Aislamiento de DNA de E.

coli y visualización en un gel de agarosa

1) INTRODUCCION

Todas las células vivientes, tanto procariotes como eucariotes, contienen DNA
como material genético. La única excepción son los virus, que no son células, y que
pueden tener DNA o RNA, de simple o doble hebra, lineal o circular, como genoma. El
material genético de procariotes y eucariotes es replicado cuando la célula se divide y
permite que la célula hija herede el mismo material genético que la célula madre. Para
que se formen las células se deben sintetizar las proteínas y los RNA estructurales
(rRNAs, tRNAs y snRNAs) que forman una célula, entre otras biomoléculas
estructurales importantes. Para ello, los genes codificados en el genoma deben ser
expresados; esto significa que los genes que codifican para proteínas tienen que ser
transcritos en RNA informacionales (mRNA) y luego ser traducidos por los ribosomas
hasta polipéptidos, y que los RNA estructucturales (rRNA, tRNAs y snRNAs) deben ser
transcritos.

El genoma de la bacteria Escherichia coli (E. coli) está compuesto por 4.7 x 106
pares de bases y codifica para 4.300 genes. En contraste, el genoma de una levadura
contiene 20 x 106 pares de bases y codifica para 6.000 genes, el genoma de la mosca
Drosophila melanogaster posee 125 x 106 pares de bases y codifica para 20.000 genes,
Arabidopsis thaliana posee 125 x 106 pares de bases que codifican 25.500 genes, y el
genoma humano está compuesto por 3000 x 106 pares de bases y codifica para 30.000 a
40.000 genes. Por lo tanto, el genoma de E. coli es 5 veces más pequeño que el de
levadura, 25 veces más pequeño que el de Drosophila y 600 veces más pequeño que el
de células humanas. El genoma de E. coli ha sido completamente secuenciado, al igual
que el de células humanas.

Para extraer DNA bacteriano se deben realizar cuatro etapas principales: a) el

tratamiento con lisozima de las bacterias que permite degradar la pared bacteriana y
generar esferoplastos, b) la ruptura de las células, que en este caso se realizará con la
solución comercial DNAzol (Gibco) que contiene isotiocianato de guanidinio como
agente desnaturante, c) la desnaturación de las proteínas con fenol a pH=8.0 y la
extracción del fenol residual en la fase acuosa que se realiza con cloroformo o éter, d) la
precipitación del DNA con etanol para purificarlo aún más y concentrarlo. El DNA
cromosomal extraído tanto de procariotes como eucariotes migra en un gel de agarosa
como una banda de un tamaño "artefactual" de 21 a 23 kpb (fragmento más grande del
estándar de tamaño molecular).

2) TRABAJO PRÁCTICO

Para comenzar con el trabajo de cada grupo, se cultivará la cepa de E. coli JM109 (DE3)
en 100 mL de medio Luria-Bertani (medio LB) (bactotriptona 10 g/L, extracto de
levadura 5 g/L, NaCl 5 g/L) durante toda la noche hasta obtener un cultivo en fase
estacionaria.

El cultivo de E. coli lo realizarán los ayudantes y se le entregará un tubo

Eppendorf con 100 µL de bacterias controles (crecidas sin cobre) congeladas y un tubo
Eppendorf con 100 µL de bacterias tratadas con cobre congeladas. A continuación el
trabajo que sigue lo realizará cada grupo de laboratorio:

- tomar un tubo Eppendorf con 100 µL de pellet bacteriano control y descongelar a

temperatura ambiente.

- resuspender las células en 100 µL de buffer Tris-HCl 50 mM pH 8.0, agregar 10 µL de

solución recién preparada de lisozima 10 mg/mL e incubar 20 minutos a temperatura
ambiente.

-agregar 1 mL de solución DNAzol (Gibco BRL) para obtener la lisis de los

esferoplastos pipeteando suavemente repetidas veces la mezcla con ayuda de una
micropipeta Gilson P1000.

- centrifugar el homogenizado 10 minutos a 14.000 rpm (velocidad máxima) en una

microcentrífuga Eppendorf a temperatura ambiente y recuperar el sobrenadante (viscoso
por la presencia de DNA genómico) en otro tubo Eppendorf.

- agregar un volumen de solución fenol-cloroformo, agitar suavemente (para no romper

el DNA cromosomal) en un vortex para mezclar las fases y centrifugar 5 minutos a
temperatura ambiente en una microcentrífuga Eppendorf.

- retirar la fase superior (fase acuosa), ponerla en otro tubo Eppendorf y repetir la
extracción con fenol-cloroformo (para eliminar bien las proteínas).

- retirar la fase superior (fase acuosa), ponerla en otro tubo Eppendorf, agregar un
volumen de éter o cloroformo, agitar suavemente en un vortex y centrifugar 1 minuto.

- retirar la fase inferior si se usó éter o la superior si se usó cloroformo (fase acuosa) y
repetir la extracción con éter o cloroformo una segunda vez (para eliminar bien el fenol
residual).

- retirar la fase acuosa, ponerla en otro tubo Eppendorf, agregar 500 µL de etanol
absoluto frío, mezclar suavemente por inversión varias veces y dejar 3 minutos a
temperatura ambiente. Observar la precipitación del DNA cromosomal.

- centrifugar 2 minutos a temperatura ambiente para obtener un pellet de DNA

cromosomal y descartar el sobrenadante.

- agregar 1 mL de etanol al 75% para lavar superficialmente el pellet de DNA y

descartar el sobrenadante.

- secar el pellet de DNA a 50 grados Celsius (poner el tubo abierto en una estufa)
ambiente durante algunos minutos (10-15 minutos aprox., o el tiempo que sea necesario
hasta que el pellet esté completamento seco). Agregar 100 µL de agua destilada para
hidratar el DNA dejándolo sin agitación a temperatura ambiente por al menos 5
minutos. Posteriormente, con la punta de una pipeta mezclar el pellet con el buffer y
luego succionar y expulsar el líquido suavemente hasta completa homogenización. De
esta manera, obtendrán una solución acuosa de DNA cromosomal de aproximadamente
1 µg/µL.
- preparar un gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X y al agregar buffer de corrida
bromuro de etidio (EtBr) 50 µg/mL (los ayudantes les mostrarán esta primera vez). Si se
prepara 1 litro de buffer de corrida y la solución stock de bromuro de etidio tiene una
concentración de 10 mg/mL, se deben agregar 5 L. Después de haber puesto el gel en
la cámara y haber adicionado el buffer de corrida, agregar 2,5 L en el compartimiento
del cátodo y 2,5 L en el compartimiento del ánodo y agitar suavemente el buffer de
ambos compartimientos para que se el EtBr se distribuya homogéneamente.
Obviamente, todo esto se hace antes de cargar las muestras en el gel.

NOTA: No es necesario ni conveniente agregar EtBr a la agarosa, ni tampoco a las

muestras que se van a cargar en el gel.

- tomar una alícuota de 3 µL de la solución de DNA bacteriano, agregar 2 µL de agua

destilada y 1 µL de buffer de carga 6X y cargar todo el volumen en un pocillo del gel de
agarosa con ayuda de una micropipeta. En un pocillo contiguo, cargar 2 µL de estándar
de tamaño molecular correspondiente a DNA de fago lambda digerido con las enzimas
EcoRI y HindIII 1 µg/µL (Promega) mezclado con 3 µL de agua destilada y 1 µL de
buffer de carga 6X.

- realizar la electroforesis en gel de agarosa a 90 Volts durante 45 minutos (o hasta que

le indique el ayudante, dependiendo de la migración del azul de bromofenol), visualizar
el DNA sobre un transiluminador de luz ultravioleta y tomar una registro fotográfico
para poder estimar la concentración.