urmă fiind principala sursă de praf şi agenţi contaminanţi.
Înainte de începerea lucrului cu cel puţin 20-30 de minute, hota se porneşte pentru
a se steriliza interiorul incintei. De asemenea, se pulverizează alcool de 96% pe partea
interioară a acesteia şi pe vasele cu medii sau celelalte materiale care se introduc sub hotă.

34
Capitolul 3
Mediile de cultură şi prepararea lor

Mediul de cultură reprezintă suportul fizic şi chimic necesar pentru creşterea şi


dezvoltarea explantelor in vitro.
Graţie unor cercetări minuţioase efectuate de-a lungul timpului un mare număr de
cercetători au formulat diferite reţete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturi in
vitro la marea majoritate a speciilor vegetale.
Momentul de răscruce în acest domeniu l-a reprezentat anul 1962, când
T. Murashige şi F. Skoog au publicat reţeta de mediu care le poartă numele, realizată iniţial
pentru culturi de ţesuturi de tutun.
Acest mediu a fost apoi preluat cu succes în nenumărate situaţii, la cele mai diferite
specii, fiind în prezent cea mai folosită reţetă de mediu, alături de varianta modificată
Linsmaier&Skoog (LS, 1965). Diferenţa dintre cele două reţete constă în nefolosirea
acidului nicotinic, piridoxinei, glicinei şi creşterea concentraţiei de tiamină la 0,4 mg/l, în
cazul variantei modificate, LS.
Alte reţete de medii larg folosite sunt B5 (Gamborg şi colab. 1968), N6 (Chu,
1978), Nitsch&Nitsch (NN, 1969). Pentru cultura in vitro a speciilor pomicole dar şi a
altor plante lemnoase se folosesc mediile Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW
(Driver&Kuniyuki, 1984) şi WPM Lloyd and McCown, 1980).
Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură sunt:
- să corespundă cerinţelor nutritive şi hormonale ale speciei cultivate pentru faza în
care se găseşte (stabilizare, proliferare, calogeneză, înrădăcinare, etc.);
- să asigure condiţii optime de creştere şi dezvoltare în ceea ce priveşte presiunea
osmotică, pH-ul, umiditatea, etc.
- să fie echilibrat din punct de vedere ionic;
- să nu conţină ioni sau substanţe toxice;
- să fie uşor de preparat şi reproductibil;
- să fie stabil după autoclavare (să-şi menţină neschimbată compoziţia şi
caracteristicile fizico-chimice;

35
- să fie ieftin şi să conţină cât mai puţini constituenţi naturali costisitori şi
neomogeni;
- eventual, să poată fi reciclat.
Mediile folosite la cultura in vitro a explantelor vegetale au în general o structură
complexă, fiind alcătuite dintr-un mare număr de constituenţi de natură diversă şi cu rol
diferit.
Aceşti constituenţi pot să fie grupaţi în:
- constituenţi cu rol nutritiv: elemente minerale: macro şi microelemente şi
elemente organice: zaharuri (ca sursă de carbon), aminoacizi (ca sursă de azot organic) şi
vitamine;
- constituenţi cu rol hormonal fitoregulator al creşterii şi dezvoltării explantelor in
vitro: auxine, citochinine, gibereline şi alte substanţe cu rol stimulator sau inhibitor: acid
abscisic, etilenă, colchicină, paclobutrazol, etc.
- constituenţi cu rol în stabilizarea mediului de cultură: apa, agenţi de solidificare,
stabilizatori osmotici şi de pH, antioxidanţi şi substanţe absorbante.

3.1. Constituenţi cu rol nutritiv


3.1.1. Constituenţi minerali
Substanţele minerale care intră în componenţa mediilor de cultură sunt săruri care
conţin cele 6 macroelemente fundamentale: azotul (N), fosforul (P), potasiul (K), calciul
(Ca), magneziul (Mg) şi sulful (S) precum şi un mare număr de microelemente: fier (Fe),
mangan (Mn), zinc (Zn), aluminiu (Al), bor (B), cupru (Cu), molibden (Mo), sodiu (Na),
cobalt (Co) şi iod (I).
3.1.1.1. Macroelementele
Concentraţia macroelementelor folosite variază în limite destul de largi, în mod
obişnuit, folosindu-se cantităţi de 1-40 mM, respectiv, 300-19.000 mg/l.
Microelementele se folosesc în concentraţii mult mai reduse de ordinul
micromolilor, respectiv 0,0025-0,5 mg/l.
În funcţie de concentraţia molară totală mediile de cultură se împart în trei
categorii:
- medii concentrate (36-50 mM): Murashige & Skoog, Quoirin & Lepoivre, Eriksson, etc.;
- medii cu concentraţie mijlocie (27-35 mM): Nitsch&Nitsch;
- medii cu concentraţie scăzută (7-26 mM): White, Heller;

36
Foarte importantă este compoziţia ionică a mediilor de cultură ştiindu-se că în
soluţie sărurile disociază în ionii componenţi. Trebuie avut în vedere echilibrul acestor ioni
şi posibilitatea de a se combina şi de a forma compuşi toxici greu solubili sau insolubili.
În general toate mediile de cultură conţin următorii ioni: NH4+, K+, Ca2+, Mg2+,
Na+, NO3-, PO43-, SO42-, Cl-.
Prin folosirea preponderentă a sărurilor sub formă de cloruri creşte concentraţia
ionului Cl- care nefiind folosit în nutriţie, are efect toxic asupra explantelor determinând
clorozarea şi ulterior moartea acestora. Efecte similare are şi excesul de sodiu (Na+) din
mediul de cultură.
Dintre macroelemente un rol important este jucat de azot. Acesta este furnizat în
mediul de cultură prin folosirea azotaţilor de amoniu, potasiu, calciu, sodiu, etc.
În soluţie se găseşte atât azot sub formă nitrică (NO3-) cât şi sub formă amoniacală
(NH4+).
Rolul celor două forme de azot este diferit şi uneori cercetările efectuate au scos în
evidenţă rezultate contradictorii. Astfel, într-o primă fază, s.a afirmat că ionul amoniu
(NH4+) ar induce formarea embrionilor somatici la morcov spre deosebire de ionul nitrat
(NO3-) care nu ar avea acest efect (Halperin şi Wetherell 1967, citaţi de Cachiţă, 1987).
Totuşi experienţele lui Reinert şi colab. (1966), au dovedit că este posibilă
obţinerea de embrioni din ţesut de morcov pe un mediu care conţinea numai ioni nitrat
(NO3-).
Important este raportul în care se găsesc cei doi ioni în mediul de cultură. În marea
majoritate a reţelelor folosite, raportul NH4+/NO3- este de 1/2-1/3, putând să ajungă la 1/5.
Azotul are un rol fiziologic deosebit de important, fiind indispensabil în
metabolismul proteic şi glucidic. Lipsa azotului sau carenţa acestuia determină acumularea
antocianilor în vacuole şi moartea rapidă a celulelor.
La salată, absenţa azotatului de amoniu din mediul de cultură a determinat formarea
calusului din cotiledoane fără a se obţine nici un fel de tip de regenerare.
Fosforul are şi el un rol important în metabolismul general al explantelor prin
formarea compuşilor nucleotizi cu valoare energetică ridicată (ADP şi ATP) care
realizează captarea, păstrarea şi eliberarea energiei chimice şi care sunt determinanţi în
biosinteza acizilor nucleici (Neamţiu şi colab. 1989).

37
După azot, cea mai mare pondere o deţine potasiul (K). Acesta s-a dovedit a fi de
neînlocuit datorită rolului pe care-l are în reglarea permeabilităţii membranei celulare şi a
vâscozităţii protoplasmei. Este deosebit de activ în cadrul schimburilor de ioni la nivelul
membranelor celulare şi este cerut în cantităţi mai mari de către explantele tinere la nivelul
cărora determină activarea diviziunii celulare.
Carenţa potasiului se concretizează prin reducerea creşterii sau chiar involuţia
explantelor de tutun. La aceeaşi specie şi la viţa de vie, cultivarea pe medii bogate în
potasiu a avut ca efect stimularea creşterii explantelor (Heller 1947-1953, citat de Cachiţă,
1987).
Calciul este prezent în majoritatea mediilor de cultură sub formă de clorură de
calciu (CaCl2 .2H2O) sau azotatul de calciu (Ca(NO3)2 . 4H2O).
Alături de potasiu, calciul are un rol important în reglarea permeabilităţii
membranelor la nivel celular. Este cunoscut, de asemenea şi rolul antitoxic al calciului.
Având în vedere faptul că este solicitat în cantităţi mai mari în metabolismul
ţesuturilor senescente datorită acumulării în membrane, la culturile meristematice in vitro
nevoile de calciu sunt mult mai reduse.
Totuşi carenţa calciului determină necrozarea apexurilor la lăstarii cultivaţi in vitro
iar lipsa lui duce la moartea celulelor.
Mărirea concentraţiei de calciu din mediu prin adăugarea clorurii de calciu (CaCl2)
trebuie făcută cu discernământ pentru că peste anumite limite se manifestă toxicitatea
ionilor de clor (Cl-).
La cultivarea gutuiului pe un mediu Quiorin & Lepoivre (1977) bogat în calciu
apar uneori simptome de cloroză datorită blocării fierului (Stănică, 1996).
Magneziul intră în compoziţia clorofilei şi carenţa sa determină perturbări
importante în funcţionarea frunzei, ducând în final la moartea explantului.
Relaţia Ca-Mg este foarte strânsă, cele două macroelemente putându-se chiar
substitui în anumite reacţii metabolice.
Sulful intră în compoziţia multor aminoacizi esenţiali şi este nelipsit din mediile de
cultură unde se află în componenţa ionului sulfat (SO42-). Reducerea conţinutului de clor
din mediul de cultură prin înlocuirea clorurilor cu sulfaţi are ca efect o creştere a
concentraţiei sulfului.

38
Anumite medii de cultură sunt foarte bogate în sulf: DKW pentru nuc (Driver şi
Kuniyuki, 1984), Litvay pentru conifere (Litvay şi Johnson, 1981).

3.1.1.2. Microelementele
Microelementele folosite în culturile in vitro sunt în număr mai redus faţă de cele
folosite în soluţiile nutritive complexe iar concentraţiile uzuale sunt asemănătoare pentru
majoritatea mediilor de cultură.
Dintre microelemente, fierul se administrează în cantităţi mai mari. Pentru a fi uşor
asimilabil se foloseşte chelatul de fier (NaFeEDTA) care se pregăteşte din sulfat feros
(FeSO4 . 7H2O) şi sare disodică a acidului etilen- diamino-tetraacetic (Na2EDTA . 2H2O).
Raportul dintre cei doi compuşi trebuie să fie de 1:2 adică, pentru 100 µM FeSO4 . 7H2O,
trebuie să se dizolve 200 µM de Na2EDTA.2H2O. Concentraţia uzuală a ionului Fe2+ este
în jur 100 µeq.
Excesul de fier bivalent (Fe2+) determină oxidarea acestuia la fier trivalent (Fe3+) şi
formarea de fosfat feric care precipită şi creşte turbiditatea mediului de cultură.
Fierul este catalizatorul multor procese redox şi are rol esenţial în fotosinteză, în
activitatea citocromilor respiratori şi în sinteza proteică.
Carenţa fierului se manifestă prin clorozarea ţesuturilor verzi şi blocarea
diviziunilor celulare în ţesuturile meristematice.
Manganul participă la o serie de activităţi enzimatice iar la conifere s-a dovedit că
poate înlocui într-o anumită proporţie, magneziul (Clarkson şi colab., 1980, citat de Enescu
V. şi colab. 1994). Are de asemenea un rol important în sinteza proteică.
Carenţa manganului determină blocarea sintezei ARN-ului în rădăcinile de mazăre.
Zincul este implicat în sinteza auxinei, a ARN-polimerazei şi a unor
dehidrogenaze. Lipsa acestuia determină dereglări în sinteza triptofanului (precursor al
auxinei endogene), îngălbenirea şi necroza ţesuturilor tinere.
Aluminiul folosit numai în anumite medii de cultură (Heller) în cantităţi foarte
mici are rol de catalizator al unor reacţii biochimice.
Borul este utilizat sub formă de acid boric (H3BO3) în concentraţii relativ ridicate
(1-10 mg/l). Rolul său preponderent se referă la reglarea proceselor de diviziune celulară şi
creştere.
Carenţa de bor se manifestă prin brunificarea şi necrozarea ţesuturilor.

39
Cuprul participă la multe reacţii redox şi este foarte important în embriogeneză. Se
foloseşte sub formă de sulfat de cupru (CuSO4 . 5 H2O) în concentraţii de 0,025 mg/l (0,1
mM).
Molibdenul se pare că are un rol important în activitatea nitrat-reductazei. Alături
de iod intră în componenţa unor enzime şi participă la procesele nutriţionale ale
explantelor.
Cobaltul este folosit în concentraţii foarte scăzute sub formă de clorură de cobalt
(CoCl2 . 6H2O). Rolul său în metabolismul ţesuturilor vegetale in vitro este necunoscut, ca
de altfel cel al nichelului.

3.1.2. Constituenţi organici


3.1.2.1. Carbohidraţii
Carbohidraţii (zaharurile) sunt folosite în culturile in vitro ca sursă de carbon şi
energie, dat fiind faptul că explantele cultivate în astfel de condiţii au o nutriţie
preponderent heterotrofă.
Prin hidrolizarea carbohidraţilor celulele vegetale îşi procură cantitatea de energie
necesară desfăşurării proceselor vitale. Trebuie spus că glucidele produse prin fotosinteză
in vitro de către ţesuturile verzi nu satisfac nici pe departe nevoile energetice globale ale
acestora şi nevoia de componenţi structurali cum ar fi unele polizaharide (celuloza şi
amidonul).
Dintre zaharuri cel mai mult folosită este zaharoza în concentraţie de 2-3%. La
unele specii (Malus robusta) s-a folosit cu rezultate bune sorbitolul, în timp ce glucoza a
fost folosită tot la specii lemnoase în concentraţie de 3%. În diferite experimente s-au
folosit şi alte glucide cum ar fi: fructoza, maltoza, rafinoza sau chiar dextrina şi amidonul.
În cantităţi crescânde de la 1% la 3%, zaharoza a stimulat creşterea explantelor de
morcov (Gautheret, 1959), iar reducerea concentraţiei la 2-3%, a determinat alungirea
lăstarilor la pin, molid şi larice (Aitken, J. şi colab. 1981, citaţi de Enescu V. şi colab.
1994).
Trebuie precizat şi rolul important pe care îl au carbohidraţii în echilibrarea
presiunii osmotice a mediului de cultură. Creşterea concentraţiei de zaharoză peste anumite
limite are ca efect creşterea presiunii osmotice şi plasmolizarea celulelor explantelor.

40
O serie de cercetători au pus problema faptului că mediile de cultură artificiale prin
concentraţia ridicată de carbohidraţi exercită o presiune osmotică "nenaturală" asupra
explantelor. De aici necesitatea unor studii privind posibilităţile de reducere a cantităţilor
de carbohidraţi din mediile de cultură precum şi găsirea altor substanţe cu rol similar
(ESNA WG4, Buşteni, 1996).

3.1.2.2. Aminoacizii
Aminoacizii sunt folosiţi în mediile de cultură şi ca surse suplimentare de azot
organic. Pe lângă aceasta s-a dovedit că ei au rol în diferite procese inductive.
Dintre aminoacizi, glicina este cel mai des folosită. Încă din 1939, White a subliniat
că glicina stimulează creşterea rădăcinilor de tomate (Cachiţă, 1987).
Gautheret (1959), de asemenea, subliniază rolul aminoacizilor în formarea
calusului. Alţi aminoacizi ca glutamina, arginina şi prolina stimulează proliferarea
calusului la pin (David H. şi colab. 1984).
S-a constatat că în cazul folosirii aminoacizilor, izomerii levogiri (L) sunt mai
eficienţi decât cei dextrogiri (D).
Dozele de folosire a aminoacizilor variază de la 2 mg/l pentru glicină, la 10 mg/l
pentru L-arginină şi cisteină şi până la 100 mg/l pentru asparagină şi L-tirozină.

3.1.2.3. Vitaminele
Vitaminele sunt substanţe organice cu rol catalitic indispensabile creşterii şi
dezvoltării explantelor in vitro.
Termenul de vitamină - amină vitală, a fost introdus pentru prima dată de către
Casimir Funk în 1911 şi ilustrează plastic importanţa deosebită pe care acest grup de
substanţe o are pentru organismele vii.
Spre deosebire de plantele din natură, ţesuturile şi organele cultivate in vitro nu au
capacitatea de a-şi sintetiza întreaga gamă de vitamine necesare desfăşurării în bune
condiţiuni a metabolismului.
La începuturile culturilor in vitro s-a constat că prin adăugarea în mediul de cultură
a unor substanţe naturale bogate în vitamine (lapte de cocos, sucuri de tomate şi banane,
extract de endosperm de cereale, lapte de porumb, extracte de drojdie)are loc stimularea
creşterii explantelor.

41
Ulterior o serie de cercetători au realizat reţete proprii de vitamine prin combinarea
în diferite proporţii a vitaminelor cunoscute.
Trebuie precizat că majoritatea vitaminelor folosite sunt termosolubile iar prin
autoclavare are loc descompunerea acestora. Uneori produşii rezultaţi au la rândul lor un
efect favorabil asupra culturilor (Hoza D., 1996).
Ideal ar fi ca amestecurile de vitamine să se poate adăuga după autoclavarea
mediului folosind filtrarea sterilă. Pentru mediile solide acest lucru este însă neaplicabil,
fiind greu să se obţină difuzia vitaminelor în masa mediului.
Principalele vitamine folosite la prepararea mediilor de cultură sunt folosite solitare
sau, mai frecvent, în combinaţii mai mult sau mai puţin complexe.
Tiamina (vitamina B1, aneurina) este nelipsită din majoritatea reţetelor de vitamine
în concentraţii care variază de la 0,1 mg/l la amestecul de vitamine MS
(Murashige&Skoog), la 0,4 mg/l la amestecul Walkey 1 şi 2 până la 5 mg/l la amestecul
SH (Shenk şi Hidelbrandt), respectiv 10 mg/l la amestecul B5 (Gamborg).
În toate cazurile, agentul solubilizant al tiaminei este acidul clorhidric.
Acţiunea fiziologică a tiaminei constă în stimularea creşterilor vegetative şi deci
sporirea biomasei produse in vitro.
Piridoxina (vitamina B6) este de asemenea prezentă în marea majoritate a mediilor
de cultură. Concentraţiile folosite variază în general între 0,1-1 mg/l, folosindu-se şi de
această dată, ca agent de dizolvare acidul clorhidric. Se ştie că piridoxina este precursorul
unor coenzime importante catalizând reacţii de bază în metabolismul aminoacizilor.
Riboflavina (vitamina B2) este folosită doar în amestecurile de vitamine mai
complexe (ex. Jacquillot) în concentraţii de 0,1-1,0 mg/l. Este rezistentă la temperaturile
ridicate (se descompune la 280°C) şi la oxidanţi dar este sensibilă la radiaţiile U.V. Se
pare că acţionează ca inhibitor al creşterii rădăcinilor şi are rol important în metabolismul
celular.
Acidul pantotenic (vitamina B5) este mai puţin utilizat ca atare. Gautheret (1945)
precizează că acidul pantotenic stimulează creşterea calusului la salcie. O serie de
cercetători au folosit însă cu succes pantotenatul de calciu în concentraţii de 0,5-2,5 mg/l.
Acesta, este stabil termic până la temperaturi de 200°C şi nu este fotolabil.

42
Cobalamina (vitamina B12) este mai rar folosită. În epoca de pionierat a culturilor
in vitro Reinert şi White (1956) citaţi de Gautheret (1959) au folosit-o cu bune rezultate la
creşterea ţesuturilor tumorale. Vitamina B12 stimulează sinteza nucleoproteidelor.
Acidul nicotinic (vitamina B3, niacina) aproape nelipsit din mediile de cultură,
este rezistent la temperaturi înalte (punct de topire 234-237°C). Este solubil în apă şi se
foloseşte în concentraţii de 0,5-5,0 mg/l. Are rol esenţial în metabolismul intermediar, în
reacţiile de oxido-reducere fiind component al dehidrogenazelor (NAD+ şi NADP+).
Biotina (vitamina H) este folosită în concentraţii reduse (0,1 mg/l). În soluţii acide
sau neutre este stabilă dar se descompune prin încălzire. Are rol de coenzimă intervenind
în numeroase procese metabolice. Stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi
proliferarea celulelor.
Acidul folic, folosit în concentraţii mici (0,01 mg/l în amestecul Jacquiot) are efect
stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină. Acest lucru s-ar datora descompunerii sale
în acid para amino-benzoic. La întuneric acidul folic are efect toxic.
Acidul para aminobenzoic, întâlnit în câteva amestecuri complexe de vitamine, se
foloseşte în concentraţii de 1,0 mg/l. Este coenzima tirozinazei şi stimulează biosinteza
acidului pantotenic şi a biotinei.
Acidul ascorbic (vitamina C) se foloseşte în concentraţii ridicate (1,0-100,0
mg/l) de regulă ca agent antioxidant al polifenolilor eliminaţi de anumite specii la cultura
in vitro: stejar, măr, dafin (Stănică şi colab. 1994), fistic, etc.
Prin autoclavare, vitamina C se distruge în bună parte. Rolul fiziologic al vitaminei
C este complex, fiind un activator general al metabolismului celular.
Vitamina E (tocoferolul) favorizează reacţiile de fosforilare şi formare a
compuşilor macroergici, participând la numeroase sinteze enzimatice. În culturile in vitro,
vitamina E măreşte sensibilitatea celulelor la auxine (Enescu V. şi colab., 1994).
Inozitolul (mio-inozitol, mezo-inozitol, m-inozitol, hexahidroxi-ciclohexan) este
un aditiv esenţial al mediilor de cultură fiind considerat de unii autori, vitamină, iar de
către alţii, glucid.
Se foloseşte de regulă în concentraţii de 100 mg/l dar se cunosc şi situaţii când a
fost folosit în concentraţii de până la 1000 mg/l.
Deşi nu se cunoaşte prea bine rolul fiziologic al inozitolului, se pare că acesta ar
stimula diviziunea celulară. Folosit în concentraţii mari (250 mg/l) a stimulat creşterea

43
calusului de Fraxinus pensylvanica (Wolter K.E. şi Skoog F. 1966, citaţi de Enescu V şi
colab. 1994).
Aditivii naturali, folosiţi la început ca substanţe complexe stimulatoare în culturile
in vitro (lapte de cocos, malţ, extracte din fructe, drojdie, endosperm, etc.), au fost
abandonaţi între timp. Acest lucru se datorează faptului că era imposibil de a se obţine o
compoziţie constantă a produselor respective, care să permită repetabilitatea mediilor de
cultură.
Un alt aditiv natural este cazeina hidrolizată, care nu este altceva decât un
complex de aminoacizi, putând fi încadrată în rândul substanţelor folosite ca sursă de azot
organic. Este folosită în concentraţii de 250 mg/l.

3.2. Constituenţi cu rol fitoregulator


Hormonii vegetali, regulatorii de creştere, stimulatorii sau substanţele de creştere
sunt compuşi organici, sintetizaţi de către plante în cantităţi foarte mici. Aceşti compuşi
stimulează, inhibă sau modifică creşterea şi dezvoltarea unor organe.
La plantele in vitro fitohormonii endogeni produşi de către explante sunt completaţi
şi complexaţi cu hormoni exogeni introduşi în mediul de cultură.
În funcţie de scopul urmărit se aleg tipurile de hormoni şi concentraţia optimă şi se
determină astfel, sensul evoluţiei explantului respectiv, ca rezultantă a acţiunii concertate a
acestora.
Istoria descoperirii hormonilor de creştere este oarecum paralelă cu cea a culturilor
in vitro. Descoperirea hormonilor şi studierea efectului lor asupra creşterii şi dezvoltării
plantelor a modificat radical evoluţia cercetărilor in vitro.
Primul care a intuit faptul că în plante ar exista substanţe care să controleze
metabolismul acestora a fost Charles Darwin. Abia în anul 1931 Kögl şi Haagen-Smit au
izolat din urina umană o substanţă pe care au denumit-o “auxina A”. Aceeaşi cercetători şi
folosind aceeaşi sursă au purificat apoi (1934) o altă substanţă denumită hetero-auxina,
care s-a dovedit a fi de fapt acidul α indolil acetic (AIA).
Ulterior, la sfârşitul anilor ‘30, Gautheret, Nobecourt şi White au studiat rolul pe
care îl are auxina în creşterea ţesuturilor in vitro.
Prima citochinină izolată a fost chinetina (6 furfurilaminopurina) obţinută din
spermă de heringi de către Miller şi colab. (1955). Doi ani mai târziu, Skoog şi Miller au

44
publicat date despre efectul raportului citochinină/auxină asupra proceselor de
organogeneză.
După descoperirea şi izolarea primilor hormoni de creştere s-a trecut la etapa
următoare de sinteză a noi compuşi cu structură şi efect fiziologic asemănător.
În prezent, se cunosc cinci grupe mari de hormoni de creştere: auxine, citochinine,
gibereline, acid abscisic şi etilena.

3.2.1. Auxinele
Auxinele sunt, în marea lor majoritate, compuşi naturali sintetizaţi de către plante şi
acumulaţi în diferite organe, în concentraţii reduse. Auxinele sunt prezente mai ales în
mugurii terminali, frunze tinere şi vârfuri de lăstari. Paralel cu izolarea compuşilor auxinici
naturali s-au realizat compuşi de sinteză cu acţiune asemănătoare ca derivaţi ai iodului,
naftalenului, acidului fenoxiacetic şi acidului benzoic.
Acţiunea auxinelor este deosebit de complexă:
- intervin în procesele de diviziune şi elongaţie a celulelor, în concentraţii mici
stimulând diviziunea celulară, iar în concentraţii mari, alungirea;
- modifică permeabilitatea membranelor celulare modificându-le în acelaşi timp,
alte caracteristici fizice şi chimice;
- influenţează pozitiv sinteza proteică prin stimularea sintezei ARN-ului ribozomal;
- controlează procesele de dominanţă apicală, determinând inhibarea activităţii
mugurilor axilari;
- stimulează procesele de calusare şi ulterior determină formarea rădăcinilor.
- în doze ridicate determină apariţia de hipertrofii (simple deformări) sau
hiperplastii (tumori)
Principalele auxine folosite în culturile in vitro sunt prezentate în tabelul 3.2.1.
Sunt prezentate de asemenea, substanţele folosite pentru dizolvarea şi diluarea acestora,
temperaturile de păstrare şi limitele concentraţiilor uzuale.

45
Tabelul 3.2.1.
Principalele auxine folosite în culturile in vitro
Masă Păstrare Păstrare Conc.
Specificaţie Solvent Diluant
molec. produs soluţie mg/l
AIA etanol
Acid β 175,2 NaOH 0°C 0°C 0,01-3,0
indolilacetic 1N apă
AIA-L- Acid 290,3 NaOH apă 0°C 0°C 0,01-5,0
aspartic 0,5N
AIA-L- Alanină 246,3 NaOH apă 0°C 0°C 0,01-5,0
0,5N
AIA-L- Fenil- 322,4 NaOH apă 0°C 0°C 0,01-5,0
alanină 0,5N
AIA-L- Glicină 232,2 NaOH apă 0°C 0°C 0,01-5,0
0,5N
IBA etanol
Acid 203,2 NaOH apă - -0°C 0,1-10,0
indolilbutiric 1N
K-IBA
Acid indolil- 241,3 apă - 0-5°C 0-5°C 0,1-10,0
butiric, sare de K
ANA NaOH
Acid α naftilacetic 186,2 1N apă temp. 0-5°C 0,1-10,0
cam.
4-CPA
Acid 4 clor- 186,6 etanol apă temp. 0-5°C 0,1-10,0
fenoxiacetic cam.
Dicamba
Acid 2 metoxi- 221,0 etanol/ apă 0-5°C 0-5°C 0,01-10,0
3,6-diclorbenzoic apă
2,4-D etanol
Acid 2,4 diclor- 221,0 NaOH apă temp. 0-5°C 0,01-5,0
fenoxiacetic 1N cam.
2,4,5 T
Acid 2,4,5 triclor- 255,5 etanol apă temp. 0-5°C 0,01-5,0
fenoxiacetic cam.
Picloram
Acid 4-amino- 241,5 DMSO* apă temp. 0-5°C 0,01-10,0
3,5,6-tricloro- cam.
picolinic
* DMSO – dimetilsulfoxid

Aşa cum rezultă din tabelul 3.2.1. solvenţii folosiţi pentru dizolvarea auxinelor sunt
etanolul şi hidroxidul de sodiu (NaOH) 0,5-1,0 N. Temperaturile de păstrare a substanţelor
şi respectiv a soluţiilor stoc sunt prezentate în acelaşi tabel.
Stabilitatea auxinelor variază destul de mult. Astfel, AIA şi o bună parte din restul
auxinelor, sunt fotolabile, în timp ce ANA şi 2,4 D sunt mai stabile.

46
3.2.2. Citochininele
Citochininele sunt substanţe deosebit de active, cu rol fitoregulator al proceselor de
creştere şi dezvoltare la plante.
Prima citochinină descoperită (Skoog, 1956) a fost izolată din spermă de heringi şi
denumită chinetină (6-furfuril-amino-purină). Aproximativ în aceeaşi perioadă s-a
descoperit rolul stimulator al laptelui de cocos asupra formării de noi plantule in vitro.
Ulterior s-a constatat că acest lucru se datorează faptului că laptele de cocos era bogat în
citochinine naturale.
Efectele citochininelor asupra explantelor cultivate in vitro sunt multiple:
- stimulează diviziunea celulară;
- au rol esenţial în formarea şi creşterea lăstarilor;
- au rol important în procesele de regenerare adventivă a lăstarilor (organogeneză
directă);
- formarea rădăcinilor este în general inhibată sub acţiunea citochininelor;
- stimulează de asemenea formarea lăstarilor axilari şi creşterea ratei de
multiplicare;
- întârzie procesele de senescenţă şi determină creşterea conţinutului de clorofilă în
explante.
Acţiunea citochininelor se corelează cu cantitatea de auxine prezente în mediu.
Astfel spus, este esenţial raportul auxine:citochinine în determinarea şi reglarea unor
procese vitale de creştere şi dezvoltare a explantelor.
Principalele citochinine şi substanţe cu efect similar folosite în culturile in vitro
sunt prezentate în tabelul 3.2.2.
Dintre acestea BAP (6 benzil-amino-purină) sau BA (benziladenina) este cel mai
mult folosită.
Zeatina, produs bioactiv izolat din porumb, are o activitate fitoregulatoare
importantă. La actinidia a stimulat formarea unui număr mare de lăstari adventivi din
explante de rădăcină, internod, frunză (organogeneză directă) şi calus (organogeneză
indirectă).
Efecte asemănătoare are şi 2 iP (2 izopentiladenina), DPU (difenil ureea),
tidiazuronul (1 fenil-3-(1,2,3, tiadiazolpentil) uree), CPPU (N-2-cloro 4 piridil N-fenil-
urea), care la fel ca şi zeatina sunt substanţe foarte costisitoare.

47
Toţi aceşti derivaţi ai fenil-ureei determină lăstărirea adventivă puternică la diferite
tipuri de explante şi specii, efectul fiind mult mai puternic decât al citochininelor “clasice”,
chiar la concentraţii inferioare.
Datorită efectelor spectaculoase a devenit chiar o modă folosirea tidiazuronului în
cercetări cât se poate de diverse.
Există şi autori (Horgan, 1986) citat de Pierik (1987) care susţin că derivaţii fenil-
ureei (DPU) inhibă de fapt activitatea citochinin oxidazei şi în acest fel concentraţia
citochininelor rămâne ridicată iar activitatea este mai intensă.
Adenina a fost folosită pentru prima dată de Skoog şi Tsui în 1948, observându-se
efectul de stimulare a formării lăstarilor adventivi pe explante de tulpină de tutun.
Concentraţia la care este folosită variază destul de mult între 2-120 mg/l. Frecvent adenina
este înlocuită cu hemisulfatul de adenină care este mult mai solubil în apă.
Sunt prezentate de asemenea, substanţele folosite pentru dizolvarea şi diluarea
acestora, temperaturile de păstrare şi limitele concentraţiilor uzuale.
Tabelul 3.2.2.
Principalele citochinine folosite în culturile in vitro
Masă Păstrare Păstrare Conc.
Specificaţie Solvent Diluant
molec. produs soluţie mg/l
Adenină 135,1 apă Na temp. 0-5°C 50-250
cam.
Adenină 184,2 apă Na temp. 0-5°C 50-250
sulfat cam.
BAP (BA)
6-Benzil- 225,3 NaOH apă temp. 0-5°C 0,1-5,0
aminopurină 1N cam.
(Benziladenină)
BAR
Benzilamino- 357,4 NaOH apă 0°C 0°C 0,01-5,0
purină ribozid 1N
BPA
N-benzil-9- 309,4 NaOH apă 0°C 0°C 0,1-5,0
(2-tetrahidro- 1N
piranil)-adenină
Chinetină
6 furfuril- 215,2 NaOH apă 0°C 0°C 0,1-5,0
aminopurină 1N
KR 347,3 NaOH apă 0-5°C 0-5°C 0,01-5,0
Chinetină ribozid 1N
4 CPPU
N-2-clor-4- 247,7 DMSO* apă 0-5°C 0-5°C 0,001-0,1
piridil-N-
feniluree
DPU 212,3 DMSO apă temp. 0-5°C 0,1-1,0
Difeniluree cam.

48
Tabelul 3.2.2. continuare
Specificaţie Masă Solvent Diluant Păstrare Păstrare Conc.
molec. produs soluţie mg/l
2 iP
2 izopentil- 203,2 NaOH apă 0°C 0°C 1,0-30,0
adenină 1N
2 iPR
2 izopentil- 335,4 NaOH apă 0°C 0°C 0,01-10,0
adenină ribozid 1N
Specificaţie Masă Solvent Diluant Păstrare Păstrare Conc.
molec. produs soluţie mg/l
Tidiazuron
1 fenil-3-(1,2,3- 220,2 DMSO apă temp. 0-5°C 0,001-
tidiazolpentil) cam. 0,05
uree
Zeatină 219,2 NaOH apă 0°C 0°C 0,01-5,0
1N
* DMSO – dimetilsulfoxid

3.2.3. Giberelinele
Giberelinele sunt substanţe hormonale mai puţin folosite în culturile in vitro.
Prima giberelină a fost descoperită în 1926 de către Kurosawa ca produs al
ciupercii Giberella fujikuroi. În prezent se cunosc un număr mare de gibereline
(aproximativ 50) notate cu GA1…….GAn.
Dintre acestea cel mai mult folosit este acidul giberelic – GA3 (tabelul 3.2.3). Prin
autoclavare, 90% din activitatea biologică a GA3 se pierde, motiv pentru care este nevoie
ca sterilizarea acestuia să se facă prin filtrare.
Rolul fiziologic al giberelinelor nu este pe deplin cunoscut. Se ştie că ele au ca
efect:
- stimularea alungirii lăstarilor, fiind recomandate în acest sens după stabilizarea
culturii de meristeme pentru formarea noilor lăstari;
- înlăturarea dormansului la seminţe şi embrioni şi stimularea germinării;
- reglarea formării auxinelor endogene;
- controlul proceselor de formare a florilor dar şi a fructelor partenocarpice etc.;
- inhibarea formării lăstarilor şi rădăcinilor adventive.

49
Tabelul 3.2.3.
Gibereline şi alţi fitoregulatori folosiţi în culturile in vitro
Masă Păstrare Păstrare Conc.
Specificaţie Solvent Diluant
molec. produs soluţie mg/l
GA3 - Acid 246,4 etanol apă temp. 0-5°C 0,01-5,0
giberelic cam.
ABA - Acid 264,3 NaOH apă 0°C 0°C 0,1-10,0
abscisic 1N
Acid t-cinamic 148,2 etanol/ac apă temp. 0-5°C 0,1-10,0
etonă cam.
Acid succinic 160,2 apă Na 0-5°C 0-5°C 0,1-10,0
Floro-glucinol 126,1 apă Na temp. 0-5°C <162,0
cam.
Triacontanol 438,8 eter/ apă 0-5°C 0-5°C
benzen
Colchicină 399,4 apă Na temp. 0-5°C
cam.

3.2.4. Alte substanţe cu rol fitoregulator


Pe lângă auxine, citochinine şi gibereline se cunosc o gamă largă de substanţe cu
rol fitoregulator, dintre care o bună parte sunt folosite şi în culturile in vitro.
În tabelul 3.2.3. se prezintă câteva dintre aceste substanţe.
Acidul abscisic este cunoscut ca inhibitor al creşterii şi dezvoltării plantelor,
determinând intrarea acestora în repaus.
Folosirea lui la culturile in vitro este limitată datorită efectelor negative pe care le
are. Există totuşi situaţii când, utilizat în concentraţii reduse, poate regla creşterea şi
dezvoltarea explantelor în primele faze ale embriogenezei somatice.
Etilena este produsă de celulele, ţesuturile şi organele cultivate in vitro. În mod
normal nu se folosesc tehnici prin care acest gaz (C2H4) să fie introdus din exterior în
vasele de cultură.
Problema care se pune însă este tocmai reducerea cantităţii de etilenă care se
acumulează în atmosfera vaselor de cultură prin folosirea unor sisteme de închidere care să
permită difuzia acesteia în exterior.
Efectele etilenei în cele mai multe situaţii sunt negative:
- determină oprirea creşterii explantelor;
- induce fenomenul de senescenţă şi determină căderea frunzelor;
- determină inhibarea procesului de embriogeneză somatică.
Există totuşi numeroase studii care au dovedit că etilena poate stimula anumite
procese biologice sau că, creşterea concentraţiei de etilenă din vasele de cultură a coincis

50
cu inducţia sau stimularea acestora. Astfel, se ştie că după divizarea calusului cantitatea de
etilenă produsă este mai mare.
La calusul de tutun odată cu creşterea concentraţiei de etilenă la lumină, a avut loc
şi formarea de lăstari adventivi (organogeneza indirectă).
La explantele de bulbi de crin prin creşterea concentraţiei de etilenă s-a stimulat
diferenţierea de bulbi adventivi (organogeneza directă). De asemenea, prin mărirea
concentraţiei de CO2 şi etilenă s-a constatat o creştere a numărului de lăstari adventivi pe
cotiledoane de Pinus radiata.
Se pare că o anumită concentraţie de etilenă este necesară şi pentru inducţia
diviziunii în suspensiile celulare la Acer. Se cunoaşte că etilena este implicată în
transportul auxinelor. Totodată, 2,4 D induce formarea etilenei în timp ce azotatul de
argint, poate fi folosit pentru inhibarea sintezei de etilenă.
Acidul 2 cloretilfosfonic (ACEP) se descompune în etilenă şi acid fosforic. În
horticultură este folosit sub denumirea comercială de Ethrel sau Ethephon cu 40%
substanţă activă.
Cercetările privind efectele ACEP asupra culturilor in vitro sunt numeroase
(Cachiţă, 1987). În general această substanţă este folosită în mediul de cultură pentru rolul
de precursor de etilenă pe care îl are.
Folosind ACEP în culturile de meristeme la garoafe în concentraţii de 0,1 şi 1,0
mg/l s-a observat formarea unui mare număr de muguri dintr-un singur meristem (Cahiţă,
1987). Efecte stimulatoare au fost observate de către aceeaşi autoare la minibutaşii de
crizanteme, gerbera, cartof şi protocormul de Cymbidium.
Floroglucinolul este un compus fenolic folosit de regulă ca inhibitor al auxin
oxidazei (AIA-oxidazei). Aplicat împreună cu auxinele determină stimularea formării
rădăcinilor adventive datorită efectului sinergic care apare. În lipsa auxinelor,
floroglucinolul stimulează formarea lăstarilor adventivi.
Colchicina se foloseşte în special atunci când se urmăreşte mărirea gradului de
ploidie prin dublarea numărului de cromozomi.
Amestecurile de substanţe de origine vegetală au fost folosite mai frecvent la
începuturile perioadei moderne a culturilor in vitro.
Amestecuri ca: laptele de cocos, sucul de tomate, portocale, ananas, seva de
mesteacăn, piureul (praful) de banane, extractele de drojdie, de endosperm de cereale etc.,

51
au dovedit efecte stimulatoare asupra creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro datorită
compoziţiei complexe pe care le au.
Principalul inconvenient pe care îl prezintă aceste amestecuri este compoziţia
variabilă de la caz la caz, fapt care face ca rezultatele obţinute să nu fie repetabile în alte
condiţii.
Firmele producătoare oferă astfel de amestecuri condiţionate sub formă de praf,
suspensii sau soluţii. De exemplu, pudra de banane poate fi folosită în concentraţii de 40
g/l, în timp ce laptele de cocos în concentraţii de 5-20%.
Laptele de cocos poate fi obţinut şi în laborator printr-o pregătire sumară după
extragerea din nuci. Astfel, după o prealabilă filtrare se face sterilizarea acestuia prin
autoclavare timp de 15 minute la 121°C. Se lasă apoi să se răcească şi a doua zi este din
nou filtrat şi păstrat, până în momentul folosirii, în congelator la –20°C. Eventualele
proteine care precipită sunt îndepărtate ulterior prin filtrare.

3.3. Constituenţi cu rol stabilizator


3.3.1. Apa
Apa este unul dintre componenţii cei mai importanţi ai mediilor de cultură, ea
reprezentând în jur de 95% din volumul acestora. Element vital, apa mediază majoritatea
proceselor metabolice care au loc în explantele cultivate in vitro.
În vasele de cultură, apa urmează un circuit relativ închis, în sensul că este
preluată de către explante, eliminată prin transpiraţie în atmosferă, se condensează în bună
parte pe pereţii vaselor sau la suprafaţa mediului şi reintră în circuit.
Condensarea apei pe capace şi pe pereţii vaselor de cultură este mai accentuată în
camerele de creştere în care poliţele rafturilor sunt încălzite de lămpile fluorescente aflate
dedesubt (în caz de izolare necorespunzătoare).
Pierderile de apă din vasele de cultură sunt ceva mai mari în camerele de creştere
neclimatizate şi cu umiditatea aerului redusă. În acest caz, se constată în timp o
deshidratare a mediului vizibilă prin scăderea pronunţată de volum şi apariţia de crăpături
în mediu.

52
Acest lucru este cu atât mai periculos cu cât, în
paralel, are loc creşterea concentraţiei în săruri şi zaharuri
a mediului şi deci creşterea presiunii osmotice a
mediului.
Apa folosită pentru prepararea mediilor de
cultură trebuie să fie în mod obligatoriu distilată. Mai
mult, se recomandă folosirea apei bidistilate care prezintă
un grad de puritate superior. Distilarea trebuie făcută în
distilatoare din sticlă (tip Pyrex) întru-cât distilatoarele
metalice pot elibera diferiţi ioni (Cu2+, Pb2+) în procesul
de distilare (foto 3.1.).
Chiar distilatoarele din sticlă trebuie spălate
foarte bine când sunt noi şi de regulă, apa rezultată din
Foto 3.1. Aparat din sticlă primele 2-3 distilări nu se foloseşte.
pentru bidistilarea apei
În timpul exploatării, periodic, se va proceda la
spălarea cu acurateţe a distilatorului cu apă deionizată.
Apa deionizată se obţine cu ajutorul unor aparate speciale numite deionizatoare,
prevăzute cu cartuşuri filtrante speciale care reţin ioni existenţi în apa de robinet.
Pentru o deionizare mai eficientă debitul de apă lăsat să treacă prin deionizator
trebuie să fie cât mai mic posibil. Se impune, de asemenea, înlocuirea periodică a filtrelor.
Trebuie spus că pe lângă deionizare şi distilare, există şi alte procedee de
purificare a apei, cum ar fi de exemplu, osmoza inversă. Ideal este însă să se combine toate
cele trei proceduri.
Atunci când se ştie că apa de la reţea este încărcată cu ioni de tot felul (Pb2+, Ca2+,
Mg2+ etc.), chiar cu germeni, sau că ea provine din foraje şi este bogată în săruri, se
recomandă ca la intrarea în laborator să se monteze o instalaţie de filtrare. O astfel de
instalaţie presupune montarea unei baterii de cartuşe filtrante alese în funcţie de
compoziţia chimică a apei şi conţinutul acesteia în suspensii, germeni etc. Există filtre
pentru săruri de Ca, de Mg, filtre cu cărbune pentru germeni, etc.
Pe lângă faptul că intră în componenţa mediilor de cultură, apa mai este folosită în
procesul de sterilizare a materialului vegetal înainte de inoculare.
În acest scop se foloseşte apa bidistilată care se autoclavează în prealabil şi care se
foloseşte la clătirea materialului vegetal după dezinfecţia cu diferiţi agenţi sterilizanţi.

53
De asemenea după clătire, explantele rămân în recipiente cu apă distilată sub hotă
până în momentul inoculării.
Atunci când se lucrează cu explante provenite de la specii care emit uşor fenoli se
recomandă dizolvarea în apă distilată sterilă a unor substanţe antioxidante. Frecvent se
foloseşte polivinilpirolidona (PVP) în concentraţie de 0,1%.
În încheiere trebuie precizat că apa deioniozată şi bidistilată produsă în laborator
trebuie păstrată în recipiente din plastic etichetate şi închise. Sticla obişnuită nu se
recomandă pentru că ea elimină ioni nedoriţi de plumb, sodiu, arsenic, etc.

3.3.2. Agenţii de solidificare


Mediile de cultură folosite pentru creşterea explantelor in vitro se pot realiza sub
formă lichidă sau solidă (de fapt semisolidă).
Mediile solide necesită adăugarea unor agenţi de solidificare care leagă apa şi
absorb celelalte componente ale mediului.
Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un bun agent de solidificare sunt:
- să fie inert şi să nu fie contaminat; să permită circulaţia (difuzia) substanţelor
minerale, apei, gazelor; să fie stabil după autoclavare; să aibă un punct de
solidificare scăzut; să fie ieftin; eventual, să poată fi recuperat şi refolosit.
Dintre agenţii de solidificare, agarul este cel mai larg folosit la culturile in vitro şi
nu numai.
Agarul este un polizaharid obţinut din alga roşie Gelidium amansii care trăieşte în
Oceanul Indian şi Marea Chinei.
Se prezintă sub formă unei pulberi galbenă murdară care se topeşte în apă la o
temperatură apropiată de 100°C, soluţia devenind translucidă şi se întăreşte la o
temperatură de 32-35°C. Se foloseşte în concentraţie de 0,6-1,0%. Cel mai bun agar este
cel produs de firma Difco Bacto (Noble agar). Există şi sortimente speciale cum ar fi
agarul bacteriologic, agarul tip A, E, M, agarul purificat, agarul spălat, folosite în lucrări
speciale de microbiologie, culturi de celule şi protoplaşti.
În lipsa agarului pulvis se poate folosi şi agarul sub formă de solzi sau plăci care
trebuie înmuiat în apă şi spălat repetat cu apă bidistilată, întru-cât este mai puţin pur.
Agaroza este formată tot din coloizi marini, prezintă un grad înalt de purificare şi
este folosită pentru culturi de protoplaşti sau de celule. Gelifică la mai puţin de 30°C (26-
30°C) fiind utilizată la prepararea mediilor cu compuşi termolabili.

54
Acidul alginic este un acid poliuronic (acidul anhidro β-D-manuronic) care are
capacitatea de a se gelifica. Este ideal pentru culturi de protoplaşti şi suspensii celulare dar
şi pentru încapsularea embrionilor somatici sau a explantelor de diferite feluri în vederea
obţinerii seminţelor artificiale. Soluţiile apoase de acid alginic se gelifică la temperatura
camerei în prezenţa unor cationi (în special a calciului). Lichefierea mediului gelificat se
poate realiza prin adăugarea unor agenţi de chelatare (ex. citraţii).
Formarea capsulelor de alginat pentru încapsularea protoplaştilor sau embrionilor
somatici se face prin adăugarea în prealabil a acidului alginic (1,75-4,00%) într-o soluţie
cu concentraţie scăzută de calciu (2mM). După amestecare se face sterilizarea prin filtrare
(0,45 µm) sau autoclavarea.
Odată obţinut alginatul, se introduc explantele timp de 1-2 secunde, după care una
câte una acestea sunt trecute într-o soluţie de CaCl2 (50 mM) unde vor rămâne timp de 45
de minute pentru formarea capsulei.
Phytagelul (Gelrite) este un heteropolizaharid natural obţinut prin purificare dintr-
un substrat bacterian şi format din acid glucuronic, ramnoză şi glucoză. Este cunoscut şi
sub numele de gumă Gellan. Produce un gel dens, perfect limpede, la o concentraţie de
doar 1,5-2,0%. Se gelifică în soluţie apoasă la 27-31°C. Uneori determină apariţia
vitrificării
Agargelul este un amestec agar + phytagel care îmbină calităţile celor doi
componenţi. În concentraţie de 0,35-0,50% produce un gel semitransparent mult folosit
pentru detectarea contaminărilor. În acelaşi timp este cunoscut pentru reducerea
vitrificărilor. Este mai ieftin ca agarul normal. Se gelifică la 26-28°C.
Transfergelul conţine hidroxietilceluloză şi se obţine prin sinteză. Este folosit în
concentraţie de 2,5% pentru încapsularea embrionilor somatici, a minibutaşilor şi
apexurilor precum şi în tehnicile de “seed drilling” (semănare în flux lichid). Împreună cu
soluţiile nutritive cu care se amestecă formează un amestec vâscos care se autoclavează.
Prin autoclavare pH-ul soluţiei scade cu 0,5-1 unităţi. Pentru autoclavare trebuie folosite
recipiente cu volum de 4 ori mai mare decât cel al soluţiei care conţine Transfergel.
Pe lângă substanţele prezentate mai sus se mai pot folosi şi alţi agenţi solidificanţi
de tipul gelatinei (10%), biogelurilor (Biogel P 200), silicagelurilor sau gelurilor de
poliacrilamidă folosite în tehnicile de electroforeză a proteinelor. Nici unul din aceste

55
produse nu pot concura însă agarul. Compoziţia chimică a câtorva agenţi solidificanţi este
prezentată în tabelul 3.3.1. (Sigma Plant Culture, 1994, Catalogue).
Tabelul 3.3.1.
Compoziţia chimică a câtorva agenţi solidificanţi (%)
Cenuşă Ca Mg K P Na
Agar 2-5 0,30 0,10 0,01 0,01 0,5
Agar bacteriologic 3-7 0,17 0,09 0,80 - 3,1
Agar tip A 5-6 0,01 0,01 0,1 0,17 1,8
Agar tip E 3-4 0,02 0,02 0,07 0,13 1,2
Agar tip M 3-6 0,09 0,14 0,07 0,01 1,4
Agar consistent 3-4 0,03 0,00 0,07 0,09 0,72
Agar purificat 2,0 0,02 0,01 0,01 0,01 0,35
Agar spălat 2,2 0,15 0,08 - - 0,38
Agaroză <1 - - - - -
Acid alginic - 0,17 0,01 2,3 - 10,1
AgargelTM 4-5 0,25 0,06 0,04 0,08 1,05
PhytagelTM 9,5 0,85 0,35 1,70 0,15 0,45

3.3.3. Stabilizatorii osmotici şi de pH


Prin combinarea unor cantităţi diferite de substanţe minerale şi organice (în
special zaharuri) se obţin medii de cultură care au potenţiale osmotice diferite.
Calcularea potenţialului osmotic al unui mediu de cultură este destul de dificilă
fiind nevoie de o cunoaştere exactă a maselor moleculare şi gradului de disociere a
sărurilor folosite. Mult mai simplă este însă măsurarea potenţialului osmotic şi eventual
corectarea acestuia.
Zaharurile au în general o pondere mai mare în determinarea potenţialului osmotic
al unui mediu faţă de sărurile minerale.
Yoshida şi colab. (1973), citat de Pierik (1987), a demonstrat cât de diferită este
contribuţia celor două grupe de compuşi la formarea potenţialului osmotic al mediului de
cultură (tabelul 3.3.2.).




56
Tabelul 3.3.2.
Ponderea sărurilor minerale şi zaharurilor în realizarea
potenţialului osmotic al mediului de cultură
Potenţialul osmotic
Săruri minerale Zaharuri
Mediul de cultură % din
bari % din total bari
total
White 0,43 22,75 1,46 77,25
Hildebrandt 0,67 31,45 1,46 68,55
Heller 0,96 19,16 4,05 80,84
Murashige&Skoog 2,27 50,78 2,20 49,21

Dacă potenţialul osmotic depăşeşte valoarea de 3 bari, activitatea explantului


încetează datorită imposibilităţii folosirii apei din mediu.
Creşterea potenţialului osmotic al mediului, atunci când este necesar, poate fi
făcută prin adăugarea de manitol, iar mai nou, de polietilenglicol (PEG), până la atingerea
valorii dorite.
Un alt element important al mediului de cultură este pH-ul acestuia. În mod
obişnuit pH-ul mediului de cultură trebuie să aibă valoarea 5,5. Oricum se pot folosi şi
medii de cultură cu valori ale pH-ului cuprinse între 5,0-6,5.
Scăderea valorii pH-ului sub 5,0 aduce după sine o serie de probleme:
- mediul nu se solidifică;
- AIA şi GA3 devin instabile;
- vitamina B1 şi acidul pantotenic se descompun;
- anumite săruri precipită.
Nici pH-ul prea ridicat (peste 7,0) nu este admisibil datorită blocării fierului,
apariţiei clorozei şi altor dezechilibre fiziologice.
Oricum rolul valorii pH asupra creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro este mai
puţin cunoscut. Într-o experienţă de calogeneză şi organogeneză indirectă la specii şi
hibrizi din genul Actinidia s-au obţinut rezultate superioare pe mediul cu pH-7 faţă de
varianta cu pH 5,5 (Stănică F. şi colab., 1994, Stănică F., 1998).
Se ştie că în urma autoclavării valoarea pH a mediului scade cu 0,3-0,5 unităţi. De
asemenea, valoarea pH poate scădea în timpul unei subculturi cu 0,5 unităţi (Skirvin şi
colab. 1986, citat de Pierik 1987).

57
Ţinând cont de aceste modificări la prepararea mediului de cultură valoarea pH
trebuie corectată prin titrare cu soluţii de baze (NaOH, KOH 0,1N) sau de acizi (HCl sau
acizi organici 0,1N) până la valoarea dorită.
Corectarea valorii pH se va face după aducerea la volum cu apă distilată a
mediului înaintea adăugării agarului şi zaharozei. Unii autori recomandă corectarea pH-
ului după introducerea zaharozei şi înainte de introducerea agarului.

3.3.4. Substanţele antioxidante şi absorbante


Una din problemele care apar în timpul cultivării in vitro a explantelor vegetale
este emisia de fenoli şi oxidarea rapidă a acestora având ca efect brunificarea mediului de
cultură şi blocarea creşterii.
Pentru prevenirea acestui fenomen la speciile cu predispoziţie, se recurge la
folosirea unor substanţe antioxidante, fie pentru tratarea explantelor înainte de inoculare,
fie chiar pentru introducerea în mediul de cultură.
Acidul ascorbic (vitamina C) intră mai rar în compoziţia unor amestecuri de
vitamine, fiind însă folosit ca antioxidant în doză de 1-100 mg/l. Prin autoclavare acidul
ascorbic se descompune şi de aceea el se va steriliza numai prin filtrare (0,22 µm).
Acidul citric se foloseşte frecvent ca antioxidant în cantitate de 150 mg/l în
amestec cu acidul ascorbic. Soluţia astfel obţinută poate fi folosită pentru îmbăierea
explantelor timp de 5-30 minute după secţionare şi înainte de inoculare.
Polivinilpirolidona (PVP) este un antioxidant larg folosit în culturile in vitro.
Acest polimer are capacitatea de a absorbi substanţele din grupa fenolilor reducând astfel
oxidarea acestora. PVP se poate introduce în mediul de cultură în cantitate de 250-1000
mg/l sau poate fi adăugat în apa distilată sterilă la clătirea explantelor în procesul
sterilizării şi la păstrarea acestora până la inoculare (0,1%).
DIECA (dietil-ditiocarbonat) este folosită de asemenea în apa de clătire a
explantelor în concentraţii de 2 g/l pentru reducerea oxidării. DIECA este nelipsită de la
protejarea împotriva oxidării a zonelor secţionate la realizarea microaltoirii in vitro sau “ex
vitro” (vezi subcapitolul 6.2.).
Efect antioxidant au şi alte substanţe cum ar fi tioureea şi diferiţi aminoacizi: L-
cisteina, glutamina, arginina şi aspargina care însă sunt mai puţin folosite în acest scop.

58
Cărbunele activ este obţinut prin carbonizarea la temperaturi ridicate a lemnului
în prezenţa aburului. Se obţine astfel o structură microporoasă caracterizată printr-o
capacitate foarte mare de a absorbi o serie de compuşi din mediul de cultură. Cărbunele
vegetal are o mare capacitate de reţinere a 5 hidroximetilfurfurolului (inhibitor de creştere
care apare datorită descompunerii zaharozei în timpul autoclavării), a unor fenoli sau
tanini (care sunt responsabili de procesul de brunificare), a unor auxine, citochinine, a
etilenei, a unor vitamine şi a chelaţilor de Fe şi Zn.
Acţiunea pozitivă a cărbunelui activ a fost observată în special la conifere în
procesele de alungire a lăstarilor la pinul maritim, Sequoia, dar şi la Clematis (Gâlă şi
colab. 2003) (foto 3.2.). De asemenea, s-au obţinut rezultate superioare la folosirea
cărbunelui activ, în embriogeneza somatică la Anemone şi Nicotiana.
Foarte frecvent, cărbunele activ este folosit în faza de înrădăcinare a explantelor
pe medii fără hormoni, în concentraţie de 0,2-0,3%, datorită efectului benefic materializat
prin absorbţia unor produşi de secreţie dar mai ales prin crearea întunericului în zona
formării noilor rădăcini.

Foto 3.2. Mediu de cultură cu cărbune activ la Clematis

59
3.4. Concentraţii. Prepararea soluţiilor stoc
Aşa cum am afirmat până aici mediile de cultură au o compoziţie complexă care se
modifică în funcţie de specii, tipul de explant (organ), vârsta explantului, scopul urmărit
etc.
Conţinutul în elemente nutritive, fitoregulatoare şi cu rol stabilizator este mult
diferit de la caz la caz.
Fiecare component are o anumită pondere în realizarea mediului final. De aceea,
compoziţia mediului este dată de tipul substanţelor şi de concentraţia acestora.
De la caz la caz, concentraţia unui component poate fi exprimată în:
- % de volume: ex. 5% reprezintă 50 ml din produsul respectiv adăugaţi la 950 ml apă;
- % de masă: pentru agar, zahăr sau alte componente solide: ex. 2%, reprezintă 2 g în 100
ml de mediu sau 20 g în 1000 ml mediu preparat. Acest mod de exprimare a concentraţiei
este notată în literatura de specialitate de limbă engleză w/v, adică: weight/volume;
- miligram/litru (mg/l; mg.l-1) reprezintă 0,001 g/litru. Frecvent pentru acest tip de
concentraţie se foloseşte exprimarea cu ajutorul puterilor, astfel:
1 g/l= 1 . 10-3
1 mg/l = 1 . 10-6
- microgram/litru (µg/l; (µg . l-1) reprezintă 0,001 mg/l sau 1 . 10-9;
- părţi pe milion (ppm). 1 ppm reprezintă o parte dizolvată într-un milion de părţi de
acelaşi ordin de mărime, de ex. 1 mg în 1000 ml (1.000.000 µl) este echivalent cu 1 ppm.
În concluzie:
1 mg/l = 1 . 10-6 = 1 ppm şi 1 g/l = 1 . 10-3 = 1000 ppm
- moli. Conform Asociaţiei Internaţionale de Fiziologia plantelor, cel mai corect mod de
exprimare a concentraţiilor într-un mediu de cultură o reprezintă concentraţia molară.
Acest lucru permite o comparare corectă a două substanţe diferite.
Ştiind că 1 mol este reprezentat de o cantitate de substanţă egală cu masa
moleculară, este mai corect să se compare de exemplu, efectul unui mol de IBA (203,2) cu
al unui mol de ANA (186,2) decât să se compare efectul unei cantităţi de câte 1 mg/l din
fiecare hormon de mai sus. Acelaşi lucru este valabil atunci când se compară concentraţiile
totale ale sărurilor din două medii diferite.
Cunoscând masa moleculară a unei substanţe (de exemplu 225,3 pentru BAP)
concentraţia molară se poate exprima astfel:

60
- 1 mol de BAP este echivalent cu o concentraţie de 225,3 g/litru;
- 1 mM de BAP este echivalent cu o concentraţie de 0,2253 g/litru;
- 1 µM de BAP este echivalent cu o concentraţie de 0,0002253 g/litru = 0,2253 mg/l;
Transformarea din concentraţie molară (M) în concentraţie exprimată în unităţi de
masă (g/l) se face folosind următoarea formulă:
concentraţia molară (M) . masa moleculară = X g/l.
concentraţia molară (mM) . masa moleculară = X mg/l.
De exemplu, dacă concentraţia dată de BAP este de 2,2 µM, concentraţia
echivalentă exprimată în mg/l va fi:
2,2 µM . 225,3 = 495,66 µg/l ≈ 0,5 mg/l
Invers, dacă iniţial concentraţia a fost exprimată în unităţi de masă se poate afla
concentraţia molară împărţind valoarea respectivă la masa moleculară.
În tabelul 3.4.1. sunt prezentate masele moleculare ale substanţelor folosite la
prepararea mediilor de cultură.
Tabelul 3.4.1.
Masele moleculare ale substanţelor folosite la prepararea
mediilor de cultură
Formula Masa
Substanţa
chimică moleculară
Macroelemente
Azotat de amoniu NH4NO3 80,04
Sulfat de amoniu (NH4)2SO4 132,15
Clorură de calciu CaCl2.2H2O 147,02
Azotat de calciu Ca(NO3)2.4H2O 236,16
Sulfat de magneziu MgSO4.7H2O 246,47
Clorură de potasiu KCl 74,55
Azotat de potasiu KNO3 101,11
Difosfat de potasiu KH2PO4 136,09
Difosfat de sodiu NaH2PO4.2H2O 156,01
Microelemente
Acid boric H3BO3 61,83
Clorură de cobalt CoCl2.6H2O 237,93
Sulfat de cupru CuSO4.5H2O 249,68
Sulfat de mangan MnSO4.4H2O 223,01
Iodură de potasiu KI 166,01
Molibdat de sodiu Na2MoO4.2H2O 241,95
Sulfat de zinc ZnSO4.7H2O 287,54
Sodiu EDTA Na2EDTA.2H2O 372,25
Sulfat de fier (feros) FeSO4.7H2O 278,03

61
Tabelul 3.4.1. continuare
Formula Masa
Substanţa
chimică moleculară
Zaharuri
Fructoză C6H12O6 180,15
Glucoză C6H12O6 180,15
Manitol C6H14O6 182,17
Sorbitol C6H14O6 182,17
Zaharoză C6H22O11 342,31
Vitamine şi aminoacizi
Acid para-aminobenzoic 137,0
Acid ascorbic (C) C6H12O6 176,12
Acid folic (vit. Bc, vit. M) C19H19N7O6 441,40
Acid nicotinic (B3) C6H5NO2 123,11
Biotină (H) C10H16N2O3S 244,31
Cianocobalamină (B12) C63H90CoN14O14P 1357,64
Glicină C2H5NO3 75,07
Inozitol C6H12O6 4180,16
L-Cisteină HCl C3H7NO2S.HCl 157,63
L-Glutamină C5H10N2O3 146,15
Pantotenat de calciu (C9H16NO5)2Ca 476,53
Piridoxină (B6) C6H11NO3.HCl 205,64
Riboflavină 376,37
Tiamină (B1) C12H17ClN4OS.HCl 337,29
Auxine
2,4-D- acid 2,4 diclorfenoxiacetic C8H6O3Cl2 221,04
AIA- acid 3 indolil acetic C10H9NO2 175,18
ANA- acid α naftil acetic C12H10O2 186,20
ANOA- Acid β naftoxiacetic C12H10O2 202,20
IBA- acid 3 indolil butiric C12H13NO2 203,23
PCAA- Acid paraclorfenoxiacetic C8H7O3Cl 186,59
Citochinine
AD – Adenină C5H5N5.3HO 189,13
AdSO4- Sulfat de adenină (C5H5N5)2.H2SO4.2H2O 404,37
BA sau BAP (6-benziladenină C12H11N5 225,20
sau 6 benzilaminopurină
6 Furfurilaminopurină C10H9N5O 215,21
SD 8339 - C17H19N5O 309,40
Zeatină C10H13N5O 219,20
Gibereline
GA3-Acid giberelic C19H22O6 346,37
Alte componente
Acid abscisic C15H20O4 264,31
Colchicină C22H25NO6 399,43
Floroglucinol C6H6O3 126,11

62
Pentru substanţe mai complexe a căror masă moleculară nu este cunoscută,
aceasta se calculează prin adunarea maselor atomice ale elementelor care o compun
(Tabelul 3.4.2.). Se va ţine cont dacă substanţa respectivă se află în stare hidratată sau nu
(“sic”) pentru a adăuga valoarea masei moleculare a apei.
În tabelul 3.4.2. este prezentat conţinutul în săruri minerale a mediilor
Murashige&Skoog şi Gamborg (B5) având concentraţia exprimată în mg/l, respectiv mM,
pentru macroelemente şi µg/l, respectiv µM, pentru microelemente.
Tabelul 3.4.2.
Conţinutul în săruri minerale a mediilor de cultură
Murashige&Skoog şi Gamborg (B5)
Substanţa Murashige & Skoog Gamborg B5
Macroelemente mg/l mM mg/l mM
NH4NO3 1.650 20,6 - -
(NH4)2SO4 - - 134 1,0
KNO3 1.900 18,8 2500 24,7
CaCl2 . 2H2O 440 3,0 150 1,0
.
MgSO4 7H2O 370 1,5 250 1,0
KH2PO4 170 1,25 - -
NaH2PO4 - - 150 1,0
Total 4.530 45,15 3.184 28,7
Microelemente µg/L µM µg/L µM
KI 830 5,0 750 4,5
H3BO4 6.200 100,0 3.000 48,8
MnSO4 . H2O 16.000 94,6 10.000 59,1
ZnSO4 . 7H2O 8.600 30,0 2.000 7,0
Na2MoO4 . 2H2O 250 1,0 250 1,0
.
CuSO4 5H2O 25 0,1 25 0,1
.
CoCl2 6H2O 25 0,1 25 0,1
Total 31.930 230,8 16.050 120,6
Total general 4.561,93 45,38 3.200,05 28,82

Se observă, în final, că cele două medii diferă atât în ceea ce priveşte compoziţia
cât şi în ceea ce priveşte concentraţia totală.
Revenind la necesitatea folosirii concentraţiilor molare, printr-un calcul simplu se
observă că în cazul concentraţiei exprimate în mg/l, mediul MS este doar cu 142,5% mai
concentrat decât mediul B5. Cât despre concentraţia molară, se constată că de fapt diferenţa
este de 157,46%.
Aşa cum reiese din tabelul de mai sus pentru prepararea unui mediu este nevoie, în
medie, de 4-5 săruri conţinând macroelemente, de 7-8 săruri cu microelemente, de chelat
de fier, de amestecuri de 2 sau mai multe vitamine, de aminoacizi şi de un număr mai mare

63
sau mai mic de hormoni de creştere. La toate acestea se adaugă zaharoza, agarul şi
eventual cărbunele activ.
Pentru prepararea unui litru de mediu ar fi nevoie în jur de 20-25 de cântăriri şi tot
atâtea dizolvări, diluări etc. ceea ce înseamnă un volum considerabil de muncă. Lucrurile
s-ar complica şi mai mult atunci când este vorba de microelemente care s-ar cântări în
cantităţi de ordinul microgramelor. Creşte în plus, riscul de apariţie a unor erori şi de
nerespectarea reţetelor.
Pentru înlăturarea acestor neajunsuri se recurge la prepararea unor soluţii stoc
concentrate formate din amestecuri de macro şi microelemente, vitamine care în momentul
preparării mediilor se diluează corespunzător concentraţiei şi reţetei de mediu folosite.
Diverşi autori recomandă să se folosească 5-6 soluţii stoc diferite pentru prepararea
unui mediu:
- soluţie stoc de macroelemente;
- soluţie stoc de microelemente;
- soluţie stoc de chelat de fier;
- soluţie stoc de vitamine;
- soluţie stoc de aminoacizi;
- soluţie stoc de hormoni.
Concentraţia acestor soluţii stoc variază între 10 X şi 1000 X (cu X se notează
concentraţia normală). De exemplu, o soluţie stoc de macroelemente Murashige&Skoog cu
o concentraţie 10 X va conţine de 10 ori mai mult azotat de amoniu (16.500 mg/l) decât o
soluţie cu concentraţia normală X (1.650 mg/l). Acelaşi lucru este valabil şi pentru
celelalte săruri care alcătuiesc soluţia de macroelemente.
Atunci când compuşii sunt mai stabili şi în laborator se prepară cantităţi mari de
mediu, se folosesc soluţii stoc cu concentraţii ceva mai mari (100 X, 1000 X). Frecvent
soluţia stoc de macroelemente are concentraţia 10 X, iar celelalte (microelemente şi
vitamine) concentraţia de 100 X.

64
Pentru a afla ce cantitate din soluţia stoc se va folosi pentru a prepara un anumit
volum de mediu se aplică formula:
volumul de soluţie stoc = concentraţia cerută . volumul de mediu
concentraţia soluţiei stoc
De exemplu, pentru a afla ce cantitate din soluţia stoc de vitamine, care are o
concentraţie 100 X este necesară pentru a prepara 2 l de mediu calculul este:

Y ml de soluţie stoc = X . 2 l = 0,02 l = 20 ml


100 X

Tabelul nr. 3.4.3. este un tabel ajutător pentru a afla cantitatea de soluţie stoc
necesară pentru a prepara un anumit volum de mediu cu concentraţia cunoscută (X).

Tabelul 3.4.3.
Calculul diluţiei pentru trecerea de la o anumită soluţie stoc la
soluţia normală
Nr. ml din soluţia stoc necesari pentru un mediu cu
Concentraţia
concentraţia normală X
soluţiei stoc
0,250 l 0,500 l 1l 2l 3l 10 l
1X 250 500 1.000 2.000 3.000 10.000
10 X 25 50 100 200 300 1.000
100 X 2,5 5 10 20 30 100
200 X 1,25 2,5 5 10 15 50
1000 X 0,25 0,5 1 2 3 10

Prepararea soluţiilor stoc


Cunoscând concentraţiile finale (normale) în diferite componente ale unui mediu de
cultură se poate trece la prepararea soluţiilor stoc.
Acest lucru este posibil prin mai multe căi. Una dintre ele ar fi cântărirea pentru
fiecare tip de mediu şi component a unor cantităţi de 10, 100 sau 1000 de ori mai mari
decât concentraţia normală, dizolvarea, amestecarea soluţiilor şi adăugarea de apă
bidistilată până la volumul de 1 litru. S-ar obţine astfel o soluţie stoc de 10, 100 sau 1000
de ori mai concentrată de macro şi microelemente sau vitamine.
Atunci când însă, într-un laborator se folosesc frecvent 4-5 medii de cultură diferite
şi se prepară zilnic cantităţi mari de mediu se poate apela la o soluţie mai practică şi mai

65
puţin laborioasă. Aceasta constă în primul rând în simplificarea operaţiilor de cântărire şi
permite o folosire mai judicioasă a substanţelor, evitându-se învechirea soluţiilor stoc.
Metoda presupune existenţa a două tipuri de soluţii stoc:
- soluţiile mamă;
- soluţiile stoc propriu-zise.
Soluţiile mamă se obţin prin cântărirea, pentru fiecare sare în parte, a unei cantităţi
constante (de exemplu 100 g pentru macroelemente şi 10 g sau 1 g pentru microelemente).
După dizolvare volumul soluţiei se aduce la un litru obţinându-se astfel o soluţie cu
concentraţia 100 g/l, respectiv 10g/l, sau 1 g/l.
Soluţiile obţinute se păstrează în sticle etichetate aşezate în ordine. Soluţiile stoc
propriu-zise de concentraţie 10 X, 100 X sau 1000 X se obţin prin diluarea unui anumit
volum din fiecare soluţie mamă corespunzătoare sărurilor care intră în componenţa
soluţiilor stoc respective.
Calculul volumului de soluţie mamă necesar pentru a obţine 1 l de soluţie stoc este
următorul:
Y ml soluţie mamă = concentr.soluţiei normale (mg/l) . concentr.soluţiei stoc
concentraţia soluţiei mamă (g/l)

Exemplu: Dacă soluţia normală a mediului Murashige&Skoog conţine 1650 mg/l


NH4NO3 şi concentraţia soluţiei mamă de NH4NO3 este de 100 g/l, să se calculeze câţi ml
de soluţie mamă vor fi necesari pentru a obţine un litru de soluţie stoc de macroelemente
cu concentraţia 10 X.
Y ml de soluţie mamă NH4NO3 = 1650 mg/l NH4NO3 . 10(X) = 165 ml
100 g/l NH4NO3

În tabelele 3.4.4. şi 3.4.5. sunt prezentate cantităţile (ml) de soluţii mamă necesare
pentru prepararea unui litru de soluţie stoc de macroelemente (10X) şi respectiv, de
microelemente (100X), la câteva dintre mediile de cultură cele mai folosite.
O problemă care poate apărea la prepararea soluţiilor stoc din soluţii mamă este
apariţia precipitaţilor insolubili. Principala cauză este formarea unor compuşi insolubili în
calciu, ionul fosfat şi magneziu.
Pentru a evita acest lucru este indicat să se respecte o anumită ordine la adăugarea
soluţiilor. Astfel se vor introduce prima fată soluţiile cu azot apoi cele cu magneziu,

66
urmează cele cu calciu şi în final cele cu fosfor. Este de la sine înţeles că fiecare sare
trebuie în prealabil integral dizolvată în soluţia mamă.
Riscul apariţiei precipitaţiilor se poate evita şi prin prepararea unor soluţii stoc de
concentraţie mai redusă (10X).
Un alt compus de bază al mediului de cultură este chelatul de fier. Fierul nu este
accesibil plantelor decât dacă este legat de un agent de chelatare. În cazul mediilor pentru
culturile in vitro, agentul de chelatare folosit este Na2EDTA, sarea disodică a acidului
etilendiaminotetraacetic (C10H14N2O8Na2.2H2O).
Ca sursă de fier se foloseşte sulfatul feros hidratat cu 7 molecule de apă
.
(FeSO4 2H2O).
De regulă se foloseşte o soluţie stoc 200X de chelat de fier care se prepară astfel:
- se cântăresc 7,45 g de Na2EDTA.2H2O şi se dizolvă în 900 ml de apă distilată până
devine perfect limpede. La nevoie se încălzeşte uşor;
- se cântăresc 5,52 g sulfat feros şi se dizolvă în restul de apă;
- se amestecă cele două soluţii obţinându-se 1 l de soluţie 200x de chelat de fier de
culoare galbenă.
La prepararea unui litru de mediu de cultură din soluţia stoc de chelat de fier se vor
lua 5 ml (pentru 1 l de mediu) cantitate care conţine 27,8 mg de sulfat feros (100 µM) şi
respectiv 37,25 mg Na2EDTA (200 µM).

67
Tabelul 3.4.4.

Prepararea unui litru de soluţie stoc de macroelemente (10X) din soluţiile mamă la câteva medii de cultură
Murashige & Quoirin & Schenk &
Conc. Gamborg B5 Nitsch & Nitsch
Skoog Lepoivre Hildebrandt
sol.
Substanţa Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie
mamă
normale mamă normale mamă normale mamă normale mamă normale mamă
(g/l)
mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml.
NH4NO3 100 1650 165 - - 400 40 - - 720 72,0
KNO3 100 1900 190 2500 250 1800 180 2500 250 950 95,0
CaCl2 · 2H2O 100 440 44 150 15 - - 200 20 166 16,6
MgSO4 · 7H2O 100 370 37 250 25 360 36 400 40 90,3 9,03
KH2PO4 100 170 17 - - 270 27 - - 68 6,8
Ca(NO3)2 · 4H2O 100 - - - - 1200 120 - - - -
(NH4)2SO4 100 - - 134 13,4 - - - - - -
NaH2PO4 · H2O 100 - - 150 15 - - - - - -
NH4H2PO4 100 - - - - - - - - - -

68
Tabelul 3.4.5.
Prepararea unui litru de soluţie stoc de microelemente (100X) din soluţiile mamă la câteva medii de cultură
Murashige & Quoirin & Schenk &
Conc. Gamborg B5 Nitsch & Nitsch
Skoog Lepoivre Hildebrandt
sol.
Substanţa Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie
mamă
normale mamă normale mamă normale mamă normale mamă normale mamă
(g/l)
mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml.
KI 10 0,83 8,3 0,75 7,5 0,08 0,80 1,0 10,0 - -
H3BO3 10 6,20 62,0 3,00 30,0 6,20 62,0 5,0 50,0 10,0 100,0
MnSO4 · H2O 10 16,00 160,0 10,00 100,0 0,76 7,60 10,0 100,0 18,9 189,0
ZnSO4 · 7H2O 10 8,60 86,0 2,00 20,0 8,60 86,0 1,0 10,0 10,0 100,0
Na2MoO4 · 2H2O 1 0,25 25,0 0,25 25,0 0,250 25,0 0,1 10,0 0,25 2,5
CuSO4 · 5H2O 1 0,025 2,5 0,025 2,5 0,025 2,50 0,2 20,0 0,025 2,5
CoCl2 · 6H2O 1 0,025 2,5 0,025 2,5 0,025 2,50 0,1 10,0 - -

69
Tabelul 3.4.6.
Amestecuri de vitamine folosite frecvent la prepararea mediilor de cultură
Necesar pt. 100 ml
Concentraţia normală (X)
soluţie 100 X
Amestec
mg/l µM mg
Murashige&Skoog
Acid nicotinic 0,5 4,0 5,0
Piridoxină - HCl 0,5 2,4 5,0
Glicină 2,0 26,6 20,0
Tiamina - HCl 0,1 0,3 1,0
Walkey 1
Acid nicotinic 0,5 4,0 5,0
Piridoxină - HCl 0,5 2,4 5,0
Glicină 5,0 66,6 50,0
Tiamina - HCl 0,4 1,2 4,0
Walkey 2
Inozitol 100,0 560,0 1000,0
Tiamina - HCl 0,4 1,2 4,0
Jacquillot
Acid nicotinic 1,0 8,1 10
Acid folic 0,01 0,02 0,1
Acid p-aminobenzoic 1,0 7,3 10,0
Biotina 0,1 0,4 1,0
Pantotenat de calciu 0,5 1,0 5,0
Riboflavina 0,1 0,26 1,0
Tiamina - HCl 1,0 3,0 10,0
Gamborg B5
Acid nicotinic 0,1 8,1 10,0
Piridoxină - HCl 1,0 4,9 10,0
Tiamina - HCl 10,0 29,6 100,0

Aşa cum se poate observa, raportul dintre cele două componente trebuie să fie de
1:2 pentru ca soluţia să fie stabilă. Orice exces de fier bivalent (Fe2+) duce la oxidarea
acestuia în Fe trivalent (Fe3+) urmată de formarea fosfatului feric care precipită.
Soluţiile de vitamine care se folosesc la prepararea mediilor de cultură sunt
amestecuri mai mult sau mai puţin complexe, diverşi autori propunând reţeta proprie.
Concentraţiile soluţiilor stoc variază în general între 100x şi 1000x. Păstrarea
acestor soluţii se face de regulă în frigider la 0-5°C, uneori fiind necesară păstrarea în
congelator (amestecul Kao&Michayluk – cod Sigma K-3129).
În tabelul 3.4.6. sunt prezentate reţetele câtorva amestecuri de vitamine folosite mai
frecvent la prepararea mediilor de cultură.

70
Mai trebuie reţinut că piridoxina şi tiamina se dizolvă cu câteva picături de acid
clorhidric în timp ce acidul folic, bistina şi acidul nicotinic se dizolvă mai uşor la cald (nu
se vor depăşi 35-37°C).
Cum marea majoritate a vitaminelor sunt termolabile nu s-ar recomanda
introducerea lor în mediu înainte de autoclavare. Soluţia este sterilizată prin filtrare,
folosind filtre bacteriologice de 0,2 µm şi introducerea în mediul autoclavat înainte de
răcirea acestuia.

Soluţiile de hormoni
Aşa cum am precizat în capitolul 3.2. mediul de cultură trebuie să conţină şi o serie
de substanţe fitoregulatoare care practic determină sensul evoluţiei explantelor.
În funcţie de tipul de explant, de tipul de cultură şi de scopurile urmărite se
apelează la o anumită combinaţie de hormoni. De regulă, se urmăreşte realizarea unui
raport auxine: citochinine optimal dar în acelaşi timp pot fi adăugaţi şi alţi hormoni cu
acţiune stimulatoare.
Pentru fiecare tip de hormon se prepară soluţii stoc concentrate care în momentul
folosirii se diluează până la concentraţia precizată în protocol. Date despre solvenţii
folosiţi, modul de diluare şi temperatura de păstrare a soluţiilor stoc se regăsesc în tabelele
3.2.1; 3.2.2.; 3.2.3 şi 3.2.4.
Cel mai frecvent se prepară soluţii stoc care conţin 1 mg din hormonul respectiv
într-un ml de soluţie. În acest sens, se dizolvă 100 mg de hormon folosind câţiva ml de
solvent după care se dizolvă în apa distilată până se ajunge la volumul de 100 ml. După
etichetare soluţia stoc se păstrează aşa cum am precizat mai devreme.
1 mg/ml = 1000 mg/l = 1.10-3
În mediile de cultură concentraţia hormonilor variază, în general, între 0,1 şi 10,0
mg/l.
Pentru a prepara un anumit mediu se aplică formula de mai jos sau se face un
raţionament simplu:
Volum de soluţie stoc necesar = Concentraţia hormonului în mediul normal . Volum de mediu
Concentraţia soluţiei stoc

Volum de soluţie stoc de BAP necesar = 0,5mg/l . 3 l = 1,5 l = 1,5 ml soluţiei stoc BAP
1000 mg/l 1000

71
În tabelul 3.4.5. sunt calculate câteva diluţii în funcţie de concentraţia dorită de
hormoni, volumul de mediu de preparat şi concentraţia soluţiei stoc.
Tabelul 3.4.5.
Cantitatea de soluţie stoc necesară pentru a prepara un anumit volum de mediu
cu concentraţia hormonilor cunoscută

Concentraţia dorită (finală) - mg/l Soluţia stoc de hormoni


Concentraţia Necesar
250 ml 500 ml 1000 ml 2 litri 10 litri
mg/l ml
0,004 0,002 0,001 0,0005 0,0001 0,01 0,1
0,02 0,01 0,005 0,0025 0,0005 0,5
0,04 0,02 0,01 0,005 0,001 1,0
0,4 0,2 0,1 0,05 0,01 10,0
0,04 0,02 0,01 0,005 0,001 0,10 0,1
0,2 0,1 0,05 0,025 0,005 0,5
0,4 0,2 0,1 0,05 0,01 1,0
4,0 2,0 1,0 0,5 0,01 10,0
0,4 0,2 0,1 0,05 0,1 1,0 0,1
2,0 1,0 0,5 0,25 0,05 0,5
4,0 2,0 1,0 0,5 0,1 1,0
40,0 20,0 10,0 5,0 1,0 10,0
4,0 2,0 1,0 0,5 0,1 10,0 0,1
20,0 10,0 5,0 2,5 0,5 0,5
40,0 20,0 10,0 5,0 1,0 1,0
400,0 200,0 100,0 50,0 10,0 10,0

Atunci când concentraţia soluţiei hormonale se exprimă cu ajutorul puterilor,


raţionamentul este acelaşi: 1 mg/l = 1 . 10-6
Dacă concentraţia dorită de hormoni este, de exemplu 0,5 .10-6 şi se prepară 3 l de
mediu având o soluţie stoc cu concentraţia de 1.10-3 se vor folosi 1,5 ml de soluţie stoc.
Volumul de soluţie stoc necesar = 0,5.10-6 . 3 l = 1,5.10-3 l = 1,5 ml soluţie stoc
1.10-3
Frecvent se prepară soluţii stoc hormonale cu concentraţia 1.10-4 şi mai rar 1.10-3.

3.5. Prepararea mediului de cultură


Prepararea mediului de cultură constă dintr-o suită de etape.
După analizarea reţetei care se va folosi, se scot sticlele cu soluţiile stoc din frigider
sau alte locuri de păstrare şi se aliniază în ordinea de pe reţetă.
Alăturat propunem spre exemplificare modelul de reţetă de la Facultatea de
Agricultură din Perugia, Italia (Standardi, A.), care conţine mediul folosit pentru faza de
menţinere a actinidiei (tabelul 3.5.1.).

72
Într-un pahar Berzelius de dimensiuni corespunzătoare se pun aproximativ 400 ml
de apă bidistilată după care se adaugă pe rând cantităţile (volumele) stabilite pentru fiecare
soluţie stoc în parte, măsurate cu cilindri gradaţi sau pipete.
Este indicat ca vasul cu mediu să fie plasat pe o plită cu agitator magnetic,
uşurându-se astfel dizolvarea şi amestecarea componentelor.
Fiecare substanţă introdusă se marchează pe reţetă pentru a evita omisiunile sau
folosirea de două ori.
După ce s-au introdus toate substanţele cu excepţia agarului se aduce la semn cu
apă bidistilată şi se trece la corectarea pH-ului amestecând continuu. În funcţie de valoarea
pH măsurată se titrează cu soluţie 0,1 N de KOH (NaOH) sau respectiv HCI, până la
valoarea dorită.
Se adaugă apoi agentul gelificant cântărit în prealabil şi se pregăteşte mediul pentru
autoclavare.
Din acest moment, se cunosc două practici diferite. Una dintre ele presupune
autoclavarea mediului în vase de mare capacitate (1-2 l), urmată de repartizarea mediului
topit în vasele de cultură sub hota sterilă. Vasele de cultură au fost în acest caz, sterilizate
în prealabil prin autoclavare, în etuvă, sau la producător (în cazul vaselor de unică
folosinţă).
Avantajul acestei metode ar fi că necesită volume de spaţiu mai mici pentru
autoclavare dar, după părerea noastră, este mai laborioasă întrucât necesită sterilizarea
prealabilă a vaselor de cultură, creşte riscul infectării mediului în timpul distribuirii şi nu
este aplicabilă la cantităţi mari de mediu (pe scară industrială).
A doua posibilitate constă în topirea agarului în vasul iniţial cu mediu prin agitare
pe o plită electrică sau baie marină. Agarul este topit când mediul devine limpede şi are
culoare albă gălbuie. Acest lucru are loc când începe să apară primele bule de aer pe
fundul vasului, semn că în scurt timp mediul dă în clocot.

73
U.Ş.A.M.V. – Bucureşti Tabelul 3.5.1.
Facultatea de Horticultură

FIŞA DE PREPARARE A MEDIULUI DE CULTURĂ

Mediul (nr./sigla): S 2,5 , preparat în 25/08 , pentru faza: multiplicare ,


specia: actinidia , ml de mediu necesari: 100, recipiente: vase sticlă ,
ml/recipient: 100 , pH măsurat: 4,32 , pH dorit: 5,5 , pH corectat cu 2,5 ml
de NaOH 0,1 N.
Componente Conc. Conc. Cant. totală ml (g) ptr.
dorită sol. mamă ml (g)/l ml
Săruri minerale
Macroelemente Quoirin&Lepoivre X 10X 100
Microelemente Quoirin&Lepoivre X 1000 X 1
Chelat de fier X 200 X 5
Vitamine / Aminoacizi
Amestec Walkey 2 X 100 X 10
Inozitol
Gibereline
GA-3 10-6 10-6 1
Altele
Auxine
ANA; AIA; IBA
Altele
Citochinine
Benziladenina (BAP) 10-6 10-7 10
Altele
Diverse

Zaharuri
Zaharoza 2,5 % 25
Altele
Substanţe gelificante
Agar 0,7 % 7
Altele
Cantitatea totală de soluţii mamă ml: 127
Apa distilată pentru aducere la volum ml: 850
Substrat preparat de: ..............................................

74
În continuare, mediul este repartizat în vasele de cultură fie direct, fie cu ajutorul
unor dispozitive care măsoară repetitiv şi debitează acelaşi volum de mediu. În eprubete se
introduc în general 5-8 ml de mediu.
În laboratoarele industriale, mediul este topit în cuve din inox prevăzute cu pompe
aspiro-respingătoare cu debit reglabil.
După repartizare vasele de cultură se închid (vezi subcapitolul 4.2.1.), se
etichetează, precizând pe fiecare sigla mediului (eventual varianta) şi data preparării.
Urmează apoi sterilizarea prin autoclavare.
Atunci când se folosesc substanţe termolabile a căror sterilizare se face prin filtrare
(0,2 µm), acestea se vor introduce în mediu după autoclavare, înainte de solidificarea
acestuia. Mediul trebuie să fie cald dar nu fierbinte (35-37°C). Se va amesteca continuu
pentru o cât mai bună omogenizare.
O altă situaţie se întâlneşte la folosirea mediului de cultură în dublu strat. Acest tip
de mediu prezintă un strat solid (cam 75-80% din volum) iar la suprafaţă are un strat de
mediu lipsit de agentul gelificant.
Pentru prepararea acestui mediu care prezintă multe avantaje (Stănică şi colab.,
1996) înainte de introducerea agarului se separă cam 20-25% din volumul total şi se
autoclavează separat. Mediul lichid se va repartiza după autoclavare şi răcirea
(solidificarea) stratului bazal, sub hotă, în condiţii sterile.
Pentru a reduce numărul de manipulări şi riscul infecţiilor, acest lucru se poate face
şi în momentul inoculării, practic, după inocularea explantelor pe mediul solid.

3.6. Probleme care apar la pregătirea şi folosirea mediilor de cultură


Prima problemă care poate apărea la prepararea mediilor de cultură este formarea
unor precipitate insolubile. Aşa cum am mai precizat, cauza este nerespectarea ordinii la
amestecarea unor compuşi, iar efectul este formarea fosfaţilor insolubili.
Frecvent sărurile cu calciu se dizolvă şi se folosesc pentru prepararea unor soluţii
stoc, separate de cele de macroelemente şi se adaugă doar în momentul preparării
mediului.
S-a mai observat formarea de precipitat atunci când se adaugă calciul şi fosforul şi
mediul are pH-ul în jur de 5,6. Pentru reducerea riscului precipitării se recomandă folosirea
unor soluţii stoc mai diluate de macroelemente (10X).

75
O altă problemă este nesolidificarea mediului de cultură după răcirea acestuia.
Dintre cauze amintim:
- cantitate prea mică de agar, sub 5-6 g/l;
- depăşirea temperaturii la autoclavare;
- ph-ul prea mic al mediului de cultură (sub 5,5);
- agar foarte vechi.
Mediile de cultură sunt amestecuri nutritive complexe şi constituie un suport ideal
pentru instalarea şi dezvoltarea rapidă a unor microorganisme de tipul bacteriilor şi
ciupercilor.
Sursele de infecţii şi cauzele apariţiei acestora în mediile de cultură sunt multiple:
- soluţii stoc învechite, infectate cu bacterii şi ciuperci;
- vase de cultură provenite din culturi infectate puternic, nespălate şi
nedezinfectate corespunzător;
- curăţenie deficitară în laborator;
- autoclavare necorespunzătoare fie prin nerespectarea timpului, fie a
temperaturii şi presiunii recomandate;
- închiderea necorespunzătoare a vaselor de cultură şi infectarea după
autoclavare;
- hotă necorespunzătoare care nu asigură sterilizarea totală a aerului în timpul
inoculărilor;
- tehnică de lucru deficitară, operatorul putând fi principalul vector al unor agenţi
contaminanţi;
- material biologic infectat şi deci sterilizat necorespunzător;
- condiţii de curăţenie necorepunzătoare în camera de creştere;
- o serie de acarieni, tripşi etc. pot pătrunde în vasele de cultură şi transporta
agenţi contaminanţi.
În general în mediile de cultură se întâlnesc două tipuri de infecţii. Cele de origine
bacteriană se caracterizează prin apariţia în jurul explantelor, la suprafaţa mediului sau în
interior, a unui halou translucid de culoare albă-gălbuie sau divers colorat (foto 3.3. a). În
mediile lichide creşte turbiditatea acestora. Infecţiile bacteriene sunt însoţite frecvent de un
miros puternic, neplăcut.

76
Infecţiile micotice se recunosc prin formarea unor reţele miceliene pe care pot
apărea fructificaţii de diferite culori (negre la Aspergillus sp., verzi-albăstrui la Penicillium
etc.) (foto 3.3. b). Prezenţa fructificaţiilor creşte riscul răspândirii infecţiei în vasul de
cultură dar şi în afara lui.

a b
Foto 3.3. Infecţii mixte cu bacterii şi ciuperci în faza de iniţiere-stabilizare in vitro

Dacă o infecţie este depistată în fază incipientă şi ea a afectat un singur explant


dintr-un vas se poate încerca salvarea celorlalte explante, mai ales dacă este vorba de un
material valoros.
În acest sens, se vor repasa de urgenţă explantele aparent sănătoase în eprubete şi se
va urmări evoluţia lor. O altă soluţie este sterilizarea explantelor aparent sănătoase şi
repasarea lor, individual, pe un mediu nou.

a b
Foto 3.4. Infecţii în faza de multiplicare in vitro (a– bacterii, b-Penicillium)

Mediul poate de asemenea să-şi schimbe culoarea devenind brun ca urmare a


emiterii de fenoli de către explante (foto 3.5.); prin oxidare aceşti fenoli determină

77
brunificarea mediului. Întrucât schimburile explantelor cu mediul se reduc drastic, se
impune de urgenţă înlăturarea zonelor brunificate şi pasarea pe un mediu nou.

Foto 3.5. Emisie de fenoli în faza de iniţiere la mesteacăn (Betula pendula Laciniata)

Pentru reducerea brunificărilor în continuare se poate apela la introducerea în


mediu a unor substanţe antioxidante:
- PVP (250-1000 mg/l); cărbune activ (0,2-3,0%); acid citric, acid ascorbic,
tiouree, etc.; aminoacizi: L-cisteină, glutamină, arginină şi asparagină.
Atunci când mediul este păstrat timp îndelungat înainte de a fi folosit sau
închiderea vaselor de cultură este defectuoasă şi/sau umiditatea din camera de cultură este
foarte scăzută, se constată deshidratarea mediului. Acest lucru este sesizat printr-o scădere
puternică de volum şi eventual, prin apariţia de crăpături în mediu (foto 3.6.) .

Foto 3.6. Deshidratarea şi crăparea mediului la Gasteria sp.


Explantele, în aceste condiţii, suferă datorită lipsei apei şi concentrării sărurilor şi
zaharurilor (creşte mult presiunea osmotică). Se impune de urgenţă pasarea pe un alt
mediu.

78
În anumite situaţii, la cultivarea unor explante pe mediu se observă că ţesuturile
acestora cresc neuniform şi au un aspect vitros. Fenomenul denumit vitrificare sau
sticlozitate este determinat de un ansamblu de factori care ţin în primul rând de mediul de
cultură dar, uneori şi de materialul biologic înmulţit.
Transformările pe care le suferă explantele vitrificate sunt multiple şi ele afectează
cloroplastele, membranele şi mezofilul frunzelor, meristemele etc. Se constată o reducere a
conţinutului în clorofilă şi o creştere a cantităţii de apă din frunză (aceasta ocupă până şi
ţesuturile lacunare, Cachiţă, 1987) (foto 3.3.).

Foto 3.7. Lăstari vitrificaţi, regeneraţi din peţiol de kiwi (Actinidia sp.)

Cauzele producerii acestui fenomen sunt legate de deficitul de agar, excesul de


etilenă, excesul ionilor de NH4+, excesul de citochinine, în special BAP etc.
Pentru salvarea explantelor vitrificate se impun o serie de măsuri:
- reducerea concentraţiei de săruri a mediului;
- creşterea conţinutului de agar (determină reducerea capacităţii proliferative);
- folosirea agarului hidrolizat reduce la minimum riscul apariţiei vitrificării;
- folosirea unor inhibitori ai producerii de etilenă: ioni de argint, CaCl2,
dinitrifenolul;
- creşterea dozei de zaharoză.
Vitrificarea rămâne o problemă controversată şi se impun noi cercetări pentru
elucidarea tuturor faţetelor acestui fenomen negativ.

79
Capitolul 4
Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro

4.1. Agenţi sterilizanţi


Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro se realizează prin folosirea unor mijloace
fizice şi chimice. Mijloacele chimice sunt reprezentate de un număr mare de agenţi
sterilizanţi cu origine şi compoziţie diversă.
Alcoolul etilic este folosit de regulă în concentraţie de 70%, deoarece alcoolul
absolut (96%) determină deshidratarea rapidă a materialul vegetal.
Calculul diluţiei alcoolului de 96% se face după schema de mai jos:

alcool 96% 70 ml alcool

70%

apă 0% 26 ml apă

Cunoscând concentraţia iniţială a alcoolului (96% volume alcool) se scade


concentraţia dorită (70% volume alcool) şi se obţine, pe linia apei, cantitatea în ml, sau
numărul de părţi de apă folosite la diluţie.
Repetând apoi acelaşi lucru pe a doua diagonală, se obţine pe linia alcoolului
cantitatea de alcool concentrat care va fi folosită, exprimată în ml sau părţi.
În general, timpul de sterilizare în alcool este scurt (30-60 de secunde) însă se poate
prelungi atunci când explantele sunt protejate de solzi, catafile etc. După introducerea în
alcool, explantul se va spăla rapid prin plonjare în apa distilată.
Sterilizarea în alcool este urmată frecvent de o sterilizare cu hipoclorit de sodiu sau
calciu.
Pentru fructe uscate, sâmburii, seminţele de orhidee sau unele plante puternic
contaminate (muşcată), sterilizarea se face prin introducerea explantelor în alcool de 96%,
flambarea rapidă şi răcirea în apă distilată sterilă.

80
Hipocloritul de sodiu (NaClO, apa de Javel) este folosit ca agent înălbitor pentru
rufe. Majoritatea produselor comerciale conţin 10-20% substanţă activă. Pentru sterilizare
se foloseşte însă o soluţie cu o concentraţie de 1,0-2,0%. Rareori concentraţia ajunge la
8,0%.
Trebuie reţinut că hipocloritul de sodiu se descompune uşor şi nu poate fi păstrat o
perioadă îndelungată.
Hipocloritul de calciu (Ca(ClO)2) se foloseşte în situaţiile în care hipocloritul de
sodiu se dovedeşte a fi toxic. Hipocloritul de calciu este condiţionat sub formă de pudră
care se dizolvă destul de dificil în apă.
Pentru prepararea soluţiei dezinfectante se dizolvă 35-100 g hipoclorit într-un litru
de apă. Se face apoi filtrarea soluţiei prin vată sau hârtie de filtru cu pori mari pentru a
înlătura particulele nedizolvate. Acestea, provoacă de regulă necrozarea ţesuturilor.
Timpul de sterilizare variază între 5 şi 30 de minute, în funcţie de tipul de explant.
După dezinfectarea cu hipoclorit de calciu, care este puternic alcalin, se recomandă
introducerea în prima apă de spălare a unei cantităţi reduse de acid clorhidric pentru
extragerea ionilor toxici de Cl-. Operaţia este urmată de 4-5 spălări succesive cu apă
distilată.
Trebuie precizat că suprafeţele secţionate ale explantelor se înălbesc sub acţiunea
clorului. Aceste zone vor fi eliminate în momentul pregătirii explantului pentru inoculare
întrucât celulele sunt moarte.
Hipocloritul de calciu în soluţie este ceva mai stabil şi poate fi păstrat o perioadă
îndelungată.
Clorura mercurică (sublimatul, HgCl2) este o otravă puternică care se foloseşte
sub formă de soluţie în concentraţie de (0,01-0,1%) timp de 2-15 minute. Concentraţia şi
timpul de sterilizare se vor reduce în cazul organelor şi ţesuturilor tinere. Efectul sterilizant
este puternic şi după folosire, sunt necesare 2-3 clătiri cu apă distilată sterilă.
Apa oxigenată (perhidrolul) se poate folosi cu succes la sterilizarea materialului
vegetal în concentraţie de 10-12%. De regulă, este folosită pentru prima sterilizare timp de
5-15 minute.
Are avantajul că pătrunde în profunzime şi curăţă materialul vegetal prin
efervescenţa pe care o produce. Apa oxigenată nu se recomandă să fie folosită la
dezinfectarea explantelor provenite de la speciile cu conţinut ridicat de polifenoli deoarece
determină oxidarea rapidă a acestora şi deci, brunificarea ţesuturilor.

81
Apa bromată (1-2%) se foloseşte timp de 2-10 minute şi are un efect sterilizant
foarte bun.
Azotatul de argint (1%) se foloseşte timp de 4-30 minute.
Antibioticele preparate în soluţii de 4-100 mg/l pot fi folosite ca agenţi sterilizanţi
mărind eficacitatea sterilizării. Pentru amestecul penicilină + streptomicină (1 mg/l) durata
sterilizării este de 2 ore.
În tabelul 4.1.1. sunt prezentate câteva dintre antibioticele şi substanţele
antimicotice folosite mai frecvent ca agenţi sterilizanţi la dezinfectarea explantelor sau
mediului de cultură. Prezenţa antibioticelor în mediu poate să determine apariţia unor
mutaţii mai ales la culturile susceptibile în acest sens: culturi de calus, culturi de celule,
etc. Din acest motiv, folosirea lor este relativ limitată.
În anumite situaţii, se apelează însă la antibiotice pentru înlăturarea unor infecţii
latente periculoase, dacă acestea au afectat un material biologic valoros.
Pregătirea soluţiilor de antibiotice este relativ simplă. În marea lor majoritate
antibioticele se prezintă sub formă de pulberi solubile în apă sau în câţiva solvenţi (DMSO,
DMF, etanol, HCl, NaOH etc.). Fiecare preparat are marcată pe etichetă şi activitatea
biologică exprimată în µg/mg sau unităţi/mg. În funcţie de aceasta se va calcula
concentraţia soluţiei care se va prepara, respectiv cantitatea de antibiotic care se va folosi,
astfel:
cantitatea de antibiotic = volumul de mediu x concentraţia dorită
activitate

După solubilizarea în solventul corespunzător, antibioticul se va dilua cu apă


distilată până la volumul dorit. Păstrarea soluţiei se face de regulă în frigider la 0-5°C, iar
perioada de păstrare variază de la o zi până la trei luni sau chiar la un an.
Majoritatea antibioticelor sunt termolabile motiv pentru care se recomandă
sterilizarea lor prin filtrare prin membrane speciale (acetat de celuloză).
Alte substanţe care pot fi folosite pentru sterilizare sunt clorura de var (de uz
sanitar), cloramina, formolul, permanganatul de potasiu, etc.

82
Tabelul 4.1.1.
Principalele antibiotice şi antimicotice folosite în culturile in vitro
Masă Păstrare Concentraţia
Specificaţie Solvent Diluant
molec. produs folosită
Amfotericină B 924,1 DMSO, DMF apă 0-5°C 2,5 mg/l
Ampicilină 371,3 apă apă 0-5°C 100 mg/l
Cicloheximidă 281,4 etanol apă 0-5°C 10 µg/l
Cloramfenicol 264,3 apă + NaOH apă temp. cam. 5 µg/l
Eritromicină 148,2 HCl, etanol apă temp. cam. 100 mg/l
Gentamicină sulfat 160,2 apă apă 0-5°C 50 mg/l
Kanamicină 582,6 apă apă temp. cam. 100 mg/l
Neomicin sulfat 908,9 apă apă temp. cam. 50 mg/l
Nistatin 926,1 suspensie/apă apă -0°C 50 mg/l
Penicilină G 372,5 apă apă temp. cam. 100.000 U/l
Streptomicină sulfat 1457,4 apă apă 0-5°C 100 mg/l
Tetraciclină 444,4 apă Na -0°C 10 mg/l

4.2. Sterilizarea vaselor de cultură şi a instrumentarului folosit


4.2.1. Închiderea vaselor de cultură
Vasele de cultură trebuie prevăzute cu dopuri şi capace adecvate care să prevină
deshidratarea mediului de cultură, pătrunderea unor agenţi contaminaţi din exterior şi
acumularea unor gaze nocive în atmosfera vasului (CO2, etilenă etc.). În acelaşi timp,
acestea trebuie să permită aprovizionarea cu oxigen din exterior.
Principalele mijloace şi materiale folosite pentru închiderea vaselor de cultură sunt:
- dopurile din vată. De regulă, se realizează prin învelirea vatei cu tifon după o
prealabilă presare a acesteia. Aceste dopuri au dezavantajul că nu pot fi sterilizate prin
flambare în momentul folosirii.
O altă variantă este reprezentată de dopurile din vată învelite într-o folie de
aluminiu care înlătură în bună măsură dezavantajele primelor.
Având în vedere că la prima sterilizare dopurile de vată elimină o substanţă toxică,
înainte de folosirea dopurilor noi, se va face autoclavarea acestora. Periodic, este necesar
ca această autoclavare de siguranţă să se repete.
- dopurile din plută pot fi folosite pentru eprubete, vase Erlenmayer şi alte vase de
cultură cu deschiderea îngustă. Este necesară de asemenea autoclavarea lor, iar în cazul în
care provin de la vase cu mediu infectat, se vor lua măsuri suplimentare de sterilizare (foto
4.1.).
- dopurile din cauciuc, sunt practice pentru că se pot spăla şi dezinfecta uşor în
alcool. Sterilizarea prin flambare în momentul inoculării este contraindicată şi trebuie

83
realizată rapid pentru a evita aprinderea cauciucului şi degajarea gazelor toxice în
atmosfera vasului de cultură (foto 4.2.).

Foto 4.1. Dopuri din plută Foto 4.2. Dopuri din cauciuc

- dopurile din steristop sunt realizate dintr-o celuloză poroasă. Acestea trebuie de
asemenea, protejate cu folie de aluminiu pentru a le face mai practice.
- capacele metalice trebuie să aibă un sistem adecvat de fixare la gura vasului de
cultură. Sunt opace şi necesită pentru etanşare folosirea foliei de aluminiu sau a foliei de
plastic autosigilante. În acelaşi fel, se pot utiliza capace din plastic rezistent la autoclavare.
În cazul capacelor prevăzute cu filet se va avea grijă ca la închidere să nu se
înşurubeze prea tare, pentru a se evita vidarea interiorului prin autoclavare şi pentru a
permite circulaţia aerului după inoculare.
- capacele din sticlă au avantajul că permit pătrunderea luminii pe la partea
superioară a vasului de cultură. Necesită sisteme suplimentare pentru fixare şi etanşare. În
anumite situaţii, pentru acoperirea vaselor de cultură se pot folosi vase Petri.
- folia de aluminiu este mult folosită la închiderea vaselor de cultură. Poate fi
refolosită dar are dezavantajul că uneori permite pătrunderea agenţilor patogeni din
exterior şi infectarea mediului de cultură.
- folia din material plastic (Parafilm, Vitafilm, folia din PVC, folia din
polipropilenă) poate fi folosită ca atare sau de regulă este folosită pentru etanşarea
corespunzătoare a altor sisteme de închidere prezentate anterior. Etanşarea trebuie să evite
deshidratarea mediului de cultură dar să permită schimbul activ de gaze între atmosfera
interioară şi exterior.
La alegerea sistemului şi materialului pentru închiderea vaselor de cultură (Pierik,
1987), trebuie ţinut cont de faptul că:

84
- dacă vasul este închis ermetic nu este posibilă schimbarea de CO2, O2 şi etilenă cu
exteriorul. Acumularea CO2 şi etilenei în interior precum şi lipsa oxigenului au consecinţe
nefaste. De regulă, polipropilena şi folia de aluminiu subţire etanşează perfect nepermiţând
realizarea acestor schimburi gazoase.
Cultivarea explantelor de Magnolia soulangeana în vase de cultură ermetic închise
a determinat clorozarea plantelor datorită acumulării excesive de CO2 şi etilenă. În aceste
situaţii se impune folosirea unor substanţe speciale absorbante ale etilenei (Ethy-sorb).
În prezent se realizează capace din polipropilenă prevăzute cu membrane
semipermeabile care înlătură aceste neajunsuri.
- anumite materiale sintetice folosite pentru realizarea vaselor de cultură, a
dopurilor sau capacelor elimină etilena care se poate acumula astfel în atmosfera interioară
şi poate declanşa simptome de toxicitate.
- în cazul unui vas de cultură închis etanş, evaporarea apei din interior este blocată.
În acest caz, umiditatea foarte ridicată determină apariţia vitrificării.
- sistemele de închidere opace reduc accesul luminii în interiorul vasului de cultură.
Pentru eprubete situaţia se poate rezolva prin aşezarea acestora în camera de cultură, în
poziţie înclinată, pe suporţi speciali. Prin răcirea mediului ţinând eprubetele înclinate, se
realizează în plus mărirea suprafeţei de contact a acestuia cu atmosfera vasului şi uşurarea
schimburilor gazoase.

4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultură


Recipientele din sticlă trebuie supuse unei sterilizări prealabile. După spălarea
acestora se autoclavează pentru eliminarea unor compuşi toxici înainte de folosire pentru
cultură.
Vasele de cultură folosite trebuie spălate cu atenţie cu apă caldă şi detergent, clătite
repetat cu apă distilată sau apă deionizată şi zvântate cu grijă.
Spălarea se face manual sau mecanic, folosind dispozitive simple cu perii rotative
sau maşini de spălat performante. Există şi dispozitive speciale de spălat cu ultrasunete
(foto 2.7.).
Pentru vasele care se curăţă greu se recomandă folosirea amestecului cromic în
care vasele se menţin timp de patru ore.
Amestecul cromic se obţine din bicromat de potasiu şi acid sulfuric. Pentru început
se prepară 100 ml de soluţie saturată de bicromat de potasiu prin dizolvarea la cald a 30 g

85
de bicromat de potasiu în 70 ml apă distilată. Se adaugă apoi treptat (agitând balonul în apă
rece), 300 ml de acid sulfuric concentrat.
Preparatul are o culoare brună-portocalie, este foarte toxic, coroziv şi oxidant. După
folosire se recuperează şi se poate refolosi. Când se uzează culoarea devine verde. Vasele
spălate cu amestec cromic se vor clăti cu atenţie, fără a face stropi care bine-nţeles sunt
corozivi.
În cazul vaselor de cultură cu medii puternic infectate, după o spălare
corespunzătoare se impune sterilizarea acestora în etuvă la 160°C, timp de cel puţin 3 ore.
Se va evita depăşirea temperaturii de 180°C pentru a se evita deteriorarea calităţii
sticlei.
Celelalte obiecte de sticlărie care se folosesc, se ambalează în hârtie sau folie de
aluminiu şi se sterilizează în etuvă la 120°C, timp de 1-2 ore.
Sterilizarea se poate face şi la umed în autoclav la 120-121°C, reducând timpul de
autoclavare la 30-40 de minute. În acest caz, se recomandă folosirea foliei de aluminiu, a
foliei autosigilante sau a unor pupinele speciale pentru autoclavare.
Dopurile şi capacele, în funcţie din materialul din care sunt confecţionate, se spală
şi se sterilizează prin autoclavare.
În cazul în care culturile sunt sănătoase, pentru reducerea cheltuielilor şi a
pierderilor de timp se va face sterilizarea vaselor de cultură şi a mediului prin autoclavare,
după repartizarea acestuia.
În prezent, se folosesc o serie de recipiente de cultură sau auxiliare de diferite
forme şi mărimi de unică folosinţă. Acestea se livrează în pungi din polietilenă etanşe care
se deschid în momentul folosirii, sub hota cu flux laminar.
La producător, recipientele din plastic se sterilizează prin radiaţii gamma (2000 r)
sau mai frecvent, cu oxid de propilenă.

4.2.3. Sterilizarea instrumentarului


Instrumentarul metalic folosit la secţionarea explantelor şi la pasarea lor pe mediu
(bisturie, ace spatulate, pense etc.) trebuie sterilizat frecvent. Acest lucru se face de regulă,
înaintea şi în timpul lucrului, prin flambare. În acest sens sub hotă va exista un recipient cu
spirt (96% vol. alcool) în care instrumentele respective se introduc. Se face apoi flambarea
propriu-zisă la flacăra unui bec de gaz sau a unei spirtiere şi aşezarea pe un suport pentru a

86
se răci. Se recomandă ca, după fiecare explant manipulat, să se facă sterilizarea prin
flambare a instrumentelor şi schimbarea acestora cu altele sterile.
Foarte importantă este înlocuirea periodică a alcoolului folosit pentru flambare,
deoarece prin evaporare, concentraţia sa scade, arderea este necorespunzătoare. Există
astfel riscul ca sterilizarea să fie ineficientă, infecţia transmiţîndu-se prin intermediul
instrumentelor.
Un alt mijloc folosit pentru sterilizarea instrumentelor este sterilizatorul
(incineratorul) electric (foto 4.3.). Acesta prezintă un corp găurit din cărămidă refractară în
interiorul căruia, cu ajutorul unor rezistenţe electrice, temperatura creşte până la
aproximativ 871°C. Timpul de sterilizare este de 1 minut.

Foto 4.3. Sterilizator electric pentru instrumentar

O altă variantă o reprezintă sterilizatorul cu bile din sticlă (foto 4.4.) între care se
introduc instrumentele de sterilizat. Şi în acest caz, temperatura de sterilizare este în jur de
250°C, iar timpul de sterilizare de 10-15 secunde. În nici un caz instrumentele nu se vor
lăsa în interior mai mult de 1 minut, chiar dacă sterilizatorul este prevăzut cu un termostat.
Timpul de răcire este de aproximativ 30-60 de secunde.

Foto 4.4. Sterilizator electric cu bile din sticlă

87
Sterilizatoarele prezentate sunt foarte eficiente împotriva germenilor rezistenţi la
căldură (flambare) şi la alcool. Este vorba de bacterii din genul Bacillus, aşa-numitele
“bacterii curate”, care supravieţuiesc sterilizării obişnuite prin flambare.
Pe lîngă instrumentele cu care se lucrează, este nevoie să se sterilizeze la
introducerea sub hota sterilă, lupele binocular, microscoapele, vasele cu mediu proaspăt
sau cele provenite din camera de culturi şi în general, orice obiect care se introduce din
afară.
Sterilizarea se face în acest caz prin pulverizarea obiectelor respective cu alcool
(96% vol. alcool) şi prin ştergere cu vată îmbibată în alcool.

4.3. Sterilizarea mediului de cultură şi a apei


Întrucât mediul de cultură reprezintă un suport ideal pentru creşterea unor bacterii
şi ciuperci nedorite se impune sterilizarea acestuia înainte de folosire.
În cazul în care se poate face autoclavarea mediului în aceeaşi zi, după corectarea
pH-ului, acesta se va păstra în frigider, urmând ca zaharoza şi agarul să fie adăugate înainte
de autoclavare.
Pentru a repartiza mediul de cultură în vase, după ce s-a făcut corectarea pH-ului şi
s-au adăugat agarul, zaharoza şi eventual cărbunele activ, se aşează recipientul cu mediu pe
o plită electrică cu agitator magnetic pentru solubilizarea agarului.

Foto 4.5. Plită electrică cu agitator magnetic

88
Operaţia este încheiată când mediul devine perfect transparent şi dispar particulele
de agar aflate în suspensie. Acest lucru este marcat şi de apariţia primelor bule de aer la
fundul vasului, indicând începutul fierberii.
Pentru dizolvarea agarului în mediul de cultură se folosesc şi recipienţi speciali din
oţel inoxidabil, prevăzuţi cu rezistenţe electrice şi agitare magnetică.
Pentru repartizarea mediului de cultură în vase se pot folosi seringi dozatoare de
mică capacitate (1-10 ml) care permit reglarea volumului de mediu distribuit (foto 2.4. şi
2.5.) precum şi dozatoare cu pompe aspiro-respingătoare pentru volume mai mari de mediu
(50-100 ml/vas) (foto 2.6.).
După repartizarea mediului vasele de cultură se închid şi se etichetează precizând
sigla mediului şi data preparării.
Autoclavarea se face în autoclave speciale electrice sau cu gaz, prevăzute cu
instrumente pentru controlul temperaturii şi presiunii, temporizatoare şi dispozitive de
siguranţă.
Timpul de sterilizare este corelat cu volumul de mediu existent în vasele de cultură
variind în general de la 15 minute la 30-40 de minute.
Timpul minim de autoclavare este compus de fapt din timpul necesar mediului de
cultură pentru a ajunge la temperatura de 121°C, la care se adaugă 15 minute de sterilizare
propriu-zisă la aceeaşi temperatură.
Temperatura optimă pentru autoclavare este de 121°C în prezenţa aburilor ceea ce
corespunde cu o presiune de 1 atm (1,05 kg/cm2). Alţi autori (Gautheret, 1959)
recomandau autoclavarea mediilor la 115°C timp de o oră (volume de 3-5 litri) şi repetarea
autoclavării după 24 ore. Această tehnică ar reduce degradarea unor componenţi
termolabili.
În lipsa unor autoclave speciale, sterilizarea mediului se poate face şi în oale de
gătit sub presiune (tip Kukta). Şi în acest caz se va face sterilizarea mediului introducând în
oală un strat corespunzător de apă pentru formarea aburilor.
Timpul de sterilizare se va măsura din momentul în care ies primii aburi din supapa
de siguranţă.

89
Tabelul 4.3.1.
Corelaţia dintre timpul minim de sterilizare şi volumul de mediu existent
în vasul de cultură
Volumul de mediu din vas Timpul minim de autoclavare
ml min
25 20
50 25
100 28
250 31
500 35
1000 40
2000 48
4000 63

În toate cazurile, pentru a se realiza răcirea rapidă a mediului, autoclavele vor fi


deschise numai după ce s-a realizat depresurizarea incintei.
Substanţele termolabile: giberelinele, zeatina, ureea, piridoxina, tiamina, glutamina,
etc. se vor steriliza prin filtrare, după autoclavarea mediului de bază.
Sterilizarea prin filtrare se poate realiza şi pentru întreaga cantitate de mediu (fără
agar). Acest lucru este posibil folosind nuci filtrante din sticlă cu porozitate de 1 micron
(filtru Jena tip F şi Pyrex tip 5H) sau filtre de unică folosinţă tip Millipor (foto 4.6.) cu
porozitate de 0,5-0,2 microni.
În primul caz se folosesc seringi şi vase din sticlă în timp ce sistemul Millipor
presupune folosirea unor seringi de unică folosinţă. Filtrele Millipor trebuie spălate înainte
de folosire cu apă distilată sterilă pentru a îndepărta urmele de detergent pe care le conţin.
Sterilizarea prin folosirea la rece este o metodă greoaie şi poate fi aplicată doar
pentru mediile lichide.
Uneori pentru uşurarea filtrării se folosesc dispozitive de filtrare care se racordează
la pompa de vid (foto 4.7.).

Foto 4.6. Filtre de unică folosinţă Foto 4.7. Sistem de filtrare sub vid

90
Sterilizarea “la rece” a unor substanţe termolabile, se poate face şi prin amestecarea
acestora (dizolvarea) cu alcool etilic, eter etilic, acetonă în incintele sterile. După
evaporarea substanţelor sterilizante, substanţa termolabilă se repartizează în mediu.
O altă practică folosită, este introducerea unor substanţe sterilizante în mediul de
cultură. Aceste substanţe împiedică dezvoltarea ciupercilor şi bacteriilor. Ca agenţi
sterilizanţi se foloseşte o gamă largă de antibiotice (penicilină, streptomicină,
cloranfenicol), conservanţi alimentari (salicilat, etc.) sulfamide, oxid de propilenă (1 ml, la
20 ml mediu).
Apa folosită pentru diferite faze ale culturilor in vitro, dar mai ales pentru clătirea
explantelor după sterilizare, trebuie să treacă şi ea printr-un proces de sterilizare.
Acest lucru se realizează prin autoclavare în recipiente din sticlă. Închiderea vaselor
nu se va face etanş, pentru a se permite aburilor sub presiune să intre în interior.
Frecvent, în apa folosită pentru sterilizare se introduc substanţe antioxidante (PVP,
0,1%).

4.4. Dezinfectarea materialului vegetal


Înaintea folosirii pentru culturile in vitro, materialul vegetal trebuie pregătit cu
minuţiozitate. Această pregătire diferă în funcţie de provenienţa materialului respectiv:
câmp sau spaţii protejate.
Materialul vegetal provenit din câmp are un grad de infecţie sporit, motiv pentru
care înainte de a fi folosit trebuie supus unor operaţii suplimentare de pregătire:
- mugurii se vor folosi înainte de a se deschide şi când sunt încă protejaţi de catafile;
- dacă materialul este reprezentat de ramuri cu muguri acestea se vor parafina la vârf şi
vor fi puse în vase cu apă pentru forţare. În prealabil, se recomandă îmbăierea lor într-o
soluţie de fungicid (Topsin 0,1%; Ronilan, Rovral, Benlate);
- dintre lăstari se vor alege întotdeauna lăstarii cei mai tineri şi porţiunile finale ale
lăstarilor;
- dacă este posibil, plantele se vor transfera din câmp în containere, în sere sau camere
de creştere şi se vor folosi numai părţile crescute ulterior.
Reducerea gradului de infecţie a materialului iniţial provenit din spaţii închise (sere,
solarii) se poate face prin:
- reducerea atacului de insecte vectoare care pot transporta agenţi patogeni;

91
- prevenirea atacului de bacterii şi ciuperci prin aplicarea tratamentului cu fungicide
sistemice şi de contact;
- irigarea plantelor folosind sisteme de udare la sol: picurare, scurgerea la suprafaţă etc.
- păstrarea la valori scăzute a umidităţii în sere;
- zvântarea plantelor înainte de dezinfectare.
Tipul de organ folosit pentru inoculare este de asemenea determinant pentru alegerea
modului de dezinfectare şi a agentului sterilizant.
În general, bulbii, tuberculii, rădăcinile tuberizate şi alte organe subterane, au un
grad ridicat de infecţie. Dacă este posibil, aceste organe vor fi puse în prealabil la forţare
pentru a obţine noi creşteri (lăstari) care vor fi folosite apoi pentru inoculare. Dacă însă se
urmăreşte inocularea unor muguri, fragmente de disc, catafile etc., se va spăla foarte bine
materialul şi se vor lua măsuri suplimentare de dezinfectare.
Mugurii pubescenţi, ramurile cu lentile numeroase, tulpinile, lăstarii sau frunzele
pubescente se dezinfectează greu datorită fixării germenilor pe formaţiunile respective şi
datorită dificultăţii cu care agentul sterilizant pătrunde la suprafaţa organului respectiv.
Reducerea tensiunii superficiale a lichidului dezinfectant se face prin adăugarea
câtorva picături de detergent lichid (Tween 20 sau 80).
Pentru a favoriza pătrunderea dezinfectantului în profunzime, sub solzi sau printre
perişori, se poate face şi dezinfectarea sub vid folosind un vas ataşat la o pompă de vid
(foto 4.7.).
Metoda de dezinfectare folosită va ţine seama întotdeauna de natura suprafeţelor
care urmează să fie dezinfectate. Se va lua în calcul de asemenea, permeabilitatea
epidermelor sau învelişurilor pentru agentul sterilizant şi se va ţine cont de modul în care
acesta poate afecta viabilitatea ţesutului ţintă.
La dezinfectarea unor explante aflate în organe de rezervă, rizomi, bulbi,
tuberculi, a unor muguri (atunci când se urmăreşte prelevarea meristemelor, a unor sâmburi
şi seminţe protejate de endocarp sau tegumente puternice, a unor fructe uscate etc., se pot
folosi concentraţii ridicate şi timpi de dezinfecţie mari.
Pentru îmbunătăţirea efectului dezinfectant se recomandă câteva măsuri:
- înlăturarea părţilor exterioare ale organelor: solzi protectori, catafile, etc.
- spălarea intensă cu apă a materialului vegetal înainte de dezinfectare;

92
- scufundarea explantelor pentru câteva secunde în alcool de 70% înaintea
dezinfectării chimice. Operaţia are ca scop eliminarea bulelor de aer de la suprafaţa
explantului şi uşurarea pătrunderii agentului chimic;
- adăugarea unor detergenţi (Tween 20 sau 80) în soluţia de dezinfectat în
concentraţie de 0,08-0,12% pentru reducerea tensiunii superficiale a acesteia;
- agitarea în timpul dezinfectării, manual, sau cu un agitator magnetic;
- folosirea dezinfectării sub vid pentru o mai bună impregnare a explantului cu
agentul dezinfectant.

4.5. Contaminările şi detectarea lor


Cauzele apariţiei infecţiilor în vasele de cultură pot fi multiple:
- dezinfectarea ineficientă a inoculilor iniţiali;
- infecţii interne;
- tehnică de lucru necorespunzătoare: mâini murdare, masă de lucru nesterilizată, unelte
nesterilizate, îmbrăcăminte murdară, instrumentar nesterilizat corespunzător etc.
- hotă improprie: filtre îmbâcsite cu praf, flux de aer necorespunzător ca uniformitate şi
viteză, orificii în filtre sau la locurile de îmbinare etc.
- alcool pentru flambarea instrumentarului contaminat. Prin folosirea îndelungată sub
hotă alcoolul se evaporă şi scade concentraţia;
- vasele de cultură au pe pereţii exteriori agenţi patogeni (păstrare în spaţii neadecvate);
- camera de inoculare murdară, nespălată şi nedezinfectată periodic;
- camera de inoculări nu este sterilă;
- accesul persoanelor străine neechipate corespunzător;
- pătrunderea în vasele de cultură a unor vectori (acarieni etc.) etc.
În anumite situaţii culturile sunt aparent sterile dar în momentul divizării explantelor şi
trecerii pe un alt mediu, sau prin pasarea pe un mediu bogat, se constată o infecţie
masivă.
Acest lucru se datorează faptului că agentul patogen se află în ţesuturi sau nu se
dezvoltă pe un mediu sărac.
Infecţiile latente (interne) reprezintă o problemă serioasă pentru culturile in vitro.
Ele se datorează unor agenţi patogeni aflaţi în interiorul plantei şi care nu pot fi distruşi
prin dezinfecţie exterioară.

93
Pentru rezolvarea acestei probleme ar fi posibilă cultura de meristeme şi folosirea
antibioticelor în mediul de cultură. Acestea din urmă însă, au deseori efecte fitotoxice.
În mod normal, se folosesc combinaţii de antibiotice diferite pentru a obţine un
efect acceptabil. Unii autori afirmă că folosirea antibioticelor stimulează creşterea
explantelor.
Pentru identificarea infecţiilor latente se recomandă cultivarea unor explante pe
medii bogate care conţin peptone sau triptone (2-3%) sau folosirea unor soluţii pentru
incubat care devin tulburi în prezenţa bacteriilor.
Există bacterii Bacillus licheniformis, B. subtilis rezistente la mijloacele comune
de sterilizare care terorizează laboratoare întregi (în laboratoarele din S.U.A. au fost
denumite “Fantoma albă” - “White ghost”).
Tabelul 4.5.1.
Medii folosite pentru identificarea infecţiilor bacteriene latente

Substanţa A B C D
g/l g/l g/l g/l
PPLO (Difco) 21,0 - - -
Triptone 10,0 - 15,0 -
Glucoză 1,0 1,0 - 24,0
Fructoză 1,0 - - -
Zaharoză 10,0 - - -
Sorbitol 70,0 - - -
Extract de drojdie 100,0 5,0 - 2,4
(soluţie 25%) (ml)
Ser de cal 200,0 - - -
Roşu de fenol 25,0 - - -
Peptone de cazeină - 5,0 - -
Peptone de soia - - 5,0 -
Agar - 15,0 15,0 -
NaCl - - 5,0 1,2
NH3PO4 - - - 1,2
K2HPO4 - 1,0 - 1,2
MgSO4 . 7H2O - - - 0,48

94
Capitolul 5
Microînmulţirea plantelor horticole

5.1. Consideraţii generale


Microînmulţirea plantelor in vitro prezintă o serie de avantaje (Pierik, 1987) care
au impus-o în faţa celorlalte metode de înmulţire: generativă şi vegetativă clasică:
- înmulţirea in vitro este mult mai rapidă decât in vivo, într-un an dintr-un explant fiind
posibil să se obţină peste 1 milion de exemplare;
- multe specii care nu pot fi înmulţite in vivo sau care se înmulţesc greu, pot fi
înmulţite in vitro în urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;
- creşterea plantelor înmulţite in vitro este mai puternică fapt datorat juvenilizării şi
devirozării. La căpşun, Cameron şi colab. (1986) a observat că, creşterea mai puternică a
explantelor obţinute in vitro se datorează modificărilor survenite în schimburile gazoase
ale acestora;
- este posibilă obţinerea şi înmulţirea plantelor libere de virusuri cu toate avantajele
care decurg de aici;
- plantele cultivate in vitro pot fi transportate în condiţii de siguranţă fitosanitară
desăvârşite putând fi schimbate, exportate sau importate;
- pentru iniţierea unui culturi in vitro este nevoie de o cantitate redusă de material
biologic. Pentru amelioratori acest lucru este foarte important încât se poate realiza o
selecţie drastică a materialului biologic şi în plus, se pot înmulţi indivizi deosebiţi obţinuţi
prin hibridări sau mutante apărute;
- se realizează importante economii de teren, spaţiu, energie şi combustibil;
- oferă posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la creşterea
productivităţii şi eficienţei culturilor şi la înlăturarea periodicităţii producţiei determinată
de anotimpuri. Se poate, de asemenea planifica producţia de plante obţinute in vitro în
funcţie de necesităţile concrete ale pieţii;
- înmulţirea in vitro permite obţinerea plantelor pe rădăcini proprii, înlăturând altoirea
cu toate dezavantajele pe care aceasta le presupune;
- materialul produs in vitro poate să fie conservat prin diferite metode şi folosit în
momentul în care este cerut;

95
- pentru ameliorarea plantelor microînmulţirea in vitro oferă avantaje suplimentare:
• se scurtează timpul necesar producerii şi lansării unui soi;
• se pot obţine şi înmulţi clone homozigote care să fie folosite pentru producerea
hibrizilor F1;
• prin utilizarea agenţilor mutageni în diferite faze şi tipuri de culturi in vitro se pot obţine
şi selecţiona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus şi la
regenerarea de lăstari adventivi din mezofil;
• prin cultura explantelor in vitro în condiţii extreme, se poate realiza stres-selecţia
genotipurilor noi (ex. rezistenţa la sărături);
• manipulările genetice de tipul hibridărilor somatice nu se pot concepe fără folosirea
culturilor de celule şi protoplaşti in vitro;
• anumite plante necesită înmulţire vegetativă exclusivă: haploizii, mutantele sterile,
liniile mascule sterile folosite la hibridări, aneuploizii sau heterozigoţii deosebiţi;
• materialul genetic valoros poate fi conservat în bănci de gene sub formă de explante in
vitro.
Folosirea microînmulţirii in vitro este limitată uneori de anumite dezavantaje:
- în anumite situaţii, stabilitatea genetică a materialului înmulţit in vitro este redusă;
- plantele înmulţite in vitro prezintă uneori defecte caracteristice şi după ce sunt
trecute in vivo: juvenilitate accentuată manifestată prin frunze necaracteristice, prezenţa
spinilor etc., lăstărire adventivă, fructificare întârziată, vigoare exagerată, pierderea
caracterului dominant;
- uneori înrădăcinarea explantelor înmulţite in vitro este greoaie sau imposibilă. De
regulă, rădăcinile formate in vitro au o funcţionalitate redusă, ele fiind înlocuite de alte
rădăcini în faza de aclimatizare;
- aclimatizarea plantelor obţinute in vitro este foarte dificilă datorită unor modificări
morfo-anatomice şi fiziologice care apar pe durata cultivării in vitro. Pentru realizarea
aclimatizării trebuie construite structuri speciale, sere, solarii dotate cu dispozitive de
control al factorilor de mediu;
- clonarea exagerată favorizează creşterea riscurilor de distrugere în masă a unor clone
de către rase virulente de boli şi dăunători apărute ulterior. Pentru evitarea acestor situaţii
se va opta pentru varianta înmulţirii şi plantării multiclonale;
- capacitatea regenerativă a explantelor poate să se reducă sau să se piardă prin culturi
repetate, după un număr mare de subculturi;

96
- în anumite situaţii, sterilizarea totală a materialului iniţial este dificilă sau imposibilă;
- microînmulţirea in vitro presupune existenţa unor structuri specializate şi a unei forţe
de muncă calificate.

5.2. Fazele microînmulţirii in vitro


5.2.1. Pregătirea materialului vegetal
Prima fază a microînmulţirii in vitro este o fază importantă mai ales pentru speciile
lemnoase care trebuie să treacă printr-o fază de juvenilizare. Juvenilizarea materialului
biologic ce urmează să fie înmulţit in vitro, se poate realiza prin:
- tăieri repetate, puternice, fiind stimulate astfel creşterile noi;
- prin butăşire;
- prin altoiri repetate sau microaltoire.
Materialul biologic juvenil se poate obţine şi prin germinarea sâmburilor şi
seminţelor atunci când este posibil.
În acelaşi timp, faza de pregătire presupune cultivarea plantelor destinate prelevării
de explante, în spaţii închise pentru prevenirea sau reducerea contaminărilor sau pentru
efectuarea unor tratamente fitosanitare eficiente. Se recomandă cultivarea plantelor în
sistem hidroponic sau alte sisteme „hors sol”.
Pentru iniţierea culturii, în perioada de repaus, ramurile sunt forţate în camera de
creştere în vederea umflării mugurilor şi pornirii în creştere a lăstarilor (foto 5.1.)

Foto 5.1. Ramuri anuale de fag puse la forţare

97
5.2.2. Iniţierea şi stabilizarea
Faza de iniţiere şi stabilizare a culturilor in vitro presupune, sterilizarea materialului
vegetal, izolarea explantelor (meristeme, apexuri, fragmente uninodale, seminţe, frunze
etc.) şi inocularea acestora pe un mediu de iniţiere (foto 5.2., 5.3.).

Foto 5.2. Apexuri de lăstari de fag în faza de iniţiere şi stabilizare

Mediile de iniţiere sunt în general variante ale mediilor obişnuite, recomandate


pentru specia respectivă, având însă concentraţia de săruri redusă la jumătate. Frecvent în
această fază, se folosesc reţete de medii lipsite de hormoni.

Foto 5.3. Plantulă de cicoare (Cichorium intybus) obţinută prin germinare in vitro
(Diaconescu O., 2002)

98
De asemenea, este importantă realizarea culturii aseptice şi începerea creşterii
explantelor. Pentru depistarea infecţiilor latente sunt necesare teste suplimentare pe medii
bogate în zaharuri, peptone, etc.

5.2.3. Multiplicarea
Faza de înmulţire (multiplicare) se întinde pe mai multe subculturi cu o durată de 3-
4 săptămâni. În această fază, scopul principal este creşterea ratei de multiplicare în
condiţiile menţinerii stabilităţii genetice a materialului. Creşterea ratei de multiplicare se
poate obţine prin stimularea lăstării axilare (foto 5.4.), prin stimularea alungirii lăstarilor,
sau prin ambele metode simultan (foto 5.5., 5.6.).

a b
Foto 5.4. Multiplicarea prin lăstărire axilară la cicoare (a) şi hosta (b)

Foto 5.5. Începerea multiplicării la


Hakonechloa aureola-graminee Foto 5.6. Multiplicarea la măr – soiul Fuji
ornamentală

99
Acest deziderat se realizează, în general, prin creşterea cantităţii de citochinine din
mediu sau, prin realizarea unui balanţe hormonale înclinate în favoarea citochininelor.
Numărul de subculturi trebuie să fie limitat (variază cu specia) şi orice prelungire a
fazei respective necesită verificări suplimentare a stabilităţii genetice a materialului.

5.2.4. Înrădăcinarea
Faza de înrădăcinare sau de pregătire a materialului pentru trecerea in vivo este o
fază importantă care constă în reducerea lăstăririi axilare, stimularea alungirii lăstarilor,
inducerea formării rădăcinilor sau chiar formarea rădăcinilor (foto 5.7.).

Foto 5.7. Rozete de Gasteria înrădăcinate in vitro

Frecvent în această fază, se folosesc medii de cultură adiţionate cu cărbune vegetal,


lipsite de hormoni sau cu concentraţii mai ridicate în auxine (Stănică şi colab. 2003).
O altă variantă constă din cultivarea pe un mediu cu concentraţie ridicată de auxine
o anumită perioadă urmată de cultivarea pe un mediu fără hormoni.
Din raţiuni economice, însă, tot mai multe laboratoare industriale optează pentru
realizarea înrădăcinării simultan cu aclima-tizarea (foto 5.8.).

100
Foto 5.8. Înrădăcinarea in vivo a lăstarilor de smochin, simultan cu aclimatizarea

5.2.5. Aclimatizarea
Faza de aclimatizare este cea mai dificilă etapă în producerea materialului
microînmulţit. Lăstarii înrădăcinaţi sau cu primordii de rădăcini sunt trecuţi în amestecuri
de pământ (foto 5.9.) şi apoi menţinuţi într-un spaţiu caracterizat prin umiditate relativă
ridicată şi temperatură controlată (foto 5.10.).

Foto 5.9. Transferul plantelor obţinute


Foto 5.10. Solar pentru aclimatizarea
in vitro pentru înrădăcinare şi
plantelor obţinute in vitro la firma
aclimatizare in vivo la firma Vitroplant,
Vitroplant, Italia
Italia

101
Înainte de a fi folosit pentru producţie materialul săditor de pomi şi viţă de vie
trebuie să fie plantat în câmp sau solar, pentru creştere şi fortificare (foto 5.11., 5.12.,
5.13.).

Foto 5.11. Plantă de smochin aclimatizată înaintea fortificării

Foto 5.12. Şcoală pentru fortificarea materialului săditor microînmulţit de actinidia


la firma Vitroplant Cesena, Italia

102
Foto 5.13. Plante de măslin înmulţite in vitro la încheierea procesului de fortificare
în solar (Vitroplant, Cesena, Italia)

5.3. Cultura de meristeme şi apexuri


Plantele superioare deţin ţesuturi cu o mare capacitate de proliferare care au ca rol
creşterea în lungime a unor organe, îngroşarea altora şi chiar generarea de noi organe atât
la nivelul tulpinii cât şi al rădăcinii.
Aceste ţesuturi denumite meristeme de creştere, sau simplu, meristeme, sunt
alcătuite din celule bogate în citoplasmă, cu numeroase mitocondrii, cu nucleu mare şi cu
vacuole reduse ca dimensiuni. Pereţii celulari sunt subţiri, celulozici iar forma celulelor
variază de la poligonală la tabulară.

5.3.1. Clasificarea meristemelor


Meristemele se pot clasifica după mai multe criterii, astfel:
1. După tipul structurilor pe care le formează meristemele sunt clasificate în
meristeme organogene şi meristeme histogene. Din acest punct de vedere se cunosc
meristemele primare, meristemele secundare şi cele speciale.
Meristemele primare sunt de mai multe feluri:
- meristeme terminale (apicale) sunt situate în vârful ramificaţiilor tulpinii şi
rădăcinii asigurând creşterea acestora în lungime. Aceste meristeme se formează în
momentul în care ia naştere embrionul şi rămân active o perioadă îndelungată. În decursul

103
anului există perioade de diviziune intensă a celulelor meristematice (perioada vegetativă)
şi perioada de repaus relativ (în timpul sezonului rece).
În perioadele de inactivitate relativă meristemele sunt protejate în structuri de tipul
mugurilor. Se cunoaşte procesul de inhibiţie corelativă pe care meristemele apicale îl
manifestă în raport cu cele axilare, fapt explicat prin conţinutul ridicat în auxine al celor
dintâi.
- meristeme axilare (laterale) - se formează la subsuoara frunzelor pe lăstarii în
creştere. Formarea lor este legată de evoluţia meristemului apical.
Prin diviziunea rapidă a celulelor meristematice existente la nivelul meristemului
terminal se formează spre exteriorul conului de creştere primordiile foliare iar la subsuoara
acestora, primordiile mugurilor laterali (axilari). Primordiile mugurilor axilari sunt
alcătuite la rândul lor, din celule de tip meristematic cu rol în dezvoltarea viitorilor muguri.
În acelaşi timp, spre baza conului de creştere în zona centrală, se formează vasele
conducătoare şi ţesut parenchimatic.
La plantele perene, formarea meristemelor laterale are loc deci, cu un an înaintea
pornirii lor în activitate.
- meristeme adventive - sunt în general meristeme profunde situate atât pe tulpină
cât şi pe rădăcină, în zona periciclului. Activarea acestor meristeme se face frecvent la
speciile care emit drajoni sau în situaţia în care planta pierde din diferite cauze, organe sau
părţi importante. În acest caz, meristemul adventiv va genera organe sau structuri similare
pentru compensarea pierderilor.
- meristemele intercalare se găsesc la monocotiledonate, fiind situate la baza
internodiilor.
- meristemele foliare sunt meristeme de tip adventiv care prezintă importanţă în
generarea unor organe noi, lăstari sau rădăcini, la speciile cu înmulţire vegetativă, prin
frunze sau fragmente de frunze. Aceste meristeme au un rol esenţial în regenerarea unor
structuri noi în cazul organogenezei directe şi a embriogenezei somatice.
Meristemele secundare se întâlnesc la speciile lemnoase, care prezintă creştere în
grosime la nivelul tulpinii sau rădăcinii. Dintre meristemele caulinare cambiul, generează
elemente conducătoare liberiene spre exterior şi vase lemnoase spre interior. În culturile in
vitro cambiul este folosit frecvent ca ţesut regenerativ.
Felogenul, denumit şi strat regenerator subero-felodermic, produce suber spre
exterior şi feloderm spre interiorul organului.

104
Meristemele speciale (Hoza D., 1996) sunt caracteristice organelor şi ţesuturilor
cultivate in vitro. Ele au proprietăţi similare meristemelor primare şi dau naştere la
structuri noi de tipul lăstarilor, rădăcinilor sau embrionilor somatici.
Promeristemul apare la nivelul calusului sau a ţesuturilor care au suferit procese
de dediferenţiere. Fiind un ţesut meristematic în fază incipientă, evoluţia sa ulterioară este
influenţată de condiţiile de cultură.
Meristemoidul este folosit ca termen tot pentru a defini o structură asemănătoare
promeristemului şi care poate evolua diferit.
Unii autori (Margara 1982, citat de Cachiţă Cozma, 1984) consideră că
meristemoidul este diferenţiat deja funcţional fiind de tip proliferativ, când dă naştere la
calus, rizogen şi caulogen, când formează rădăcini respectiv lăstari.
Cu toate că se afirmă că meristemul radicular la angiosperme este diferit de cel
caulinar, cele două nefiind interconvertibile, cercetările proprii au dovedit contrariul
(Stănică, 1998).
Astfel, cultivate pe un mediu bogat în citochinine rădăcinile de kiwi au generat
lăstari, în timp ce limbul foliar cultivat pe un mediu cu conţinut ridicat de auxine (Stănică,
1994) a dat naştere la rădăcini (foto 5.14.).
Embrioidul este o structură evoluată care este capabil să genereze elemente
bipolare de tipul embrionilor somatici.

Foto 5.14. Formarea rădăcinilor direct din limbul foliar la kiwi

105
Formarea embrioizilor are loc prin procese de diferenţiere în masa celulară a
calusului sau direct prin embriogeneză adventivă la nivelul altor organe (limb foliar,
cotiledoane, etc.).
Meristemului apical la angiosperme este alcătuit din două părţi principale: tunica şi
corpusul.
Tunica este formată din 1-3 straturi de celule care se divid anticlinal pe un plan
perpendicular pe suprafaţă. Ea asigură alungirea conului de creştere.
Corpus - corpul meristemului este format din celule care se divid în toate sensurile.
Aceste celule dau naştere primordiilor foliare şi primordiilor de muguri spre exterior iar
spre bază din zona axială iau naştere vasele conducătoare şi ţesuturile paranchimatice.
2. După zona în care se găsesc meristemele, acestea pot fi meristeme
radiculare sau meristeme caulinare.
Meristemele radiculare au o structură mai simplă şi funcţii limitate. În cadrul
meristemelor radiculare întâlnim:
- meristeme apicale - situate în vârful rădăcinilor sub piloriză (scufie), care au rolul
de a asigura creşterea în lungime a acestora;
- meristeme laterale - situate pe rădăcinile principale cu rol în formarea de noi
ramificaţii;
- meristeme adventive - situate în periciclu având rolul de a naştere la lăstari
(drajoni) sau alte rădăcini.
Meristemele caulinare sunt mult mai complexe din punct de vedere structural şi
funcţional.
La nivelul tulpinii se întâlnesc toate tipurile de meristeme a căror evoluţie este
diferită în funcţie de o serie de factori: nutriţionali, hormonali, de mediu, tehnologic, etc.

5.3.2. Cultura de meristeme


Meristemele caulinare sunt folosite în mod normal pentru a fi cultivate pe medii
aseptice in vitro.
Datorită totipotenţei de care dau dovadă meristemele caulinare, ele vor fi capabile
să genereze organe diferite, deci, în final, plante întregi.
În general, se folosesc pentru iniţierea de culturi meristematice terminale şi cele
axilare (laterale). Acestea sunt capabile să genereze in vitro plăntuţe, care sunt folosite apoi
pentru înmulţirea rapidă.

106
Primele încercări de cultivare a meristemelor caulinare şi radiculare in vitro au fost
făcute în 1922 de câtre Kotte la mazăre şi de către Robbins la porumb. Abia în 1946, Ball a
reuşit să obţină plante din apexuri meristematice de Lupinus albus şi Tropaellum majus.
Ulterior, Wetmore şi Morel, citaţi de Cachiţă-Cozma (1984) au studiat comportarea
meristemelor provenite de la diferite specii, în diferite condiţii de cultură.
Epoca optimă pentru prelevarea meristemelor variază de la caz la caz. De regulă se
evită perioadele de latenţă a organelor când activitatea meristematică este redusă.
La garoafe, cel mai mare procent de supravieţuire 1-au avut meristemele recoltate
primăvara sau toamna devreme, în timp ce cele recoltate iarna au înrădăcinat mai uşor, iar
cele recoltate vara au prezentat cel mai ridicat grad de devirozare.
La cartof, meristemele recoltate primăvara şi vara formează plante care
înrădăcinează mai bine decât cele recoltate în a doua parte a anului.
Prelevarea meristemelor se face după sterilizarea prealabilă a materialului vegetal.
În cazul garoafelor, având în vedere că meristemele sunt bine protejate de primordiile
frunzelor se poate renunţa la sterilizare.
La speciile lemnoase care prezintă meristeme protejate de catafilele mugurilor,
sterilizarea poate să se facă la concentraţii mai ridicate ale agenţilor sterilizanţi.
Ulterior prelevarea meristemelor se face la hotă sub o lupă binocular. Se înlătură
treptat catafilele şi primordiile frunzelor cu ajutorul bisturiului şi a unor ace spatulate până
se ajunge la domul meristematic. Excizarea acestuia se face prin una sau două tăieturi
urmărind detaşarea unei cantităţi cât mai reduse din ţesutul aflat dedesubt.
Pentru uşurarea lucrului, la muguri vegetativi proveniţi de la speciile lemnoase
înainte de "dezvelirea" domului meristematic sub lupă, se poate recurge la eliminarea prin
patru tăieturi paralele cu marginile mugurilor a aproximativ 50% din volumul acestora.
Tăierea se va face antrenând şi scoarţa adiacentă de pe ramură şi înlăturând astfel şi
eventualele riscuri de infecţie.
Se ajunge astfel în vecinătatea meristemului şi se continuă operaţia sub lupa
binocular.
După detaşare, meristemul este aşezat uşor de pe lama bisturiului pe mediul de
cultură. Eventual cu ajutorul vârfului bisturiului se face o mică incizie în masa mediului în
care se va aşeza meristemul.
O altă variantă este aceea prin care se cultivă pe mediu meristemul însoţit de mai
multe primordii foliare. În acest caz, după dezinfecţia mugurilor se înlătură numai

107
catafilele exterioare ale acestora. Mugurele „dezbrăcat” în acest fel este inoculat pe mediu
şi va porni în creştere în aproximativ două săptămâni. Metoda poate fi folosită pentru
iniţierea culturilor in vitro la speciile lemnoase (foto 5.15. a şi b)

a b
Foto 5.15. Iniţierea culturii cu meristeme şi primordii foliare
a – Acer platanoides Drumondi, b – Carpinus betulus Fastigiata

Mediul de cultură folosit este de regulă mediul solid, putându-se însă folosi şi medii
lichide (foto 5.16), meristemele sau apexurile, aşezându-se în acest caz, pe punţi de hârtie.
Frecvent se recomandă reducerea conţinutului de macroelemente la 1/2 (Standardi,
1982). pH-ul mediului variază între 5,5-5,8.

Foto 5.16. Explante de kiwi (Actinidia deliciosa) provenite din apexuri


şi cultivate pe mediu lichid

108
Concentraţiile de hormoni sunt reduse 0,1-,5 µm/1, auxinele şi citochininele fiind
indicate pentru stimularea diviziunii celulare, iar giberelinele (GA3) pentru stimularea
alungirii lăstarilor.
Intensitatea luminoasă variază de la caz la caz, în general recomandându-se 2400-
2600 lucşi, cu o perioadă de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. La unele specii, ţinerea
meristemelor la întuneric timp de 3-7 zile, are ca efect reducerea brunificărilor (Stănică şi
colab., 1992).
Există situaţii când intensitatea luminoasă trebuie să atingă valori de 3000-4000
lucşi sau chiar de 10000 lucşi la conifere. Uneori se recomandă suplimentarea luminii
fluorescente, cu lumină roşie.
Temperatura optimă este de 22-25°C. Sunt situaţii în care cultivarea meristemelor
la temperaturi mai ridicate are un efect mai drastic în eradicarea virusurilor (viţa de vie).
După începerea formării lăstarilor din meristeme se trece la înmulţirea acestora
folosind un procedeu adecvat.
Astfel, se poate realiza minibutăşirea lăstarului prin secţionarea lui în fragmente
uninodale sau stimularea lăstăririi axilare şi izolarea lăstarilor formaţi.
Avantajele folosirii meristemelor (după Cachiţă-Cozma, 1984) sunt multiple:
posibilitatea înmulţirii clonale a materialului biologic valoros; eliminarea bolilor şi
dăunătorilor periculoşi; obţinerea unui material juvenilizat cu capacitate mare de
multiplicare; conservarea prin frig a inoculilor valoroşi până în momentul folosirii;
realizarea băncilor de gene.

5.3.3. Cultura de apexuri


Pe lângă folosirea meristemelor, iniţierea culturilor in vitro se poate face şi prin
folosirea unor apexuri de lăstari. Vârful de creştere al lăstarului, însoţit de 1-2 frunze în
formare, este detaşat după o prealabilă sterilizare şi inoculat pe mediul de cultură. Cel mai
bun moment pentru inoculare este perioada de creştere intensă a lăstarilor.
Lăstarii pot proveni de la plante cultivate în câmp sau în seră. În acest caz însă,
gradul de infectare a materialului este ridicat.
O soluţie mult mai practică este obţinerea lăstarilor în laborator prin punerea la
forţare a unor ramuri anuale. În acest scop, ramurile se fasonează în butaşi de 10-15 cm, se
parafinează la vârf şi eventual se dezinfectează prin îmbăiere într-o soluţie de fungicide. Se
pun apoi în vase cu apă la temperatură ridicată (în camera de culturi) urmând ca în 10-14

109
zile mugurii să se deschidă şi să se formeze lăstarii care vor fi folosiţi pentru prelevarea
apexurilor (foto 5.17., 5.18.).

Foto 5.17. Ramuri de kiwi (Actinidia arguta) puse la forţat

Foto 5.18. Coarde de viţă de vie puse la forţat în vederea prelevării apexurilor

110
În tabelele următoare, sunt prezentate câteva din realizările obţinute prin cultura de
meristeme şi apexuri la plantele horticole: legume (5.3.1.), flori (5.3.2.), pomi şi arbuşti
fructiferi (5.3.3.), arbori şi arbuşti ornamentali (5.3.4.) şi viţă de vie (5.3.5.). Sunt indicate
mediile de cultură folosite, rezultatul cercetărilor şi bineînţeles, autorii.

111
Tabelul 5.3.1.
Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele legumicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Plantulă înrăd. Havel & Novak (1985) 5,6 30 8 (0,1)BAP+/- ANA Havel&Novak 1985
Apium graveolens Plantule via Murashige&Skoog - 30,8 agar (1)2,4-D+(1)BAP Rappaport et al.
calus (1962) (1980)
Asparagus Lăstari Doré (1975) CMI 5,6 20 6 (1) ANA Doré (1975)
officinalis Calus Reuther (1984) 5,8 30 agar (1) ANA + (1) Kin Reuther (1984)
Lăstar unic Murashige & Skoog 5,8 20 6 (0,5) ANA Revière & Müller
(1962) (1974)
Lăstari Tenedille & Lecerf (1974) 5,6 20 6 (1) ANA+(0,1) Kin+(0,1) Tenedille & Lecerf
înrădăcinaţi KNO3 GA3 (1974)
Lăstari axilari si Murashige & Skoog 5,7 30 7 (0,1-0,3) ANA + (0,05- Yang & Clore
înrădăcinare (1962) 0,1) Kin (1973)
Plantule libere Murashige & Skoog 5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang & Clore
de virusuri (1962) (1976)
Lăstari multipli Murashige & Skoog 5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang (1976)
(1962)
Creşterea Yang (1977) 5,7 30 7 (0,05 - 0,1)ANA + Yang (1977)
lăstarilor (0,05) Kin
Brassica oleracea Regenerarea Murashige & Skoog - 30 agar (12,9) Kin Walkey et al (1980)
capitata lăstarilor (1962)
Cichorium intybus Regenerare lăstari Quoirin&Lepoivre (1977) 5,8 (0,1)GA3 + (0,05) BAP Pieron et al (1992)
Cucumis sativus Lăstar unic, Handley&Chambliss 30 agar (0,1)ANA+(0,1) Kin Handley&Chambliss
înrădăcinat (1979) (1979)
Cucurbita pepo Dezvoltare pana Tran Than Van (1973) 5,8 30 lichid (8)AIA+ (2,56)Kin Pink & Walkey
la 5 mm (1984)
Proliferare Tran Than Van (1973) 5,8 30 10 (1)BAP Pink & Walkey
lăstari (1984)

112
Tabelul 5.3.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Ipomoea batatas lăstari Elliot(1969)M-S 5,8 30 lichid (1)AIA Elliot(1969)
calus Murashige & Skoog 5,6-5,8 30 7 (0,1)2,4-D Jarret et al. (1984)
(1962)
Lăstari multipli Kartha et al.(1974a) 5,7 30 6 (0,2-1)ANA sau AIA + Kartha (1982b)
[(0,2-1)BAP/Z/Kin]
Caulogeneză Murashige & Skoog 5,8 30 8 (1)BAP sau Litz&Conover(197
(1962) [(1)AIA+(1)Kin] 8b)
Lăstar unic Murashige & Skoog 5,8 30 agar BAP Moyer&Collins(19
(1962) 82)
Lăstar unic Nielsen(1960) 30 10 - Nielsen(1960)
devirozat
Lactuca sativa Dezvoltare Kartha et al.(1974a) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,5)BAP Bloksberg&Saltveit
lăstari (1985)
Lăstari cu Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Koevary et al
rădăcini (1978)
Lycopersicon Lăstari cu Gresshoff&Doy 5,8 -6,4 20 8 (8)ANA+(0,1 ) Kin Gresshoff&Doy
esculentum rădăcini (1972a,b)DBM2 (1972b)
Phaseolus Lăstari multipli Kartha et al (1974 a) 5,7 30 6 (1,9) ANA + (1,1) BAP Kartha (1982 b)
vulgaris
Pisum sativum Proliferare Kartha et al (1974 a) 5,6 30 8 (0,02) ANA + (4,5) Griga et al (1986)
lăstari BAP
Regenerare Gamborg et al (1968) B 8 (0,11) BAP Haskins & Kartha
plantă 5 (1980)
Dezvoltare Gamborg et al (1968) B 5,7 20 6 (0,19) ANA + (0,1) Kartha et al (1974b;
lăstari 5 BAP 1979)
Solanum Lăstar unic Murashige & Skoog 20 lichid (2) AIA + (2) Kin Dodds & Roberts
tuberosum (1962) (1982)
Alungire lăstari Goodwin (1966) 30 lichid (0,01) AIA + (1) Kin Goodwin (1966)
Plante Morel & Martin (1955) 20 agar Morel & Martin
devirozate (1955)

113
Tabelul 5.3.2.
Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele floricole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediu pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Anthurium Dezvoltare Kunisaki (1975) 5,8 20 0 15% CM Kunisaki (1980)
andraeanum lăstari
Begonia rex Dezvoltare Murashige & Skoog 5,8 30 6 Cassells & Morrish
lăstari + (1962) (1985)
înrădăcinare
Cattleya sp, Calus Lindemann et al (1970) 5,5 50 0 (0,1) ANA + (0,1) Kin Lindemann et al
1 + 15% CM (1970)
Protocorm Knudson (1946) C 5,2 20 Agar (1) AIA sau (1) ANA Morel (1965 b)
Protocorm Reinert & Mohr (1967) 5 6 (1,75) ANA + (1,75 ) Reinert & Mohr
2 IBA + (1) Kin (1967)
Chrysanthemum Lăstari adventivi Linsmaier & Skoog
30 5 (0,02) ANA + (2) Kin Bush et al (1975)
sp, şi axilari (1965)
Cultura de Hollings (1965) 40 0 (1) ANA Hollings (1965)
meristeme
Calus friabil Nitsch & Nitsch (1965) 5,5 20 6 (2) ANA + (2-5) Kin Sangwan & Harada
S (1977)
Coleus blumei Lăstar Linsmaier & Skoog 5,8 30 10 (1) ANA + (0,001) Kin Smith & Murashige
înrădăcinat (1965) (1970)
Planta întreagă Linsmaier & Skoog 5,8 30 10 (1) AIA + (0,003) Kin Smith & Murashige
(1965) (1970)
Colocasia Proliferare Linsmaier & Skoog 5,8 30 0 (0,15 – 1,5) AIA + (1) Jackson et al (1977)
esculenta lăstari (1965) Kin
Cordyline Proliferare Evaldsson & Welander 5,8 30 6 (0,1) ANA + (2) BAP Evaldsson &
terminalis lăstari (1985) Welander (1985)

114
Tabelul 5.3.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Cymbidium sp, Propagare Morell (1965 a) 5,2 20 Agar Morell (1965 a)
Protocorm Knudsom (1946) C 5,2 20 Agar Morell (1965 b)
Calus Reinert & Mohr (1967) 1 0 (1,75) ANA + (1,75) Reinert & Mohr
IBA (1967)
Protocorm Reinert & Mohr (1967) 2 6 (1,75) ANA + (1,75) Reinert & Mohr
IBA +(1) Kin (1967)
Organogeneză Vacin & Went (1949) 6 20 8-9 10 % CM Sagawa & Kunisaki
(1982)
Dendrobium sp Protocorm Morell (1965a) 5,2 20 Agar Morell (1965 a)
Diferenţiere Vacin & Went (1949) 6 20 8-9 10 % CM Sagawa & Kunisaki
(1982)
Dianthus Lăstari Murashige & Skoog 30 Agar (1) ANA Hackett &
caryophyllus (1962) Anderson (1967)
Muguri axilari Hempel (1979) 5,8 20 0 (1,35) BAP Hemplel (1979)
Freesia Rizogeneză Petru et al (1976) 30 Agar (2,5) Kin Petru et al (1976)
superfreesia meristem
Gladiolus sp, Plantulă Murashige & 5,9 30 7 (0,1)ANA + (2-5)Kin Sutton (1978)
Skoog(1962) +15% CM
Iris spp, Cultură Hollings (1965) 40 glucoză 0 (1)ANA Hollings (1965)
meristeme
Lilium sp, Cultură Hollings (1965) 40 glucoză 0 (1)ANA Hollings (1965)
meristeme
Mammillaria Lăstărire Vyskot & Bezdek 5,5 30 agar (1)ANA + (2)BAP Vyskot &Jara
carmenae (1984)1 sau 2 (1984)
Mammillaria Lăstărire Vyskot & Bezdek 5,5 30 agar (0,5-1)ANA + Vyskot &Jara
prolifera (1984)1 sau 2 (0,5-1)BAP (1984)
Oncidium Iniţiere Lim-Ho (1982) VW 0 0 15% CM Lim-Ho (1982)
lanceanum
Oncidium spp, Diferenţiere Vacin & Went (1949) 20 8-9 Thompson (1975)
Pelargonium sp, Lăstar unic Murashige&Skoog(1962) 20 0 (2)AIA + (2)Kin Dodds&Roberts(1982)

115
Tabelul 5.3.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Pelargonium spp, Cultură Beauchesne et al (1977) 30 glucoză 6-7 (0,25)AIA + (0,1)2iP + Beauchesne et al
meristeme I sau II (1)GA3 +/- (2)Ad (1977)
Petunia hybrida Lăstari adventivi Sharma & Mitra (1976) 20 7 (0,5)BAP Sharma & Mitra
via calus C (1976)
Tulipa gesneriana Bulbili Riviere & Muller 5,5 50 glucoză 6 (0,1)ANA + (0,1)BAP Riviere & Muller
(1979) (1979)

Tabelul 5.3.3.
Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele pomicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Ananas comosus Lăstari axilari Murashige & Skoog 30 0 (1,8)ANA+ (2)IBA Matheus & Rangan
(1962) (agar) +(2)Kin (1979)
Lăstar unic Murashige & Skoog 30 0 25% CM Zepeda & Sagawa
(1962) (1981)
Castanea sativa Lăstar unic Rodriguez (1982b) 5,5 30 6 (1)IBA Rodriguez (1982c)
K(h)
Lăstari Rodriguez (1982b) K(h) 5,5 30 6 (0,01)IBA+(1)BAP Rodriguez (1982c)
Proliferare Vieitez & 5,5 30 7 (0,1)BAP Vieitez &
lăstari Vieitez(1980b) Vieitez(1980b)
Citrus sp, Lăstari axilari si Bouzid (1975) A 5,8 30 8 (1)ANA + (1)Kin Bouzid (1975)
adventivi
Cocos nucifera Rizogeneza D’Souza (1982) BM 68,4 agar (1-2)ANA+12%CM D’Souza (1982)
Fragaria Lăstari Mullin et al, (1974)B 5,7-5,8 30 glucoză 0 (2,5)AIA + (0,1)Kin Mullin et al, (1974)
devirozati White (1954)-saruri 20 7 10%CM Miller&Belkengren
(1963)
Adams (1972) 5,2 30 0 (1)IBA+(0,1)BAP Adams (1972)

116
Tabelul 5.3.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragaria Proliferare Boxus (1974a) 5,6 22 glucoză 7 (1)BAP Boxus et al, (1974)
lăstari
Lăstari Mullin et al (191974)A 4,5 30 glucoză 0 (1)AIA Mullin & Schlegel
(1976)
Malus x domestica Proliferare Murashige & Skoog 5,3 20 7 (1,1)BAP Lane (1979)
lăstari (1962)
Proliferare Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(1)BAP+ Snir & Erez (1980)
lăstari (0,1)GA3
Musa cavendishii calus Murashige & Skoog 30 agar (0,3)AIA+(1)Kin sau Ma et al (1978)
(1962) [(2)BAP+20%CM]
Musa textilis Lăstari axilari si Mante & Tepper (1983) 5,7 30 5-8 (10)BAP+(80-160)AdS Mante & Tepper
adventivi I (1983)
Prunus cerasifera Proliferare Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (0,5)BAP Norton &
lăstari axilari (1965) Norton(1986a)
Rubus idaeus Creştere lăstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 0 Donnelly et al,
(1980)
Rubus sp, Lăstari axilari Skirvin & Chu 5,8 30 10 (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin et al
1978a,b)0 (1981a)
Vaccinium sp, Proliferare Goldy & Lyrene (1984) 5,7 30 4 (10)2iP+(80)AdS Goldy & Lyrene
lăstari (1984)
Lăstari axilari Smagula & Lyrene 5,7 30 0 (5)2iP Smagula & Lyrene
(1984) WPM (1984)

117
Tabelul 5.3.4.
Câteva realizări privind cultura de meristeme şi apexuri la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Hedera helix Înrădăcinare Hackett (1970) 5,8 20 (5-10)ANA sau Hackett (1970)
(sub lumină (10)AIA+(5,5) catechol
puternică)
Înrădăcinare Hackett (1970) 5,8 20 (10)AIA+(5,5) catechol Hackett (1970)
(sub lumină
slabă)
Lăstari Polito & Alliata 5,6 20 8 (0,5)ANA + (2)BAP Polito & Alliata
(1981) (1981)
Lavandula Calus Kartha et al, (1974a) 5,5 20 7 (1)ANA + (4)BAP + Quazi (1980)
augustifolia & sp, 10%CM
Pinus sylvestris Înmugurire Bornman & Janson 5,6-5,8 50,5 6-7 (1,1-2,2) BAP + (1-2) Bornman & Janson
(1980) 2iP (1980)
Syringa vulgaris Dezvoltare Wetmore (1954) 2 20 10 15% CM Wetmore (1954)
lăstari
Weigela florida 4 lăstari/expl, Murashige & Skoog 30 agar (2,25) BAP Calvert & Stephens
(1962) (1986)

118
Tabelul 5.3.5.
Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la viţa de vie
Regulatori de
Denumirea Zaharoză Agar
Explant Rezultat Mediu pH creştere Autori
speciei (g/l) (g/l)
(mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis rupestris Apex lăstar Dezvoltare Gazly (1964) 6,5 15 8 Gazly (1972)
lăstar unic
Vitis rupestris Apex lăstar Lăstar Gazly (1964) 6,5 15 8 (0,02)ANA Gazly (1972)
înrădăcinat
Vitis vinifera Apexuri lăstari Alungire lăstari Webb & Street 30 agar (1,48)BAP Aldwinckle &
(1977)CI Buturac (1981)
Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Webb & Street 30 agar (0,023)BAP Aldwinckle &
lăstari (1977)CI Buturac (1981)
Vitis vinifera Apexuri lăstari Lăstari Murashige & 5,8 30 0 (2,2)BAP Barlass et al (1982)
Skoog (1962)
Vitis vinifera Apexuri lăstari Lăstari White (1943a)A 5,8 30 0 (2,2)BAP Barlass et al (1982)
înrădăcinaţi
Vitis vinifera Meristeme Proliferare Jona & Webb 5,7-5,8 20 3-5,5 (2,25)BAP Jona & Webb
lăstari axilari (1979)BG (1979)
Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Jona & Webb 5,7-5,8 20 3-5,5 (0,23)BAP Jona & Webb
(1979)C (1979)
Vitis vinifera Meristeme Lăstar unic, Jona & Webb 5,7-5,8 20 3-5,5 (0,023-0,23)BAP Jona & Webb
înrădăcinat (1979)C (1979)
Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Stevenson & 5 30 0 (0,1)AIA Stevenson &
Monette (1983)R Monette (1983)

119
5.4. Cultura de fragmente uninodale
Metoda constă în secţionarea lăstarilor crescuţi in vitro în porţiuni uninodale urmată
de cultivarea acestora pe un nou mediu de cultură.
Din mugurii axilari vor lua naştere noi lăstari care după o anumită perioadă de timp
vor fi secţionaţi din nou.
Primele experienţe privind cultura de fragmente uninodale, obţinerea de lăstari şi
înrădăcinarea acestora au fost efectuate de Galston 1947, 1948 şi Gorter 1965, la asparagus.
Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniţiale meristeme, vârfuri de
lăstari (apexuri), muguri aflaţi la subsuoara bracteelor la unele tipuri de inflorescenţe, precum
şi alte organe capabile să genereze lăstari in vitro.
Lăstari se pot obţine prin folosirea unor primordii de muguri florali care se transformă
apoi în structuri vegetative (conopidă - Crisp şi Walkey, 1974).
De regulă în mediul de cultură nu se adaugă citochinine care să anuleze efectul
dominanţei apicale. Se urmăreşte, în fapt alungirea lăstarilor pentru a obţine un număr cât mai
mare de noduri.
Iniţierea culturii este foarte importantă. În vederea stabilizării trebuie realizată
juvenilizarea materialului iniţial.
La speciile lemnoase un alt aspect important îl reprezintă necesitatea ruperii
dormansului mugurilor după inoculare. Acest lucru este posibil prin tratamente cu temperaturi
scăzute (0-5°C), mărirea duratei zilei (16 h) asociată cu temperaturi scăzute, urmate apoi de
creşterea temperaturii.
Uneori se recomandă creşterea concentraţiei de citochinine şi gibereline.
La speciile erbacee dormansul se poate întrerupe prin etiolarea materialului.
Rata multiplicării este direct proporţională cu viteza de creştere a lăstarilor, respectiv
cu numărul de frunze care se formează.
De regulă lăstarii formaţi din apexuri cresc şi se alungesc mai rapid decât cei formaţi
din muguri axilari. De aceea ei sunt trecuţi în vase de cultură separate.
Folosirea mediului de cultură în dublu strat, solid + lichid, a avut ca efect creşterea
vitezei de creştere a lăstarilor de gutui BA-29 (Stănică F. şi colab., 1996).
De asemenea, folosirea apei structurate şi a unor glico-steroizi naturali (Ecostim) a
determinat creşterea lăstarilor de măr (Săvulescu Anca şi Stănică F., 1996).
Folosirea apei π la prepararea mediului pentru faza de multiplicare la măr (foto 5.19.) şi la
smochin a avut ca efect o stimulare a creşterii explantelor şi sporirea proporţională a ratei de
multiplicare (Stănică F. şi colab. 2002, Gâlă R. şi colab. 2003).

120
Foto 5.19. Efectul apei π asupra multiplicării in vitro la trei soiuri de măr

La liliac (Syringa vulgaris) stimularea creşterii lăstarilor este posibilă prin folosirea
zeatinei sau a 2ip (Pierik şi colab. 1986).
La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981) la realizarea regenerării pot fi folosiţi
numai lăstari ortotropi. La cafea, în schimb (Pierik, 1987) are loc o transformare a lăstarilor
plagiotropi în ortotropi.
Metoda de faţă se foloseşte cu succes la foarte multe specii (cartof, manioc, pomi
fructiferi (foto 5.20.a), viţă de vie (foto 5.20.b), trandafir, iederă, clematită (foto 5.21), salcie
pletoasă etc.) (tabelele 5.4.1., 5.4.2., 5.4.3., 5.4.4., 5.4.5.) .
La tomate, castraveţi şi vinete (Pierik, 1987) a regenerat lăstari din seminţe, ca apoi
să-i folosească pentru cultura de fragmente uninodale.
După mai multe cicluri de multiplicare este necesară inducerea înrădăcinării lăstarilor
obţinuţi (foto 5.22.). Acest lucru este realizabil prin folosirea unor tratamente cu auxine
combinate sau nu cu tratamente cu întuneric.
În faza de alungire a rădăcinilor, concentraţia de auxine trebuie redusă.

121
a b
Foto 5.20. Cultura de fragmente uninodale la măslin (a)
şi la portaltoiul de viţă de vie Richter 110 (b) – Vitroplant

Foto 5.21. Multiplicarea la Clematis sp. Foto 5.22. Formarea rădăcinilor la încheierea
prin stimularea alungirii lăstarilor ciclului de multiplicare la Sequoia sempervirens

122
Tabelul 5.4.1.
Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la plantele legumicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Asparagus Lăstari în 4 Murashige & Skoog 5,7 30 7 (0,09) ANA + Chin (1982)
officinalis săptămâni (1962) (0,11)Kin
Lăstari axilari Pelletier et al, (1972) - 20 5 Doré (1974)
Tosaruri
Brassica oleracea Lăstari via calus De Fossard et al (1974 5,5 41,1 8 6 auxine + 2 citochinine Trimboli et al
botrytis a) HMHH (1977)
Capsicum annuum Muguri Phillips & Hubstenb’ 5,8 30 8 (0,05) AIA + (50 ) BAP Phillips&Hubstenb
adventivi (1984, 1985) glucoză (1984, 1985)
Cichorium intybus Plăntuţe Murashige şi Skoog 5,8
GA, BA, ANA Grazia şi co (1985)
înrădăcinate (1962)
Calus, muguri, Linsmaier şi 5,8
- Harada (1966)
flori Skoog(1965)
Cucumis sativus Lăstar unic Murashige&Skoog 5,8 30 agar (0,023)BAP Aziz&McCown(19
(1962) 85)
Solanum Lăstar unic Hussey & Stacey 5,9 30 7 Hussey & Stacey
tuberosum (1981) (1981)
Lăstar unic cu Hussey & Stacey 5,9 30 lichid Hussey & Stacey
rădăcini (1981) (1981)
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 12 Levy (1985)
(19620
Lăstari via calus Murashige & Skoog 5,7 20 7 (1) BAP + (1) GA3 Marani & Pisi
(1962) (1977)
Lăstari în 3-5 Murashige & Skoog 5,8 30 6 (0,5) BAP Thomas (1981)
săptămâni (1962)

123
Tabelul 5.4.2.
Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la plantele floricole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Anthurium Lăstari multipli Kunisaki (1975) 5,8 20 8 (0,2 – 1) BAP Kunisaki (1980)
andraeanum
Camellia japonica Iniţiere Carlisi & Torres (1985; 5 30 8 (0,5-1) BAP Carlisi & Torres
caulogeneză 1986) (1985; 1986)
Dendrobium sp, Muguri axilari Ball & Arditti (1976) S 20 13 (2) BAP Ball & Arditti
(1976)
Dianthus Lăstari axilari si Murashige & Skoog 5,8 30 8 (0,1) AIA + (1) BAP Roest &
caryophyllus adventivi (1962) Bokelmann (1981)
Dracaena Lăstari Debergh (1975) 5,8 20 6 Debergh (1975);
deremensis 1976)
Phalenopsis sp, Protocormi Koch (1974) A 20 5 (0,5-3)ANA + (2)BAP Koch (1974)
55% Lăstari Reisinger et al (1976) 5-5,5 20 13 (2)BAP Reisinger et al
(1976)

124
Tabelul 5.4.3.
Câteva realizări privind cultura de fragmente uninodale la plantele pomicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Actinidia delicosa Lăstari Harada (1975) 5,5 20 7 (0,1)ANA+ (40) Ad Harada (1975)
înrădăcinaţi
Armeniaca 70% lăstari Lloyd&McCOWN 5,2 20 6 (2)2iP Snir (1984)
vulgaris (1981)
WPM
Castanea Proliferare Yang et al,(1986) 5,5 20 6,5 (0,1)BAP Yang et al,(1986)
mollissima lăstari axilari
Castanea sativa Proliferare San Jose et al, (1984) L 30 6 (0,1)BAP San Jose et al,
lăstari axilari sau Ha (1984)
Proliferare lăstari Heinz & Mee (1969) 5,5 30 6 (1)BAP Vieitez&Vieitez(1980
b)
Citrus sp, Proliferare lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 30 10 (1)BAP+(100)AdS Navarro et al (1975)
Corylus avellana Embriogeneză 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 (0,1-1)IBA Pérez et al (1986)
directă
Juglans hindisii x Multiplicare Driver & Kuniykuhi 5,5 30 2 (0,001)IBA+(1)BAP Driver &
J. regia lăstari (1984)DKW gelrite Kuniykuhi (1984)
Juglans regia Lăstari Chalupa (1981a)A 30 6 (0,15)ANA+(0,1)BAP Chalupa (1981a)
+(20)AdS
Olea europaea Proliferare Rugini&Fontanazza 5,8 30 6 (0,5)IBA+(0,5)GA3+ Rugini&Fontanazza
lăstari (1981)Shoot (10)Zr (1981)
Pyrus communis Lăstar unic Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (0,45)BAP Shen&Mullins(1984)
Rubus idaeus Lăstar unic Snir (1981)B 5 20 agar (0,22)2,4-D Snir (1981)
+(1)BAP+(0,1)GA3
Theobroma cacao Proliferare Passey & Jones (1983) 5,2 30 7 (0,2)BAP Passey & Jones
lăstari axilari (1983)

125
Tabelul 5.4.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Vaccinium Lăstari axilari Cohen & Elliot(1979) 5,7 30 6 (5)2iP Cohen&Elliot(1979)
corymbosum 1-2 lăstari/expl, Lloyd & McCown 5,2 30 6 (5)2iP Wolfe et al
(1981) WPM (1983;1986)
Vaccinium sp Lăstari axilari Smagula & Lyrene 5,7 30 4 (5)2iP Smagula & Lyrene
(1984)WPM (1984)

Tabelul 5.4.4.
Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Acer negundo Calus Murashige&Skoog(1962) 20 6 (3)ANA + 15%CM Radojevic et al(1980)
Betula verrucosa Calus Chalupa (1981b) 1 30 6 (0,05)IBA+ (0,6)BAP + Chalupa (1981b)
(20)AdS
Paulownia Muguri axilari Ben-Jaacov & Dax 5,6 30 agar (0,1)ANA + (1)BAP Burger et al (1985)
tomentosa (1981)
Ouercus robur Lăstari Chalupa (1984 a,b) 20 6 (0,2-1) BAP Chalupa (1984a)
BTM sau WPM
Salix babylonica Lăstari Morel & Martin (1955) 15 glucoză 8 Daguin&Letouze(198
6)
Lăstari Daguin&Letouze(1986)B 15 glucoză 8 Daguin&Letouze(198
6)
Salix madsudana Lăstari adventivi Whitehed & Giles 5,8 20 agar (0,01) ANA + (0,05) Bhojwani (1980)
şi axilari (1976) BAP + (20) AdSs
Tilia cordata Lăstari axilari Chalupa (1984 20 6 (0,2-1) BAP + [(0-0,1) Chalupa (1984 a,b)
a,b)WPM ANA sau IBA]
Vinca minor Proliferare lăstari Stapfer & Heuser (1985) 5,6-5,8 30 7 (0,018-0,18) ANA + Stapfer & Heuser
(14,4) BAP (1985)

126
Tabelul 5.4.5.
Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la viţa de vie
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Vitis berlandieri x Proliferare Murashige & Skoog 5,8 30 8 (2,25)BAP Novak&Jujova
V. cardinalis lăstari axilari (1962) (1983)
Vitis berlandieri x Plantule 0,5 x Murashige & 5,8 20 7 (0,02)IBA sau ANA Novak&Jujova
V. cardinalis înrădăcinate Skoog (1962) (1983)
Vitis hybrid Baco Proliferare Miller & Murashige 5 30 0 (2-4)BAP+(80)AdS Harris & Mason
lăstari (1976)II (1983)
Vitis rupestris Lăstar unic Gazly (1964) 6,5 15 8 Gazly (1964)
Vitis spp. Lăstari multipli Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0,09)ANA + (1,1)BAP Chee&Pool
(1982a,b)
Vitis spp. Lăstari Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0,02)ANA Chee&Pool
înrădăcinaţi (1982a,b)
Vitis vinifera Proliferare Webb & Street 30 agar (2,25)BAP Aldwinckle &
lăstari axilari (1977)CI Buturac (1981)
Vitis vinifera Calus Jona & Webb (1979)C 5,7- 20 3-5,5 (1)ANA+(0,2)Kin Jona & Webb
5,8 (1979
Vitis vinifera Proliferare Murashige & Skoog 5,8 30 8 (2,25)BAP Novak&Jujova
lăstari axilari (1962) (1983)
Vitis vinifera Proliferare Murashige (1974) 5 30 0 (0,03) IBA+(2)BAP+ Stevenson &
lăstari (80)AdS Monette (1983)&

127
5.5. Cultura de lăstari axilari
Această metodă presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale,
stimularea creşterii lăstarilor axilari prin creşterea concentraţiei de citochinine, fără
stimularea alungirii lăstarului mamă.
Creşterea concentraţiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanţei apicale a
mugurelui. Acest lucru este posibil şi prin eliminarea apexului lăstarului iniţial.
Principiile acestei metode sunt cunoscute încă din 1925. Ea a fost aplicată pentru
prima dată de către Hackett şi Anderson (1967) la garoafe, de către Adams (1972) şi Boxus
(1973; 1974) la căpşun şi de Pierik (1973; 1974; 1975a) şi Murashige (1974) la gerbera.
După descoperirea kinetinei, eliminarea dominanţei apicale a fost posibilă prin folosirea
acesteia şi apoi a altor citochinine.
Frecvent această metodă de microînmulţire este folosită în tandem cu cultura de
fragmente uninodale. Astfel, în prima etapă dintr-un explant uninodal se obţine un lăstar,
apoi acest lăstar este trecut pe un mediu cu un conţinut ridicat în citochinine şi este
stimulată formarea lăstarilor axilari.
Cultura de lăstari axilari are o serie de avantaje:
- este simplă;
- rata de multiplicare este relativ ridicată;
- stabilitatea genetică este asigurată;
- este unica metodă de multiplicare eficientă la plantele care cresc în rozetă: căpşun,
gerbera, bromelia etc.).
Necesarul de citochinine este variabil cu specia. Astfel, plantele de Bromelia
obţinute din seminţe au generat lăstari axilari fără citochinine. La multe specii s-a observat
scăderea necesarului de citochinine odată cu creşterea numărului de subculturi datorită
acumulării acestora dar, mai ales datorită juvenilizării lăstarilor.
Concentraţia citochininelor trebuie corelată şi cu stadiul de dezvoltare al
materialului biologic. Astfel, materialul juvenil necesită o cantitate mai redusă de
citochinine decât cel provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982).
Frecvent se recomandă să se folosească medii cu concentraţii scăzute de auxine şi
concentraţii ridicate de citochinine. Raportul citochinine: auxine cel mai recomandat este
de 10:1.

128
Felul citochininelor folosite este şi el important. Cele mai multe specii reacţionează
bine la folosirea BAP şi mai puţin bine la kinetină sau 2-iP. Pentru Rhododendron însă, se
recomandă folosirea 2-iP.
Tidiazuronul şi compuşii de substituţie ai piridilfenilureei stimulează uneori mai
mult lăstărirea axilară decât citochininele (Read şi colab. 1986).
În multe situaţii se recomandă distrugerea mugurelui apical şi asocierea acestei
măsuri cu aplicarea citochininelor. Pentru creşterea eficienţei metodei, citochininele
trebuie aplicate după ce lăstarul s-a alungit.
Creşterea concentraţiei de citochinine aduce uneori după sine formarea calusului.
Acest lucru trebuie evitat pentru reducerea riscului apariţiei unor mutaţii.
Uneori formarea lăstarilor axilari este stimulată de folosirea mediului de cultură
lichid (Bromeliaceae).
De regulă, capacitatea de proliferare scade odată cu creşterea numărului de
subculturi, acest fenomen fiind frecvent însoţit şi de formarea calusului.
La căpşun, de exemplu, depăşirea unui număr de 12 subculturi a avut ca efect
apariţia unor modificări fiziologice majore.
Metoda lăstăririi axilare poate fi folosită atât pentru plantele care cresc în rozete
(foto 5.23. a şi b şi 5.24. a şi b), cât şi pentru plantele care formează lăstari obişnuiţi.

Foto 5.23. Rozetă de Drossera sp. înainte de multiplicare (a) şi după (b)

129
a b
Foto 5.24. Cultură de lăstari axilari al Cichorium intybus (a) şi Drosera sp. (b)

Uneori stimularea lăstăririi axilare prin mărirea concentraţiei de citochinine are ca


efect apariţia fenomenului de "tufă". Astfel şi după trecerea explantelor pe medii lipsite de
citochinine, pentru alungire sau înrădăcinare acestea continuă să formeze lăstari axilari
numeroşi (foto 5.25.).

Foto 5.25. Lăstărire axilară puternică la explantele de Sequoia sempervirens

În câmp fenomenul se manifestă prin formarea unui număr mare de flori/fructe de


dimensiuni reduse (căpşun).

130
Alte efecte negative ale concentraţiei ridicate de citochinine ar fi apariţia unor
frunze de formă anormală, apariţia calusului (foto 5.26.) sau formarea lăstarilor adventivi
susceptibili la mutaţii.

Foto 5.26. Formarea calusului în exces la concentraţii ridicate de citochinine


la dafin (Laurus nobilis) în faza de multiplicare

În prezent metoda este mult folosită la microînmulţirea materialului săditor pomicol


în multe ţări fiind generalizată: Italia, Franţa, Anglia, etc.

Foto 5.27. Cultură de lăstari axilari la smochin (Ficus carica)

În tabelele 5.5.1., 5.5.2., 5.5.3, sunt prezentate câteva cercetări privind cultura de
lăstari axilari la plantele horticole.

131
Tabelul 5.5.1.
Cercetări privind cultura de lăstari axilari la plantele legumicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Lăstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5)IBA+(0,12)BAP Hussey&Falavigna
înrădăcinaţi (1980)
Proliferare lăstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5-4)BAP Hussey (1978a)&
adv, şi axil,
Proliferare si Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,12)ANA+ (2)BAP Hussey (1978a)&
creştere lăstari
Asparagus Creştere lăstari şi Gorter (1965) - 40 20 Gorter (1965)
officinalis înrădăcinare
Creştere lăstari şi Reuther (1984) 5,8 30 agar (0,5) AIA Reuther (1984)
înrădăcinare
Brassica oleracea Lăstari axilari si Linsmaier & Skoog 5,8 30 lichid (8) AIA + (2,6) Kin Walkey & Woolfitt
botrytis adventivi (1965) (1970)
Cichorium intybus Regenerare lăstari Qoirin&Lepoivre (1977) 5,8 20 5 (0,1)GA3 + (0,05) BAP Pieron et al (1992)
Regenerare lăstari Murashige&Skoog(1962) (0,1) AIA + (2) BAP Park & Lim (1999)
Cucumis melo Lăstari axilari şi Moreno et 5,8 40 8 (2,5)ANA+(1)BAP Moreno et al,
adventivi al,(1984)MEL (1984)
Lycopersicon Proliferare lăstari Linsmaier&Skoog(1965) 30 agar (4)AIA+(4)kin Herman&Haas(1978)
esculentum Proliferare lăstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 7 (5) BAP Schnap&Preece-1986
Creştere lăstari Shahin (1985) TM –1 5,8 30 6 Shahin (1985)
Plantule Shahin (1985) TM –5 5,8 30 6 (0,1) IBA Shahin (1985)
înrădăcinate
Phaseolus vulgaris Lăstari Kartha et al (1974a) 5,7 30 6 (0,19) ANA Kartha (1982 b)
înrădăcinaţi
Pisum sativum Lăstari Kartha et al (1974 a) 5,6 30 8 (0,93) ANA Griga et al (1986)
înrădăcinaţi
Lăstari 0,5 x Gamborg et al 5,7 10 6 (0,19) ANA Kartha et al (1974
înrădăcinaţi (1968) B 5 b; 1979)

132
Tabelul 5.5.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Solanum Plantule Murashige&Skoog 30 agar Gleddie et al (1982)
melongena înrădăcinate (1962)
Lăstari Pelletier et al (1972) 5,8 20 7,5 Isouard et al (1979)
înrădăcinaţi Tosaruri
Dezvoltare White (1954) 20 agar (2) GA3 Yamada et al
lăstari (1967)
Solanum Lăstari 0,5 x Murashige & 5,8 15 7 (0,1) AIA + (0,01) Kin Austin & Cassells
tuberosum înrădăcinaţi Skoog (1962) (1983)
Multiplicare Murashige & Skoog 5,8 30 lichid (0,1) GA3 + (0,5) Kin Goodwin et al
lăstari (1962) (1980a)
20% lăstari în 1 Murashige & Skoog 5,8 10 4 (0,5)Z Thomas (1981)
luna (1962)

Tabelul 5.5.2.
Câteva realizări privind cultura de lăstari axilari la plantele pomicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Actinidia delicosa Lăstari Harada (1975) 5,5 20 7 (0,1)ANA+ (40) Ad Harada (1975)
înrădăcinaţi
Ananas comosus Plantule Lakshmi Sita et al 5,8-6 20 9 (1)ANA Lakshmi Sita et al
(1974) (1974)
Plantule Murashige&Skoog 30 agar Mapes (1973)
(1962)
Lăstari multipli Murashige & Skoog 30 0 (1,8)ANA+ (2)IBA Matheus & Rangan
(1962) (agar) +(2)Kin (1979)
Ananas comosus Creştere lăstari 0,5 xMurashige&Skoog 30 0 25% CM Zepeda & Sagawa
(1962) (1981)

133
Tabelul 5.5.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Castanea sativa Proliferare Vieitez & 5,5 30 6 (1-2)BAP Vieitez &
lăstari Vieitez(1980a) 2 Vieitez(1980a)
Ficus carica Lăstar unic Murashige & Skoog 5,8 30 8 (0,18)ANA+(0,1)BAP Muriithi et al,
(1962) +(0,03) GA3 (1982)
Proliferare Linsmaier & Skoog 5,2 30 7 (0,5)BAP+(0,1)IBA+(0 Pontikis & Melas
lăstari (1965) ,1)GA3+(89)PG (1986)
Glossularia Creştere lăstari Jones & Vine (1968)B 5,6-5,8 40 glucoza 0 Jones & Vine
redinata si rădăcini (1968)
Dezvoltare Jones & Vine (1968)B 5,6-5,8 40 glucoza 0 (1)IBA+(0,2)BAP Jones & Vine
lăstari +(1)GA3 (1968)
Malus x domestica 8 lăstari/ Linsmaier & Skoog 5,2 29,9 7 (0,1)IBA+(0,99)BAP Van Nieuwkirk et
explant (1965) +(0,48)GA3 al (1986)
Musa spp. Lăstari unic Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (5)BAP Cronauer &
Krikorian (1984)
Rubus idaeus Proliferare Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,1)IBA+(4)BAP Anderson (1979)
lăstari

134
Tabelul 5.5.3.
Cercetări privind cultura de lăstari axilari la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Clematis sp. Lăstari multipli Linsmaier & Skoog 30 6 (10)BAP Kratz &
(1965) Langhans(1978)
Cotoneaster Lăstari multipli Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe
dammeri (1965) (1982)
Crataegus Lăstari multipli Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe
rachyacantha (1965) (1982)
Fraxinus Lăstari multipli Lloyd & McCown 5,2 20 lichid (5-10)BAP Heiman & Preece
americana (1981) WPM (1983)
Hydrangea 6 lăstari/ explant Gamborg et al, 5,5 20 2 (1,8)BAP Bailey et al, (1986)
macrophylla (1968)B5 gelrite
Proliferare Miller & Murashige 5,7-5,8 20 7 (1)BAP Stoltz (1984)
lăstari (1976) II
Lavandula Plantule Kartha et al, (1974a) 5,5 20 7 (2) 2,4-D+ (4)BAP + Quazi (1980)
augustifolia & sp. 10%CM
Picea glauca Proliferare Rumary & Thorpe 5,9 30 8 Rumary & Thorpe
lăstari (1984) (1984)

135
Capitolul 6
Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro

6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme


Un alt scop al înmulţirii prin meristeme este acela de a obţine plante sănătoase,
libere de virusuri, micoplasme şi chiar alţi agenţi patogeni. Înmulţirea vegetativă aduce
după sine şi transmiterea agenţilor patogeni menţionaţi în descendenţa clonală.
Înmulţirea generativă, prin seminţe înlătură în parte transmiterea virusurilor. Ea nu
poate fi folosită însă la toate speciile deoarece:
- nu toate speciile formează seminţe, sau numărul seminţelor este insuficient;
- descendenţa obţinută prin seminţe la plantele alogame este neuniformă;
- înflorirea sau fructificarea descendenţilor obţinuţi din sămânţă sunt întârziate
datorită perioadei juvenile lungi;
- o serie de viroze se transmit prin polen sau prin sămânţă (prin polen la pomii
fructiferi şi prin sămânţă la leguminoase: mazăre, fasole, soia etc.).
Având în vedere că o serie de genotipuri se înmulţesc numai vegetativ apare riscul
degenerării acestora sub influenţa atacului de virusuri.
În perioada anilor (1949-1950) Limasset şi Cornuet (citaţi de Martin, 1977) au
constatat că intensitatea virozării organelor vegetative creşte proporţional cu distanţa
zonei analizate faţă de apex. Astfel, cei doi au aşezat ţesut meristemal apical (calota +
câteva primordii foliare) pe rana existentă pe o frunză de tutun. După un timp s-a
constatat virozarea frunzelor de tutun în proporţie de 60%. Atunci când s-au folosit ca
inoculi zone mai depărtate de meristem, infectarea s-a produs în proporţie de 100%.
Plecând de la aceste observaţii, Morel (1952) reuşeşte să obţină plante sănătoase,
devirozate, prin cultivarea unor apexuri meristematice de dimensiuni reduse (75-100 µm
lăţime şi 150-200 µm înălţime) cu 1-2 primordii foliare, provenite de la plante bolnave.
Morel şi Martin au obţinut primele rezultate prin devirozarea daliilor şi în
continuare au extins metoda la cartof şi orhidee.
Quak (1957) a aplicat devirozarea prin culturi de meristeme la garoafe.
Din acest moment s-au pus bazele tehnologiilor industriale de devirozare a
materialului biologic vegetal. Plantele devirozate obţinute sunt în continuare înmulţite in
vitro pentru a obţine o descendenţă suficient de numeroasă.

136
Ulterior ele se păstrează în izolatoare speciale (depozitare) şi constituie capetele de
clonă furnizând materialul iniţial pentru înmulţirea în condiţii de câmp.
Folosirea culturilor de meristeme pentru devirozarea materialului biologic a făcut
posibilă eradicarea şi a altor boli produse de ciuperci sau bacterii.
Astfel, la garoafe s-a înlăturat infecţia de Fusarium roseum şi F. oxysporum f.
dianthi, în timp ce la Dieffenbachia s-au eliminat bacteriozele sistemice (Pseudomonas
caryophylli şi Pectobacterium parthemi).
În ceea ce priveşte motivaţia faptului că celulele meristematice sunt libere de
virusuri există o serie de ipoteze:
- s-ar părea că datorită diviziunii intense a celulelor în meristem, există o competiţie
între acestea şi particula virală, pentru folosirea acizilor nucleici sintetizaţi. Acizii nucleici
se pare că sunt puşi la dispoziţia diviziunii celulare în detrimentul multiplicării virale
(Quak, 1966);
- o altă ipoteză se referă la faptul că absenţa plasmodesmei şi a structurilor
vasculare în meristem împiedică răspândirea virusului;
- alte explicaţii precizează că datorită concentraţiilor ridicate de auxine şi
citochinine din apexurile meristematice penetrarea particulelor virale este oprită sau chiar,
are loc inactivarea acestora (Quak, 1977);
- alţi autori afirmă că dezvoltarea virusurilor este împiedicată în apexurile
meristematice datorită lipsei unor enzime specifice de care acestea au nevoie pentru
multiplicare sau, datorită prezenţei unor substanţe inhibitoare;
- o explicaţie plauzibilă este şi aceea că ritmul diviziunilor celulare în meristeme
este mult mai mare decât ritmul replicării virusului. Acest lucru este evident în special
atunci când plantele bolnave sunt crescute în condiţii foarte favorabile fapt ce duce la
alungirea rapidă a lăstarilor.
- o altă explicaţie ar fi faptul că meristemul excizat suferă un traumatism puternic
(cu atât mai mare cu cât el este de dimensiuni mai mici) prin secţionare, fapt care duce la
eliminarea virusurilor. Acest lucru a fost remarcat de Hollings şi Stone (1964) la garoafa şi
de Walkey şi colab. La cireş (1969).
Din păcate nu toate virozele pot fi înlăturate prin cultura de meristeme. La cartof
virusul X a putut fi înlăturat doar în proporţie de 1%.
În acest caz se recomandă combinarea microînmulţirii prin culturi de meristeme cu
termoterapia.

137
Această metodă constă din cultivarea plantelor supuse devirozării timp de 5-10
săptămâni la temperatura de 35-39°C, fapt care determină o inactivare a virusului. Acest
efect se obţine prin păstrarea organelor furnizoare de meristeme la temperaturi ridicate (ex.
tuberculii de cartof la 37-38°C).
Urmează apoi excizarea meristemelor şi inocularea lor pe mediu (foto 6.1.).

Foto 6.1. Excizarea apexului meristematic la viţa de vie după încheierea


tratamentului de termoterapie (Vitroplant, Cesena)

În acest sens se face sterilizarea vârfurilor de lăstari în alcool 70% urmată de


imersia în hipoclorit de sodiu sau calciu. Se înlătură apoi frunzele inclusiv cele tinere din
vârf şi se repetă sterilizarea cu alcool (70%) fără să se mai facă clătirea cu apă, deoarece
picăturile de apă îngreunează detaşarea meristemelor.
Meristemul izolat este apoi detaşat şi inoculat pe mediul de cultură. Dimensiunile
explantului trebuie să fie reduse (0,1 mm diametru şi 0,2-0,4 mm înălţime).
Creşterea numărului de primordii foliare cu care se detaşează meristemul determină
scăderea ratei de devirozare. În sens contrar, în multe situaţii detaşarea meristemului fără
cele 2 primordii foliare duce la moartea acestuia.
Pentru cultivarea meristemelor se foloseşte apoi, tehnica descrisă în subcapitolul
5.3., având ca scop final, multiplicarea rapidă a materialului devirozat.

138
Înainte de începerea multiplicării propriu-zise este esenţial să se facă testarea
gradului de devirozare a materialului biologic apelând la tehnici serologice de tipul testului
ELISA.
În anumite situaţii lăstarii obţinuţi nu înrădăcinează. În acest caz se recomandă
altoirea in vitro a lăstarului devirozat pe un portaltoi obţinut din seminţe in vitro (Morel,
1964 - la dalia). Tehnica poartă denumirea de microaltoire şi va fi prezentată în continuare.

6.2. Microaltoirea
Obţinerea plantelor libere de virusuri se poate realiza prin diferite metode
microaltoire.
Microaltoirea plantelor horticole poate fi definită ca un ansamblu de tehnici
moderne, prin care se realizează îmbinarea între un explant de dimensiuni mici (crescut şi
multiplicat in vitro) şi un portaltoi adecvat, micropropagat sau obţinut prin metode
tradiţionale.
Gândită pentru prima dată de Morel şi Martin (1952) ca metodă pentru devirozarea
daliei, microaltoirea a fost folosită cu succes de către Murashige şi colab. (1972) şi apoi de
către Navarro şi colab. (1975).
Datorită faptului că în urma termoterapiei meristemul izolat are o capacitate redusă
de creştere, sau că, uneori lăstarii regeneraţi din meristeme nu formează rădăcini, se
recurge la altoirea acestora pe portaltoi stabilizaţi, proveniţi de la plante sănătoase.
De la caz la caz, microaltoirea se realizează în condiţii aseptice, concreşterea
partenerilor urmând a fi făcută în prima fază in vitro, sau în condiţii septice, "la masă",
când prinderea are loc în seră.
Microaltoirea oferă cercetătorului şi pepinieristului un câmp larg de posibilităţi
pentru rezolvarea unor probleme existenţiale la culturile in vitro şi pentru înlăturarea unor
neajunsuri ale înmulţirii clasice prin altoire.
Principalele câştiguri pe care le aduce microaltoirea sunt:
- se rezolvă problema producerii unei mari cantităţi de plante altoite într-un timp relativ
scurt;
- se foloseşte pentru devirozarea materialului genetic virozat în următoarele cazuri:
când acesta nu suportă tratamentele de termoterapie; când există pericolul apariţiei unor
mutaţii în urma termoterapiei; la specii care se înmulţesc greu in vitro;

139
- se poate folosi pentru specii care, deşi se multiplică foarte bine in vitro, nu
înrădăcinează;
- este un instrument util pentru studiul afinităţii la altoire a noilor soiuri şi portaltoi
obţinuţi în lucrările de ameliorare. Se pot studia mecanismele de declanşare a lipsei de
afinitate;
- are avantajul că altoiul nu vine în contact cu mediul de cultură şi astfel nu este supus
riscului mutaţiilor sau influenţei directe a hormonilor;
- există posibilitatea juvenilizării materialului îmbătrânit prin microaltoire repetată pe
portaltoi juvenili;
- condiţiile de cultură şi de mediu sunt mai bine controlate.

6.2.1. Microaltoirea in vitro


Constă în altoirea în condiţii aseptice in vitro a unui apex meristematic pe un
portaltoi obţinut din seminţe sau din minibutaşi.
Portaltoii folosiţi trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
- să aibă seminţe cu bună germinabilitate şi creştere pe mediile artificiale de
cultură;
- minibutaşul să aibă ţesuturi elastice şi turgescente;
- minipuietul să aibă cambiu activ uşor depistabil;
- să aibă ţesuturi rezistente la oxidare şi care se înverzesc după trecerea la
lumină;
- să aibă un aparat radicular bine format, capabil să crească şi să trăiască în
mediu lichid de cultură.
În cazul folosirii înmulţirii vegetative a portaltoiului (minibutăşire), în plus, aceasta
trebuie să aibă o rată de multiplicare ridicată, să înrădăcineze uşor şi să nu aibă probleme
de aclimatizare.
1. Obţinerea portaltoiului se poate face din seminţe. În acest sens, pentru început, seminţele
sunt scoase din starea de dormans prin una din metodele cunoscute: stratificare; tratamente
cu citochinine şi gibereline (benzil-aminopurinâ 20 mg/1, respectiv acid giberelic GA3 100
mg/1); tratamente cu frig (4°C), etc.
Se înlătură apoi endocarpul păstrând tegumentele seminale.

140
În continuare, se face verificarea viabilităţii seminţelor prin scufundarea timp de 20
de ore a unor probe într-o soluţie 1% de clorură de 2,3,5 trifeniltetrazoliu. Seminţele cu
ţesuturi colorate roşu-intens sunt viabile.
Materialul este supus apoi, la 1-2 sterilizări cu etanol 70%, 1 min., hipoclorit de
sodiu (0,7% clor activ) + Tween 20 0,3% timp de 20 minute, după care se fac spălări
repetate cu apă distilată sterilă. După caz, se face o a doua sterilizare.
Seminţele sterilizate se pun la germinat pe mediu Murashige&Skoog + 10 g/1 agar,
în termostat la 20°C, la întuneric. După 10-20 de zile seminţele germinează şi puieţii se
alungesc.
Portaltoii se pot obţine şi din minibutaşi. Minibutaşii (fragmente uninodale) se
prelevează de la plante libere de viruşi. Se sterilizează apoi cu hipoclorit de calciu (0,7%
clor activ) + Tween 20 (0,3%) şi se trec pe mediu adecvat.
Pentru obţinerea portaltoilor se pot folosi şi meristeme apicale sau laterale. După
mai multe multiplicări, lăstarii se trec pe un mediu de înrădăcinare, de exemplu, la
sâmburoase cu 1 mg/1 IBA.
2. Pregătirea altoiului. Altoiul constă dintr-un apex meristematic provenit fie de la lăstari
crescuţi in vitro, fie de la lăstari sau ramuri in vivo. În al doilea caz înainte de prelevare se
execută un protocol pentru sterilizarea explantelor.
3. Altoirea propriu-zisă se face prin înlăturarea cotiledoanelor de la portaltoii obţinuţi din
seminţe care apoi sunt secţionaţi transversal. Se secţionează de asemenea transversal
portaltoii vegetativi.
Apexul meristematic de dimensiuni foarte reduse (0,3 mm) se detaşează şi se
aşează pe zona cambială a portaltoiului secţionat.
Planta altoită se trece apoi într-o eprubetă sterilă pe mediu de cultură lichid pentru a
se asigura o atmosferă saturată în umiditate, necesară prinderii.
4. Aclimatizarea se realizează când mini-altoiul atinge 1,5-2 cm lungime prin
transplantarea plantei altoite într-un vas in vivo. Se trece apoi gradat la realizarea
aclimatizării în condiţii "blânde" cu umiditatea relativă a aerului, ridicată.
Dezavantajele acestei metode ar consta în folosirea unui personal calificat şi în
tehnica de lucru pretenţioasă.

141
6.2.2. Microaltoirea in vivo
Microaltoirea in vivo se execută în condiţii normale folosind ca altoi un meristem
apical crescut in vitro iar ca portaltoi, un puiet sau un butaş înrădăcinat de dimensiuni
reduse.
1. Pregătirea altoiului se face prin prelevarea apexului meristematic (0,5 mm) după
sterilizarea materialului şi creşterea pe mediu pentru a-şi mări dimensiunile. Se recomandă
ca acesta să nu fie în contact direct cu mediul ci să fie aşezat pe o bucată de hârtie de filtru
(punte).
Când apexul atinge 0,5-1 cm lungime se fasonează în formă de pană dublă
punându-se pe secţiuni câte o picătură de DIECA (antioxidant).
2. Pentru altoirea propriu-zisă se folosesc portaltoi obţinuţi prin metode tradiţionale, aflaţi
în ghivece. Aceştia trebuie să aibă dimensiuni reduse (pentru puieţi 40-160 zile de viaţă).
În momentul altoirii, portaltoiul se retează şi apoi se execută o incizie diametrală.
Pentru prevenirea brunificărilor pe suprafeţele secţionate se aplică un antioxidant: dietil
diticarbonat de sodiu 2 g/1 (DIECA). Pot fi folosiţi alţi oxidanţi cum ar fi: acidul ascorbic,
polivinil pirolidona (PVP), tiourea, cisteina. Pentru stimularea creşterii altoiului se adaugă
o citochinină.
Altoiul se introduce în incizia de pe portaltoi şi apoi se leagă strâns (foto 6.2.)

Foto 6.2. Microaltoirea la piersic folosind altoi şi portaltoi obţinuţi in vitro

142
3. Aclimatizarea se execută în sere în condiţii de umiditate relativă ridicată pentru a se
realiza sudura punctului de altoire.

6.2.3. Microaltoirea ex vitro


Este o tehnică care permite folosirea ca altoi a lăstarilor produşi in vitro, aceştia
altoindu-se pe portaltoi obţinuţi prin metode tradiţionale, sau in vitro.
Altoirea se face la masă în condiţii normale. Se îmbină astfel avantajele
multiplicării in vitro cu simplitatea metodei tradiţionale de altoire.
1. Obţinerea portaltoilor se face fie plecând de la seminţe şi sâmburi, fie prin butăşire în
uscat sau verde. Materialul înrădăcinat este trecut apoi la ghivece. Portaltoii pot fi obţinuţi
şi in vitro, aclimatizaţi şi fortificaţi (foto 6.3.).

Foto 6.3. Portaltoi de viţă de vie fortificaţi, pregătiţi pentru altoirea ex vitro
(Vitroplant)

2. Obţinerea altoilor este relativ simplă, pornindu-se fie de la meristeme, fie de la


fragmente uninodale sau chiar de la alte organe (frunze etc.). După mai multe multiplicări,
lăstarii având o lungime de 3-5 cm se folosesc 1a altoire.

143
3. Altoirea propriu-zisă constă în retezarea portaltoiului transversal şi despicarea
longitudinal pe 1-2 cm lungime.
Lăstarul altoit, preluat din cultura in vitro se fasonează sub formă de pană dublă şi
se introduce în incizia de pe portaltoi. Punctul de altoire se leagă apoi strâns cu folie de
aluminiu, o bandă de cauciuc (foto 6.4.), sau se protejează cu un dispozitiv cu arc (tip
cârlig de rufe).

Foto 6.4. Plantă de viţă de vie microaltoită ex vitro (Vitroplant)

4. Aclimatizarea se face în spaţii protejate, cu umiditatea relativă ridicată în prima fază,


urmată apoi de o călire treptată (foto 6.5.). Plantele sunt trecute apoi în câmp, în pepinieră,
unde, după un sezon de vegetaţie, ating dimensiunile optime pentru plantare.
Altoirea ex vitro este o metodă economică, cu aplicabilitate largă, fiind uşor de
efectuat şi pe cale industrială în complexele de microînmulţire.

144
Foto 6.5. Viţă de vie microaltoită, pregătită pentru livrare şi plantare (Vitroplant)

6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro


Pe lângă cultura de meristeme, însoţită sau nu de termoterapie, s-au studiat şi alte
posibilităţi pentru eliminarea virusurilor sau micoplasmelor din plantele de cultură.
Una din tehnicile folosite este obţinerea de bulbili adventivi sănătoşi pe solzi de
Lilium longiflorum cultivaţi in vitro (Brierley, 1962). Rezultate similare au fost obţinute de
Hildebrandt (1971) la gladiole.
Button şi Bornman (1971), au regenerat plante libere de virusuri la Citrus folosind
embrionii somatici obţinuţi din ţesut nucelar.
La conopidă, devirozarea se poate realiza prin cultivarea meristemelor provenite de
la mugurii floriferi din inflorescenţă (Walkey şi colab., 1974).
Mai multe cercetări experimentale au demonstrat posibilitatea devirozării
materialului biologic prin regenerarea in vitro a unor lăstari adventivi pe frunze, solzi
(tunici) de bulbi sau alte organe infectate.
Astfel, Mori şi colab. (1982) au obţinut lăstari adventivi sănătoşi prin organogeneză
directă din frunze de tutun infectate cu VMT. Acelaşi lucru a fost reuşit şi la viţa de vie.
La crin şi zambilă s-a reuşit regenerarea de lăstari devirozaţi din tunici de bulbi
infectaţi (Allen, 1974; Asjes şi colab., 1974). După diferenţierea meristemelor pe
fragmentele de tunici cultivate in vitro, acestea au fost detaşate şi inoculate pe un alt mediu
pentru alungire şi formarea lăstarilor.

145
Combinând cultura de meristeme cu obţinerea de lăstari adventivi Hakkaart şi
colab. (1983) au reuşit să devirozeze soiul de Kalanchoe “Yucatan”.
Bazându-se pe faptul că la o serie de specii (petunia, tutun, varză) frunzele prezintă
zone cu o densitate redusă a virusurilor sau lipsite de virusuri, în timp ce celelalte părţi ale
plantei sunt puternic infectate, regenerarea lăstarilor adventivi prin organogeneză directă
din limb a fost principala metodă de devirozare.
La plantele cu frunze variegate (himere) această metodă duce la pierderea
caracterului variegat, datorită faptului că fiecare lăstar regenerat se formează dintr-o
singură celulă (Cassells şi colab., 1980; Pelargonium).
Cultura de calus poate să fie folosită de asemenea pentru realizarea devirozării. S-a
observat că prin subcultivarea repetată a calusului de tutun infectat cu VMT acesta devine
liber de virusuri. Eliminarea virusului s-ar datora prezenţei celulelor meristematice tinere
dotate cu o mare capacitate de multiplicare. Aceste celule sunt mult mai rezistente la
pătrunderea şi multiplicarea virusului (Cooper, 1962, citat de Hildebrandt, 1977).
Ţinându-se cont de aceste observaţii, s-a reuşit regenerarea de plante sănătoase din
calus de cartof infectat cu virusul X.
Supunând calusul de Nicotiana rustica unui tratament termic, Walkey (1978) a
reuşit devirozarea completă a acestuia.
Mori şi colab. (1982) au obţinut plante libere de virusuri din protoplaşti izolaţi din
frunze infectate cu virusul mozaicului tutunului.

146
Capitolul 7
Organogeneza in vitro

Organele şi ţesuturile cultivate in vitro în anumite condiţii au capacitatea de a


diferenţia centri meristematici (foto 7.1.) care ulterior dau naştere la lăstari sau rădăcini, iar
uneori la structuri de tip embrioid.

Foto 7.1. Centri meristematici formaţi pe limbul foliar de kiwi (Actinidia deliciosa)

Formarea adventivă a lăstarilor şi rădăcinilor poartă denumirea de organogeneză.


Aceasta poate fi de două feluri: directă sau indirectă, după cum organele respective se
formează, direct sau se trece printr-o fază intermediară de calus.

7.1. Organogeneza directă


7.1.1. Organogeneza adventivă de lăstari
Organogeneza adventivă de lăstari constă în regenerarea directă a unor lăstari
adventivi pornind de la diferite tipuri de organe şi ţesuturi. Metoda este folosită pe scară
largă la specii care regenerează uşor: Saintpaulia, Begonia, Achimenes Streptocarpus,
Lilium, Hyacinthus, Nerine etc.

147
Factorii care influenţează pozitiv organogeneza şi formarea lăstarilor adventivi sunt
numeroşi:
- plantele juvenile au o capacitate organogenetică ridicată; la gimnosperme
regenerarea de lăstari adventivi este posibilă doar folosind embrioni, puieţi tineri sau părţi
ale acestora (David, 1982).
- zaharurile stimulează organogeneza directă cu formarea de lăstari;
- giberelinele şi acidul abscisic inhibă organogeneza;
- lumina stimulează în general procesul de organogeneză.
Există însă o serie de plante care necesită o perioadă de întuneric: muguri floriferi
de Freesia (Pierik şi Steegmans, 1975b) pedunculi de Nerine bowdenii (Pierik şi
Steegmans, 1986a). Rezultatele obţinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stănică F, au
dovedit importanţa întunericului în faza de inducţie pentru stimularea organogenezei
adventive din limb foliar la portaltoiul de măr M-27 (1996).
- culoarea roşie are efect stimulativ la regenerarea lăstarilor adventivi de Petunia
hybrida (Economou şi Read, 1986).
- temperatura ridicată stimulează formarea de lăstari adventivi la marea majoritate a
speciilor horticole. Face excepţie Begonia (Heide, 1965) Streptocarpus (Appelgren şi
Heide, 1972).
- poziţia explantului, importantă. În cazul limbului foliar la majoritatea speciilor,
acesta trebuie aşezat cu pagina inferioară pe mediu. Uneori se recomandă crestarea
nervurilor frunzei înainte de inoculare.
Cercetările lui Pierik, 1987 au demonstrat creşterea numărului de lăstari inoculaţi
la Kalanchoe forinacea prin aşezarea explantelor în poziţie verticală.
- hormonii de creştere influenţează organozeneza în mod diferit; există specii care
nu necesită aport suplimentar de auxine sau citochinine pentru declanşarea organogenezei
chiar dacă aceste substanţe stimulează apoi procesul respectiv: honesty (Pierik, 1967),
cicoarea (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren şi Heide, 1972).
- marea majoritate a speciilor formează lăstari adventivi în prezenţa citochininelor
în timp ce auxinele inhibă procesul. Uneori acest lucru este posibil şi atunci când este
vorba de explante de tipul peţiolului, rădăcinilor sau internodurilor (Stănică, F., 1995).
- puţine specii au nevoie de auxine: crinul (van Aartrijk, 1984), zambila (Pierik şi
Steegmans, 1975d)

148
- raportul citochinine:auxine trebuie să încline în favoarea primelor, fapt
demonstrat la Begonia (Heide, 1965), hrean (Wurm, 1960), conopidă (Margara, 1969),
cicoare (Diaconescu, 2002).
Cicoarea witloof (Cichorium intybus L.) are capacitatea de a forma in vitro noduli
meristematici pe explantele foliare aşezate cu partea superioară în contact cu mediul de
cultură (foto 7.2.). Cea mai mare rată de regenerare s-a observat la o balanţă hormonală
alcătuită din 0,1 mg/l AIB şi 1,0 mg/l BAP.

Foto 7.2. Regenerare de noduli meristematici din limb foliar la Cichorium intybus L.

- cea mai folosită citochinină este BAP iar pentru gimnosperme este singura
recomandată. Celelalte citochinine sunt mai puţin folosite.
- concentraţii ridicate de citochinine (BAP) pot determina dereglarea procesului de
organogeneză. Se recomandă în această situaţie alternarea culturii pe două medii cu
concentraţii diferite de BAP.
- zeatina a avut un rol important în procesele de organogeneză la kiwi folosind
diferite tipuri de explante (Stănică, F. şi colab. 1995, 1998) (foto 7.3. a, b şi c).
- tidiazuronul (TDZ) şi 2 izopentiladenina (2iP) au determinat efecte spectaculoase
de stimulare a lăstăririi adventive. Din acest motiv cele trei substanţe sunt mult folosite în
lucrările de cercetare în ultimii ani în ciuda preţurilor de cost ridicate.
- adenina sulfat poate stimula organogeneza adventivă la Begonia (Ringe şi Hitsch,
1968), tutun (Skoog şi Tsui, 1948), ulm (Jacquiot, 1951). În combinaţie cu citochininele,
adenina sulfat a stimulat formarea lăstarilor adventivi (Skoog şi Miller, 1957; Nitsch şi
colab. 1969a).

149
a b

c
Foto 7.3. Organogeneză directă de lăstari din rădăcini (a), peţiol (b) şi limb foliar (c)
la kiwi (Actinidia sp.)

- acidul abscisic inhibă formarea lăstarilor adventivi la marea majoritate a speciilor,


excepţie făcând batatul (Yamanguchi şi Nakajima, 1974)
- etilena are şi ea un rol important în formarea bulbilor adeventivi la arin (van
Aartrijk, 1984).
- substanţele antiauxinice, cele care inhibă transportul auxinelor (TIBA) au ca efect
stimularea organogenezei adventive.
- vitaminele stimulează formarea lăstarilor adventivi la ciclamen (Mayer 1956),
ulm (Jacquiot, 1951), hrean (Wurm, 1960).
- infectarea materialului iniţial cu A. tumefaciens rasa C58, stimulează
organogeneza adventivă la cartof, plop, tutun (Ooms şi colab., 1983, Steffen şi colab.
1986). Efectul s-ar datora şi juvenilizării materialului iniţial datorită acţiunii bacteriei.
Datorită multiplelor aplicabilităţi ale acestei tehnici, dintre care amintim în primul
rând folosirea în transformarea genetică, numărul lucrărilor de cercetare privind
organogeneza directă de lăstari la speciile horticole este mare.
În tabelele 7.1.1, 7.1.2., 7.1.3., 7.1.4. sunt prezentate câteva din rezultatele
cercetării în acest domeniu.

150
Tabelul 7.1.1.
Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele legumicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant iniţial Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Lăstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0-2)ANA+(4) BAP Hussey&Falavigna
1980
Asparagus Calus Nitsch et al, (1969a) 30 6 (0,09- Bui Dang Ha et al,
officinalis 0,43)AIA+(0,9)BAP (1975)
Calus Pelletier et al, (1972) To - 20 5 Doré (1974)
Calus Pelletier et al, (1972) To - 20 5 (0,2)BAP (µg/l) Pelletier et al (1972)
Calus Murashige & Skoog - 30 - Steward & Mapes (1971
(1962) b)
Calus Linsmaier & Skoog 5,8 30 8 Wilmar & Hellendoorn
(1965) (1968)
Lăstar cu un Yang (1977) 5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang (1977)
mugure
Brassica oleracea Calus Gamborg et al, (1968) B5 5,5 20 8 (0,5)BAP Bagga et al (1982)
botrytis
Brassica oleracea Calus Shahin (1985) TM-4 5,8 10 7 (0,99) BAP +(0,1) GA3 Lillo & Shahin
capitata (1986)
Brassica oleracea Calus Murashige & Skoog 5,7 30 7 (2)AIA + (0,043) Kin + 15% Dietert et al (1982)
gemmifera (1962) CM
Lăstari Gamborg et al (1968) B5 - 20 8 (0,3) 2iP Ockendon (1984,
1985)
Capsicum annuum Cotiledon + Murashige & Skoog 5,8 30 6,8 (1)AIA + (1) BAP sau Gunay & Rao
hipocotil (1962) (1) PBA (1978)
Cichorium intybus Fragmente de, frunze
Knop Kin, AIA Vasseur (1978a)
etiolate (16 mm Ø)

151
Tabelul 7.1.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Cucumis melo Fragmente de frunze, Reynolds et al, (1980) 5,7 40 glucoză 8 (0,1)NOA+(20) Blackmon&
cotiledon sau frunze 2iP+(0,1)CCC Reynolds (1982)
cotiledonare
calus Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (0,1)BAP Moreno et al,(1984)
Calus si lăstari Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (0,1)AIA Moreno et al,(1984)
Cucumis sativus Calus din Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (1)ANA+(1)BAP Wehner&Locy
cotiledon (1981)
Daucus carota Lăstari Thorpe&Murashige(1968; 5,8 30 10 (2)AIA+(2)Kin+(160)A Smith&Murashige
1970)Sf dS (1970)
Ipomoea batatas Fragmente de Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (1)ANA+( 0,1)BAP Carswell&Locy(198
rădăcini 4)
Lactuca sativa Cotiledon Doerschung & Miller 30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Doerschung & Miller
(1967) (1967)
Calus Engler & Grogan 5,8 17,1 15 (0,01) 2,4-D+(0,2)Z Engler & Grogan
(1983)DM (1983)
Calus Murashige&Skoog (1962) 5,7-5,9 20 6 (10)AIA+(0,04)Kin Vasil & Hildebrandt
(1966c)
Lycopersicon Cotiledon Yang&Chang(1979) 5,7 30 2 gelrite (0,5)AIA+(2)BAP Ammati et al,(1984)
esculentum Calus Murashige&Skoog (1962) 30 8 [(7)ANA+(2)Z] sau Behki & Lesley
[(1)ANA+(2)BAP] (1980)
Hipocotil Nitsch et al,(1967)S 5,5 30 8 (0-3,5)AIA + (0,2-2)2iP Bigot et al,(1977)
Ţesut medular Murashige&Skoog (1962) 5,8 3 6 (2)Z+(0,01)TIBA Cassells (1979)
Hipocotil Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,5)AIA+(2)BAP Gunay&Rao (1980)
Fragmente de Pence & Caruso (1984) - 30 8 (1,75) AIA + (2) BAP Pence & Caruso
frunze (1984)
Calus Shahin (1985) TM –4 5,8 30 6 (0,2) GA3 + (1) Zr Shahin (1985)
Petroselinum Calus Murashige&Skoog (1962) 5,7-5,9 30 10 (10) AIA + (0,04) Kin Vasil & Hildebrandt (1966
hortense b,c)

152
Tabelul 7.1.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Solanum Fragmente Murashige&Skoog 30 agar (0,5 – 10) Kin Gleddie et al (1982)
melongena frunze (1962)
Calus Pelletier et al (1972) To 5,8 20 7,5 (0,2) BAP Isouard et al (1979)
Fragmente Matsuoka& Hinata 5,5 20 8 (0,0225) BAP + (10) Matsuoka& Hinata
hipocotil (1979) AdS (1979)
Calus White (1954) 20 agar (2-4) AIA + (4-) Kin Yamada et al (1967)
3 cm rădăcină Murashige&Skoog (1962) 30 0 (agar) Zelcer et al (1983)
Solanum Calus Shepard & Totten 5,7 3 10 (0,1 ) AIA + (0,5) Z Austin & Cassells
tuberosum (1977) D (1983)
Calus Murashige & Skoog 5,8 10 7 (1)AIA + (1) BAP + Austin & Cassells
(1962) (10) GA3 (1983)
Fragmente Ratnamba & Chopra 5,8 30 agar (0,4) AIA + (0,8) Kin + Bragdo – Aas
tuberculi (1974) (0,4) BAP (1977)
Calus Ratnamba & Chopra 5,8 30 agar (0,4) AIA + (0,8) Kin + Bragdo – Aas
(1974) (0,4) BAP (1977)
Fragmente Jarret et al (1980 a, b) 5,7 30 9 (0,03) ANA + (0,3-1) Jarret et al (1980 a,
tuberculi BAP b)
Fragmente Lam (1975) 20 9 (0,4) AIA + (0,8) Kin + Lam (1975)
tuberculi (0,4) GA3 + (0,4) BAP
Fragmente lăstari Murashige & Skoog 5,7 20 7 (1) BAP Marani & Pisi
(1962) (1977)
Fragmente lăstari Murashige & Skoog 5,7 30 agar (0,01) ANA + (1) BAP Resende & Paiva
(1962) + (0,1) GA3 (1985)
Lăstari Murashige & Skoog 5,7 30 agar (0,01) ANA + (1) Kin + Resende & Paiva
(1962) (0,1) GA3 (1985)
Calus Murashige & Skoog 5,8 30 agar (3,63) Zr Sopory & Tan
(1962) (1979)

153
Tabelul 7.1.2.
Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele floricole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant iniţial Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Agave sp, Calus Linsmaier & Skoog 5,8 30 8 (0,2) 2,4-D+(1)Kin Groenewald et al,
(1965) (1977)
Calus Groenewald et al, 5,8 30 8 (0,2) 2,4-D+(1)Kin Groenewald et al,
(1975) (1977)
Amaryllis sp, Calus Bapat & 5,8 20 8 (0,5) 2,4-D + (1) Kin + Bapat &
Narayanaswamy (1976) 10% CM Narayanaswamy
(1976)
Anemone Fragmente 0,5 x Linsmayer & (0,2) AIA + (2) BAP Sutter & Langhans
coronaria Lăstari Skoog (1965) (1978 a,b)
Anthurium Calus Pierik et al (1974) 40 agar (0,23) BAP Fersing & Lutz
scherzerianum (1977)
Antirrhinum majus Lăstari Sangwan & Harada 5,5 20 6 (0,25) NOA +10 % CM Pfister & Widholm
(1975) (1984)
Begonia rex Petiol Murashige & Skoog 5,8 30 6 (00,1) ANA + (0,1) Cassells & Morrish
(1962) BAP (1985)
Fragmente Schott & Scraudolf 20 agar Schott & Scraudolf
frunze (1967) (1967)
Begonia Frunze sau petiol Ranga Swamy (1961) I 5,8 20 8 (10-20) Ad Sehgal (1975)
semperflorens Frunze Bourgin & Nitsch 5,8 20 7 (0,23) BAP sau (0,31 – Thakur (1973)
(1967) H 3,1) PBA
Begonia spp, Frunze si petioli Ringe & Nitsch (1968) 5 20 8 (1)AIA + (2,3)BAP Ringe & Nitsch
(1968)
Begonia Fragmente Peck & Cumming (1984 5,8 30 6,5 (1) ANA + (5) BAP + Peck & Cumming
tuberhybrida frunze a) 1 (125) Ad (1984 a)

154
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Camellia japonica Lăstari Samartin et al ( 1984) 1 5,5- 30 6 (1) BAP + (0,1) ANA + Samartin et al
5,6 (20) AdS (1984)
Chrysanthemum sp. Calus Hill (1967) B2 5,6 20 10 (1) Kin Hill (1968)
Fragmente lăstar Kaul & Staba (1968) 6 30 10 (9) AIA + (2,25) BAP Grewald & Sharma
(1978)
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 10 (20) BAP Staba et al (1984)
(1962)
Fragmente Murashige & Skoog 5,8 30 10 (0,203) BAP Wambugu &
lăstari (1962) Rangan (1981)
Calus Linsmaier & Skoog 30 5 (0,2) ANA + (2) Kin + Bush et al (1975)
(1965) (10) GA3
Calus Nitsch & Nitsch (1965) 5,5 20 6 (1) 2,4 -D Sangwan & Harada
S (1977)
Coleus blumei Fragmente Robbins & Hervey 4,5 20 0 (0,01) ANA + (0,05) Hervey & Robbins
frunze (1969) BRVS 2 BAP (1978)
Lăstari Robbins & Hervey 4,5 20 0 (0,005) ANA + (0,0025) Hervey & Robbins
(1969) BRVS 2 BAP (1978)
Ţesut medular Thorpe & Murashige 5,8 30 10 (2) AIA + (2) Kin + Smith & Murashige
(1968; 1970) Sf (160) AdS (1970)
Colocasia Calus Abo El – Nil & Zettler 5,8 20 6 (2) Kin + (0,09-0,93) Abo El – Nil &
esculenta (1976) A Z ANA Zettler (1976)
Calus Linsmaier & Skoog 5,8 30 0 (1) Kin Jackson et al (1977)
(1965) a
Cordyline Ţesut medular Kunisaki (1975) 5,8 30 9 (0,5) BAP Kunisaki (1975)
terminalis Calus Heinz & Mee (1969) 5,6 20 9 10% CM Mee (1978)
Fragmente Miller & Murashige 5 30 8 (1) AIA + (3) Kin + Miller & Murashige
lăstari (1976) (80)AdS (1976)

155
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Dianthus Fragmente Davis et al (1977)MS- 5 50 6 (0,19)ANA + (2,15)Kin Davis et al (1977)
caryophyllus lăstari 3X
Fragmente Davis et al (1977)MS- 5 50 6 (0,05)ANA + (0,54)Kin Davis et al (1977)
lăstari 3X
Fragmente Linsmaier & Skoog 5,7 30 6 (0,1)ANA+(0,5)Kin Earle & Langhans
lăstari (1965) (1975)
Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962) 30 0 (1) Kin Gukasyan et al(1977)
Calus Hackett & Anderson 30 agar (1) ANA Hackett &
(1967) Anderson (1967)
Dracaena Ţesut medular Debergh (1975) 5,8 20 6 (0,1) ANA + (5) Kin Debergh (1975);
deremensis 1976)
Dracaena Fragmente Miller & Murahige 5 30 0 (1) AIA + (3) Kin + Miller & Murashige
gosetfiana lăstari (1976) II (120) AdS (1976)
Dracaena Calus Murahige & Skoog 30 8 (1) Kin + 15% CM Choa et al (1981)
marginata (1962)
Ficus benjamina Fragmente Miller & Murahige 5,8 30 agar (0,3) AIA + (30) 2iP + Makino et al (1977)
lăstari (1976) II (80) AdSh
Ficus lyrata Frunze Debelgh & De Waiel 5,8 20 6 (2,5) IBA + (5) BAP Debelgh & De
(1977) Shoots Waiel (1977)
Freesia sp, Calus Bajaj & Pierik (1974) 5,8 30 8 (5) Kin Bajaj & Pierik
(1974)
Freesia hybrida Calus Linsmaier & Skoog 5,6 30 6 (5) Kin Stimart & Ascher
(1965) (1978 b, 1982)
Fuchsia hybrida Fragmente Miller & Murashige 5 30 7 (2-4)BAP+(80)AdS Harris&Mason
lăstari (1976) II (1983)
Fragmente Gamborg et al, (1968) 5 30 0 (3)BAP Stevenson&Harris
lăstari B5 (1980)
Gardenia Fragmente Economou & Read 5 20 6 (5-10)2iP Economou &
jasminoides lăstari (1984) Spanoudaki (1985)

156
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Gerbera jamesonii Fragmente Hedtrich (1979)A 10 8 (0,1)AIA +(10)BAP Hedtrich (1979)
frunze
Fragmente Hedtrich (1979)A 10 8 (1)BAP+(0,1)GA3 Hedtrich (1979)
Lăstari
Calus Meynet & Sibi (1984) 1 5,8 20 8 (0,25)AIA + (1)BAP Meynet & Sibi
(1984)
Fragmente Murashige et al (1974) 5,7 45 10 (0,5)AIA + (10)Kin + Murashige et al
Lăstari (80) AdS (1974)
Calus Sitbon (1981)1 5,7 45 8 (0,5)AIA + (2)BAP + Sitbon (1981)
(2)Kin
Gladiolus Calus Murashige & Skoog 5,8 30 agar (0,1)ANA + (2)Kin Bajaj et al (1983)
grandiflorus (1962)
Lilium sp, Calus Simmonds & Cumming 5,7 30 6 (1,1)2,4-D sau BAP Simmonds &
(1976) Cumming (1976)
Mammillaria Tuberculi Johnson & Emino 5,6 45 10 (1)IBA+(10)2iP Johnson & Emino
elongata (1979) (1979)
Mammillaria Ţesut medular Murashige & Skoog 5,8 30 8 (2)AIA + (2)Kin Kolar et al (1976)
voodsi (1962)
Monstera Fragmente Linsmaier & Skoog 5,7 30 8 (2)AiA + (10)PBA Fonnesbech &
deliciosa Lăstari (1965) Fonnesbech (1980)
Narcissus sp, Bulbili sau Heinz & Mee (1969) 20 7 (0,03-5)ANA + (2- Hussey
plantule 8)BAP (1976c;1977a)
Lăstari Heinz & Mee (1969) 20 7 (0,03-5)ANA + Hussey
(1-2)BAP (1976c;1977a)
Fragmente Hussey (1977a)1 sau 2 20-30 7 (0,25-4)ANA + (2- Hussey (1982)
frunze sau (1982) 16)BAP + (150)AdS
Nephrolepsis Fragmente Miller & Murashige 30 8 (1,1-11)Kin +/- Beck & Caponetti
falcata Lăstari (1976)III (0,93)ANA (1983)

157
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Nephrolepsis spp Stoloni 0,5x Murashige & 5,6 30 8 Henson (1979)
Skoog (1962)
Rizom Miller & Murashige 5,8 30 8 (2)AIA+(0,04)Kin+ Beck & Caponetti
(1976)III (1,13) BAP (1983)
Pelargonium Fragmente Theiler (1977) 5,6- 30 0 (1)IBA + (0,2)Z Theiler (1977)
peltatum Lăstari 5,8
Pelargonium spp, Lăstari Beauchesne et al (1977) 10 glucoză 6-7 (0,25)AIA + (0,1)2iP + Beauchesne et al
III sau IV (1)GA3 +/- (2)Ad (1977)
Petunia hybrida Fragmente Linsmaier & Skoog 5,7- 30 5 (0,2)BAP Daykin et al (1976)
frunze (1965) 5,8
Calus Sangwan & Norreel 5,6 20 agar (0,1)ANA + (1)BAP Sangwan & Norreel
(1975) (1975)
Phalenopsis sp, Muguri Knudson (1946)C 30 agar (2)ANA Hackett et al (1972)
adventivi
Phalenopsis sp, Muguri dorminzi Koch (1974) A 20 5 (0,3)ANA Pipper & Zimmer
(1976)
Saintpaulia Peţiol Murashige & Skoog 5,8 25 8 (0,1)ANA + (0,01- Bilkey et al (1978)
ionantha (1962) 0,5)BAP
Frunze tinere Murashige & Skoog 5,8 30 6 (1)ANA + (1)BAP Cassells & Plunkett
(1962) (1984)
Fragmente frunze Cooke (1977) 5,7 30 9 (2)AIA + (0,08)BAP Cooke (1977)
Peţiol Grunewaldt (1976) 5,8 30 8 (0,2)AIA+(0,1)2,4-D Grunewaldt (1976)
+(0,4) BAP + 19 % CM
Peţiol Grunewaldt (1977) 5,8 30 8 (0,8)AIA+(0,5)Kin Grunewaldt (1977)
Peţiol Harney & Knap (1979) 30 6 (0,5)ANA + (0,5)Kin Harney&Knap (1979)
Calus Murashige & Skoog 5,8 30 8 (1)ANA+(0,5)BAP Weatherhead et
(1962) al(1982)
Sansevieria Meristemoizi Murashige & Skoog 6,3 20 8 (0,3) Kin Blazich & Novitzky
trifasciata (1962) (1984)

158
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Tagetes erecta Muguri Murashige & Skoog 5,8 30 8 (1)AIA + (3)BAP Kothari & Chandra
(1962) (1984a)
Fragmente Murashige & Skoog 5,8 30 8 (5)AIA + (3)BAP+ Kothari & Chandra
Lăstari (1962) (0,5)GA3 (1984b)
Calus Murashige & Skoog 5,8 30 8 (5)AIA + (7)BAP Kothari&Chandra
(1962) (1984b)
Tulipa gesneriana Bulbili Riviere & Muller 5,5 50 glucoză 6 Riviere & Muller
(1979) (1979)

Tabelul 7.1.3.
Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele pomicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant iniţial Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Actinidia deliciosa Fragmente Harada (1975) 5,5 20 7 (1) Z + (40) Ad Harada (1975)
rădăcini
Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962) 30 Agar (1) Z Kwei et al (1980)
Fragmente Monette (1986 a) I 5,7 22,5 0,7 (0,023) IBA + (2) BAP Monette (1986 a)
lăstari + (60) AdS
Amygdalus Lăstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,0225) BAP Hisajima (1982 a)
communis Lăstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,0225)BAP+(0,005) Hisajima (1982 a)
IBA
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 9 (0,1) ANA + (0,7) BAP Ruginii & Verma
(1962) (1982;1983)
Calus Matheus&Rangan (1981) 30 agar 5%CM Matheus&Rangan(1981)
Ananas comosus Lăstari 0,5xMurashige & 30 0 (0,5-1)IBA Zepeda & Sagawa
Skoog (1962) (1981)

159
Tabelul 7.1.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Armeniaca Fragmente Skirvin et al,(1980) 5,7 20 agar Nu sunt mentionate Skirvin et al,(1980)
vulgaris lăstari
Castanea sativa Epicotil San Jose et al, (1984) L 30 6 [(0,1)NAN sau IBA] San Jose et al,
sau Ha +(2)BAP (1984)
Cerasus avium Fragmente Jones et al (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP+ Seirlis et al, (1979)
lăstari (0,1)GA3
Cerasus vulgaris Fragmente Skirvin et al (1980) 5,7 20 agar Skirvin et al (1980)
lăstari
Lăstari Skirvin & 5,7 30 agar (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin et
Chu(1978a,b) al,(1981b)
Citrus sp, Fragmente Hoagland&Snyder 0 0 Murashige et al
rădăcini (1933) (1972a)
Fragmente Kitto& Young (1981)S 5,6- 30-40 10 (5)BAP+(80)AdS Kitto& Young
lăstari (5mm) 5,8 (1981)
Corylus avellana Calus Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)Kin+(2)Ad Radojevic et
al,(1975)
Calus Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)Kin+(2)Ad+(1)GA3 Radojevic et
al,(1975)
Diospyros kaki calus Yokoyama&Takeuchi 5,6- 30 7 (1)ANA + (0,1-1)Kin Yokoyama&Takeu
(1976) 5,8 chi (1976)
Fragaria Fragmente Murashige & Skoog 5,6 30 7 (0,2-1)IBA + (1,1)BAP Anderson et al,
lăstari (1962) + (1)GA3 sau (0,02- (1982)
0,2)IBA+(1,1)BAP
Glossularia Fragmente Murashige & Skoog 5,5 30 6 (0,1)IBA + (0,49)BAP Welander (1985a)
redinata lăstari (1962)
Juglans hindisii x Lăstari Extra vitrum Driver &
J, regia Kuniykuhi (1984)

160
Tabelul 7.1.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Juglans regia Lăstari Chalupa (1981a)A 30 6 (0,1-0,3)ANA+(0,1- Chalupa (1981a)
0,6)BAP +(20)AdS
Seminţe 0,5 x Rodriguez 5,5 30 6 (9)BAP Rodriguez (1982b)
(1982b)K(h)
Juglans regia Lăstari Rodriguez (1982b)K(h) 5,5 30 6 (0,4)IBA+(0,4)BAP Rodriguez (1982b)
Malus x domestica Fragmente Jones et al (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP Jones et al (1979)
lăstari +(0,1)GA3+(162)PG
Cotiledon Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,3)BAP Liu et al (1983a)
Calus Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (1)BAP Liu et al (1983a)
Calus din cotiled., White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin Mehra & Sachdeva
sau tesut med. +(1)GA3 + 15% CM (1979)
Calus din embr. White (1943a)A 20 agar (2)ANA+(2)BAP + Mehra & Sachdeva
sau lăstari 15% CM (1979)
Lăstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(1)BAP+ Snir & Erez (1980)
(0,1)GA3
Lăstari Linsmaier & Skoog 5,2 29,9 7 (0,1)IBA+(0,48)GA3 Van Nieuwkirk et
(1965) al (1986)
Muguri dorminzi Zimmerman 20 7 (0,01)IBA + (0,09 Zimmerman
/ lăstari (1984a)Lep BAp) (1984a)
Morus alba Fragmente Lakshmi-Sita et al 5,6 30 8 (1)BAP Oka & Ohyama
lăstari (1976) (1981)
Fragmente Lakshmi-Sita et al 5,6 30 8 (10)BAP Oka & Ohyama
lăstari (1976) (1981)
Muguri Murashige&Skoog(1962) 5,6 30 8 (10)BAP Oka&Ohyama(1981)
Musa acuminata Lăstari Krikorian & Cronauer 5,8 41 0 (4,95)BAP+10%CM Cronauer &
(1984) Krikorian (1985a)
Lăstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 7 (5)BAP + 10% CM Cronauer &
Krikorian (1985b)
Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 20 8 (10)BAP+15%CM Dore Swamy & al (1983)

161
Tabelul 7.1.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Musa cavendishii Calus Murashige & Skoog 30 agar (0,3)AIA+(1)Kin sau Ma et al (1978)
(1962) [(2)BAP+20%CM]
Musa spp, Lăstari Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (5)BAP Cronauer &
Krikorian (1984)
Musa textilis Lăstari Mante & Tepper (1983) 5,7 30 5-8 (0,1)IBA+(3-5)BAP Mante & Tepper
I +(160)AdS (1983)
Persica vulgaris Lăstari Miller et al (1982)A 20 8 (0,1)ANA+(2)BAP Miller et al (1982)
Lăstari Skirvin &Chu 5,7 30 agar (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin &Chu
(1978a,b) (1978a,b)
Phoenix Fragmente Linsmaier&Skoog 5,7 30 8 [(0-1)2,4-D sau Tisserat et al (1979)
dactylifera lăstari (1965) ANA]+(3)2iP +(40)AdS
Calus Thompson & Gordon 5,6- 30 8 Tisserat (1982)
(1977) 5,8
Fragmente lăstari Tisserat (1984a) 5,6-5,8 30 8 (10)2,4-D Tisserat (1984a)
Pistacia vera Seminţe 0,5xMurashige & 5,8 0 0 Barghchi&Alderso
Skoog (1962) n (1983)
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 0 7 (4)BAP Barghchi&Alderso
(1962) n (1983)
5-8 mm lăstari Murashige & Skoog 30 7 (4)BAP Barghchi&Alderso
(1962) n (1985)
Prunus cerasifera Fragmente Miller&Murashige 5,6 30 7 (10)2iP+(162) PG Garland&Stoltz
lăstari (1976)II (1981)
Fragmente Kim et al, (1981) 5,8 20 0 (0,01)IBA+(1)BAP Hammerschlag
lăstari (1982b)
Fragmente Linsmaier&Skoog 5,8 30 7 (0,5)BAP Norton & Boe
lăstari (1965) (1982)
Prunus domestica Fragmente Pietropaolo & Reisch 5,8 30 7 (1,1)BAP Pietropaolo &
lăstari (5-15mm) (1984) Reisch (1984)
Fragmente lăstari Skirvin et al (1980) 5,7 20 agar Nu sunt menţionate Skirvin et al (1980)

162
Tabelul 7.1.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Prunus insititia Fragmente Jones et al, (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP+ Jones & Hopgood
lăstari (0,1)GA3 +(162)PG (19790
Pyrus communis Fragmente Lane (1979b) 5,2 30 7 (1,13)BAP Lane (1979b)
lăstari
Fragmente Murashige & Skoog 5,8 30 8 (1,36-2,25)BAP+(1,1)Z Shen&Mullins
lăstari (1962) +(1,02)2iP (1984)
Fragmente Linsmaier & Skoog 5,7- 30 6 (2)BAP Singha (1982a,c)
lăstari (1965) 5,8
Ribes nigrum Fragmente Murashige & Skoog 5,7 20 6 (1,35)BAP Flegmann&
lăstari (1962) Wainwright(1981)
Fragmente Jones &Vine (1968)B 5,6- 40 glucoză 0 Jones &Vine
lăstari 5,8 (1968)
Rubus idaeus Lăstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 agar (0,1)IBA+(1)BAP Donnelly et al,
(1980)
Lăstari Snir (1981)a 5 20 agar (0,22)2,4-D Snir (1981)
+(1)BAP+(0,1)GA3
Lăstari cu noduri Welander (1985c) 5,2 30 6 (1)BAP Welander (1985c0
Rubus sp, Fragmente Linsmaier & Skoog 5,6- 30 7 (1)IBA+(1)BAP Broome &
lăstari (1965) 5,8 +(0,1)GA3 Zimmerman (1978)
Fragmente Linsmaier & Skoog 5,6- 30 0 (0,1)IBA+(1)BAP Donnely et al
lăstari (1965) 5,8 (1986)
Vaccinium sp, Fragmente Zimmerman & B’ 30 5,5 (4)AIA+(15)2iP Zimmerman &
lăstari (1980)Z-2 +(80)AdSh Broome (1980)

163
Tabelul 7.1.4.
Cercetări privind organogeneza de lăstari la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Acer rubrum x Fragmente Murashige&Skoog 5,7 30 10 (0,1-0,5)Thidiazuron Kerns & Meyer
Acer saccharum lăstari (1962) (1985)
Betula pendula Calus Simola (1985)N7 5,6 20 6 [(5/10)Z/Zr] + Simola (1985)
[(0,1/0,2)ANA/NOA]
Calus Srivastava&Steinhauer 5,8 40 6 (2)AIA + (6)Kin + Srivastava&Steinha
(1981a)2 (40)Ad uer (1981a)
Frunze Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (2)AIA + (5)Z + Srivastava et al
(2)GA3 (1985)
Fragmente Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (0,5)ANA + (5)2iP + Srivastava et al
rădăcini (30)Ad (1985)
Betula verrucosa Calus Chalupa (1981b) 1 30 6 (0,05)IBA+ (0,2- Chalupa (1981b)
0,3)BAP + (20)AdS
Biota orientalis Hipocotil Thomas & Tranvan 5,4 30 8 (0,1) IBA + (1,1)BAP Thomas & Tranvan
(thuja) (1982) (1982)
Chaenomeles Fragmente Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (2,5)BAP Norton & Boe
japonica lăstari (1965) (1982)
Crataegus Fragmente Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (0,1-10)BAP Norton & Norton
rachyacantha lăstari (1965) (1986b)
Crataegus cv, Fragmente Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe
TOBA lăstari (1965) (1982)
Fraxinus Fragmente Lloyd & McCown 5,2 20 6 (0,5-1)BAP Heiman & Preece
americana lăstari (1981) WPM (1983)
Fraxinus Fragmente Lloyd & McCown 5,2 20 6 (0,5-1)BAP Heiman & Preece
pennsylvanica lăstari (1981) WPM (1983)

164
Tabelul 7.1.4. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Hedera helix Cotiledon/ Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (0,5)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979)
hipocotil
Hedera helix Calus Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (0,5)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979)
Ţesut medular Banks(1979) 1, 5,7 30 5 (2)ANA + (0,5)BAP Banks (1979)
Hydrangea Fragmente Gamborg et al, 5,5 20 6 (1,8)BAP Bailey et al, (1985)
macrophylla lăstari (1968)B5
Larix decidua Fragmente Bonga (1984) LM 5,6 30 8 (2,25)BAP Bonga (1984)
frunze
Paulownia Hipocotil Murashige & Skoog 30 8 (3)AIA + (3)Kin Marcortriginiano &
tomentosa (1962) Stimart (1983)
Lăstari Murashige & Skoog 30 8 (0,1)IBA + (1)BAP + Marcortriginiano &
(1962) (0,1)GA3 Stimart (1983)
Picea abies Frunze Murashige & Skoog 5,8 30 agar (1,3) BAP Bornman &
cotiledonare (1962) a:DIT Vogelmann (1984)
Frunze Bornman (1981) 5,5 30,8 7 (1,1) BAP Bornman (1983)
cotiledonare MCMa:B
Ace Bornman (1981) 5,5 30,8 7 Bornman (1983)
MCMa:B
Hipocotil Chalupa (1974) WS 5,6 30 7 (0,01) AIA + (2) BAP Chalupa (1977)
Muguri Chalupa (1974) WS 5,6 30 7 Chalupa (1977)
Picea glauca Hipocotil Campbell & Durzam 30 7 (2,25) BAP Campbell &
(1975) Durzam (1975)
Epicotil Rumary & Thorpe 5,9 30 8 (1,13) BAP + (1,02) 2iP Rumary & Thorpe
(1984) (1984)
Picea pungens Muguri dorminzi Von Arnold & Eriksson 5,8 34 8 (2,2) BAP Misson et al (1982)
(1977) LP
Picea mugo Muguri Champbell&Durzan(1975) 30 7 (0,19)ANA + (2,25) BAP Stiff et al (1985)
Pinus sylvestris Ace Bornman & Janson 5,6- 50,5 6-7 (4,5) BAP Bornman & Janson
(1980) 5,8 (1980)

165
Tabelul 7.1.4. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Pseudotsuga Muguri Linsmaier & Skoog 5,6 30 7 Chalupa (1977)
menziesii (1965)
Cotiledon Cheng (1977; 1978) 5,5 30 6 (0,001) ANA + (1,125) Cheah & Cheng
BAP (1978)
Lăstari Thompson (1981) 30 agar (22,5) BAP +/- (0,019) Thompson (1981)
ANA
Pyracantha Lăstari Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (2,5) BAP Norton & Boe
coccinea (1965) (1982)
Quercus robur Fragmente Vieitez et al (1985) H + 30 6 (0,1) BAP Vieitez et al (1985)
lăstari SO4
Rhododendron sp, Lăstari Ma & Wang (1977) 2 5,7 20 7 (5) Kin Ma & Wang (1977)
Lăstari Economou & Read 5 20 6 (5-20) 2 iP Economou & Read
(1984) (1984)
Fragmente Lloyd & McCown 5,8 lichid (1,6) 2 iP McCown & Lloyd
tulpină (1981) WPM (1981)
Rosa hybrida Fragmente Hasegawa (1979) 5,7 30 8 (0,3) AIA + (3) BAP Bressan et al (1982)
lăstari
Fragmente Skirvin & Chu (1979 a) 5,7 30 10 (0,1) ANA + (2) BAP Skirvin & Chu
lăstari (1979 a)
Rosa sp, Lăstari Murashige & Skoog 40 agar (0,004) ANA + (2) Davies (1980)
(1962) BAP + (0,1) GA3
Salix madsudana Lăstari Whitehed & Giles (1976) 5,8 20 agar (0,2) ANA + (0,1) BAP Bhojwani (1980)
Syringa vulgaris Lăstari Start & Cumming 4,5 30 7 (0,25) AIA + (0,1) Hildebrandt &
(1976)S ANA Harney (1983)
Thuja plicata Cotiledon Coleman & Thorpe 5,2 30 agar (0,02) ANA + (0,2) Coleman & Thorpe
(1977) S BAP (1977)
Fragmente Coleman & Thorpe 5,2 30 agar (0,02) ANA + (1,1) Coleman & Thorpe
lăstari (1977) S BAP (1977)

166
7.1.2. Organogeneza adventivă de rădăcini
Formarea adventivă a rădăcinilor in vitro este determinată de un număr mare de
factori care influenţează intensitatea şi desfăşurarea procesului:
- vârsta şi stadiul de dezvoltare al explantului. În general, explantele tinere, baza
lăstarilor, cotiledoanele au capacitate mărită de a diferenţia rădăcini la marea majoritate a
speciilor. Fac excepţie de la această regulă Freesia, Lunaria, Nicotiana, Phoenix, Musa şi
altele.
- poziţia pe plantă a explantului regenerator, în principiu, nu influenţează hotărâtor
formarea şi creşterea rădăcinilor adventive. Totuşi se ştie că explantele bazale şi solzii de
bulbi au randamente mai mari în acest sens. La pomi şi arbuşti fructiferi şi în general la
speciile lemnoase, este importantă atât poziţia pe plantă a explantului cât şi poziţia faţă de
soare.
- specia şi soiul au rol hotărâtor. Se ştie că plantele erbacee au o capacitate mai
mare de a emite rădăcini, acest lucru fiind influenţat şi de prezenţa sau absenţa unor bariere
anatomice.
- sexul plantei de la care se recoltează materialul biologic este şi el important. S-a
observat că la speciile dioice (actinidia, plop, etc.), plantele mascule au o vigoare de
creştere superioară şi o capacitate rizogenetică pe măsură.
- influenţa mărimii explantului este contradictorie. Cu toate că aparent, explantele
de dimensiuni mari ar avea o capacitate mai mare de a forma rădăcini (foto 7.4.), s-a
observat că cele de dimensiuni mai mici au format un număr comparabil de rădăcini,
datorită, se pare, suprafeţei mai mari de contact cu mediul (foto 7.5.).
- orientarea explantelor este esenţială. În mod paradoxal cele mai multe rădăcini s-
au obţinut la cultivarea lăstarilor (explantelor) cu vârful în jos. Fenomenul se explică prin
mai buna oxigenare a ţesuturilor care se află în afara mediului.
- numărul de subculturi influenţează diferit formarea rădăcinilor adventive. Efectul
este diferit însă, în funcţie de specie şi citochinina folosită. Astfel la Rosaceae în general,
numărul de rădăcini scade cu creşterea numărului de subculturi (ex. Chaenomeles). Face
excepţie soiul Jonathan la care se petrece fenomenul invers, datorită probabil, creşterii
gradului de juvenilizare în timp.

167
Foto 7.4. Volum mare de rădăcini la un explant mare de Hakonechloa aureola

Foto 7.5. Rădăcini lungi la un explant de dimensiuni reduse


de curmal chinezesc Ziziphus jujuba

În prezenţa 2iP procesul de reducere a capacităţii rizogenetice evoluează rapid, în


timp ce BAP-ul atenuează acest fenomen.
- prezenţa oxigenului determină formarea rapidă a explantelor după trecerea in vivo.
De asemenea, pe mediile lichide trebuie luate obligatoriu măsuri de aerare prin barbotare
sau alte mijloace. O variantă bună este şi folosirea mediului de cultură în dublu strat.
- lumina influenţează în mod diferit formarea rădăcinilor adventive. Pentru
reducerea acestui fenomen se recomandă folosirea cărbunelui activ în mediile de
înrădăcinare. La majoritatea speciilor şi în special la Prunus cersifera, efectul negativ este

168
evident. Totuşi, la Helianthus tubeosus şi la crin lumina stimulează formarea rădăcinilor.
Acelaşi efect se constată la Petunia când explantele sunt expuse la lumina roşie.
- temperatura ridicată influenţează pozitiv procesele de rizogeneză. Fac excepţie
Lunaria annuna şi speciile lemnoase care reacţionează mai bine la temperaturi scăzute.
- agarul în concentraţie mai scăzută stimulează formarea rădăcinilor.
- creşterea conţinutului mediului de cultură în zaharoză, stimulează formarea
rădăcinilor la speciile lemnoase. Face excepţie Pseudotsuga menziesii, la care se petrece
fenomenul invers.
În tabelele 7.2.1, 7.2.2., 7.2.3., 7.2.4., 7.2.5. sunt prezentate câteva rezultate ale
cercetărilor privind organogeneza de rădăcini la plantele horticole.

7.2. Organogeneza indirectă


Regenerarea unor organe in vitro (lăstari, rădăcini, bulbili, etc.) trecând printr-o
fază intermediară de calus, poartă denumirea de organogeneză indirectă.

Foto 7.6. Formarea lăstarilor prin organogeneză indirectă din calus


de frunză de kiwi (Actinidia deliciosa)

În mod normal calusul formează mai uşor rădăcini decât lăstari (Thomas şi Dovey,
1975). Acest lucru este mai evident pe medii cu conţinut ridicat de auxine şi mai coborât
de citochinine.

169
Ca şi în cazul organogenezei directe auxinele sunt necesare în concentraţie mai
ridicată în faza de inducţie.
În acelaşi timp pe calus se pot forma independent rădăcini sau lăstari.
La concentraţii ridicate de citochinine şi scăzute de auxine are loc formarea
lăstarilor adventivi. Ctochinina cea mai folosită este benzilaminopurina (BAP).
Uneori la baza lăstarilor formaţi se formează simultan şi rădăcini.
Formarea lăstarilor din calus este condiţionată de un număr mare de factori:
- concentraţia de săruri ridicată (care reduce creşterea) stimulează organogeneza
indirectă de lăstari. În acest sens, creşterea concentraţiei de NH4NO3 în cultura de calus
stimulează formarea lăstarilor adventivi. (Pierik şi colab., 1976) a demonstrat însă
contrariul la Anthurium andreanum, la care, reducerea concentraţiei de NH4NO3 determină
creşterea numărului de lăstari adventivi formaţi din calus.
- curentul electric 1-2 µA stimulează organogeneza din calus la Nicotiana tabacum.

170
Tabelul 7.2.1.
Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele legumicole
Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH Autori
(g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Lăstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5)IBA+(0,12)BAP Hussey&Falavigna
1980
Calus Dunstan&Short 5,5 30 8 (0,05-2)ANA+(2-8)2iP Dunstan&Short
(1977a)BDS 1977b
Fragmente White (1937a) - 20 lichid White (1938a)
rădăcini
Asparagus Lăstari Murashige & Skoog 5,7 30 7 (0,09) ANA + (0,11)Kin Chin (1982)
officinalis (1962)
Lăstari Gorter (1965) - 40 20 Gorter (1965)
Lăstari Murashige et al (1972 b) 5,7 25 6 (0,3) ANA + (0,1) Kin + Murashige et
(40) AdS al.(1972b)
Lăstari Pelletier et al. (1972) To - 20 5 Pelletier et al (1972)
Lăstari Murashige & Skoog - 30 agar (0,1) AIA Steward&Mapes(19
(1962) 71b)
Lăstari Murashige & Skoog 5,7 30 7 (0,05-0,1)ANA+(0- Yang & Clore
(1962) 0,05)Kin (1973)
Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,7 30 7 (0,01-0,1) ANA Yang&Clore(1974a,b)
Lăstari Yang (1977) 5,7 30 7 (0,1)ANA Yang (1977)
Brassica alba Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar AIA Leelavahti et al(1984)
Brassica oleracea Calus sub lumină Gamborg et al (1968) B5 5,5 20 agar (2) ANA + (0,5)BAP Tejovathi & Anwar
botrytis roşie (1984)
Lăstari De Fossard et al (1974a) 5,5 41,1 8 Concentraţie ridicată de Trimboli et al (1977)
H-ZH IBA
Lăstari Linsmaier & Skoog 5,8 30 lichid (8) AIA + (0-0,25) Kin Walkey & Woolfitt
(1965) (1970)

171
Tabelul 7.2.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Brassica oleracea Lăstari Shahin (1985) TM-4 5,8 10 7 Lillo & Shahin
capitata (1986)
Brassica oleracea Lăstari Gamborg et al (1968) B5 - 20 8 Ockendon (1984,
gemmifera 1985)
Capsicum annuum Muguri Phillips & Hubstenb’ (1984, 5,8 30 glucoză 8 (0,05) AIA + (0,05) BAP Phillips & Hubstenb
1985) (1984, 1985)
Cichorium intybus Fragmente rădăcini Vasseur şi co.
Heller ANA, kin, GA
cilindrice (6/2mm) (1986)
Cucumis melo Lăstari Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 +/-(0,01-0,1)AIA sau ANA Moreno et al.(1984)
Cucurbita pepo Hipocotil Jelaska et al. (1985) 30 9 (1-32) AIA Jelaska et al. (1985)
Lăstari Tran Than Van (1973) 5,8 30 10 (8)AIA Pink & Walkey
(1984)
Daucus carota Fragmente Bonner (1940b)C 20/40 lichid Bonner (1940b)
rădăcini
Calus Halperin (1966)B 5,6 20 lichid Halperin (1966)
Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 10 (0,1)AIA Smith&Murashige(1970)
Ipomoea batatas Lăstari Elliot(1969)M-S 5,8 30 agar (1)ANA Elliot(1969)
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 8 (1)BAP sau Litz&Conover(1978
(1962) [(1)AIA+(1)Kin] b)
Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,1)BAP Carswell&Locy(1984)
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 8 (1)ANA+(0,1)BAP Carswell&Locy
(1962) (1984)
Lactuca sativa Lăstari Kartha et al.(1974a) 5,8 30 8 Bloksberg&Saltveit
(1985)
Lăstari adventivi Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 Brown et al (1986)
Lăstari Shepard (1982)T 5,6 58,2 5 (40)AdS Engler & Grogan
(1983)
Lăstari Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (1)IBA Koevary et al (1978)

172
Tabelul 7.2.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lycopersicon Lăstari Yang&Chang(1979) 5,7 30 2 gelrite Ammati et al.(1984)
esculentum Fragmente Boll&Street(1951) 20 lichid Boll&Street(1951)
rădăcini
Fragmente Bonner&Devirian 20 lichid Bonner&Devirian
rădăcini (1939) C (1939)
Lăstari 0.5xMurashige&Skoog 5,8 3 vermiculit (0,01)ANA Cassells (1979)
(1962)
Fragmente Sheat et al. (1959)B 30 7,5 Chin et al. (1981)
rădăcini
Hipocotil Murashige&Skoog 5,8 30 agar (2)Kin Gunay&Rao (1980)
(1962)
Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,5)AIA Gunay&Rao (1980)
Fragmente de Pence & Caruso (1984) - 30 8 (17,5) AIA/ (25) IA, Ala/ Pence & Caruso
frunze (23,4) IA, Gly (1984)
Fragmente de White (1937 a) - 20 lichid White (1937)
rădăcini
Pisum sativum Fragmente de Bonner & Addicott (1937) 1 - 40 lichid Bonner & Addicott
rădăcini sau 2 (1937)
Fragmente de Bonner & Devirian - 40 lichid Bonner & Devirian
rădăcini (1939) A (1939)
Fragmente de Robbins (1922 a) - 20 glucoză lichid Robbins (1922 a)
rădăcini
Fragm. rădăcini Torrey (1956) 6-6,4 40 lichid (1,75) AIA + (42) Ad Torrey (1956)
Raphanus sativus Fragmente de Bonner & Devirian - 40 lichid Bonner & Devirian
rădăcini (1939) A (1939)
Fragmente de White (1937 a) - 20 lichid - White (1938 a)
rădăcini
Fragmente de White (1943 a) B - 20 lichid - White (1943 a)
rădăcini

173
Tabelul 7.2.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Solanum Fragmente de Matsuoka& Hinata 5,5 20 8 (0,016)ANA + (10)AdS Matsuoka& Hinata
melongena hipocotil (1979) (1979)
Solanum tuberosum Lăstari Ratnamba & Chopra 5,8 30 agar Bragdo – Aas (1977)
(1974)
Lăstari Murashige & Skoog (1962) 5,8 10 lichid (0,1) AIA Goodwin et al (1980
Supl b)
Lăstari Murashige & Skoog 5,7 20 7 (1) IBA Marani & Pisi
(1962) (1977)

Tabelul 7.2.2.
Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele floricole
Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH Autori
(g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Amaryllis sp, Lăstari White (1943 a) A 10 agar Bapat &
Narayanaswamy
(1976)
Anthurium Calus Pierik et al (1974) 40 agar (0,23) BAP Fersing & Lutz
andraeanum (1977)
Anthurium Lăstari Pierik et al (1974) 10 agar (0,002 – 0,02) 2,4-D Fersing & Lutz
scherzerianum (1977)
Lăstari Pierik et al (1974) 30 7 (0,1) AIA Pierik & Steegmas
(1976 a)
Antirrhinum majus Lăstari Bourgin & Nitsch (1967) 5,5 10 8 Pfister & Widholm
(1984)
Begonia Frunze Bourgin & Nitsch (1967) 5,8 20 7 (0,18)AIA sau (0,2) Thakur (1973)
semperflorens H IBA sau (0,19) ANA

174
Tabelul 7.2.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Caladium bicolor Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (1) ANA +(1) BAP Sahavacharin (1982)
Camellia japonica Lăstari Samartin et al ( 1984) 2 5,5 30 6 Samartin et al (1984)
Cattleya sp, Protocorm Knudson (1946) C 20 agar Lindemann et al
(1970)
Chrysanthemum sp, Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 10 (0,205) ANA Wambugu &
(1962) Rangan (1981)
Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 30 5 (0,02) ANA Bush et al (1975)
Coleus blumei Lăstari Linsmaier & Skoog 5,8 30 10 (0,1)AIA Smith & Murashige
(1965) (1970)
Colocasia Lăstari Abo El – Nil & Zettler 5,8 20 6 (1,9) ANA + (0,09) 2iP Abo El – Nil &
esculenta (1976) A Z Zettler (1976)
Cordyline Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 6 Evaldsson &
terminalis (1962) Welander (1985)
Lăstari Kunisaki (1975) 5,8 30 9 Kunisaki (1975)
Dendrobium sp, Lăstari Ball & Arditti (1976) S 5,8 30 13 (0,1) AIA Ball&Arditti (1976)
Protocorm Morell (1974)B 5,5 20 8 (1) ANA Morell (1974)
Dianthus Lăstari Linsmaier & Skoog 5,7 30 6 Earle & Langhans
caryophyllus (1965) (1975)
Calus Engvild (1972) 30 10 Engvild (1972)
Lăstari Gukasyan et al (1977) 0,2 7 (1)ANA Gukasyan et al (1977)
Lăstari Vieitez&Vieitez (1980 b) 5,8 30 7 Leshem (1986)
Lăstari Petru & Landa (1974) A 30 Petru&Landa (1974) A
Lăstari Petru & Landa (1974) A 20 (0,4) AIA + (5) Ad Petru & Landa (1974) A
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 8 (0,1) AIA Roest & Bokelmann
(1962) (1981)
Dracaena fragrans Internod Linsmaier&Skoo(1965) 30 6 (1) 2,4-D + (0,3) BAP Hunault (1976)
Dracaena Lăstari Miller & Murahige 5 30 0 (10) AIA Miller & Murashige
gosetfiana (1976) II (1976)

175
Tabelul 7.2.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Dracaena Lăstari Murahige & Skoog 6 30 8 (1) ANA + 15% CM Choa et al (1981)
marginata (1962)
Ficus benjamina Lăstari Miller & Murahige 5,8 30 Agar Makino et al (1977)
(1976) II
Ficus lyrata Lăstari Debelgh & De Waiel 5,8 20 6 Debelgh & De
(1977) Roots Waiel (1977)
Lăstari Gamborg et al, (1968) 5 30 0 Stevenson&Harris
B5 (1980)
Gardenia Lăstari Extra Vitrum Economou &
jasminoides Spanoudaki (1985)
Lăstari 0,25xMurashige & 5,8 20 8 Beyl & Sharma
Skoog (19620 (1983)
Gerbera jamesonii Lăstari Murashige et al (1974) 5,7 45 10 (10)AIA Murashige&al (1974)
Lăstari Pierik & Woets (1971)A 30 6 (1)AIA Pierik et al (1973)
Lăstari Pierik et al (1975) 30 6 (10)AIA Pierik et al (1975)
Lăstari Sitbon (1981)1 5,7 45 8 (1)IBA Sitbon (1981)
Hyacinthus Bulbili Kim et al (1981) 5,7 30 8 (0,1)ANA Kim et al (1981)
orientalis
Iris sp, Calus Meyer et al (1975) 5,8 30 6 Meyer et al (1975)
Mammillaria Lăstari Vyskot & Bezdek 5,5 30 agar (1)ANA Vyskot &Jara (1984)
carmenae (1984)1 sau 2
Mammillaria Tuberculi Johnson & Emino (1979) 5,6 45 10 (60)[ANA sai IBA] + (1- Johnson & Emino
elongata 2) (Kin sau 2iP) (1979)
Mammillaria Lăstari Vyskot & Bezdek 5,5 30 agar (1)AIA Vyskot &Jara (1984)
prolifera (1984)1 sau 2
Monstera deliciosa Lăstari Linsmaier & Skoog 5,7 30 8 (2)AiA Fonnesbech &
(1965) Fonnesbech (1980)

176
Tabelul 7.2.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Narcissus sp, Lăstari 0,5xMurashige & Skoog 5,4-5,6 15 6 Seabrook et al (1976)
(1962)
Nephrolepsis Calus Steeves et al (1955)2 20 agar Sulklyan & Mehra
cordifolia (1977)
Nephrolepsis falcata Lăstari Miller & Murashige 30 8 Beck & Caponetti
(1976)III (1983)
Oncidium lanceanum Protocorm Lim-Ho (1982) VW 20 10 7,5% CM Lim-Ho (1982)
Oncidium varicosum Lăstari Dalla Rosa & Laneri 5,5 20 8 Kerbauy (1984b)
(1977) KO7
Petunia hybrida Lăstari Linsmaier& Skoog (1965) 5,7-5,8 30 5 Daykin et al (1976)
Lăstari Sangwan & Norreel (1975) 5,6 20 agar (0,1)ANA Sangwan & Norreel
(1975)
Lăstari Sharma & Mitra (1976) R 10 agar (0,5-1)AIA Sharma Mitra (1976)
Saintpaulia ionantha Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 6 Cassells & Plunkett
(1962) (1984)
Lăstari Cooke (1977) 5,7 30 9 Cooke (1977)
Lăstari Grunewaldt (1976) 5,8 30 8 (2)AIA Grunewaldt (1976)
Lăstari Harney & Knap (1979) 15 6 Harney&Knap (1979)
Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 Weatherhead et al (1982)
Sansevieria Lăstari Murashige&Skoog (1962) 6,3 20 8 (1)IBA Blazich & Novitzky (1984)
trifasciata
Tagetes erecta Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (0,5)IBA +(0,5)GA3 Kothari & Chandra (1984a)
Fragmente frunze Murashige & Skoog 5,8 30 8 (1)AIA + (1)Kin Kothari & Chandra
(1962) (1984a)
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 0 (0,5)IBA + (0,5)GA3 Kothari & Chandra
(1962) (1984b)

177
Tabelul 7.2.3.
Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele pomicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Actinidia deliciosa Fragmente lăstari 0,5 x Murashige & 10 agar Kwei et al (1980)
Skoog (1962)
Lăstari Extra vitrum Monette (1986 a)
Amygdalus Lăstari 0,25 x Hisajima (1982 5,5 30 6 (1) IBA Hisajima (1982 a)
communis a)
lăstari Ruginii & Verma 5,8 30 Verm (0,1) ANA + (0,7) BAP Ruginii & Verma
(1982) R (1982;1983)
Ananas comosus Lăstari Murashige & Skoog 30 0 (0,18)ANA+ (0,4)IBA Matheus & Rangan
(1962) (agar) (1979)
Lăstari Ranga Swamy (1961)I 30 agar (0,05)ANA+(0,4)IBA+( Matheus & Rangan
2)Kin (1981)
Lăstari 0,5xMurashige & 30 agar Zepeda & Sagawa
Skoog (1962) (1981)
Armeniaca Lăstari 0,13 x 5,7 3, 5-6 (0,1-2)ANA Skirvin et al,(1980)
vulgaris Murashige&Skoog(196
2)
Lăstari Snir & Erez (1980)R 5,3 20 7 (0,5)ANA Snir (1984)
Castanea Lăstari Yang et al, (1986) 5,5 20 6,5 Yang et al,(1986)
mollissima
Castanea sativa Lăstari 0,5 x Rodriguez 5,5 30 6 (1)IBA Rodriguez (1982c)
(1982b) K(h)
Lăstari Vieitez et al 30 6 (0,5-1)BAP San Jose et al
(!983)MS(N/2)/2 (1984)
Lăstari Vieitez & 5,5 30 6 (1)IBA Vieitez &
Vieitez(1980a) 2 Vieitez(1980a)

178
Tabelul 7.2.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Cerasus avium Calus Murashige & Skoog 5,3 30 0 (1)ANA+[(1)IBA sau Feucht & Dausend
(1962) (1)ABA] (1976)
Lăstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(0,1)GA3 Seirlis et al, (1979)
Cerasus vulgaris Lăstari 0,13xMurashige&Skoog 5,7 30 5-6 (0,1-2ANA) Skirvin et al,(1980)
(1962)
Lăstari Skirvin et al, (1981) 5,7 20 6 (3)IBA+(1)ANA+ Skirvin et al,
MS-H2 (0,04)Kin+(0,01)BAP+( (1981b)
0,1)GA3
Ficus carica Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 8 (0,15)ANA+(0,5)IBA Muriithi et al,
(1962) (1982)
Lăstari Linsmaier & Skoog 5,2 30 7 (1)IBA+(0,1)GA3+ Pontikis & Melas
(1965) (89)PG (1986)
Fragaria Lăstari Murashige & Skoog 5,6 30 7 (0,4-1)IBA Anderson et al,
(1962) (1982)
Lăstari Boxus (1974a) 5,6 22 glucoză 7 Boxus et al, (1974)
Glossularia Lăstari Welander (1985a) 5,5 30 6 Welander (1985a)
redinata
Juglans regia Lăstari 0,5 x Chalupa (1981a)A 5-10 6 (0,3)ANA+(0,3)IBA Chalupa (1981a)
Cotiledon 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 (7,4)ANA+[(0,45)BAP Rodriguez (1982a)
sau (0,43)Kin]
Malus x domestica Lăstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (03)IBA+(0,1)GA3+ Jones et al (1979)
(162)PG apoi (0,1)GA3
Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,3 20 7 (1,9)ANA Lane (1979)
Lăstari Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (0,03-0,3)AIA+ Liu et al (1983a)
(0,01)ANA
Calus din sămânţă, White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin Mehra & Sachdeva
cotiledon sau frunză +(1)GA3 + 15% CM (1979)
Lăstari Snir & Erez (1980) 5,8 20 7 (1)IBA Snir & Erez (1980)
Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,2 15 0 (0,3)IBA Nieuwkirk&al(1986)

179
Tabelul 7.2.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Mangifera indica Cotiledon Murashige & Skoog 40 agar (5)ANA+(2,5)Kin Rao et al, (1982)
(1962) +15%CM
Morus alba Frunze, peţiol, Lakshmi-Sita et al 5,6 30 8 (0,1)ANA Oka & Ohyama
lăstari (1976) (1981)
Musa acuminata Lăstari Krikorian & Cronauer 5,8 41 0 (1)ANA+10%CM Cronauer &
(1984) Krikorian (1985a)
Lăstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 7 (1)ANA + 10% CM Cronauer &
Krikorian (1985b)
Lăstari Murashige & Skoog 5,8 20 8 (5)IBA Dore Swamy et al
(1962) (1983)
Musa spp, Lăstari Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (1)ANA, AIA sau IBA Cronauer &
Krikorian (1984)
Calus Linsmaier & Skoog 5,6 30 3 Jarret et al (1985b)
(1965)
Lăstari Wong (1986) 5,7 20 7 (5)BAP Wong (1986)
Musa textilis Lăstari Mante & Tepper (1983) 5,7 30 5-8 (0,1-1)ANA sau Mante & Tepper
I (2-10)IBA (1983)
Olea europaea Lăstari Colomas (1971) 5,8 30 6 (2-4)ANA Rugini&Fontanazza
(1981)
Persica vulgaris Lăstari Miller et al (1982)A 20 8 (0,1)ANA Miller et al (1982)
Lăstari 0,13xMurashige & 5,7 30 5-6 (0,1-2)ANA Skirvin et al (1980)
Skoog (1962)
Lăstari Skirvin et al (1981) 5,7 20 6 (3)IBA+(1)ANA+ Skirvin et al (1981)
MS-H (0,1)GA3+(0,04)Kin
1+(0,01)BAP
Phoenix Plantule Thompson & Gordon 5,6-5,8 30 8 (0,1)ANA Tisserat (1982)
dactylifera (1977)
Lăstari Tisserat (1984a) 5,6-5,8 30 8 (0,1)ANA Tisserat (1984a)

180
Tabelul 7.2.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Pistacia vera Lăstari Murashige & Skoog 5,8 0 7 Barghchi&Alderson
(1962) (1983)
Lăstari Pierik et al (1974) 30 7 (2,5)IBA Barghchi&Alderson
(1985)
Prunus cerasifera Lăstari 0,5 x Murashige & 5,7- 30 7 (2)IBA Garland&Stoltz
Skoog (1962) 5,8 (1981)
Lăstari 0,5 x Kim et al, (1981) 5,8 20 agar [(2,5)AIA+(0,1)GA3] Hammerschlag
sau (5)AIA (1982b)
Lăstari Linsmaier&Skoog 5,8 30 7 (0,5-2,5)IBA Norton & Boe
(1965) (1982)
Prunus domestica Fragmente lăstari Pietropaolo & Reisch 5,8 30 7 (0,5-2,5)IBA/5 săpt Pietropaolo &
(7-12 mm) (1984) sau Reisch (1984)
(2-6,1)IBA/3 săpt
Lăstari 0,13 x 5,7 30 5,6 (0,1-2)ANA Skirvin et al (1980)
Murashige&Skoog
(1962)
Prunus insititia Lăstari Jones et al, (1977) 5,2 30 7 (3)IBA+(0,1)GA3 Jones & Hopgood
+(162)PG (1979)
Pyrus communis Lăstari Lane (1979b) 5,2 30 7 Auxina Lane (1979b)
Ribes nigrum Fragmente lăstari Jones &Vine (1968)B 5,6- 40 glucoza 0 (1)IBA+(0,2)BAP Jones &Vine (1968)
5,8 +(1)GA3
Calus Harvey (1967)Basal 6 30 10 (1)AIA+(1)Kin Harvey&Grasham (1977)
Rubus idaeus Lăstari Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,1)IBA Anderson (1979)
Lăstari Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (1)IBA Borgman & Mudge
(1986)
Fragmente Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,5)IBA+(80)AdS Borgman & Mudge
rădăcini (1986)
Lăstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 0 (0,5)BAP Donnelly et al, (1980)
Lăstari Hedtrich(1979)B 5,7 20 0 (0,5)AIA Gebhardt(1985)

181
Tabelul 7.2.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Rubus sp, Lăstari (7-15 Linsmaier & Skoog 5,6- 30 7 (1)IBA Broome &
mm) (1965) 5,8 Zimmerman (1978)
Lăstari Linsmaier & Skoog 5,6- 30 0 (0,5)IBA Donnely et al
(1965) 5,8 (1986)
Theobroma cacao Fragmente Hall & Collin (1975) 5,7 30 10 (2)AIA+(0,1)Kin Pence&Janick
frunze +10%CM (1978)
Lăstari Passey & Jones (1983) 5,2 30 7 (0,5)IBA+(0,5)ANA Passey & Jones
+(162)PG (1983)
Vaccinium Lăstari Extra vitrum Cohen &
corymbosum Elliot(1979)
Lăstari Extra vitrum Wolfe et al
(1983;1986)
Vaccinium sp, Lăstari Extra vitrum Zimmerman&Broo
me (1980)
Lăstari Extra vitrum Smagula & Lyrene
(1984)

182
Tabelul 7.2.4.
Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultatul Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Betula pendula Lăstari Simola (1985)N7 5,6 20 6 Simola (1985)
Lăstari Srivastava&Steinhauer 5,8 40 6 (2)AIA + (6)Kin + Srivastava&Steinha
(1981b)MMS (40)Ad uer (1981b)
Calus+ lăstari Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (1)ANA Srivastava&al (1985)
Betula verrucosa Lăstari Chalupa (1981b) 2 15 6 (0,1)IBA sau (0,1)ANA Chalupa (1981b)
Calus Jacquiot (1955) 30 agar (1)ANA Jacquiot (1955)
Biota orientalis Lăstari Thomas & Tranvan 5,4 30 8 (0,1) IBA + (1,1)BAP Thomas & Tranvan
(thuja) (1982) (1982)
Chaenomeles Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (10-20)IBA Norton & Boe (1982)
japonica
Cotoneaster Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (1-5)IBA Norton & Boe (1982)
dammeri
Crataegus Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (0,5-5)IBA Norton & Boe (1982)
rachyacantha
Crataegus cv, TOBA Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (5-10)IBA Norton & Boe (1982)
Fraxinus Lăstari Lloyd & McCown 5,2 20 6 nespecificat Heiman & Preece
americana (1981) WPM (1983)
Fraxinus Lăstari Lloyd & McCown 5,2 20 6 nespecificat Heiman & Preece
pennsylvanica (1981) WPM (1983)
Hedera helix Lăstari Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (1)ANA Banks et al, (1979)
Lăstari Banks(1979) 1, 5,7 30 5 (1)ANA Banks (1979)
Hydrangea Lăstari 0,5 x Murashige&Skoog 5,7- 20 7 Stoltz (1984)
macrophylla 2-3cm (1962) 5,8

183
Tabelul 7.2.4. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lavandula Lăstari Kartha et al, (1974a) 5,5 20 lichid (5)AIA + (0,5)BAP + Quazi (1980)
augustifolia & sp, (5)GA3
Paulownia Lăstari Ben-Jaacov & Dax (1981) 5,6 30 agar (0,5-1)IBA Burger et al (1985)
tomentosa Lăstari Murashige & Skoog 30 8 (1)IBA Marcortriginiano &
(1962) Stimart (1983)
Picea abies Lăstari 0,5 x Linsmaier & 5,6 5 7 (0,02) ANA Chalupa (1977)
Skoog (1965)
Pinus sylvestris Lăstari Bornman & Janson 5,6- 50,5 6-7 (1,46) Cumarina Bornman & Janson
(1980) 5,8 (1980)
Pseudiotsuga Lăstari 0,5 x Linsmaier & 5,6 5 7 (0,02) ANA Chalupa (1977)
menziesii Skoog (1965)
Pyracantha Lăstari Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (5-10) IBA Norton & Boe
coccinea (1965) (1982)
Quercus robur Lăstari Chalupa (1984 a,b) 10 6 (0,1) ANA + (0,3) IBA Chalupa (1984a)
WPMR
Fragmente lăstari Vieitez et al (1985) H + 30 6 Vieitez et al (1985)
SO4
Rhododendron spp Lăstari Extra Vitrum Economou & Read
(1984)
Lăstari Kyte & Briggs (1979) R 30 6 Kyte & Briggs
(1979)
Rosa hybrida Lăstari Hasegawa (1979) 5,7 60 6 (1) AIA Bressan et al (1982)
Lăstari Hyndman et al (1982a, b) 5,7 70 8 Hyndman et al (1982 a, b)
Lăstari 0,25 x Skirvin & Chu 5,7 30 10 Skirvin & Chu
(1979 a) (1979 a)
Rosa sp, Lăstari Murashige & Skoog 40 6 +/- (0,05-0,1) ANA Davies (1980)
(1962)
Salix madsudana Lăstari Whitehed & Giles 5,8 20 agar (0,2) ANA Bhojwani (1980)
(1976)

184
Tabelul 7.2.4. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Thuja plicata Lăstari Coleman & Thorpe 5,2 30 agar (10) IBA Coleman & Thorpe
(1977) S (1977)
Tilia cordata Lăstari Chalupa (1984 a,b) 10 6 (0,1) ANA + (0,3) IBA Chalupa (1984 a, b)
BTMRsau WPMR
Weigela florida Lăstari Murashige&Skoog(1962) 30 agar (0,88) AIA Calvert&Stephens(1986)

]
Tabelul 7.2.5.
Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la viţa de vie
Regulatori de
Denumirea Zaharoză Agar
Explant Rezultat Mediu pH creştere Autori
speciei (g/l) (g/l)
(mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis berlandieri Fragmente Plantule 0.5 x Murashige & 5,8 20 7 (0.02)IBA sau ANA Novak&Jujova
x V. cardinalis lăstari înrădăcinate Skoog (1962) (1983)
Vitis riparia x V. Internod, Rădăcini Favre (1977) P7 5,8 20 (20)AIA Favre (1977)
rupestris frunze, petiol adventive +(0.1)BAP
Vitis rupestris Lăstar Lăstar înrădăcinat Gazly (1964) 6,5 15 8 (0.02)ANA Gazly (1972)
Vitis spp Fragmente lăstari Lăstari înrădăcinaţi Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0.02)ANA Chee&Pool (1982a,b)
Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Webb & Street 30 agar (0.023)BAP Aldwinckle &
lăstari (1977)CI Buturac (1981)
Vitis vinifera Apexuri lăstari Lăstari înrădăcinaţi White (1943a)A 5,8 30 0 (2.2)BAP Barlass et al (1982)
Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8 20 3-5,5 (0.23)BAP Jona & Webb (1979)
Vitis vinifera Meristeme Lăstar unic, Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8 20 3-5,5 (0.023-0.23)BAP Jona & Webb (1979)
înrădăcinat
Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Stevenson & Monette 5 30 0 (0.1)AIA Stevenson &
(1983)R Monette (1983)

185
Capitolul 8
Embriogeneza somatică

8.1. Formarea embrionilor somatici


Embriogeneza somatică a fost realizată pentru prima dată în 1958 de Reinert şi
Steward la morcov, din calus şi suspensie de celule. Tot ei au realizat o paralelă între
formarea embrionilor zigotici şi a celor somatici fapt uşurat de folosirea laptelui de cocos
în mediul de cultură.
Şi alţi reprezentanţi din Fam. Umbeliferae produc uşor embrioni somatici (Thomas
şi colab. 1979, ţelină). Formarea embrionilor somatici parcurge mai multe etape:
- dediferenţierea celulelor diferenţiate şi începerea diviziunii;
- formarea celulelor parenchimatice, începerea diviziunii şi creşterea conţinutului
de citoplasmă sub influenţa auxinelor. În urma acestor procese, celulele parenchimatice se
transformă în celule embriogenice. Acestea sunt mici, cu conţinut citoplasmatic dens,
vacuolă mică, nuclei mari cu nucleoli mari, conţinut mare de grăunciori de amidon. Au
activitate metabolică intensă şi o sinteză intensă de ARN;
- formarea embrionilor din celule embriogenice în absenţa auxinelor din mediu.
Formarea embrionilor somatici se poate face în interiorul calusului, (endogen) sau
la exteriorul acestuia (exogen). Embrionii somatici se mai pot forma în ţesutul nucelar şi
hipocotil, sau pe organe florale, antere, grăunciori de polen, enndosperm, embrioni
zigotici.
Embrionii somatică se formează dintr-o singură celulă care se divide şi formează o
structură embrioidă.
Embriogeneza somatică a fost realizată la 132 de specii din 81 de genuri din
familiile: Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbeliferae. Graminae etc. (Tisserat,
colab., 1979, citaţi de Pierik, 1987).

186
8.2. Embriogeneza somatică directă
Embriogeneza directă reprezintă formarea embrionilor somatici sau a ţesuturilor
embrionare direct din explantul iniţial. Embrionii somatici se pot forma din celule
somatice, din celule nucelare la Citrus, din celule epidermice, din hipocotil de morcov,
Ranunculus, Brassica napus.
Pentru inducerea şi studierea embriogenezei somatice, cel mai adesea se recurge la
culturi de embrioni zigotici imaturi. Ţesutul acestora are un pronunţat caracter
embriogenic. Momentul oprim pentru izolarea embrionilor şi inocularea lor in vitro este la
aproximativ 14 zile după polenizare.
Mediile de cultură folosite conţin cantităţi variabile de auxine, în special 2,4 C şi
ANA.
După sterilizarea de suprafaţă se face excizarea embrionului imatur şi inocularea lui
pe mediu. După aproximativ o săptămână, la o parte dintre explante încep să se
diferenţieze embrioni somatici în diferite stadii de dezvoltare. Fazele de evoluţie ale
embrionilor somatici sunt: globulară, cordiformă, de torpilă şi cotiledonară (forma de
ţăruş). De remarcat dezvoltarea asincronă a embrionilor, fapt care determină suprapunerea
diferitelor faze de evoluţie. Acest lucru îngreunează mult orice tentativă de automatizare a
culturilor şi sporeşte cheltuielile cu manopera.

8.3. Embriogeneza somatică indirectă


Regenerarea unor embrioni somatici din calus poartă denumirea de embriogeneză
indirectă. După obţinerea şi multiplicarea calusului (subcapitolul 11.1.) acesta este trecut
pe un mediu pe care se realizează inducţia şi formarea embrionilor somatici. După
realizarea inducţiei are loc formarea celulelor embriogenice care vor da naştere
embrionilor somatici.
Capacitatea de regenerare depinde de specie, felul explantului iniţial (floem
secundar la morcov, fragmente de frunze la cafea, kiwi, Petunia, Asparagus, cotiledoane,
embrioni zigotici la conifere, citrice), vârsta explantului iniţial (gradul de juvenilizare),
numărul de subculturi, etc. Unele specii regenerează numai organe şi embrioni somatici.
Inducţia embrionilor somatici este condiţionată de un număr însemnat de factori:
- concentraţia ridicată de auxine şi în special 2,4 D, determină inducţia embrionilor
somatici;

187
- acidul abscisic stimulează formarea embrionilor somatici în culturile de calus şi
suspensii celulare;
- giberelinele şi etilena inhibă procesele de inducţie;
- şansa formării embrionilor somatici creşte la ţesuturile juvenile. La speciile
aparţinând genului Citrus, aceştia se formează numai în nucelă;
- azotul redus sub formă de ioni de amoniu, potasiul şi concentraţia ridicată de
săruri stimulează formarea celulelor embriogenice în masa calusului; în acelaşi timp, ionii
de calciu influenţează negativ acest proces;
- lumina este un factor stimulator al embriogenezei somatice cu toate că, anumite
specii reacţionează mai bine la întuneric;
- temperatura ridicată stimulează formarea embrionilor somatici. Atunci când
materialul iniţial este reprezentat de antere, acesta necesită la început un şoc cu temperaturi
scăzute.
- concentraţia de zaharoză de 2-3% şi prezenţa laptelui de cocos au un efect pozitiv
asupra inducţiei procesului de embriogeneză somatică.
Embriogeneza somatică indirectă rămâne o tehnică mai puţin folosită în practică
datorită unor neajunsuri pe care le prezintă:
- materialul genetic este relativ instabil în timpul proceselor de embriogeneză, iar
riscul apariţiei mutaţiilor face ca metoda să nu fie recomandată la înmulţirea materialului
clonal;
- este o metodă dificilă pentru că multe specii nu formează embrioni somatici;
- prin culturi repetate scade capacitatea de regenerare a calusului;
- frecvent formarea embrionilor somatici este asociată cu apariţia fenomenului de
dormans care face dificilă sau imposibilă pornirea acestora în “vegetaţie” şi regenerarea
unor plante întregi;
- formarea scalară a embrionilor face ca procesul să fie destul de greu de gestionat.
În tabelele 8.1., 8.2., 8.3. şi 8.4. sunt prezentate principalele realizări în domeniul
embriogenezei somatice la plantele horticole.

188
Tabelul 8.1.
Cercetări privind embriogeneza somatică la plantele legumicole
Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH Autori
(g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Apium graveolens Calus Murashige&Skoog - 30 lichid Al-Abta&Collin
(1962) (1978)
Calus Murashige&Skoog 5,6 30 10 (0,1)ANA+(3)Kin Chen (1976)
(1962)
Peţiol Murashige&Skoog - 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Williams&Collin
(1962) (1976)&
Calus Murashige&Skoog - 30 lichid (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Williams&Collin
(1962) (1976)&
Asparagus Calus Nitsch et al. (1969a) - 30 6 Bui Dang Ha et al.
officinalis (1975)
Calus Murashige & Skoog - 30 lichid (5) ANA Steward & Mapes
(1962) (1971 b)
Celule din cultura Linsmaier & Skoog 5,8 30 8 (0,01) 2,4-D + (0,1) Kin Wilmar &
în suspensie (1965) Hellendoorn (1968)
Brassica alba Calus Murashige & Skoog 5,8 30 agar (0,1)ANA+(0,1) 2,4-D Leelavahti et al
(1962) (1984)
Brassica oleracea Frunze tinere Murashige & Skoog 5,8 30 agar (1) AIA + (0,5)Kin Pareek & Chandra
botrytis (1962) (1978 a)
Calus Murashige & Skoog 5,8 30 agar (0,01-0,1)AIA +(0,5)Kin Pareek & Chandra
(1962) (1978 a)
Cichorium intybus Segmente de
Murashige&Skoog (1962) Kin, BA, AIA, ANA,
nervură foliară (2 Mix (1985)
Gamborg & co. (1968) 2,4-D, picloram
mm gros)
Fragmente rădăcini Murashige şi Skoog
BA, 2,4-D, 2,4,5-T Van Dick (1986)
5x5x5 mm (1962)

189
Tabelul 8.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Cucumis melo Hipocotil Reynolds et al (1980) 5,7 40 glucoza 8 (0,5)2,4-D+(0,5)2,4,5- Blackmon et
T+(0,5)NOA+(0,5)IBA+ al.(1981b)
(0,5)2,4,5-TP+
(0,5)CPA+(0,5)pic+
(0,5)MCPP+(0,1)CCC+
(30)Ad
Cucumis sativus Calus Lazarte&Sasser (1982)L 0 agar +/-(1)Kin Lazarte&Sasser(1982)
Cucurbita pepo Fragmente Murashige & Skoog 30 glucoza 9 (10)IBA apoi (1)IBA in Jaleska (1974)
hipocotil (1962) urmatoarele subculturi
Daucus carota Suspensie Eriksson(1965)1. 5,8 40 lichid (0,9)ANA+(0,02 )Kin Fridborg et al.(1978)
Calus Halperin&Wetherell 20 agar (0,0005)2,4-D Halperin&Wetherell
(1965)B +(0,001)Kin (1965)
Segmente peţiol Halperin (1964) 6 20 agar (0,1)2,4-D+(2)Ad Halperin (1964)
calus Gamborg et al.(1968)B5 lichid Hari (1980)
Ipomoea batatus Fragmente Skirvin&Chu(1979a) 5,8 30 10 (0,1)ANA+(2)BAP Hwang et al.(1980)
rădăcină
Calus Murashige & Skoog 5,6- 30 7 (0,1-3)2,4-D-depinzand Jarret et al. (1984)
(1962) 5,8 de genotip
Lycopersicon Calus Murashige & Skoog 5,8 20 8 (0,5) AIA + (0,25) Z Zamir et all (1980;
esculentum (1962) 1981)
Petroselinum Calus Murashige&Skoog - 30 10 (10) AIA + (0,04) Kin + (15- Vasil & Hildebrandt
hortense (1962) 20) AdS (1966 b,c)
Pisum sativum Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 lichid (0,06) pic + (0,1) BAP Jacobsen & Kysely (1984)
Solanum Fragmente frunze Murashige&Skoog (1962) 30 agar (10) ANA Gleddie et al (1982)
melongena Calus Murashige&Skoog (1962) 30 lichid (10) ANA Gleddie et al (1982)
Fragmente Matsuoka& Hinata 5,5 20 8 (8)ANA + (10) AdS Matsuoka& Hinata
hipocotil (1979) (1979)
Solanum Fragmente Lam (1975) 20 9 (0,4) AIA + (0,8) Kin + Lam (1975)
tuberosum tuberculi (0,4) GA3

190
Tabelul 8.2.
Cercetări privind embriogeneza somatică la plantele pomicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Actinidia deliciosa Fragmente de Harada (1975) 5,5 20 7 [(0,1-1)2,4-D sau Harada (1975)
rădăcini NOA] + (40) Ad
Mangifera indica Seminţe imature Litz et al (1984) 5,7 30 0 Litzet al, (1984b)
Fructe imature Litz (1984a) 5,7 60 8 (1)2,4-D Litz(1984b)
Phoenix Fragmente Linsmaier&Skoog 5,7 30 8 (10-100)2,4-D+(3)2iP Tisserat et al (1979)
dactylifera lăstari (1965) +(40)AdS
Muguri laterali Thompson & Gordon 5,6- 30 8 (100)2,4-D+(3)2iP Tisserat (1982)
(1977) 5,8
Calus Tisserat (1984a) 5,6- 30 8 Tisserat (1984a)
5,8

Tabelul 8.3.
Cercetări privind cultura embriogeneza somatică la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant iniţial Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Hedera helix Calus Banks(1979) 2, 5,7 30 5 (1)ANA + (0,5)BAP Banks (1979)
Ilex aquifolium Embrioni Linsmaier&Skoog (1965) 5,6 40 10 Hu & Sussex (1972)
Larix decidua Calus Nagmani&Bonga (1985) 5,8 20 8 (2)BAP Nagmani&Bonga(1985)
Picea abies Calus Von Arnold & Erikson 5,8 34,2 5 (2,2) 2,4-D + (1,1) BAP Hakman et al
(1981) LPm (1985)
Embrioni maturi Von Arnold & Erikson 10 3 (2,21) 2,4-D + (1,13) Von Arnold &
(1981) LPm gelrite BAP Hakman (1986)
Quercus rubra Internod Murashige&Skoog(1962) 30 agar (5) ANA + (0,1) BAP Seckinger&al(1979)

191
Tabelul 8.4.
Cercetări privind embriogeneza somatică la viţa de vie
Regulatori de
Denumirea Zaharoză Agar
Explant Rezultatul Mediu pH creştere Autori
speciei (g/l) (g/l)
(mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis vinifera Calus Calus Mullins&Srinivasan 5.6 20 0 (1)NOA+(1.1)BAP Mullins &
embriogen (1976)N Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Embrioizi Dezvoltare Mullins&Srinivasan 5.6 20 agar (1)2iP+(0.35)GA3 Mullins &
embrioni (1976)N Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Embrioizi Plantulă White (1954) 5.6 20 agar Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera x Calus 2500 Bourgin & Nitsch 20 0 Rajakeran &
Vitis rupestris embrioizi/flacon (18670 H Mullins (1979)
Vitis vinifera x Embrioizi 83% plante Bourgin & Nitsch 20 agar (1.11)2,4-D + Rajakeran &
Vitis rupestris haploide (18670 H (0.225)BAP Mullins (1979)

192
8.4. Poliembrionia nucelară
O serie de specii din genul Citrus formează în mod natural, în aceeaşi sămânţă, pe
lângă embrionul zigotic şi unul sau mai mulţi embrioni somatici. Aceşti embrioni iau
naştere din celule somatice (diploide ale ţesutului nucelar). Ţesutul nucelar este un ţesut
juvenil caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare.
Prin cultivarea ţesutului nucelar in vitro şi inducerea formării calusului s-au obţinut
un mare număr de embrioni somatici la genul Citrus (Rangaswamy, 1981).
Formarea embrionilor somatici prin embriogeneză directă sau indirectă a fost
posibilă prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz şi
colab. 1985).
ANA, citochinina şi compuşii complecşi (lapte de cocos, extractul de drojdie de
malţ) stimulează formarea embrionilor somatici.
Embriogeneza somatică din ţesut nucelar este prezentă la mango (Mangifera
indica) şi la alte specii pomicole tropicale. La fel ca în cazul genului Citrus, la speciile cu
tendinţă de poliembrionie in vivo capacitatea o de regenerare a embrionilor somatici in
vitro este mai ridicată decât la plantele monoembrionare.
Utilizarea poliembrioniei nucelare prezintă o serie de avantaje: permite înmulţirea
“în masă” rapidă a speciilor monoembrionare; procesele de embriogeneză somatică sunt
însoţite şi de devirozarea materialului vegetal obţinut; în paralel, se pot induce mutaţii şi se
pot selecţiona mutantele utile; se realizează juvenilizarea materialului obţinut.
În toate cazurile, folosirea pentru înmulţire a embrionilor somatici care conservă
caracteristicile genetice ale plantelor mamă, deschide mari perspective în domeniul
seminţelor sintetice (Standardi, 1997).

8.5. Încapsularea materialului vegetal in vitro


8.5.1. Sămânţa sintetică
Pentru utilizarea în producţie a embrionilor somatici s-a imaginat şi realizat
sămânţa sintetică prin crearea unui endosperm artificial, care să protejeze şi eventual să
hrănească embrionul.
Folosirea embrionilor somatici presupune apelarea la două sisteme pentru
menţinerea viabilităţii acestora:
- încapsularea în substanţe speciale de tipul gelurilor care conţin substanţe nutritive,
regulatori osmotici şi eventual pesticide;

193
- semănatul embrionilor în flux lichid (fluid drilling) folosind sistemele puse la
punct pentru semănatul seminţelor preîncolţite de legume sau flori.
Avantajele folosirii seminţelor artificiale sunt multiple:
- permite obţinerea şi folosirea seminţelor la specii care în mod normal nu produc
seminţe;
- elimină procedurile greoaie şi costisitoare de obţinere a seminţelor hibride cu
toate avantajele care decurg de aici:
- se înlătură liniile parentale menţinute pentru hibridări;
- se elimină cercetările pentru obţinerea liniilor androsterile;
- se elimină polenizarea artificială an de an, hibrizii fiind menţinuţi prin
înmulţire vegetativă in vitro.
- permite obţinerea de sporuri substanţiale de recoltă prin folosirea unor super-
genotipuri;
- aduce mari avantaje lucrărilor de ameliorare.
Folosirea pe scară largă a seminţelor artificiale este limitată datorită unor greutăţi
care apar:
- seminţele artificiale trebuie protejate împotriva deshidratării prin folosirea unor
învelişuri care să reziste pe timpul păstrării, transportului şi semănatului;
- păstrarea seminţelor artificiale presupune folosirea unor substanţe chimice sau
agenţi fizici care să menţină embrionul în stare de repaus;
- în momentul semănatului trebuie găsite soluţii pentru scoaterea embrionului din
repaus şi începerea dezvoltării acestuia;
- procentul de plante viabile obţinute este relativ redus datorită unor cauze multiple:
- embrionii au grade de dezvoltare diferită;
- păstrarea viabilităţii embrionilor este diferită;
- crearea condiţiilor optime pentru dezvoltarea embrionilor după semănat
este greu de realizat.
- embrionul necesită şi o protecţie antipatogenă realizabilă prin înglobarea unor
substanţe pesticide. Efectul acesta trebuie să fie de scurtă durată, pentru a nu împiedica
ulterior procesele de micorizare.
Cea mai răspândită metodă pentru încapsularea embrionilor prin schimb ionic este
cea în care se foloseşte alginatul de sodiu.

194
Embrionii sunt scufundaţi în alginat de sodiu 2-4% apoi sunt trecuţi individual în
soluţie de clorură de calciu 50 µM, la pH 7. După 20-30 de minute, capsulele de alginat se
întăresc (0,5 - 2 kg/cm2) şi pot fi manipulate.
Păstrarea se poate face în vase închise ermetic la frigider la (3-6°C) în condiţii
aseptice.
Alginatul de calciu are avantajul că este ieftin, se gelifică uşor şi nu este toxic.
Are însă şi dezavantaje (Hoza, 1996).
- permeabilitate mare pentru elementele solubile;
- creşterea rădăcinilor lăstarilor este mai lentă;
- capsulele sunt lipicioase şi se îngreunează manipularea şi semănatul.

8.5.2. Încapsularea unor organe şi ţesuturi in vitro


Ca o extindere a folosirii capsulelor de alginat s-a recurs la încapsularea altor
organe, în afara de embrionii somatici.
Astfel, multiplele cercetări efectuate de Standardi, A., şi colab., (1994-1998), au
dovedit că pot fi încapsulaţi bulbili, obţinuţi in vitro precum şi minibutaşi sau rozete de
diferite dimensiuni provenite de la un mare număr de specii: crin, măr, zmeur, kiwi etc.
După înglobarea explantelor respective în alginat, acestea au fost păstrate în
frigidere la 3-4°C timp îndelungat 6-12 luni, după care s-au trecut din nou pe un mediu de
creştere şi multiplicare.
Metoda vine să simplifice tehnologia conservării materialului genetic in vitro şi
aduce o serie de avantaje:
- se reduc substanţial cheltuielile pentru păstrarea materialului vegetal in vitro;
- se face economie de spaţiu şi de mediu de cultură;
- se realizează economie de forţă de muncă, energie etc.

195
Capitolul 9
Embriocultura in vitro la plantele horticole

Cultura embrionilor zigotici a apărut ca necesitate pentru rezolvarea unor probleme


apărute în procesul ameliorării plantelor horticole.
În pomicultură, apare posibilă cultivarea pe medii aseptice a unor embrioni imaturi
care provin prin încrucişări de la soiuri extratimpurii şi timpurii de sâmburoase.
În mod natural, aceşti embrioni nu ajung la maturitate datorită unor dereglări
fiziologice care apar în procesul de creştere al seminţei şi fructului (foto 9.1.).
În mod similar, în cazul unor hibridări interspecifice are loc avortarea embrionilor
înaintea ajungerii lor la maturitate (Ion L. şi colab., 1997).
La viţa de vie nu este posibilă obţinerea unor descendenţi hibrizi atunci când se
foloseşte ca genitor matern un soi apiren, în acest caz, embrionul avortând timpuriu.
Situaţii oarecum similare se întâlnesc şi la realizarea unor combinaţii hibride sau
încrucişări între soiuri, specii sau genuri incompatibile la majoritatea speciilor horticole.
Prin extragerea embrionului abia format cu o porţiune de ţesut nucelar, sau prin
cultivarea ovulului fecundat, se reuşeşte depăşirea barierelor incompatibilităţii.
Un alt caz particular este reprezentat de cultivarea embrionilor maturi. Metoda se
foloseşte pentru scurtarea procesului de ameliorare prin eliminarea perioadelor de repaus
relativ al seminţelor.
Un avantaj important al embrioculturii este acela al înmulţirii clonale pornind de la
seminţele hibride ale unor plante anuale, legume şi flori. Plecând de la ideea că indivizii
regeneraţi ulterior vor păstra efectul heterozis al hibrizilor valoroşi, se poate realiza apoi
înmulţirea clonală in vitro. La Cichorium intybus L. s-a reuşit iniţierea unei culturi in vitro
cu un procent de 100% explante sănătoase prin germinarea seminţelor hibride (Diaconescu
O., 2002) (foto 9.2.).
De asemenea, în cazul unor combinaţii hibride valoroase, se face înmulţirea
materialului genetic înainte de realizarea selecţiei, sau materialul hibrid este supus unor
procese de stres selecţie in vitro înainte de a fi aclimatizat şi trecut în câmp.

196
a b

d e

Foto 9.1. Fazele embrioculturii la hibrizii extratimpurii de nectarin:


a – extragerea embrionilor din sâmburi, b – cultivarea embrionilor imaturi in vitro,
c – puieţii hibrizi obţinuţi prin germinare in vitro, d – plantarea hibrizilor pentru
fortificare, e – hibrizi de nectarin fortificaţi

197
Foto 9.2. Plantă hibridă de cicoare (Cichorium intybus L.)
obţinută prin germinare in vitro

Momentul începerii culturii variază de la specie la specie, în funcţie de scopul


urmărit. Astfel, la cireş, inocularea se face la 28-35 de zile de la înflorire, la vişin, la 29-41
zile şi piersic, la 81-97 zile.
Un alt indiciu folosit este reprezentat de mărimea cotiledoanelor. La piersic
momentul optim fiind atunci când acestea ating 4-5 mm în diametru.
La cireş, se mai recomandă iniţierea culturii în momentul întăririi sâmburelui, după
aceea viabilitatea embrionilor scade până la momentul intrării în pârgă.
Stabilizarea culturilor de embrioni este relativ uşoară datorită faptului că sâmburii
sau seminţele protejate de endocarp sau tegumente, pot fi sterilizate la concentraţii ridicate.
Compoziţia mediului de cultură este cu atât mai complexă cu cât embrionii se află
într-un stadiu de dezvoltare mai incipient.
După inoculare, embrionii se lasă la întuneric timp de 30-60 de zile la temperatura
camerei pentru germinare după care sunt trecuţi la lumină.
În tabelele 9.1., 9.2. şi 9.3. sunt prezentate câteva din cercetările privind folosirea
embrionilor zigotici imaturi la plantele horticole.

198
Tabelul 9.1.
Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la plantele legumicole
Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Autori
(g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Cultură embrioni Guha&Johri (1966) 5,8 50 7 (0,5)AIA-pentru formare Guha&Johri (1966)
bulbili
Apium graveolens Plantule Murashige&Skoog (1962) 5,6 30 10 Chen (1976)
Plantule Murashige&Skoog (1962) 30 agar Williams&Collin
(1976)&
Dezvoltare Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 lichid (0,6)Kin Zee&Wu(1979)
embrioni
Plantule Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar Zee&Wu (1980)
Asparagus Plante diploide Nitsch et al. (1969a) - 30 6 AIA + Z (nespecificat) Bui Dang HA et al
officinalis (1975)
Creşterea Linsmaier & Skoog 5,8 30 8 (1) 2,4-D + (0,315) Kin Wilmar &
embrionilor (1965) Hellendoorn (1968)
Creşterea Knudson (1946) C - 30 8 Wilmar &
plantelor Hellendoorn (1968)
Brassica alba Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar Leelavahti et al (1984)
Brassica oleracea Plantule Gamborg et al. (1968) B5 5,5 20 8 (0,5)BAP Bagga et al (1982)
botrytis Plantule Murashige & Skoog 5,8 30 agar Pareek & Chandra
(1962) (1978 a)
Capsicum annuum Plantule haploide Dumas De Vaulx et al 5,9 30 8 (2) Kin Dumas De Vaulx et
şi diploide (1981) R al (1981)

199
Tabelul 9.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Cucumis melo Germinarea Murashige&Skoog 5,8 30 8 Norton (1981)
embrionilor şi plantule (1962)
Lăstari şi rădăcini Murashige&Skoog 40 agar (5)ANA+(2,5)Kin+ Rao et al. (1982)
adventive (1962) 15%CM
Cucumis sativus Germinare Randolph&Cox(1943) 20 lichid Aalders (1958)
Lăstari Lazarte&Sasser (1982)L 0 agar - Lazarte&Sasser
(1982)
Cucurbita pepo Plantule cu rădăcini Murashige&Skoog 30 9 (0,3)2,4-D Jelaska (1972)
(1962) glucoză
Daucus carota Dezvoltarea Hildebrandt et al 20 5 Zenkteler et al
embrionilor (1946)Tob (1961)
White (1942) 20 5 Zenkteler et al
(1961)
Zenkteler et al. 20 5 (6)2,4-D+(0,1)ANA+15%CM Zenkteler et al
(1961)D1. (1961)
Zenkteler et al. 20 5 (6)2,4-D+(0,1)ANA+15%CM Zenkteler et al
(1961)D2. (1961)
Zenkteler et al. 10 5 (0,2)Ad+15%CM Zenkteler et al
(1961)D3. glucoză (1961)
Ipomoes batatus Germinarea Murashige & Skoog 5,6- 30 7 Jarret et al. (1984)
embrionilor (1962) 5,8
Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 16 agar (0,19-0,38)ANA Schultheis et al.
(1986)
Pisum sativum Dezvoltare embrioni Bonner & Axtman (1937) - 40 Agar Bonner & Axtman
(1937)
Creşterea lăstarilor Bonner & Bonner (1938) - 40 10 Vitamina C Bonner & Bonner (1938)
2 rădăcini Murashige&Skoog (1962) 5,8 15 10 Jacobsen&Kysely(1984)
Dezvoltare embrioni Stafford & Davies (1979) 5,8 10 Lichid Stafford & Davies
(1979)

200
Tabelul 9.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Solanum Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 Agar (0,005) ANA + (1-2) Kin Anon (1981 b)
melongena (1962)
Dezvoltare Murashige&Skoog 30 Agar Gleddie et al (1982)
plantule (1962)
Calus White (1954) 20 Agar (1) ANA Yamada et al (1967)
Calus şi White (1954) 20 Agar Auxina Yamada et al (1967)
embriogeneză
Plantule White (1954) 20 Agar Yamada et al (1967)

Tabelul 9.2.
Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la plantele pomicole
Zaharoză Agar Regulatori de
Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Autori
(g/l) (g/l) creştere (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Amygdalus Lăstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,56) BAP Hisajima (1982 b)
communis
Armeniaca vulgaris Dezvoltare şi Tukey (1933)I 5,5 5 glucoză 6,5 Tukey (1938)
germinare
Castanea sativa Lăstari axilari San Jose et al, (1984 L sau 30 6 (2-5) BAP San Jose et al,
H) (1984)
Lăstari axilari Vieitez & Vieitez(1980a) 1 5,5 30 6 (1-2) BAP Vieitez &
Vieitez(1980a)
Cerasus vulgaris Dezvoltare Tukey (1933)I 5,5 5 glucoză 6,5 Tukey (1938)
germinare
Citrus sp, Germinare Van Overbeek et al (1941) 10 7 (0,2) AdS+33%CM Ozsan&Cameron
(1963)
Plantule Dubey&Rishi (1976) 5,7 20 7 Dubey&Rishi (1976)
Plantule Murashige&Tucker (1969) 5,7 30 8 (1) GA3 Gmitter&Moore
(1986)

201
Tabelul 9.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Cocos nucifera Creştere embrioni Cutter&Wilson (1954) 5 20 agar Cutter&Wilson(1954)
Calus Eeuwens (1976) Y3 6 45 8 (50)2,4-D+(2)Kin Kumar et al (1985)
Creştere embrioni Murashige&Skoog(1962) 40 8 (10)AIA Nurita-Toruan (1978)
glucoză
Corylus Proliferare embrioizi 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 +/-(0,11)BAP Pérez et al (1986)
avellana Calus şi Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)2,4- Radojevic et al,(1975)
embriogeneză D+(1)Kin+(2)Ad
Fragaria Ţesut embriogen Wang D, et al, (1984) 5,8 50 8 (5)2,4-D + (0,5)BAP Wang D, et al, (1984)
Regenerare plantule Wang D, et al, (1984) 5,8 50 8 (1)GA3 sau Wang D, et al, (1984)
[(0,5)BAP+ (0,1)ANA
Juglans regia Lăstari Cassio&Minotta 5,7 30 10 (0,2)ANA Cassio&Minotta
(1983)1,2&3 (1983)
Malus x Proliferare embrioizi Murashige & Skoog 5,6-5,8 30 8 Eichholtz et al (1979)
domestica (1962)
Mangifera Proliferare embrioni Litz et al (1984) 5,7 30 8 (1-2)BAP Litz et al, (1984b)
indica Germinare limitată Litz (1984a 5,7 60 0 Litz (1984b)
Persica Germinare Brooks & Hough (1958) 20 6,8 Brooks & Hough
vulgaris (1958)
Dezvoltare embrioni Monet (1968) 5,8 20 8 2-3 ml CM pe Monet (1968)
suprafata agarului
Phoenix Calus, embriogeneză Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 30 8 (10-100)2,4-D+(3)2iP Tisserat et al (1979)
dactylifera +(40)AdS
Theobroma Maturare Murashige & Skoog 5,8 30 8 Kononowikz & Janik
cacao (1962) (1984b)
Embriogeneză Murashige & Skoog 30 10 (1,5)ANA+10%CM Pence et al
(1962) (1979;1980)
Dezvoltare embrioni Murashige & Skoog 30 0 (1,5)ANA+10%CM Pence et al
şi germinare (1962) (1979;1980)
Germinare precoce Ben-Jaacov & Dax (1981) 5,7 30 0 Pasare la 10 zile Wang & Janich (1984)

202
Tabelul 9.3.
Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Rezultat Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Fraxinus Dezvoltare Bulard & Monin (1960) 5 30 glucoză 8 +/- (1)GA3 Bulard & Monin
americana embrioni (1963)
Gingko biloba Calus Linsmaier&Skoog(1965) 20 8 Arias et al (1982)
Lăstar Tukey (1933) I 20 10 Ball (1956a,b)
Lăstar Ball (1959)A sau B 40 glucoză 10 30% CM Ball (1959)
Hedera helix Calus Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (2)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979)
Ilex aquifolium Germinare şi Linsmaier & Skoog 5,6 40 10 Hu & Sussex
creştere (1965) (1972)
Magnolia Germinare Heller (1953;1955) 20 8 Le Page-Degivry
grandiflora (1970)
Magnolia Germinare Heller (1953;1955) 20 8 Le Page-Degivry
soulangeana (1970)
Picea abies Calus şi Von Arnold & Eriksson 5,8 34,2 5 (2,2) 2,4-D + (1,1) BAP Hakman et al
embriogeneză (1981) LPm (1985)
Lăstari adventivi 0,5 x Schenk & 15 5 (1) Kin + (1,1) BAP Von Arnold &
Hildebrandt (1972) Eriksson (1984)
Lăstari adventivi Von Arnold (1982) 17,1 (2,1) Kin Von Arnold (1982)
Pinus strobus Calus Murashige & Skoog 5,8 30 8 [(0,01-2) ANA, 2,4-D Minocha (1980)
(1962) sau IBA] + (0,1-5) Z,
BAP sau 2iP
Lăstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (1-5) IBA + (0,1-1)Z Minocha (1980)
Pseudiotsuga Calus şi muguri Linsmaier & Skoog 5,6 30 7 (1-2) ANA + (1) BAP Chalupa (1977)
menziesii (1965)
Ouercus robur Lăstari Vieitez & Vieitez 30 6 (1) BAP Vieitez et al (1985)
(1983) QL

203
Capitolul 10
Producerea haploizilor

10.1. Generalităţi
În urma diviziunilor celulare care se încheie cu formarea gameţilor se obţin celule
haploide cu număr simplu de cromozomi (n).
Plecând de la aceste celule se pot regenera prin diferite metode plante haploide sau
prin diploidizare, plante homozigote care prezintă o importanţă practică deosebită pentru
activitatea de ameliorare.
In vivo, plantele haploide se pot obţine relativ uşor cunoscându-se peste 100 de
specii la care s-au obţinut haploizi pe cale spontană.
Cea mai comună metodă în acest sens este obţinerea de plante din seminţe cu doi
embrioni (duble). Acestea pot avea 2 embrioni n-n sau 2 embrioni 2n-n.
Avantajele folosirii haploizilor:
- prin dublarea cromozomilor se obţin rapid plante homozigote - procesul are mare
importanţă la speciile la care acestea nu pot fi obţinute in vivo (ex. plante dioice şi
autoincompatibile). Se reduce durata procesului de obţinere a liniilor homozigote care
presupune autopolenizări timp de 5-7 generaţii;
- obţinerea plantelor homozigote la speciile cu perioada juvenilă lungă este dificilă
şi îndelungată;
- producerea de hibrizi F1 este uşurată;
- la speciile poliploide prin obţinerea de haploizi se poate lucra mai uşor cu niveluri
de ploidie inferioare;
- mutantele recesive sunt rapid puse în evidenţă la plantele haploide;
- folosirea plantelor haploide permite obţinerea de plante mascule normale prin
dublarea garniturii cromozomale. Acestea sunt deosebit de utile pentru Asparagus
officinalis la care producţia este mai ridicată şi mai timpurie decât la cele femele;
XX x Y Y (super mascul)


XY

204
- in vitro haploizii îşi dublează spontan garnitura cromozomală sau necesită
cantităţi mici de colchicină. Aceasta determină apariţia de probleme secundare atunci când
este folosită în mod normal in vivo;
- fuziunea protoplaştilor haploizi este mai indicată pentru că se realizează mai uşor
şi hibridul somatic va fi diploid, decât în cazul protoplaştilor diplozi care formează hibrizi
somatici tetraploizi.
Producerea haplozilor in vitro presupune două procese:
- cultivarea unor gameţi femeli (ovule) sau sinergide-ginogeneza;
- cultivarea unor gameţi masculi (grăuncior de polen) – androgeneza.

10.2. Androgeneza in vitro


Cel mai mult s-au studiat produsele de androgeneză in vitro cu rezultate pozitive la
speciile din fam. Solanaceae, Cruciferae, Gramineae şi Ranunculaceae.
Peste 247 de specii şi hibrizi de 88 de genuri şi 34 de familii au produs haploizi in
vitro (Maheshwari şi coalb. 1983).
Rezultate mai puţin promiţătoare s-au obţinut la arbori şi arbuşti.
Primele cercetări în urma cărora s-au obţinut haploizi din antere de Datura innoxia
au fost realizate de Guba şi Maheshwari (1964 şi 1966). În 1967 Borgin şi Nitsch au
obţinut acelaşi lucru din antere de Nicotiana.
Materialul iniţial pentru obţinerea haploizilor:
- anterele sunt cele mai folosite fiind cultivate pe mediu lichid sau solid.
Izolarea se face folosind antere provenite din mugurii închişi sau flori deschise.
- grăunciori de polen se folosesc mai puţin;
- inflorescenţe care cresc uşor pe mediu lichid (la specii de ierburi care au
flori de dimensiuni reduse).
- embriocultură - cultivarea unor embrioni rezultaţi din încrucişări
interspecifice sau intergenerice la care unul din genitori este eliminat. Ex. Hordeum
vulgare x H. bulbosum, acesta din urmă este eliminat, idem T. aestivum x H. bulbosum.
- pseudofecundare - Hess şi Wagner (1974) au polenizat Mimulus luteus cu
polen de Torenia fournieri in vitro. Gameţii femeli de Mimulus au generat plante haploide.
- ovule nefecundate - avantaj majoritatea plantelor regenerate sunt verzi, la
cereale la orz celulele sacului embrionar haploide, la grâu, orez şi porumb ovule. La

205
gerbera prin cultură de capitul, s-au obţinut plante haploide clorofilo-deficitare, galbene
(Preil şi colab, 1977); ovule + placentă la Petunia axillaris (Keller 1986).
Producerea haploizilor din antere se poate realiza pe două căi:
- direct - embrionul haploid se formează direct din grăunciorul de polen;
- indirect - pentru început din grăunciorul de polen se obţine calus dar apoi se
formează un embrion sau un lăstar adventiv. Prezintă dezavantaje datorită existenţei în
masa calusului a unor celule diploide şi haploide.
Momentul izolării anterelor este esenţial: mulţi autori (Debergh 1978; Reinert şi
Bajaj, 1977a etc.) optează pentru momentul de dinaintea primei diviziuni a grăunciorilor de
polen.
Dunwell (1985) precizează că momentul optim este între diviziunea microsporilor
din tetradă şi prima mitoză.
La tutun se folosesc mugurii florali la care petalele sunt abia vizibile.
Prin cultura de antere se formează frecvent un număr mare de haploizi, himere şi
plante cu diferite niveluri de ploidie.
Factori care influenţează producerea haploizilor din antere:
- pretratamente la plantele mamă: temperatura scăzută, centrifugarea anterelor, incizia
vârfului inflorescenţelor, tăierea peretelui anterei;
- tipul de material iniţial: - plante sănătoase, viguroase;
- vârsta plantei, vârsta florii;
- poziţia explantului - la cereale se izolează flori din vârful spicului;
- compoziţia mediului, MS ori Nitsch, se modifică în fiecare de fază;
- pH-ul mediului recomandat este 5,8, conţinutul în zaharoză de 2-4%;
- prezenţa agarului nu este obligatorie. Se poate folosi un mediu lichid în care anterele
plutesc, sau un mediu cu dublu strat;
- cărbunele activ absoarbe metaboliţii din mediul de cultură şi are efect pozitiv.
Androgeneza in vitro se confruntă cu o serie de probleme:
- uneori creştere dificilă - avortarea embrionilor;
- se formează simultan diploizi sau tetraploizi; diviziunea celulară trebuie să se
realizeze în haploid şi nu în celule diploide adiacente;
- se formează frecvent plante albinotice care nu trăiesc;
- costuri ridicate, uneori se recurge la obţinerea de haploizi in vivo, care este mai
ieftină (Solanum tuberosum x S. phureja);

206
- formarea calusului este nedorită;
- este greu să se izoleze haploizi dintr-un amestec în care există şi celule cu diferite
grade de ploidie, deoarece acestea cresc mai puternic.
- selecţia plantelor diploide este dificilă şi de lungă durată prin metoda citogenetică
şi presupune folosirea metodelor cu marcatori genetici.
- nu întotdeauna dublarea garniturii cromozonale are ca efect producţia de plante
homozigote, întrucât în descendenţă poate apărea segregarea.

10.3. Fecundarea in vitro


În anumite situaţii, realizarea hibridării sexuate este imposibilă datorită mai multor
factori cu influenţă negativă :
- polenul nu germinează pe stigmat;
- creşterea tubului polinic este parţială;
- fecundarea nu se produce;
- zigotul nu se dezvoltă;
- ovarul îmbătrâneşte prematur, etc.
După 1962 s-a pus problema rezolvării cazurilor de incompatibilitate prin realizarea
polenizării şi fecundării in vitro.
Tipuri de polenizare şi fecundare:
a) polenizarea stigmatului - se realizează castrarea (emascularea) florii provenite
de la genitorul matern, sterilizarea acesteia şi inocularea pe un mediu in vitro.
Polenul provenit de la antere mature este sterilizat şi el şi amplasat pe stigmat.
Metoda a fost folosită cu succes la Nicotiana rustica, N. tabacum, Petunia violacea,
Antirhinum majus, Pisum sativum, Lathyrus odoratus, Zea mays (Pierik,. 1979; Zenkteler,
1980) şi Glycine sp. (Silvoy şi alţii, 1984).
b) polenizarea placentei - după sterilizarea florii femele se extrage sub lupă
binocular placenta cu ovulele proprii şi se inoculează pe un mediu nutritiv. În acelaşi timp,
anterele ajunse aproape de maturitate, se sterilizează şi se deschid sub hotă, depunând apoi
grăunciorii de polen pe ovule. Grăunciorii de polen germinează, străpung sacul embrionar
şi se realizează fecundarea.
Rezultate bune s-au obţinut la specii din familia Caryophyllaceae, Gossypium
precum şi la Zea mays.

207
c) polenizarea ovulelor izolate - după izolarea ovulelor fără placentă se face
polenizarea ca în metodele precedente, şi are loc fecundarea.
Metoda este mai puţin folosită deoarece embrionul se dezvoltă greu în acest caz.
Totuşi polenizarea in vitro se poate folosi:
- în cazuri de incompatibilitate in vivo ex. Petunia axilaris (Rangaswarny şi
Shivanna, 1967) şi hibrizii de Petunia (Numi, 1970).
- în cazuri de incompatibilitate la realizarea polenizării încrucişate interspecifice
sau intergenerice. Ex. :
- Nicotiana alata x Nicotiana tabacum;
- la genuri din Familia Caryophyllaceae – se foloseşte metoda polenizării
placentei;
- producerea de haploizi prin partenogeneză. Hess şi Wagner (1974) au obţinut un
haploid de Mimulus luteus prin polenizarea cu polen de Torenia fournieri.
- când are loc căderea prematură a florii sau ovulului se poate recurge la
polenizarea stigmatului in vitro
- realizarea studiilor de fiziologia fecundării şi a studiilor fenomenului de
incompatibilitate.
Pentru reuşita fecundării in vitro trebuie îndeplinite mai multe condiţii:
- gameţii să fie în faza optimă de dezvoltare pentru realizarea fecundării;
- mediul de cultură să asigure condiţii optime pentru fecundare, creşterea
embrionului şi obţinerea de noi plante. Se folosesc de regulă soluţii foarte complexe;
- operaţiile de stabilizare a materialului vegetal trebuie să fie executate rapid
pentru a nu determina spălarea lichidului de pe stigmat sau crăparea anterelor;
- când se recurge la metoda polenizării stigmatelor nu se înlătură sepalele,
deoarece acestea stimulează creşterea şi dezvoltarea ovarului.
- temperatura influenţează direct procesul de fecundare. Speciile din genul
Narcissus necesită temperaturi mai scăzute, inferioare temperaturii de 25°C (Balatkova şi
colab. 1977), în timp ce Papaver somniferum are nevoie de temperaturi ridicate.
Tabelele 10.1., 10.2., 10.3. şi 10.4. prezintă rezultatele unor lucrări de cercetare
privind androgeneza şi ginogeneza in vitro la plantele horticole.

208
Tabelul 10.1.
Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la plantele legumicole
Regulatori de
Denumirea Zaharoză Agar
Explant iniţial Rezultat Mediu pH creştere Autori
speciei (g/l) (g/l)
(mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Allium cepa Primordii Lăstari multipli Dunstan&Short 5.5 30 8 (1) BAP Dunstan&Short
florale (1977a)BDS (1979a)
Flori fertilizate Cultura de Nitsch (1951)1 5.8 50 7 (0.5)AIA+(0.5-1) Kin Guha&Johri (1966)
ovare/fruct +(4)GA3
Ovule Răsad Johri&Guha (1963) - 50 7 (1)AIA+(0.5) Johri&Guha (1963)
fertilizate Kin+(4)GA3
Asparagus Antere Calus Pelletier et al. (1972) - 20 5 (0,1) ANA +(0,5) 2,4- Doré (1974)
officinalis Tosauri D +(0,5) BAP
Antere Calus Pelletier et al. (1972) - 20 5 (0,1) ANA +(1) 2,4-D Pelletier et al (1972 b)
Tosauri +(0,2) BAP
Brassica alba Antere Calus Leelavahti et al 5.6 20 agar (2) 2,4-D Leelavahti et al (1984)
(1984)
Brassica oleracea Antere Calus Bagga et al (1982) 1 5.5 20 8 (0.22)2,4-D + (0.22) Bagga et al (1982)
botrytis uninucleate Kin
Antere 42% calus Gamborg et al. 5.5 20 8 (0.5)BAP Bagga et al (1982)
uninucleate 8% embrioizi (1968) B5
Fragmente Lăstari Linsmaier & Skoog - 30 lichid (8) AIA + (2,56) Kin Crisp & Walkey
petale (1965) (1974)
Fragmente Lăstari Margara (1969a,b) C - 45 8 (2.3) BAP Margara (1969 a,b)
pedunculi
florali
Fragm. pedunc. Lăstari Margara (1977; - 30 8 (1) IBA + (0,93) ANA Margara (1978)
florali 1978) N 30 NH4
Brassica oleracea Antere Embriogeneză Keller et al (1975) - 100 8 (0.1) 2,4-D + (0,1) Ockendon (1984,
gemmifera ANA 1985)

209
Tabelul 10.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Capsicum Antere Embriogeneză Dumas De Vaulx et al 5.9 30 8 (0.1) Kin Dumas De Vaulx et
annuum (1981) R al (1981)
Antere Plante haploide George & 5.8 20 8 (0.5)AIA George &
Narayanaswamy Narayanaswamy
(1973) (1973)
Antere (48h, 4°C) Embrioizi Sibi et al (1979) Cm 5.9 30 8 (2) 2,4 – D + (2) Kin Sibi et al (1979)
Antere Embrioizi şi Sibi et al (1979) Cm 5.9 30 8 (0.1) Kin Sibi et al (1979)
plantule
Cichorium Murashige & Skoog
Antere Calus BA, AIA, ANA, 2,4-D Smets (1983)
intybus (1962)
Seminţe, muguri
florali, flori, Calus, muguri, Murashige & Skoog
BA, AIA Dabin (1985)
fragm. foliare lăstari, rădăcini (1962)
(0,1-1cm2)
Cucumis sativus antere calus Lazarte&Sasser 0 agar - Lazarte&Sasser
(1982)L (1982)
Lactuca sativa polen 40% germinare Eenik (1983) 40 lichid - Eenik (1983)
Lycopersicon Polen/antere torpedo Bourgin & Nitsch 5.5 20 lichid (0.1)ANA+(0.1)BAP Debergh&Nitsch
esculentum (1967)H (1973)
Antere Calus haploid Gresshoff&Doy 5.8- 20 8 (2)ANA+(1.5 )Kin Gresshoff&Doy
(1972a,b)DBM1 6.4 (1972b)
Antere Calus Gresshoff&Doy 5.8 20 8 (2)ANA+(1)Kin Gulshan&Sharma
(1972a,b)DBM2 (1981)
Ovare 8-10 zile Seminţe viabile Uralets (1980) 1 5.8 20 agar Uralets (1980)
Antere Calus Murashige & Skoog 5.8 20 8 (0.5) AIA + (0.25) Z Zamir et all (1980;
(1962) 1981)
Phaseolus Antere Calus haploid Veliky & Martin 20 8 (1) 2,4-D Peters et al (1977)
vulgaris şi diploid (1970) 67-V

210
Tabelul 10.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Raphanus Muguri florali Calus şi Konar et al (1972 a) - 0 7 (1) AIA + 10% CM Konar et al (1972
sativus embriogeneză a)
Sepale, petale, Calus şi Ranga Swamy (1962) 5.8 20 7 (1) 2,4 –D + 10 % Nataraja & Konar
antere embriogeneză I CM (1970)
Solanum Antere Calus şi Murashige & Skoog 5.8 30 agar (0.25 - 2) 2,4-D + Anon (1981 b)
melongena embriogeneză (1962) (0.25-1)Kin + (0.2)
Rac
Antere Calus şi Pelletier et al (1972) 5.8 20 7.5 (0.1) ANA + (0.2) Isouard et al
embriogeneză Tosauri BAP (1979)
Solanum Antere Embrioizi Bourgin & Nitsch 5.5 20 8 (0.22) Kin Kohlenbach &
tuberosum (1967) H Geier (1972)
Antere Calus Murashige & Skoog 5.8 30 agar (1.9) ANA + (0.39) Sopory & Tan
(1962) Kin (1979)
Antere Calus Murashige & Skoog 5.8 30 agar (1.86) ANA + (0.23) Sopory & Tan
(1962) BAP (1979)
Antere Embrioizi Bourgin & Nitsch 5.8 20 8 (0.23) BAP + (1.86) Sopory (1977a )
(1967) H ANA
Antere Embriogeneză Murashige & Skoog 5.8 60 agar (1.1)AIA + (0.9) BAP Sopory et al
directă (1962) (1978)&
Polen Embrioizi Murashige & Skoog 5.8 30 lichid (1.4) 2,4-D + (0.4) Sopory (1977)
globulari (1962) Kin

211
Tabelul 10.2.
Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la plantele pomicole
Regulatori de
Denumirea Zaharoză Agar
Explant Rezultat Mediu pH creştere Autori
speciei (g/l) (g/l)
(mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Armeniaca Antere Calus Murashige & Skoog 30 agar (2)ANA+(2)Kin Harn & Kim
vulgaris (19620 (1972)
Cerasus avium Antere Calus Seirlis et al, (1979)A 30 9 (0,5)2,4-D+(0,5- Seirlis et al, (1979)
1)BAP
Citrus sp, Antere Calus Murashige & Tucker 50 agar (3)2,4-D+(1)Kin Murashige&Tucke
(1969) r
(1969)
Ovule Formarea şi Murashige & Tucker 5,7 30 8 (0,01)2,4- Gmitter & Moore
nedezvoltate creşterea (1969) D+(0,1)daminozide (1986)
embrionilor
Kochba et al, (1972) 5,7 30 8 Gmitter & Moore
(1986)
Inflorescenţe Rizogeneză Eeuwens&Blake(1977) 5,5-5,8 68,5 3,9 (0,022)2,4-D+(1,13)BAP Eeuwens (1978)
Cocos nucifera Antere Torpedo Thanh-Tuyen&De 5,8 60 7 (2)ANA+/-(0,25)2,4- Thanh-Tuyen&De
Gz,(1983)1 D+15%CM Gz,(1983)1
Juglans regia Polen 80% Luza & Polito (1985) 20 6,5 Luza & Polito
germinaţie (1985)
Musa acuminata Muguri florali Lăstari Krikorian & Cronauer 5,8 41 0 (4,95)BAP+10%CM Cronauer &
(1984) Krikorian (1985a)
Muguri florali Lăstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 0 (5)Bap + 10% CM Cronauer &
Krikorian (1985b)

212
Tabelul 10.3.
Cercetări privind cultura embriogeneza somatică la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant Rezultat Mediu pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Clematis gouriana Antere Calus Ranga Swamy (1961)I 5,8 20 7 (1)AIA + 10%CM Nataraja (1971)
Antere Embriogeneză Nitsch & Nitsch (1969) 5,8 20 lichid Johansson et al
(1982)
Ginkgo biloba Polen Calus Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6)2,4-D +10- Lamport (1964)
40%CM
Polen Calus Tulecke (1960) A 6 20 10 (0,1)ANA + 20% CM Tulecke (1960)
Gametofit Calus haploid White (1943a) A 20 agar (6)2,4-D + 18%CM Tulecke (1964)
Larix decidua Gametofit Calus Nagmani & Bonga 5,8 20 8 (2)BAP Nagmani & Bonga
(1985) (1985)
Paulownia Ovule Plantule via Radojevic et al, (1975) 20 7 (1)2,4-D + (1)Kin + Radojevic (1979)
tomentosa calus (2)Ad
Picea abies Megagametofit Calus haploid & Huhtinen (1976) 30 (1-10) 2,4-D + (0,1-1) Huhtinen (1976)
lăstari adventivi Kin
Megagametofit Calus Simola & Honkanen 5,6 20 6 (2) 2-4-D +(0,5) Kin Simola & Honkanen
(1983) (1983)
Pinus mugo Polen Germinare polen Nygaard (1970) B, Nf 5,2 3,4 lichid Nygaard (1970)
sau C
Pinus mugo Megagametofit Calus haploid Brown & Lawrence 5,6- 20 8 (5) 2,4-D Bonga (1974)
mughus (1968) 5,8
Pinus nigra Megagametofit Calus haploid Brown & Lawrence 5,6- 20 8 (5) 2,4-D Bonga (1974)
austriaca (1968) 5,8
Pseudotsuga Embrioni Dezvoltare Mapes & Zaerr (1981) 5,8 30 agar Mapes & Zaerr
menziesii zigotici embrioni (1981)
Polen Germinare polen Muren et al (1979) 5,2 lichid Muren et al (1979)
Rosa hybrida Antere Calus haploid Murashige & Skoog 5,8 30 agar (7,5) AIA +(0,8) Kin Tabaeezadeh &
(1962) Khosh –K, (1981)

213
Tabelul 10.4.
Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la viţa de vie
Regulatori de
Denumirea Zaharoză Agar
Explant iniţial Rezultat Mediu pH creştere Autori
speciei (g/l) (g/l)
(mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis thunbergii Antere Lăstari Nitsch (1971)1 5.5 20 8 (1.86) ANA+(0.225) Hirabayashi et al
BAP (19760
Vitis vinifera Antere Calus Gresshoff & Doy 5.8 20 8 (2) ANA+(2) AIA+(1.5)
(1974)1 Kin
Vitis vinifera Lăstari Dezvoltare Favre & Grenan 20 agar Favre & Grenan
(1979)S glucoză (1979)
Vitis vinifera Ovule Calus Mullins & Srinivasan 5.6 20 0 (2.8)CPA + 10-15% Mullins &
(1976) HDVM CM Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Ovule Calus Mullins&Srinivasan(1 5.6 20 0 (1.1) BAP Mullins &
976)N Srinivasan (1976)
Vitis vinifera x Antere Calus Bourgin & Nitsch 20 0 (1.11) 2,4-D + Rajakeran &
Vitis rupestris (18670 H (0.225) BAP Mullins (1979)

214
Capitolul 11
Cultura de calus in vitro

11.1. Cultura de calus


Calusul reprezintă o aglomerare de celule mai mult sau mai puţin diferenţiate care au o
capacitate diferită de multiplicare.
Formarea calusului are loc pe diferite tipuri de explante cultivate in vitro pe zonele
rănite, sub influenţa unor substanţe specifice.
Cultura calusului presupune trei etape:
- inducerea formării calusului;
- înmulţirea calusului;
- regenerarea de organe adventive de calus.
Inducerea calusului
Pentru iniţierea unei culturi de calus pot fi folosite diferite tipuri de organe: rădăcini,
tulpini, frunze, flori şi ţesuturi. Când este nevoie de material juvenil, de regulă se apelează la
cotiledoane, embrioni imaturi, puieţi etc.
Stimularea formării calusului pe explantele iniţiale se face prin folosirea unor hormoni
specifici. Pentru monocotiledonate sunt recomandate auxinele. Unele specii necesită
citochinine în timp ce altele au nevoie atât de citochinine cât şi de auxine.
La început, la explantele de morcov se folosea 2,4 D şi lapte de cocos pentru obţinerea
calusului. Ulterior s-a demonstrat că laptele de cocos are un conţinut ridicat de citochinine
care stimulează procesul de calogeneză.
Alţi factori care intervin în formarea calusului sunt: genotipul, compoziţia mediului de
cultură, pH-ul, factorii fizici de creştere.
Pe lângă mediul de cultură MS, în reţeta de bază se mai foloseşte zaharoza în
concentraţie de 2-4% şi alte substanţe auxiliare cum ar fi: caseina hidrolizată, extractul de
malţ, de drojdie, laptele de cocos.
pH-ul ridicat (7) a stimulat formarea şi creşterea producţiei de calus la actinidia
(Stănică şi colab., 1995).

215
a) b)
Foto 11.1. Formare calusului la kiwi (Actinidia deliciosa) din peţiol (a) şi lim foliar (b)

Temperatura ridicată (22-28°C) stimulează procesul de calogeneză în timp ce lumina


are efect diferit.
Sub influenţa factorilor amintiţi, celulele ţesuturilor diferenţiate suferă un proces de
dediferenţiere. În timpul acestuia celulele parenchimatice se convertesc în celule juvenile cu
capacitate mare de diviziune.
Ţesuturile meristematice nu au nevoie de procese de dediferenţiere, ele fiind capabile
de diviziune rapidă şi formare de calus. În masa de calus pot să coexiste celule cu grade
diferite de diferenţiere.
Cultura de calus
După obţinerea calusului, acesta este cultivat pe un alt mediu, de regulă solid în prima
fază de cultură şi lichid după aceea.
Compoziţia mediilor este similară cu cea din faza de inducţie cu excepţia concentraţiei
auxinelor şi citochininelor care este mai redusă. Dacă creşterea calusului este mai redusă
atunci se recomandă şi păstrarea unei porţiuni din explantul iniţial în timpul primei subculturi.
Calusul format are culori, grade de compactare şi consistenţă (duritate) diferite în
funcţie de specie, tipul de explant din care provine şi condiţiile de cultură (Stănică, 1995,
1998). La kiwi, calusul cel mai consistent a fost produs de către limbul foliar, indiferent de
mediul de cultură folosit. De asemenea, pH-ul 7, a avut ca efect producerea unui calus mai
dens şi de culoare verde intensă, faţă de cel obţinut pe un mediu cu pH- ul de 5.5.
Trebuie remarcat calusul cu aspect sticlos deosebit de consistent, de culoare verde, cu
infiltraţii roz care a avut şi o mare capacitate organogenetică. Odată cu scăderea consistenţei,
culoarea calusului trece de la verde închis strălucitor la verde deschis, verde albicios, brun şi
alb gălbui.

216
În acelaşi timp, culoarea şi duritatea calusului, numărul de subculturi şi pH-ul
mediului de cultură, s-a dovedit că influenţează radical viteza acestuia de creştere şi
capacitatea organogenetică (Stănică F. şi Armeanu I. 2004).
S-a observat de asemenea, o corelaţie inversă între cantitatea de calus produs şi
procentul de organogeneză indirectă, respectiv între cantitatea de calus produs şi numărul de
lăstari formaţi din calus. După o subcultură cu o creştere importantă a calusului, urmează o
subcultură cu formarea unui număr mare de lăstari pe calusul respectiv.
În funcţie de specie, provenienţă şi compoziţia mediului de cultură, calusul va
continua să crească sau va începe să diferenţieze centri meristematici din care se vor forma
apoi diferite organe prin organogeneză indirectă (foto 11.2.).

Foto 11.2. Calus cu capacitatea organogenetică ridicată obţinut din frunză de cicoare

În trecut, se practica cultura calusului pe mediu solid, însă viteza de creştere a acestuia
era mai redusă deoarece: suprafaţa de contact cu mediul era mai redusă, fapt care influenţa
negativ absorbţia substanţelor nutritive; cantitatea de oxigen era limitată; o serie de factori
prezenţi în mediul solid stimulau diferenţierea şi regenerarea unor organe şi reduceau
creşterea calusului.
Cultura calusului pe mediul lichid se realizează pe agitatoare în vase Erlenmeyer. În
această situaţie, se folosesc agitatoare rotative cu o frecvenţă de rotire de 80-100 rotaţii/minut.
Cantitatea de mediu trebuie să reprezinte 20-30% din volumul vasului.
În funcţie de specie calusul rămâne agregat (Anthurium andreanum) sau se separă în
celule formând o suspensie celulară (la morcov).
Tabelele 11.1., 11.2., 11.3., şi 11.4. prezintă câteva rezultate ale lucrărilor de cercetare
privind cultura de calus la speciile horticole.

217
Tabelul 11.1.
Cercetări privind cultura de calus la plantele legumicole
Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH Autori
(g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Ţesut medular Dunstan&Short (1977a) 5,5 30 8 (0,28)2,4-D Dunstan&Short
BDS (1977a)
Radicele Dunstan&Short 1977a 5,5 30 8 (0,138) 2,4- Dunstan&Short
BDS D+(0,05)ANA (1977b)
Fragmente rădăcini Mullin (1970) 5,5-6,0 20 6 (6)2,4-D+15%CM Mullin 1970
Radicele Mullin 1970 5,5-6,0 40 6 (0,6)2,4-D+15%CM Mullin 1970
Apium graveolens Peţiol Murashige&Skoog(1962) - 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Al-Abta & Collin (1978)
Calus Murashige&Skoog(1962) - 30 agar (5)2,4-D Al-Abta & Collin (1978)
Peţiol tânăr sau Murashige&Skoog(1962) - 30 9 (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Browers&Orton
frunze (1982)
Peţiol 3-5cm Murashige&Skoog(1962) 5,6 30 10 (1)ANA+(0,1)Kin Chen (1976)
Fragmente de Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6) Kin Zee&Wu (1980)
frunză
Asparagus Internod Linsmaier&Skoog(1965) - 30 6 Hunault (1976)
officinalis Calus Reuther (1984) 5,8 30 agar (1) AIA + [(0,1) BAP Reuther (1984)
sau (0,5) 2iP]
Ţesut medular White (1943 a)A - 30 agar (5) ANA + 10% CM Steward & Mapes
(1971 b)
Calus Murashige & Skoog - 30 lichid (5) 2,4 -D +10% CM Steward & Mapes
(1962) (1971 b)
Fragmente de Linsmaier & Skoog 5,8 30 8 (1) 2,4-D + (0,315) Kin Wilmar &
hipocotil (1965) Hellendoorn (1968)

218
Tabelul 11.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Brassica oleracea Fragmente de Bagga et al. (1982) 1 5,5 20 8 (0,22)2,4-D +(0,22) Kin Bagga et al (1982)
botrytis frunze
Ţesut medular Gamborg et al. (1968) 5,5 20 8 (2) ANA + (0,5)BAP Bagga et al (1982)
B5
Hipocotil Murashige&Skoog 5,8 30 8 (1,1)2,4-D+(0,11) Kin Dietert et al (1982)
(1962) +10% CM
Calus Murashige&Skoog 5,8 30 8 (8) IBA + (0,04) Kin Dietert et al (1982)
(1962) +15% CM
Brassica oleracea Minicalus Lillo & Shahin (1986) 5,6 30 7 (1) 2,4-D + (0,5) BAP + Lillo & Shahin
capitata (0,1) ANA + (40) AdS (1986)
Brassica oleracea Fragmente de Clare & Collin (1973) 5,7 30 7 (1) IBA + (2) AIA + Clare & Collin
gemmifera peţiol (0,05) Kin (1974)
Cichorium intybus Fragm. foliare Murashige & Skoog Saksi şi co. (1986)
ANA, BA
obţinute in vitro (1962)
Cucumis melo Fragmente de Bourgin&Nitsch 5,7 40 glucoză 8 - Blachmon &
frunză sau (1967)H Reymonds (1982)
cotiledon
Cotiledon Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (6)Kin+(1,5)AIA Moreno et al.(1984)
Cucumis sativus Internod Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,19)ANA+(0,023)BAP Aziz&McCown(1985)
Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (6,75)BAP Aziz&McCown(1985)
Calus Lazarte&Sasser 20 8 (0,1)IBA+(1)BAP+ Lazarte&Sasser
(1982)MS (0,1)GA3 + (162)PG (1982)
Fragmente de hipocotil Murashige&Skoog 30 agar (0,37)ANA+(0,23)BAP Sekioka&Tanaka
sau cotiledon (1962) (1981)
Cotiledon sau Murashige&Skoog 5,8 30 agar (1)ANA+(1)BAP Wehner&Locy
hipocotil (1962) (1981)

219
Tabelul 11.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Daucus carota Fragmente Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2)AIA+(6)2,4-D+ Abou-Mandour
rădăcini (0,3)Kin+(4)AdS (1977a)
Calus Gamborg et al.(1968) 20 lichid (1,1)2,4-D+(0,1)Kin Baldwin&Gresshoff
(1978)
Cambiu-rădăcină Butcher&Ingram 5,5 20 7 (0,15)2,4-D+(0,15)Kin Butcher&Ingram
(1976)C (1976)
Fragmente Caplin&Steward(1948) 5,6 20 8 (0,1)ANA+15%CM Caplin&Steward(19
rădăcină 48)
Fragmente Murashige & Skoog 5,7-5,8 30 8 (10) 2,4-D+[(2)BAP sau Dodds&Roberts
rădăcină (1962) 10%CM] (1982)
Peţiol Halperin (1966)A 5,6 20 agar (0,1-1)2,4-D Halperin (1964)
Rădăcini Lamport 1964 20 lichid (0,6-6)2,4-D+10-40%CM Lamport (1964)
Ipomoea batatas Fragmente Murashige & Skoog 5,7-5,8 30 8 (10) 2,4-D+[(2)BAP sau Dodds&
rădăcină (1962) 10%CM] Roberts(1982)
Fragmente Murashige & Skoog 5,8 30 8 (0,25) 2,4-D Handley&Locy
rădăcină (1962) (1984)
Calus Murashige & Skoog 5,8 30 8 (0,5) 2,4-D+(3)Kin Handley&Locy
(1962) (1984)
Fragmente Henderson et al.(1984)1. 20 8 (3)2,4-D Henderson et
tuberculi al.(1984)
Calus Henderson et al.(1984)2. 20 8 (1)2,4D+(1)ANA+(0,25) Henderson et
2iP+ (2)ABA al.(1984)
Lactuca sativa Cotiledon sau Murashige&Skoog 5,8 30 8 (0,05)ANA+(0,5)BAP Brown et al (1986)
frunze cotiledonare (1962)
Peţiol Vasil&Hildebrand 5,7-5,9 20 6 (0,1)ANA+15%CM Fukami&Hildebrandt(19
(1966c) C 67)
Calus Fukamil&Hildebrand 5,7-5,9 0 6 (0,1)ANA+15%CM Fukami&Hildebrandt
(1966c) THS (1967)
Fragmente de Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Koevary et al (1978)
frunză

220
Tabelul 11.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lactuca sativa Fragmente de Vasil&Hildebrand 5,7-5,9 20 6 (6)2,4-D+ Vasil & Hildebrandt
frunză (1966c)C (0,1)ANA+15%CM (1966c)
Calus Vasil&Hildebrand 5,7-5,9 20 6 (0,1)ANA+15%CM Vasil & Hildebrandt
(1966c)C (1966c)
Lycopersicon Frunze Murashige&Skoog 30 8 (0,5)2,4-D+(1)BAP Behki&Lesley
esculentum (1962) (1980)
Ţesut medular Murashige&Skoog 5,8 3 6 (2)Z Cassells (1979)
(1962)
Calus Murashige&Skoog 5,8 3 6 (2)Z Cassells (1979)
(1962)
Calus Gresshoff&Doy 5,8-6,4 20 8 (5)ANA+(0,01 )Kin Gresshoff&Doy
(1972a,b)DBM3 (1972b)
Hipocotil Murashige&Skoog 5,8 30 agar (2)BAP Gunay&Rao (1980)
(1962)
Fragmente frunze Linsmaier&Skoog 30 agar (0,4)AIA+(4)Kin Herman&Haas(1978
(1965) )
Fragmente frunze Kartha et al. (1974a) 5,8 30 8 [(1,1-2,3)BAP+/-(0,02- Kartha et al. (1976)
1,8)AIA] sau [(0,22-
1,1)+/-(0,18-1,8)AIA]
Fragmente de Pence & Caruso (1984) - 30 8 [(2,5) IA, Ala/ (2-3) IA, Pence & Caruso
frunze Gly] + (0,2) BAP (1984)
Pastinaca sativa Fragmente de Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2) AIA + (6) 2,4-D Abou-Mandour
frunze +(0,3) Kin + (4)AdS (1977a)
Petroselinum Peţiol Vasil & Hildebrandt 5,7-5,9 20 6 (6) 2,4-D +(0,1) ANA + Vasil & Hildebrandt
hortense (1966c)C 15% CM (1966 b,c)
Phaseolus vulgaris Fragmente de Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2) AIA + (6) 2,4-D Abou-Mandour
frunza/ rădăcini +(0,3) Kin + (4)AdS (1977a)
Fragmente de Veliky & Martin (1970) 4,5 20 10 (1) AIA + (10) Kin Crocomo et al
frunze 67-V (1976)
Pisum sativum Fragmente de Murashige&Skoog 5,8 30 10 (0,06) pic + (1) Kin Jacobsen & Kysely
frunze (1962) (1984)

221
Tabelul 11.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Solanum Fragmente Matsuoka& Hinata 5,5 20 8 (0,8)ANA + (0,225) Matsuoka& Hinata
melongena hipocotil (1979) BAP + (10) AdS (1979)
Solanum Fragmente lăstari Murashige&Skoog 5,8 30 7 (5)ANA Austin & Cassells
tuberosum (1962) (1983)
Calus Austin & Cassells 5,7 10 10 (0,2)ANA + (0,1) AIA + Austin & Cassells
(1983)4 (0,5) BAP + (0,1) Kin + (1983)
(0,2) GA3
Fragmente Engvild (1973) MSN 5,8 30 agar (8) ANA + (0,5) Kin Bragdo – Aas
tuberculi (1977)
Fragmente Gamborg (1966) PRL – 5,8 20 agar (2) 2,4 -D Gamborg (1966)
tuberculi 4–C
Fragmente frunze Ratnamba & Chopra 5,8 20 7 (3) 2,4-D + (0,3)Kin + Gavinlertvatana & Li
(1974) (0,4) GA3 + (40 ) AdS (1980)
Spinacia oleracea Calus din peţiol Vasil& Hildebrandt 5,7-5,9 20 6 (0,1) ANA + 15% CM Fukami & Hildebrandt
(1966 c)C (1967)
Calus Fukami & Hildebrandt 5,7-5,9 0 6 (0,05) Kin + 15% CM Fukami & Hildebrandt
(1967) THS (1967)

222
Tabelul 11.2.
Cercetări privind cultura de calus la plantele pomicole
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant iniţial Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Amygdalus Fragmente Wu & Kuniyuki (1985) 5 0 8 (0,1)ANA +(0,45) BAP Wu & Kuniyuki
communis lăstari CS (1985)
Ananas comosus Fragmente Murashige&Skoog 30 0 (20)Ad sau Mapes (1973)
lăstari (1962) (30)adenosine
Lăstari Murashige & Skoog 30 0 (5,4)ANA+ (5,2)AIA Matheus &
(1962) (agar) +(2,1)Kin Rangan (1981)
Calus Matheus & Rangan 30 0 (10)ANA+ 15%CM Matheus &
(1981) (agar) Rangan (1981)
Cerasus avium internod Murashige&Skoog(1962) 5,3 30 0 (10)IBA+(1)ABA Feucht&Dausend(1976)
Fragmente Pierik et al (1974) 20 0 (1)ANA+(1)BAP Hedtrich (1977)
frunze
Cerasus mahaleb internod Murashige & Skoog 5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
(1962)
Fragmente Pierik et al (1974) 20 0 (4)ANA+(1)BAP Hedtrich (1977)
frunze
Cerasus vulgaris Internod Murashige & Skoog 5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
(1962)
Cocos nucifera Ţesut medular Eeuwens(1976) Y3 5,5 45 agar (0,022)ANA+(0,05)Kin Eeuwens (1976)
+(0,22)GA3
Diospyrus kaki Hipocotil din Yokoyama&Takeuchi 5,6-5,8 30 7 (3)ANA+(0,1)Kin Yokoyama&Take
embrioni imaturi (1976) uchi (1976)
Ţesut medular Fujii & Nito (1972) 20 agar (5)Ad Fujii & Nito
(1972)

223
Tabelul 11.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Malus x domestica Calus Murashige & Skoog 5,6- 0 5,5 (2)ANA+(0,2)Kin Chong & Taper
(1962) 5,8 (1974)
Internod Murashige & Skoog 5,6- 0 5,5 (0,25)2,4-d+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
(1962) 5,8
Fragmente Hurwitz & Agrios 5,7 30 8 (1)2,4-D+(2)ANA Hurwitz & Agrios
frunze tinere (1984)CS +(0,2)Kin (1984)
Frunze Schenk & 5,8 30 8 (0,5)2,4-D+(2)CPA Liu et al (1983a)
cotiledonare Hildebrandt(1972) +(0,1)Kin
Diferite surse White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin Mehra & Sachdeva
+(1)GA3 + 15% CM (1979)
Mangifera indica Seminţe imature Litz et al (1984) 5,7 30 8 (2)2,4-D Litz et al, (1984b)
Musa cavendishii Calus Murashige & Skoog 30 0 (5)IBA Ma et al (1978)
(1962)
Musa spp, Fragmente Linsmaier & Skoog 5,6 30 3 (20)Dicamba Jarret et al (1985b)
frunze (1965)
Olea europaea Calus Lavee (1963)21-MW 6,6 20 10 (2)AIA+suc de piersici Lavee (1963)
Persica vulgaris Mezocarp Bradley & Dahmen 6,5 20 8 Bradley&Dahmen
(1972) (1972)
Internod Murashige & Skoog 5,6- 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
(1962) 5,8
Phoenix Calus Linsmaier&Skoog 5,7 30 8 (3)2iP +(40)AdS Tisserat et al (1979)
dactylifera (1965)
Prunus domestica Internod Murashige & Skoog 5,6- 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
(1962) 5,8
Pyrus communis Internod Murashige & Skoog 5,6- 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
(1962) 5,8
Seminţe Schenk & Hildebrandt 5,9 30 6 (0,5)2,4-D+(2)CPA Schenk &
(1972) +(0,1)Kin Hildebrandt (1972)
Phoenix Ţesut medular Eeuwens (1976)Y3 5,5 45 agar (0,022)2,4-D+(0,05)Kin Eeuwens (1976)
dactylifera +(0,22)GA3
Ribes nigrum Ţesut medular Harvey (1967)Basal 6 30 10 (0,15)2,4-D+(1)Kin Harvey&Grasham (1977)

224
Tabelul 11.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Theobroma cacao Pericarp Dublin (1984) 30 agar (0,5-1)2,4-D+[(1)BAP Dublin (1984)
sau Z]
Hipocotil Hall & Collin (1975) 5,7 30 10 (2)AIA+(2)IBA+(0,1)K Hall & Collin
in +10%CM (1975)
Hipocotil Jalal & Collin (1979) 5,7 30 10 (1)IBA+(0,05)Z Jalal & Collin
(1979)
Fragmente Maraffa & Sharp 5,5 30 10 2,4-D Maraffa & Sharp
frunze (1979) (1979)
Cotiledon Gamborg et al (1968) 5,5 20 7 (1)2,4-D+(0,2)Kin Tsai & Kinsella
B5 a:G (1981)
Calus Murashige & Skoog 5,7 30 7 (1)2,4-D+10%CM Tsai & Kinsella
(1962) (1981)

Tabelul 11.3.
Cercetări privind cultura de calus la arborii şi arbuştii ornamentali
Denumirea Zaharoză Agar Regulatori de creştere
Explant Mediul de cultură pH Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8
Acer negundo Calus Radojevic et al (1980) 20 6 (3)ANA + (1)Kin + Radojevic et al
(2)Ad (1980)
Acer Ţesut cambial Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6)2,4-D+10-40%CM Lamport (1964)
pseudoplatanus Cambiu Sunderland (1966) 5,4 20 agar (0,1)ANA+10%CM Sunderland (1966)
Calus Sunderland (1966) 5,4 20 agar [(1)2,4-D sau Sunderland (1966)
(10)ANA] +10%CM
Acer rubrum Cambium 0,5 x Linsmaier&Skoog (1965) 5,6 20 Agar (5)AIA + (0,2)Kin Mathes et al (1973)
Betula pendula Fragmente Simola (1985)N7 Supl 5,6 20 6 [(2)2,4-D+(0,5)Kin] sau Simola (1985)
frunză [(5)2,4-D+(1)Kin]
Calus Simola (1985)N7 5,6 20 6 [(2)2,4-D / ANA] + Simola (1985)
(0,5)Kin

225
Tabelul 11.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Betula verrucosa Cambiu Jacquiot (1955) 30 agar (1)ANA Jacquiot (1955)
Crataegus x Internod Murashige&Skoog (1962) 5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D + (0,2)Kin Coffin et al (1976)
mordensis
Fraxinus Ţesut medular Reinert & White (1956) 5,6-5,8 30 10 (0,05)2,4-D + (1)Kin Wolter&Skoog(1966)
pennsylvanica Calus Wolter & Skoog (1966) 5,6- 30 10 (0,04)2,4-D + (1)Kin Wolter & Skoog
Standard 5,8 (1966)
Gingko biloba Calus Tulecke (1964) 5,5 20 10 (1)ANA + (0,5)Kin + Tulecke (1964)
(10)AdS
Hedera helix Ţesut medular Murashige&Skoog(1962) 5,7 30 5 (2)ANA + (0,5)BAP Banks (1979)
Ţesut medular Stoutemyer & Britt 5,6 20 8 (1)ANA + 10%CM Stoutemyer & Britt
(1965) (1965)
Picea abies Ţesut medular Harvey & Grasham 10 glucoza 8 (0,5) AIA + (0,5) Kin Harvey & Grasham
(1969) 1 (1969)
Picea glauca Ţesut De Torok & Thimann 5,6 20 agar De Torok &
(1961) Thimann (1961)
Hipocotil Durzan et al (1973) 35 5 (2,5) ANA + (1) Kin Durzan et al (1973)
Picea pungens Ţesut medular Harvey & Grasham 10 glucoza 8 (0,5) AIA + (0,5) Kin Harvey & Grasham
(1969) 1 (1969)
Pinus nigra Ţesut medular Harvey & Grasham 10 glucoza 8 (1) ANA + (0,5) Kin Harvey & Grasham
(1969) 1 (1969)
Pinus strobus Lăstari Kasperbauer & Reinert 6 20 6 (0,2) ANA + (2) BAP Kaul (1986)
(1967)
Calus Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (0,1) 2,4 –D + (0,1) Z Minocha (1980)
Pseudotsuga Cotiledoane Cheng (1977; 1978) 5,5 30 6 (0,9) ANA + (1,13) BAP Cheah & Cheng
menziesii (1978)
Rosa sp. Ţesut medular Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6) 2,4-D + 10-40% Lamport (1964)
CM
Syringa vulgaris Cambiu Wetmore&Sorokin(1955) 5,5 40 8 (1) 2,4-D + 15% CM Wetmore&Rier(1963)

226
Tabelul 11.3. continuare

1 2 3 4 5 6 7 8
Thuja plicata Ţesut medular Harvey & Grasham 25 glucoza 8 (1) ANA Harvey & Grasham
(1969)3 (1969)
Vinca rosea Ţesut din Schenk & Hildebrandt 5,9 30 6 (0,5) 2,4-D + (2) CPA Schenk &
sămânţă (1972) + (0,1) Kin Hildebrandt (1972)

Tabelul 11.4.
Cercetări privind cultura de calus la viţa de vie
Regulatori de
Denumirea Zaharoză Agar
Explant iniţial Rezultatul Mediu pH creştere Autori
speciei (g/l) (g/l)
(mg/l)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis vinifera Antere Calus Gresshoff & Doy 5,8 20 8 (2)ANA+(2)AIA+
(1974)1 (1,5)Kin
Vitis vinifera Lăstari tineri Calus Jona & Webb 5,7- 20 3-5,5 (1)ANA+(0,2)Kin Jona & Webb
sau peţiol (1979)C 5,8 (1979
Vitis vinifera Frunze Calus Gamborg (1966) 5,5 20 agar (0,1)ANA+(0,2)Kin+ Lai & Yye (1980)
PRL-4-C 15%CM
Vitis vinifera Calus Lăstărire Gamborg (1966) 5,5 20 agar (0,1)ANA+(0,2)Kin+ Lai & Yye (1980)
PRL-4-C 15%CM
Vitis vinifera Ovule Calus Mullins & Srinivasan 5,6 20 0 (2,8)CPA + 10-15% Mullins &
(1976) HDVM CM Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Ovule Calus Mullins&Srinivasan(1 5,6 20 0 (1,1)BAP Mullins &
976)N Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Calus Calus Mullins&Srinivasan 5,6 20 0 (1)NOA+(1,1)BAP Mullins &
embriogen (1976)N Srinivasan (1976)
Vitis vinifera x Antere Calus Bourgin & Nitsch 20 0 (1,11)2,4-D + Rajakeran &
Vitis rupestris (18670 H (0,225)BAP Mullins (1979)

227
11.2. Cultura de protoplaşti şi hibridarea somatică
Protoplaştii sunt celule lipsite de peretele celular, care au capacitatea de a fuziona, de a
se divide în continuare şi de a da naştere la plante noi.
Hibridarea somatică, cunoscută sub numele de hibridare parasexuată, constă din
fuzionarea (contopirea) a doi protoplaşti realizată prin contopirea nucleilor şi citoplasmei
acestora.
Celula obţinută este un hibrid somatic şi ea poate da naştere unei plante întregi.
În anumite situaţii, schimbul de material genetic este parţial. Se poate întâmpla ca în
urma fuziunii protoplaştilor nucleii să nu fuzioneze şi să se realizeze numai o hibridare a
citoplasmei. În acest caz vorbim de hibridare citoplasmatică, plantele obţinute fiind numite
hibrizi citoplasmatici sau cibrizi.
Realizarea unor astfel de hibrizi este importantă pentru transmiterea unor caractere
controlate de ereditate citoplasmatică. Este cazul transmiterii sterilităţii mascule care este
controlată de gene existente în mitocondrii.
Etapele hibridării somatice (Pierik, 1987):
1- Alegerea şi creşterea materialului iniţial.
Alegerea genotipurilor este esenţială întrucât nu toate se comportă la fel. Astfel la
tomate, Evans şi Bravon,1983 a, au obţinut rezultate pozitive cu un singur genotip din cele 14
încercate.
Condiţiile de creştere a materialului vegetal sunt şi ele importante. Se recomandă ca
ultimele faze de creştere să se desfăşoare în condiţii controlate (seră, fitotron, etc.) pentru a
oferi plantelor condiţii optime (Evans şi Bravon 1983 a).
Se preferă folosirea materialului vegetal cultivat in vitro care, pe lângă juvenilitate,
prezintă avantajul că nu trebuie sterilizat.
Cel mai frecvent, pentru obţinerea protoplaştilor se foloseşte mezofilul frunzei.
Alte organe folosite pentru izolarea protoplaştilor sunt vârfurile de lăstari (Binding şi
colab., 1981), puieţii în primele faze de creştere, cotiledoanele şi hipocotile (Potrykus şi
colab., 1983).
Datorită instabilităţii genetice, calusul sau suspensiile celulare sunt mai puţin folosite.
2. Dezinfectarea materialului vegetal se face urmărind tehnica şi metodologia folosită
la iniţierea culturilor in vitro.
Datorită faptului că ţesuturile folosite sunt juvenile, trebuie acordată o atenţie
deosebită timpilor şi concentraţiilor folosite pentru a nu afecta viabilitatea celulelor.

228
Din acest punct de vedere, tratamentele aplicate mezofilului trebuie să fie cât se poate
de "blânde".
3. Izolarea protoplaştilor se face prin macerarea enzimatică a peretelui celular.
De regulă, se foloseşte un amestec de enzime ca celuloza, pectinoza şi uneori
hemiceluloza. Aceste enzime dizolvă celuloza, pectina (lamela mediană) şi stratul de
hemiceluloză. În urma procesului de macerare celula rămâne doar cu plasmalema intactă.
În timpul tratamentului enzimatic trebuie asigurată în soluţie o presiune osmotică
superioară pentru a preveni plasmoliza celulelor. Acest lucru este realizat prin adăugarea de
glucoză, manitol şi sorbitol.
Datorită efectului negativ al agenţilor osmotici asupra protoplaştilor, durata
tratamentului enzimatic trebuie redusă la minimum posibil.
Macerarea enzimatică a celulelor se efectuează de regulă la întuneric, fiind importante
şi celelalte condiţii de lucru: temperatură, pH, viteza de agitare etc.
După obţinerea protoplaştilor aceştia se purifică prin filtrare prin site metalice sau de
nylon pentru înlăturarea impurităţilor de tipul pereţilor celulari etc.
Urmează apoi o centrifugare la turaţie redusă într-o soluţie cu zaharoză (15-20%)
pentru a separa protoplaştii.
4. Fuziunea protoplaştilor se realizează prin inoculare într-o soluţie concentrată de
polietilenglicol (PEG), care are şi o mare concentraţie de ioni de Ca2+ şi un pH ridicat
(Menczel, 1983).
Acest tratament are ca scop înlăturarea sarcinii negative a protoplaştilor. După
realizarea fuziunii polietilenglicolul şi ioni de Ca2+ sunt spălaţi.
Zimmermann (1982) a propus şi realizat electrofuziunea protoplaştilor (fuziunea într-
un câmp electric), această tehnică determinând creşterea viabilităţii lor.
Kameya (1984) a realizat, în schimb, fuziunea protoplaştilor prin folosirea dextranului
şi a stimulării electrice.
După fuzionarea protoplaştilor are loc fuzionarea nucleilor.
Atunci când se urmăreşte fuzionarea protoplaştilor proveniţi de la două genotipuri
diverse A şi B, apare problema selecţiei hibrizilor somatici din suspensia celulară.
În populaţia de celule vor fi întâlniţi protoplaşti nefuzionaţi A, B, celule AA, BB
(monocarion) şi hibrizi somatici AB (heterocarion) care trebuie selectaţi.
Hibridarea somatică s-a realizat cu succes la plante din familia Solanaceae.
Un aspect interesant îl reprezintă hibridarea somatică interspecifică şi mai ales,
intergenerică.
229
Au fost astfel realizaţi hibrizi între Solanum tuberosum şi Lycospersicon esculentum,
sau între Brassica şi Arabidopsis, între Daucus şi Aegopodium podagraria (Vasil 1978,
Thomas şi colab. 1979)
Frecvent însă hibrizii realizaţi sunt inutilizabili, fiind sterili.
Cercetările continuă pentru obţinerea unor hibrizi utili din punct de vedere agronomic
la un număr de specii, vărzoase, lucernă, tomate, cartof, trifoi, morcov, tutun, petunii etc.
5. Cultura protoplaştilor, regenerarea peretelui celular, diviziunea celulară
Cultura de protoplaşti presupune asigurarea unor condiţii deosebite.
Astfel, în timpul regenerării peretelui celular potenţialul osmotic al mediului de
cultură trebuie să fie redus şi concentraţia ionilor de Ca2+ ridicată. După regenerarea peretelui
celular (câteva zile) potenţialul osmotic trebuie să crească treptat (Burgess, 1983).
După 2-7 zile de la izolarea protoplaştilor, are loc prima diviziune celulară.
Cultura de protoplaşti se poate realiza în diferite moduri:
- într-un strat subţire de mediu lichid, în vase Petri;
- pe mediu solid după tehnica Bergmann (1960);
- în microcamere de sticlă;
- în picături de mediu lichid (metoda micropicăturii) în vase Petri;
- cultura în “creşă” (“nurse culture) - protoplaştii sunt crescuţi pe o punte de hârtie
de filtru sau celofan aşezate pe un strat de celule “mamă”.
- cultura în dublu strat lichid + solid
- cultura pe pat de agar şi discuri de agar (Shillito şi colab., 1983; Dons şi Bouwer,
1986).
După formarea peretelui celular condiţiile de creştere sunt similare celor folosite la
cultura de celule izolate, atât în ceea ce priveşte compoziţia mediului de cultură cât şi factorii
de creştere.
Cele mai bune condiţii de creştere a protoplaştilor se realizează la întuneric sau lumină
de slabă intensitate.
După formarea aglomerărilor de celule (microcalus) se trece la faza următoare, de
regenerare a noilor plante.
6. Regenerarea de noi plante
Posibilitatea regenerării de noi plante este încă redusă (Evans şi Bravo, 1983; Binding
şi colab., 1982).
Acest lucru a fost posibil până în 1983 la 66 de specii din care 38, sunt din Familia
Solanaceae.
230
Factorii de care depinde regenerarea sunt:
- familia, specia şi genotipul;
- nivelul de diferenţiere a materialului iniţial;
- condiţiile de creştere a materialului iniţial;
- folosirea mediilor de cultură bogate: Kao şi Michayluk pentru calus (1975), B5,
suplimentat cu 5-10% lapte de cocos, pentru embrioni şi organe (Gamborg şi colab., 1982) şi
MS (Murashige & Skoog, 1962).
Avantajele hibridării somatice sunt multiple:
- realizarea tetraploizilor, a amfidiploizilor şi fuzionarea protoplaştilor haploizi;
- hibrizi la plante cu probleme sexuale: organe incomplet/ insuficient dezvoltate,
sterilitate masculină etc.
- hibridare între plante juvenile înainte de primul înflorit;
- hibridare parţială pentru obţinerea hibrizilor asimetrici la care nu toţi cromozomii
se combină după fuziunea nucleară.
- realizarea transmiterii caracterelor citoplasmatice de la partenerul mascul –
ereditatea citoplasmatică – hibrizi citoplasmatici – sterilitate masculină, rezistenţă la boli şi
erbicide etc.
Problemele şi dezavantajele hibridării somatice sunt redate în continuare:
- lipsa unei metode eficiente de selecţie a hibrizilor somatici;
- produşii obţinuţi sunt frecvent necorespunzători, neviabili, sterili, instabili etc.
- poate apărea formarea unui calus himeric în locul plantelor;
- apar amfidiploizi, care de regulă sunt nedoriţi (4n);
- produşii obţinuţi au o variabilitate accentuată;
- nu se poate asigura transmiterea unui caracter dorit, datorită stabilităţii genetice reduse;
- frecvent, la combinaţii necompatibile, apare eliminarea cromozomilor străini;
- producţia de cibrizi este încă slab dezvoltată;

231
11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singură celulă
După izolarea unor celule, s-a pus problema stimulării fiecăreia dintre ele de a se
divide şi eventual de a da naştere unor lăstari sau plante întregi.
Primele rezultate pozitive au fost obţinute de Muir şi colab. (1954, 1958) care au
cultivat o celulă pe o punte din hârtie de filtru, care a fost aşezată apoi pe o bucată de calus
din care celula respectivă a provenit.
Extrăgând substanţele hormonale şi nutritive formate de calus prin puntea de filtru,
celula a început să crească şi să se dividă.
Bergmann (1960), după ce a filtrat o suspensie de celule de tutun şi mazăre, le-a
amestecat într-un mediu de cultură cu agar care era pe cale să se solidifice.
După dispersarea celulelor şi întărirea mediului de cultură, acestea au început
diviziunea şi formarea calusului. Pentru stimularea proliferării la acea dată se folosea 2,4 D şi
laptele de cocos.
Alte încercări reuşite de inducere şi de realizare a diviziunii unor celule izolate au
constat în cultivarea unor celule în micro-camere pe agar în vecinătatea unor "celule-mamă"
de calus (Strat, 1973).
Pentru obţinerea celulelor izolate există mai multe metode:
- filtrarea suspensiilor celulare prin site din diferite materiale;
- dezintegrarea calusului pe cale mecanică sau chimică prin adăugarea de pectinoză;
- macerarea peretelui celular cu ajutorul unor enzime, urmată de separarea protoplaştilor.
Ulterior aceştia îşi refac membrana celulară şi încep diviziunea;
- folosirea grăunciorilor de polen pentru obţinerea unor celule izolate;
- centrifugarea suspensiilor de celule şi separarea acestora pe baza diferenţelor de masă etc.
Obţinerea unei culturi monocelulare este dependentă de: genotip, densitatea celulară,
rata diviziunii celulare în material iniţial, vârsta materialului iniţial, prezenţa calusului iniţial,
compoziţia mediului de cultură (Pierik, 1987).
După separarea celulelor, fiecare dintre ele se divid formând calus din care vor lua
naştere apoi lăstarii sau embrionii somatici.
Culturile monocelulare au fost realizate cu succes la Nicotiana tabacum, Daucus
carota, Cichorium endivia, Asparagus officinalis, Brassica napus, Citrus sinensis, etc.

232
Capitolul 12
Baby plant

12.1. Consideraţii generale


O aplicaţie comercială a culturilor in vitro, destul de răspândită după anii 80’, este
baby plant. Acest nou produs se obţine prin cultivarea unor specii horticole pe medii
colorate în vase din sticlă decorative. Astfel realizat, este destinat valorificării ca obiect
decorativ care poate „trăi” 6- 12 luni sau chiar mai mult.
În momentul în care explantele au ocupat volumul interior al vasului în care au
crescut şi mediul de cultură s-a epuizat, acestea se pot scoate în condiţii in vivo, se pot
aclimatiza şi trece la ghivece.
Crearea de baby plants a fost posibilă prin îmbinarea tehnicilor de microînmulţire,
cu diverse modele de sticlărie şi medii colorate. La baza acestor combinaţii stă bunul gust,
imaginaţia şi plăcerea de a crea frumosul.
Produsele Baby plant pot înfrumuseţa orice spaţiu interior, conferind prospeţime şi
culoare. Ele pot fi aşezate pe mobila din sufragerie, pe consola din baie, pe noptiera din
dormitor, pe birou sau în apropierea unei ferestre.
Când sticluţele cu baby plant sunt comercializate, ele sunt întotdeauna însoţite de
câteva sfaturi practice de întreţinere:
- niciodată să nu se îndepărteze dopul;
- sticluţele nu se expun direct la soare;
- se evită răsturnarea sau agitarea recipientului;
- se ţin la distanţă de orice sursă de căldură.
Pentru realizarea produselor baby plant se folosesc plante care în principiu, trebuie
să răspundă la următoarele cerinţe:
- să fie decorative;
- să aibă creştere redusă în timp pentru a nu ocupa rapid vasul de prezentare;
- să aibă talii asemănătoare;
- să aibă cerinţe asemănătoare faţă de mediul de cultură şi, în general să nu fie mari
consumatoare de substanţe nutritive;
- să nu-şi modifice aspectul la cultivarea pe medii colorate;

233
- să nu aibă cerinţe deosebite faţă de factorii de mediu şi să crească bine la
temperatura camerei;
- să se aclimatizeze uşor;
Dintre speciile cele mai folosite pentru realizarea de produse baby plant amintim:
Syngonium, Phylodendron, Vriestea, Spathiphylium, Aechemea, Cordyline, cactuşi şi alte
specii de suculente etc.

12.2. Tipuri de produse şi materiale folosite la producerea de baby plant


12.2.1. Vase din sticlă
Varietatea gamei de modele şi dimensiuni de vase în care se pot realiza baby plants
este impresionantă. În această situaţie, cel mai important rol îl joacă imaginaţia fiecăruia.
Se pot folosi vase de laborator de tip Erlenmeyer (100 ml), sticlărie destinată ambalării
produselor alimentare (50ml,150ml, 250ml, 400ml), sticluţe de parfum, vase pentru
servirea vinului, bomboniere, vase din cristal, etc.
Detaliind departamentul formelor recipientelor, putem vorbi despre vase cilindrice,
conice, tronconice, rotunde, pătrate, piramidale, prismatice, hexagonale, octogonale, de tip
pară, turtite, bombate, cu sau fără mâner, cu gât lung sau scurt, cu deschidere mai mult sau
mai puţin largă, etc. Recipiente aparent banale, pot căpăta o imagine deosebită folosindu-le
pentru baby plant.
În funcţie de ocazia cu care sunt oferite produsele baby plants se pot alege forme
adecvate ale vaselor. De exemplu, pentru perioada Crăciunului există recipiente cu forma
unui brad sau a unui sfeşnic.
Este foarte important ca sticla să fie albă şi perfect transpsrentă pentru a nu
împiedica în nici un fel captarea luminii şi pentru a nu îngreuna vizibilitatea către
interiorul vasului.
Dimensiunea recipientului se corelează cu specia pentru a asigura acesteia spaţiul
necesar dezvoltării timp de mai multe luni.
12.2.2. Alte materiale
Deoarece produsele baby plant se realizează în condiţii aseptice, trebuie alese
materiale cu care putem realiza acest lucru. Se pot utiliza dopuri de plastic, sticlă, cauciuc
sau plută, capace metalice sau de plastic, iar pentru izolare silicon transparent, folie pentru
alimente, chip band sau bandă izolatoare.

234
Pentru a conferii produselor o valoare estetică deosebită se folosesc accesorii
adecvate fiecărei ocazii, de exemplu: panglici şi şnururi de diferite culori, dimensiuni şi
combinaţii, hârtie creponată sau pânză, ciucuri, flori artificiale şi multe altele în funcţie de
imaginaţia fiecăruia.

12.3. Folosirea mediilor de cultură colorate


Pentru colorarea mediilor de cultură, se pot folosi mai multe tipuri de substanţe care
trebuie să răspundă la următoarele cerinţe:
- să nu fie toxice pentru plante;
- să nu determine colorarea ţesuturilor plantelor;
- să nu formeze compuşi toxici, prin descompunere sau prin reacţie cu celelalte
componente ale mediului;
- să fi stabile şi să nu se decoloreze prin autoclavare;
- să-şi păstreze culoarea în timp, în condiţii de iluminare naturală şi artificială.
În general este recomandat să se folosească coloranţi alimentari. În acelaşi timp, se
pot folosi coloranţi naturali, dar trebuie testată în prealabil persistenţa culorii în timp şi
influenţa asupra explantelor (Groza I., 2004).
În tabelul 12.1. şi graficul aferent, este ilustrată influenţa tipului de colorant asupra
ratei de multiplicare şi creşterii lăstarilor de Sequoia sempervirens, după o lună de cultură
pe mediu colorat.

235
Tabelul 12.1.
Comportarea explantelor de Sequoia sempervirens
pe medii de cultură colorate

Culoarea Cantitate/ Rata de Lungimea


mediului Colorantul 100 ml mediu multiplicare lăstarilor (cm)
colorant
albastră alimentar praf 0,02 g 11,00 2,95
colorant
galbenă alimentar lichid 1 ml 16,00 5,91
amestec colorant
violetă albastru şi roşu 0,01 g+0,01 g 15,20 5,47
amestec colorant
verde albastru şi galben 0,01 g+0,01 g 8,00 6,46
colorant
roşie alimentar praf 0,02 g 7,80 3,35
]

S-a observat că pe mediile de cultură colorate mai închis este stimulată formarea şi
creşterea rădăcinilor.

236
a b

c
Foto 12.1. Testarea culorilor şi unor specii de plante:
a – Gasteria sp. b - Sequoia sempervirens, c - Drosera rotundifolia

237
a

b
Foto 12.2. Produse baby plant pregătite pentru livrare

238
Bibliografie selectivă

Al-Abta S. & Collin H.A. – Control of embryoid development in tissue culture of celery.
Plant Sci. Lett. 16. 773-782, 1978
Austin S. & Cassells A.C. – Variation between plants regenerated from individual calli
produced from separated potato stem callus cells. Plant Sci. Lett. 31, 107-114, 1983.
Aziz H.A. & Mccown B.H. – Hormonal response curves of shoot and callus culture of
cucumber (Cucumis sativus L.). Hortscience 20, 540, 1985
Bagga S., Bhalla-Sarin N., Sopory S.K. & Guha-Mukhrenjee S. – Comparison of in vitro
plant formation from somatic tissue and pollen grains in Brassica olearacea var.
botrytis. Phytomorph. 32, 152-156, 1982
Barba, M., Cupidi, A. - Il microinnesto del ciliegio e del pesco in vitro studio sull' idoneità dei
portinnesti. Frutticoltura 5, p: 37-41, 1989.
Barba, M., Cupidi, A., Ammirabile A. -Uso del microinnesto in vitro per il risanamento del
mandorlo. Frutticoltura 3, p:73-75, 1990.
Behki C., R.M. &Lesley S.M. – Shoot regeneration from leaf callus of Lycopersicon
esculentum. Pflanzenphysiol. 90,83-87, 1980
Bigot C, Ohki S. & Mousseau J. – Experimental data for a strategy for the improvement of the
shoot forming capacity in vitro. Acta Hort. 78, 125-132, 1977
Blackmon W.J., Reynolds B.D. – In vitro shoot regeneration of Hibiscus acetosella,
muskmelon, watermenlon and winged bean. Horscience 17, 588-589, 1982
Blackmon W.J., Reynolds B.D. & Postek C.E. – Production of somatic embryo from callused
cantaloupe hypocotyl explants. Hortscience 16, 451,1981b
Bloksberg L.N. & Saltveit M.E. – Regenerating plants from axillary buds of field-grown
iceberg lettuce hearts. HortScience 20, 540, 1985
Bonner J. – On the growth factor requirements of isolated tomato roots. Bull. Torrey Bot.
Club 70 184-189, 1940B
Bonner J. & Axtman G. – The growth of plant embryos i vitro. Preliminary experiments on
the role of accessory substances. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 23, 453-457, 1937
Bonner J. & Bonner D. – Ascorbic acid and the growth of plant embryos. Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. 24, 70-75, 1938
Bragdo – Aas M. – Regeneration of plants from, callus of potato tubers. Acta Hort. 78, 133-
137, 1977

239
Brezeanu A., Roşu Ana, Mirancea D., Iordan M. (1983) - "Modificarea genetică a plantelor cu
ajutorul protoplaştilor-perspective şi limite". În: Lucr.celui de al II-lea Simp.Naţ. Cult.
Tes. Veg. Piteşti, p. 61-64.
Browers M.A. & Orton T.J. – A factorial study of chromosome variability in callus cultures
of celery (Apium graveolens). Plant Sci. Lett. 26, 65-73, 1982
Brown D.M. & Charlwood B.V. – The control of callus formation and differentiation in
scented pelargoniums. J. Plant Physiol. 123 409-417, 1986
Bui Dang Ha D., Norreel B. & Masset T.A. – Regeneration of Asparagus officinalis L.
through callus cultures derived from protoplasts. J. Exp. Bot. 26, 263-270, 1975
Butcher D.N. & Ingram D.S. – Plant Tissue Culture. Inst. of Biology, Studies in Biology no
65. Edward Arnold, 1976
Cachiţă-Cosma, Dorina - Metode in vitro la plantele de cultură - baze teoretice şi practice.
Editura Ceres, Bucureşti, 1987.
Cachiţă-Cosma, Dorina, Petrescu C. - Curs practic de culturi de ţesuturi in vitro cu aplicaţii în
legumicultură şi floricultură. I.A.N.B., Atelierul de multiplicat cursuri, Bucureşti,
1985.
Caplin S.M. & Steward F.C. – Effect of coconut milk on the growth of explants from carrot
root. Science 108, 688-657, 1948
Capuano G., Piccioni E., Standardi A. – Effect of different treatments on the conversion of
M.26 apple rootstock synthetic seeds obtained from encapsulated apical and axillary
micropropagated buds. Journal of Horticulture Science and Biotechnology, 73 (3),
299-305, 1998
Carswell G.K. & Locy R.D. – Root and shoot initiation by leaf, stem and storage root
explants of Sweet potato. Plant Cell Tiss. Organ Cult.3, 299-236, 1984
Cepoiu, N.; Stănică, FI.; Dumitraş, D.; Ioniţă-Mânzatu, Mirela; Mihăila, Mariana; Cornea,
Cornelia - Carbon Dioxide Laser, as work technique in fruit tree biotechnology -
poster. 2nd International Symposium Biotehnos, "Biotechnology now& tomorow"
Lucrări, Volumul II, SP III, 1 pag., 29-30 septembrie, Bucureşti 1994.
Chin C.K., Haas J.C. & Still C.C. – Growth and sugar uptake of excised root and callus of
tomato. Plant Sci. Lett. 21, 229-234, 1981
Crisp P. & Walkey D.G.A. – The use od aseptic meristem culture in cauliflower breeding.
Euphytica 23, 305-313, 1974

240
Crocomoco O.J., Sharp W.R. & Peters J.E. – Plant morphogenesis and the control of callus
growth and root induction of Phaseolus vulgaris with the addition of bean seed
extract. Z. Pflanzenphysiol. 78, 456-460, 1976
Cupidi, A., Barba, M. - Produzione di materiale virus-essente esperienze di microinnesto in
vitro. Frutticoltura 5, p: 25-28, 1988.
Diaconescu Oana - Studiul influenţei factorilor ecologici şi a tehnologiei de cultură asupra
calităţii andivelor, Lucrare de dizertaţie, U.S.A.M.V.B., Facultatea de Horticultură,
2002
Diaconescu Oana, - The influence of culture medium on in vitro clonal regeneration on
witloof chicory (Cichorium intybus L.), Lucrări ştiinţifice U.S.A.M.V.B. Seria B, vol.
XLVI, 2003
Diaconescu Oana, Petrescu C. - Influenţa mediului de cultură asupra ratei de multiplicare in
vitro la cicoare (Cichorium intybus L.). Sesiunea ştiinţifică a Facultăţii de
Horticultură, Iaşi, 2003
Diaconescu Oana, Petrescu C. - Research regarding the in vitro germination of some chicory
hybrids (Cichorium intybus L.), Lucrări ştiinţifice U.S.A.M.V.B. Seria B, vol. XLV,
2002
Dietert M.F., Barron S.A. & Yoder O.C. – Effects of genotype on in vitro culture in the genus
Brassica. Plant Sci. Lett. 26, 233-240, 1982
Dodds J.H. & Roberts L.W. – Experiments in plant tissue culture. Cambridge University
Press, Cambridge, London, New York, 1982
Doerschung M.R. & Miller C.O. – Chemical control of adventious organ formation in
Lactuca sativa explants. Am. J. Bot. 54, 410-413, 1967
Doré C. – Production de plantes homoyigotes mâles et jemelles à partir d’anthère d’asperge,
cultivées in vitro (Asparagus officinalis). Compt. Rend. Acad. Sci. Paris 278D, 2135-
2138, 1974
Dumas De Vaulx R., Chambonnet D. & Pochard E. – Culture in vitro d’anthère de piment
(Capsicum annuum L.) : amélioration des taux d’obtention de plantes chez différents
génotipes des traitments à +35°C. Agronomie 1, 859-864, 1981
Dumitraşcu, Monica; Stănică, Fl.; Ion, Ligia. - Cercetări privind stabilirea protocolului de
înmulţire in vitro a embrionilor imaturi la hibrizi interspecifici din genul Prunus.
Lucrările celui de-al VII-lea Simpozion Naţional de Culturi de Ţesuturi şi Celule
Vegetale, 58-62, Arad, 1997.

241
Dunstan D.I. & Short K.C. – In vitro studies on organogenesis and growth in Allium cepa
tissue cultures. Acta Hort. 78, 139-148, 1977b
Eenik A.H. – Preliminary results of research on storage and in vitro germination of lettuce
pollen as an aid in lettuce breeding. Euphytica 32, 521-526, 1983
Elliot R.F. – Growth of excised meristem-tips of Rumara, Ipomoea batatas (Linn.) Poir in
axenic culture N.Z.J. Bot. 7, 158-166, 1969
Enescu, V., Ioniţă, Lucia, Palada-Nicolau, Magdalena - Înmulţirea vegetativă a arborilor
forestieri. Editura Ceres, Bucureşti, 1994.
Engler D.E. & Grogan R.G. – Isolation, culture and regeneration of lettuce leaf mesophyll
protoplasts. Plant Sci. Lett. 28, 223-229, 1983
Falcinelli M., Standardi A., Piccioni E. – Il seme sintetico nelle piante agrarie: stato attuale
della ricerca. Riv. Sementi elette, XLII, nr. 1, 1997
Famiani, F., Ferradini, N., Standardi, A., Hoza, D. and Stănică, Fl. - In vitro regeneration of
different Actinidia species Acta Horticulturae No. 444, ISBN 9066058099 pp 133-138,
1997
Famiani, F.; Ferradini, N.; Hoza, D.; Standardi, A.; Stănică, Fl. - In vitro regeneration of
different Actinidia species. Proceedings of the III-Rd International Symposium on
Kiwifruit, Tessaloniki, 19-22 September 1995.
Ferradini, Nicoletta; Famiani, F.; Proietti, P.; Stănică, Fl. - Influence of growth regulators and
light on in vitro regeneration in M.26 apple rootstock. Journal of Horticultural Science
71 (5), 859-865, 1996.
Fridborg G., Pedersen M., Landstrom M. & Eriksson T. – The effect of inhibiting
morphogenesis. Physiol. Plant. 43, 104-106, 1978
Fukami T. & Hildebrandt A.C. – Growth and chlorophyll formation in edible green plant
callus tissues in vitro on media with limitated sugar supplements. Bot. Mag.: Tokyo
80, 199-212, 1967
Gâlă Ruxandra, Stănică Fl., Diaconescu Oana - Cercetări privind iniţierea culturii in vitro de
Clematis vitalba, Lucrări ştiinţifice, Facultatea de Horticultură, UŞAMV Iaşi, 2003
Gâlă Ruxandra, Velcea M., Stănică Fl., Diaconescu Oana - Influenţa apei Pi asupra înmulţirii
in vitro a smochinului (Ficus carica L.), Simpozionul internaţional „Apa un miracol”
Ediţia a III a, Bucureşti 25-26 iunie, pp. 24-25, 2003
Gamborg O.L., Philips G.C. – Plant Cell, Tissue and Organ Culture – fundamental methods.
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1995

242
Gardi T., Piccioni E., Standardi A. - Effect of bead nutrient composition on regrowth of stored
vitro-derived encapsulated microcutting of diferent woody species, J.
Microencapsulation, vol. 16, nr. 1, 13-25, 1999;
Gavinlertvatana P. & Li P.H. – The influence of 2,4 D and kinetin on leaf callus formation in
different potato species. Potato Res. 23, 115-120
George E.F., Puttock D.J.M., George H.J – Plant Culture Media: Vol 1, Formulation and uses.
Exegetics Limited, Edington, 1987
George L. & Narayanaswamy S. – Haploid Capsicum through experimental androgenesis.
Protoplasma 78, 467-470, 1973
Gleddie S., Keller W. & Setterfield G. – In vitro morphogenesis from tissue, cells and
protoplasts of Solanum melongena L. Pp 139-140 in Fujiwara (ed), 1982
Goodwin P.B. – An improved medium for the rapid growth of isolated potato buds. J. Exp.
Bot 17, 590-595, 1966
Gresshoff P.M. & Doy C.H. – Development and differentiation of haploid Lycopersicon
esculentum (Tomato). Planta 107, 161-170, 1972b.
Griga M., Tejklova E., Novak F.J. & Kubalakova M. – In vitro clonal propagation of Pisum
sativum L. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 6, 95-104, 1986
Grigore, Ana; Stănică, Fl. - Stabilirea metodologiei de microînmulţire a unor specii şi hibrizi
din genul Actinidia. Simpozionul omagial dedicat semicentenarului Universităţii de
Ştiinţe Agricole a Banatului din Timişoara, 1-3 iunie 1995.
Groza, Ioana, Stănică, Fl. - In vitro propagation of BA 29 quince rootstock, Abstracts 4th
International Symposium Biotehnos, Biotechnology now&tomorow, Bucureşti, 26-27
Sept, SP 48/130, pp XLVIII-XLIX, 1996.
Groza Ioana Camelia, - Baby plant, o nouă modalitate de promovare a culturilor in vitro la
plantele horticole. Lucrare de diplomă, UŞAMV Bucureşti, Facultatea de Horticultură,
2004.
Guha S. & Johri B.M. – In vitro development of ovary and ovule of Allium cepa L.
Phytomorph. 16, 353-364, 1966
Gunay A.L. & Rao P.S. – In vitro plant regeneration from hypocotyls and cotyledon explants
of red pepper. Plant Sci. Lett. 11, 365-372, 1978
Gunay A.L. & Rao P.S. – In vitro propagation of hybrid tomato plants (Licopersicon
esculentum) using hypocotyls and cotyledon explants. Ann. Bot. 45, 205-207, 1980
Halperin W. – Alternative morphogenetic events in cell suspesions. Am.J. Bot. 53, 443-453,
1966

243
Halperin W. & Wetherell D.F. – Ammonium requirement for embryogenesis in vitro. Nature
205, 519-520, 1965
Handley L.W. & Chambliss O.L. – In vitro propagation of Ciucumis sativus L. HortScience
14, 22-23, 1979
Hari V. – Effect of cell density changes and conditioned media on carrot cell embryogenesis.
Z. Pflanzenphysiol. 96, 227-231, 1980
Havel L. & Novak F.J. – Meristem tip culture of Allium cepa L. Scientia HOrt. 27, 209, 214,
1985
Herman E.B. & Haas G.J. – Clonal propagation of Coffea Arabica L. from callus culture.
HortScience 10, 588-589, 1978
Hoza, D. - Culturi in vitro cu aplicaţii în pomicultură. UŞAMV, Atelierul de multiplicat
cursuri, Bucureşti, 1996.
Hoza, D.; Standardi, A; Stănică,. Fl.; Tudor, T.A. - Date preliminare privind cultura in vitro a
nucului (Juglans regia). Lucrări ştiinţifice USAB, seria B, vol. XXXV, 51-56, 1992.
Hunault G. – Obtention de nouvelle souches de tissues à partir de diverse espèces de
Liliacées. Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 283D, 1401-1404, 1976
Hussey G. & Stacey N.J. – In vitro propagation of potato (Solanum tuberosum L.) Ann. Bot.
48, 787-796, 1981
Ion, Ligia; Stănică, Fl.; Dumitraşcu, Monica; Peticilă, A. - Cercetări privind cultura in vitro a
unor embrioni imaturi din genul Prunus. Sesiunea ştiinţifică anuală a cadrelor
didactice şi studenţilor, Bucureşti, 11 decembrie 1997.
Iordan M., Roşu Ana, Enescu V., Brezeanu A., Grigorescu A., Coman I. (1983) -
"Regenerarea de plante prin cultura in vitro la Quercus". În:Lucr. II-lea Simp. Naţ.
Cult. Ţes. Veg.. Piteşti, p.10-26.
Isouard G., Raquin C. & Demarly Y. – Obtention de plantes haploids par culture in vitro
d’anthères d’Aubergine (Solanum melongena L.). Compt. Rend. Acad. Sci., Paris
288D, 987-989, 1979
Jarret R.L., Hasegawa P.M. & Erickson H.T. – Factors affecting shoot initiation from tuber
discs of potato (Solanum tuberosum). Physiol. Plant. 49, 177-184, 1980 B
Jelaska S. – Embroyd formation by fragments of cotyledons and hypocotyls in Cucurbita
pepo. Planta 103, 278-280, 1972
Johri B.M. & Guha S. - In vitro development of onion plants from flowers. Pp 215-223 in
Maheswari & Ranga Swamy (eds.), 1963
Kartha K.K. – Meristem culture. Pp 19-24 in Wetter and Costabel (eds.), 1982

244
Kartha K.K., Gamborg O.L. & Constable F. – Regeneration of pea (Pisum sativum) plants
from shoot apical meristems. Z. Pflanzenphysiol. 72, 172-176, 1974b
Koevary K., Rappaport L. &Morris L.L. – Tissue culture propagation of head lettuce.
HortScience 13, 39-41, 1978
Lakon, G.- Tho topografical tetrasolium method for determined the germinating capacity of
seeds. Plant Phys., 24. p:389-994, 1949.
Lamport D.T.A. – Cell suspension cultures of higher plants: isolation and growth energetics.
Exp. Cell Res. 33, 195-206, 1964
Lazarte J.E. & Sasser C.C. – Asexual embryogenesis and plantlet development in anther
culture of Cucumis sativus HortScience 17, 88, 1982
Leelavahti S., Reddy V.S. & Sen S.K. – Somatic cell genetic studies in Brassica sp. I High
Frequency production of haploid plants in Brassica alba (L.) H.f. & T. Plant Cell Rep.
3, 102-105, 1984
Marani F. & Pisi A. – Meristem-tip culture and vegetative propagation in potato. Acta Hort.
78, 415-422, 1977
Morel G. & Martin C. – Curing potatoes infected with vitus. C.R. hebd. Séance. Acad. Agric.
Fr. 41, 472-473, 1955
Murashige, T. - A technique of shoot apex grafting and its utilization toward recovering virus
citrus clones. Hortic. Science 7, p:118-119, 1972
Neculae Luminiţa, Teodorescu A. – Rezultate privind microînmulţirea portaltoiului de măr
MM 106 în condiţii diferite de iluminare. Abstracts 3rd International Symposium
Biotehnos, “Biotechnology now & tomorrow” 19-20 octombrie, B 12, Bucureşti, 1995
Neri, D.- Tecniche da innesto con materiale proveniente da colture in vitro. Frutticoltura 3, p:
69-72, 1990.
Nielsen L.V. – In vitro bulbet formation from leaf segments of lilies, especially Lilium
rubellum. Scientia Hort. 11, 379-390, 1960
Pelletier G., Raquin C. & Simon G. – La culure in vitro d’anthères d’Asperge (Asparagus
officinalis). Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 274D, 848-851, 1972
Pence V.C. & Caruso J.L. – Effects of IAA and four IAA conjugates on morphogenesis and
callus growth from tomato leaf discs. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 3, 101-110, 1984
Piccioni E., Standardi A., Ţuţuianu V.C. – Storage of M 26 apple rootstock encapsulates
microcuttings. Adv. HortScience, 10, 185-190, 1996
Pierik R.L.M. – In vitro culture of higher plants – Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht,
1987

245
Pink D.A.C. & Walkey D.G.A. – Rapid propagation of Cucurbita pepo L. by culture of
meristem tips. Scientia Hort. 24, 107-114, 1984
Pliego-Alfaro, F., Murashighe, T.- Possible rejuvenation of adult avocado by greffage onto
juvenile roctstock in vitro. Hortscience, Vol.22 (6),p: 1321-1324, 1987.
Quoirin M., Lepoivre P. – Etudes de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus. Acta
Horticulturae, 78: 437-442. 1977
Raicu Petre, Badea, Elena Marcela - Cultura de celule şi biotehnologiile moderne. Editura
Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti, 1986.
Raicu Petre şi colab. - Culturi de celule şi ţesuturi vegetale – aplicaţii în agricultură, Ed.
Ceres, Bucureşti, 1984;
Resende R.O. & Paiva M. – Eradication of potato viruses X and S by meristem-tip culture.
hortScience 20, 525, 1985
Reuther G. – Chapter 8 – Asparagus. Pp 211-242 in Sharp et al (eds.), 1984
Roşu Ana - An efficient method for rooting of in vitro propagated roses-XXV-th Annual
Meeting of ESNA, Piacenza, Italy, 1995
Roşu Ana - Elemente de biotehnologii vegetale – aplicaţii în ameliorare, Ed. Ametist 92,
Bucureşti, 1999
Roşu Ana, Brezeanu A., Iordan M. - Micropropagation in Vitis vinifera L. III: Studies
regarding in vitro stimulation of multiple axillary shoot development in some
grapevine cultivars for clonal multiplication. Rev. Roum. Biol., Biol. veg., 28 (2).,
1983
Roşu Ana, Grigorescu A. -Multiplicarea clonală prin tehnicile de culturi de ţesuturi la
Paulownia tomentosa. Studii Cerc.Biol., Biol. Veg., 1, 1984
Roşu Ana, Indreaş A., Sfetcu D. (1992) - A method of in vitro rescue of hybrid embryos from
crosses between seeded x seedless table varieties in grapevine (Vitis vinifera L.).
Abstract published in: Proceed. of NATO ASI Seminar Plant Morphogenesis-
Molecular Approaches, Heraclio, Crete., 1992
Roşu Ana, Iordan M., Brezeanu A., Volosciuc E. - Cercetări privind utilizarea calusului de
Daucus carota în scopul obţinerii de produşi secundari de importanţă farmaceutică.
Studii şi Cercetări de Biologie, Biol. Veget. 34 (1)., 1982
Roşu Ana, Skirvin R. M., Bein A., Norton M.A., Kushad M., Otterba Cher A.G. - The
development of putative adventitious shoots from a chimeral thornless rose (Rosa
multiflora) in vitro. Journal of Horticultural Science (1995) 70 (6), 1995

246
Roşu Ana, Skirvin R.M. - In vitro culture of plant chimeras. Implications in horticulture -
Book of Abstract - XXIV.th Annual Meeting of ESNA, Varna, Bulgaria , 1994
Roşu, Ana – Elemente de biotehnologii vegetale-aplicaţii în ameliorare. Editura Ametist 92,
Bucureşti, 1999.
Săvulescu, Anca, Buliga, A., Stănică Fl. - Influence of X structured waters on in vitro
organogenesis of apple varieties and mother plant, Abstracts 4th International
Symposium Biotehnos, Biotechnology now&tomorow, Bucureşti 26-27 Sept., B2, 3/7,
pp XII, 1996
Smith R.H. & Murashige T. – In vitro development of the isolated shoot apical meristems of
angiosperms. Am.J.Bot. 57, 5623-568, 1970
Sopory S.K. & Tan B.H. – Regeneration and cytological studies and anther and pollen calli of
dihaploid of Solanum tuberosum. Z. Pflanzenzücht. 82, 31-35, 1979
Standardi A., Micheli M., Piccioni E. – Propagazione in vitro dell’olivo: acquisizioni e
prospettive. Riv. Frutticoltura Nr. 7/8, 1998
Standardi A., Piccioni E. - Recent perspectives on synthetic seed technology using
nonembryogenanic în vitro-derived explants, Int. J. Plant Sci. 159(6):968-978, 1998
Standardi A., Piccioni E. - Rooting induction în encapsulated buds of M.26 apple rootstock
for synthetic seed, biology of root formation and development, Plenum press, New
York, 1997;
Stănică Fl. – Microînmulţirea plantelor horticole şi alte tehnici de cultură in vitro. Editura
Grand, Bucureşti, 1999
Stănică Fl., Armeanu Ileana - Influence quantification of some factors implied in the kiwifruit
in vitro organogenesis Scientifical Papers UŞAMV Bucureşti, Serie B, Vol. XLVII,
ISBN 973-7753-04-6, Invel Multimedia, 2004
Stănică Fl., Dumitraşcu M., Davidescu V., Madjar R., Peticilă A. - Înmulţirea plantelor
horticole lemnoase, Format electronic, Editura Invel Multimedia, Bucureşti, ISBN
973-86341-4-8, 2003
Stănică Fl., Dumitraşcu M., Davidescu V., Madjar R., Peticilă A. - Înmulţirea plantelor
horticole lemnoase, Editura Ceres, Bucureşti, ISBN 973-40-0558-8, 431 pg., 2002
Stănică Fl., Gâlă Ruxandra, Diaconescu Oana - Cercetări privind înmulţirea in vitro a
smochinului (Ficus carica L.), Lucrări ştiinţifice, Facultatea de Horticultură, UŞAMV
Iaşi, 2003

247
Stănică Fl., Gâlă Ruxandra, Velcea M., Diaconescu Oana - Rezultate preliminare privind
folosirea apei Pi la microînmulţirea in vitro a unor soiuri de măr - Simpozionul
Internaţional Apa un miracol Ediţia a II a, Bucureşti, 25-26.06, pp. 12 , 2002
Stănică Fl.; Hoza, D.; Lăzureanu, C. - The micro-grafting of fruit-growing plants
(Microaltoirea plantelor pomicole). Bioterra 1: 33-38, Bulletin of Scientific
Information, Athenaeum Academic University, Faculty of Horticultural. Sciences and
Bioengineering, Bucureşti, 1992.
Stănică, Fl. - Organogenesis via callus in kiwifruit hybrid plants (Actinidia deliciosa Chev. x
Actinidia arguta Sieb. e Zucch.). European Society for New Methods in Agricultural
Research (ESNA) XXVIII-th Annual Meeting, WG. 4, 151, Brno, 25-29 august, 1998.
Stănică, Fl. – Rezultate preliminare privind microînmulţirea in vitro a curmalului chinezesc
(Ziziphus jujuba Mill.). Lucrările Simpozionului "Horticultura Clujeană XX", Cluj-
Napoca, 236-238, 19-20 iunie 1997.
Stănică, Fl., Cepoiu N., Standardi A., Zuccherelli G.- Aspects of in vitro organogenesis in
Actinidia plants. 2nd International Symposium Biotehnos, "Biotechnology
now&tomorow", Lucrări, Volumul I, B10, 13 pag., 29-30 septembrie, Bucureşti 1994.
Stănică, Fl.; Cepoiu, N.; Dumitraşcu, Monica - Double layer and culture medium composition
on in vitro propagation of BA 29 and EM-C quince rootstocks. European Society for
New Methods in Agricultural Research (ESNA) XXVI-th Annual Meeting, 145, 12-16
septembrie, Buşteni, 1996.
Stănică, Fl.; Groza, Ioana; Cepoiu, N.; Standardi, A. - Influence of inductive factors on M.26
apple rootstocks organogenesis from leaf blade. Abstracts 3rd International
Symposium Biotehnos, "Biotechnology now & tomorow" 19-20 octombrie, B 11,
Bucureşti, 1995.
Stănică, Fl.; Hoza, D.; Cepoiu, N. - Organogeneza in vitro la plantele hibride de kiwi
(Actinidia deliciosa Chev. x Actinidia arguta Sieb. e Zuch.). Lucrările Simpozionului
omagial dedicat semicentenarului Universităţii de Ştiinţe Agricole a Banatului din
Timişoara, 1-3 iunie 1995.
Stănică, Fl.; Standardi, A; Hoza, D.; Tudor, T.A. - Cercetări privind microînmulţirea dafinului
(Laurus nobilis L.). Lucrări ştiinţifice USAB, seria B, vol. XXXV, 83-90, 1992.
Teodorescu A., Neculae Luminiţa – Cercetări pentru stabilirea biotehnologiilor de înmulţire a
unor specii pomicole şi dendrologice şi stadiul aplicării acestora în producţie. 2nd
International Symposium Biotehnos, “Biotechnology now & tomorrow”, Lucrări, Vol.
I, B10, 13 pag., 29-30 sept., Bucureşti, 1994

248
Teodorescu A., Neculae Luminiţa – Rezultate privind înrădăcinarea în condiţii septice a
minibutaşilor unor specii horticole înmulţite in vitro. Abstracts 4th International
Symposium Biotehnos, Biotechnology now & tomorrow”, 26-27 sept., SP 50,
Bucureşti, 1996
Walkey D.G.A., Neeley H.A. & Crisp P. – Rapid propagation of whitw cabbage by tissue
culture. Scientia Hort. 12, 99-107, 1980
Yan R.L., G.R. Liu, L. Zhang, Z.X. Wang, E.Q. Yang, - Effect of exogenous plant hormones
on rapid multiplication of Ziziphus jujuba test-tube plants, Journal of Fruit Science, 7,
4, 231-233, 1990.
Yang H.J. & Clore W.J. – Obtaining virus-free plants from Asparagus officinalis L. by
culturing shoot tips and apical meristems. HortScience 11, 474-475, 1976.
Zucherelli G.- Metodologie nelle moltiplicazione, industriale in vitro dei portinnesti clonali
del pesco. Pescomandorlo GF 677, Susino GF 43, Damasco 1869, San Giuliene 655/2.
Atti Convegno “Tecniche di coltura in vitro per la propagazione su vasta scala delle
specie ortoflorofrutticole” p: 147-154, 1979.
Zucherelli G.- Moltiplicazione in vitro di cinque varieta di nocciolo e loro micorizazione con
Tuber melanosporum. L’Informatore Agrario, Verona, XLVI (41), 1990
Zucherelli G., Capaccio V. – Micorrizazione del castagno con simbionti a carpoforo edule.
Pianfei-Cuneo, 9 novembre 1990
Zucherelli G., Zucherelli S., Capaccio V. – Production in vitro of two hazelnut varieties and
results about inoculum of Tuber magnatum pico on a mass scale. Acta Horticulture
351
*** - Colecţia revistei Frutticoltura. Edagricole, Bologna, 1990-1995
*** - Colecţia revistei Plant Cell Tissue and Organ Culture, Martinus Nijhoff Publishers,
1990-1997
*** - Sigma Plant Culture Catalg, 1994
*** - Tehnici moderne de producere a materialului săditor pomicol. I.C.P.P. Mărăcineni,
Piteşti 1983
*** Abstracts VIIth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture – Amsterdam,
June 24-29 1990.

249
Editură de Carte Electronică

din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL


str. Belizarie nr 1, bl. 21/5, sc. 1, ap. 2, sector 1 - Bucureşti, PO Box 63-110
tel.: 0723.20.50.48; fax: 021/430.35.42; e-mail: invel_multimedia@pcnet.ro
ing. Florin STĂNICĂ

Avem tehnologia ... OFERTĂ SPECIALĂ


Cercetări
dar şi uneltele, pentru a vă oferi: GRATUIT experimentale
privind
fertilizarea
în primul trimestru în livezi
♦carte electronică ♦CD personalizat al anului 2005 TEZĂ DE DOCTORAT
♦CD multimedia ♦paper to digital text prelucrăm
♦desen proiectiv digital 2D ♦CD film teze de doctorat în Coordonator ştiinţific
Acad. David DAVIDESCU

♦DTP ♦consultanţă birotică/office/IT format electronic 1996

Evaluarea
maşinilor şi
echipamentelor
American Society of Appraisers

CD carte CD carte CD carte CD carte CD carte


MINISTRY OF EDUCATION AND RESEARCH
UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES
AND VETERINARY MEDICINE BUCHAREST

SCIENTIFICALLY PAPERS
SERIA B - XLV - 2002
SERIA B - XLVI - 2003

HORTICULTURE

CD curs universitar CD lucrări ştiinţifice CD colecţie reviste 2 CD carte + film 2 CD carte + film

CD film CD film CD film CD film CD film


ISBN 973-7753-07-0