PROPUESTA DE MODIFICACION DEL METODO

KJELDAHL EXCLUYENDO SUS ETAPAS DE

DESTILACION Y TITULACION PARA LA
DETERMINACION DE PROTEINA EN QUINUA
1.ANTECEDENTES
Desde 1883en que John kjeldahl presento sus trabajos, su método ha ganado una
gran aceptación y se aplica en una gran variedad de trabajos para los análisis de
alimentos, bebidas, piensos, grano, aguas residuales, suelos para cultivos y otros.

La cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los experimentos

relacionados con proteínas en una multitud de temas de investigación. Se han
desarrollado diferentes métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna en
particular. Los métodos de cuantificación de proteínas totales incluyen métodos
tradicionales tales como la medición de la absorbancia a 280 nm, los ensayos de
Bradford. Así como métodos alternativos como el de Lowry o novedosos ensayos
desarrollados por los proveedores comerciales. Normalmente, los proveedores
comerciales venden kits bien diseñados y prácticos para cada tipo de ensayo. Los
métodos para cuantificar proteínas individuales incluyen el ELISA, el Western blot
y, más recientemente, la espectrometría de masas, entre otros.

Aquí describimos algunos de los métodos comúnmente utilizados para determinar

la concentración de proteínas en solución, resaltando sus utilidades y limitaciones.
Es importante mencionar que ninguno de estos ensayos para proteínas son ni
específicos para proteínas, lo que significa que componentes no proteicos pueden
interferir, ni uniformemente precisos y compatibles con todas las proteínas. Más
aún, las modificaciones de las proteínas pueden interferir con la estimación de su
concentración en algunos de estos ensayos cuando se comparan con las
proteínas no modificadas.
2.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En el análisis de nitrógeno por el método kjeldahl se obtiene un resultado en
porcentaje (%) debido al uso de buretas y medios que no permiten trabajos
sensibles, pero se requiere obtener un resultado en una concentración de [ppm]
para que se obtenga resultados más precisos y esto se obtiene utilizando equipos
como el espectrofotómetro visible, así que se opta por desarrollar el método
kjeldahl modificado.

3.OBJETIVO GENERAL
Realizar el método Kjeldahl modificado, sustituyendo las fases de destilación y
titulación volumétrica por un análisis colorimétrico en muestras de quinua.

3.1OBJETIVO ESPECIFICO
 Reducir el tiempo del método convencional kjeldahl por combinación con la
espectrofotometría.
 Determinar el contenido de proteínas en quinua utilizando el método
kjeldahl modificado.
 Comparar los resultados obtenidos por el método kjeldahl normal y el
método kjeldahl modificado
 Evaluar las facilidades y resultados del método colorimétrico
 Comprobar los resultados del contenido de proteínas en quinua

4.JUSTIFICACION
El método de análisis kjeldahl es un proceso bastante largo ya que este tiene tres
fases en su proceso que son: la digestión, destilación y titulación, al desarrollar
este método kjeldahl modificado se podrá excluir dos fases que son: la destilación
y la titulación, en vez de esas dos fases se llevaría directamente al
espectrofotómetro donde obtendremos resultamos en partes por millón. Tomando
también en cuenta que en el método original el uso de reactivos controlados es
bastante alto y el tiempo en el que se realiza el análisis es bastante moroso, por
esa y todas las razones ya mencionadas se opta por desarrollar este método
kjeldahl modificado con espectrofotometría.
5.ALCANCE
El método modificado se realizará en muestras vegetales y quinuas.

6.FUNDAMENTACION TEORICA
6.1 LA QUINUA (CHENOPODIUM QUINOA)

Es un pseudocereal perteneciente a la sub familia chenopodioideae de las

amarantáceas. Se cultiva, principalmente, en la cordillera de los andes. Los
principales países productores son: Ecuador, Perú, Bolivia, Colombia y Estados
Unidos, si bien su cultivo se está expandiendo a diversos países de Europa y Asia,
con altos niveles de rendimiento. Es una planta resistente, tolerante y eficiente en
el uso del agua, con una extraordinaria adaptabilidad, pudiendo soportar
temperaturas desde -4 hasta 38°C y crecer con humedades relativas desde el
40%hasta el 88%.

6.2DESCRIPCION

Es una planta herbácea anual, que normalmente alcanza una altura de 1 a 3

metros. Las hojas, alternas, son anchas y polimorfas; el tallo central puede estar
más o menos ramificado, dependiendo de la variedad o densidad del sembrado.
Las flores, organizadas en panículas, son pequeñas y carecen de pétalos. Las
terminales so hemafroditas o masculinas y las laterales generalmente femeninas.
El fruto es un utrículo (aquenio de pericarpo membranoso) de unos 2mm de
diámetro; tiene semillas lenticulares con abundante perisperma harinoso.

6.3PROPIEDADES DE LA QUINUA

La quinua no es más que una semilla, pero con características únicas al poder
consumirse como cereal, por eso, la llamamos también pseudocereal.

Como tal, la quinua provee la mayor parte de sus calorías en formas de hidratos
complejos, pero también aporta cerca de 16g de proteínas por cada 100g.

Si comparamos la quinua con la mayor parte de los cereales, esta contiene

muchas más proteínas y grasas, aunque estas son en su mayoría insaturadas,
destacando la presencia de ácidos omega 6 y omega 3. Respecto al aporte
calórico, la quínoa es semejante o levemente superior a un cereal, pues contiene
menor cantidad de hidratos.

Si nos referimos a los micronutrientes, en la quinua destaca el contenido de

potasio, magnesio, calcio, fosforo, hierro y zinc entre los minerales, mientras que
también ofrece vitaminas del complejo B en cantidades apreciables y vitamina E.

6.4DETERMINACION DE PROTEINAS

El contenido proteínico de los alimentos puede determinarse por medio de

diversos métodos. La forma más habitual es su cuantificación de forma indirecta y
aproximada, bien a partir del contenido en nitrógeno de la muestra, o bien
deduciendo su cantidad a partir del contenido de uno o dos aminoácidos
particulares que conforman la proteína, fáciles de identificar y de cuantificar por su
reactividad química específica. Este segundo procedimiento conlleva una mayor
inexactitud. Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl
para la determinación del nitrógeno en una amplia gama de muestras (alimentos y
bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el cálculo del contenido en proteína.
También se utiliza el método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno en aguas
residuales y suelos. Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC,
USEPA, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias. La convención
general, sobreentendida, es que la totalidad del nitrógeno de la muestra está en
forma proteica, aun cuando la realidad es que, según la naturaleza del producto,
una fracción considerable del nitrógeno procede de otros compuestos
nitrogenados (bases púricas y pirimidínicas, creatina y creatinina, urea, amoniaco,
etc.), por ello se denomina “proteína bruta” o “proteína total” a la obtenida por este
método. Con este análisis, sin embargo, no se determina el nitrógeno nítrico, el
cianhídrico, el de la hidracina, el de grupos azo y el nitrógeno de un núcleo cíclico.

6.5 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

 Absorción a 280 nm.

 Método de biuret
 Método de Lowry
  Metodo kjedahl

7.HIPOTESIS

Al modificar el método kjeldahl convencional se reducirá el tiempo de análisis de

la muestra y con el uso de equipos como el espectrofotómetro se obtendrá
resultados de concentración más precisos.

8.MARCO METODOLOGICO
8.1 METODO KJELDAL NORMAL

El método kjeldahl mide el contenido de nitrógeno de una muestra. El contenido de

proteína se puede calcular seguidamente, presuponiendo una porción entre la
proteína y el nitrógeno para el alimento especifico que está siendo analizado.

Este método puede ser dividido básicamente en tres etapas: digestión o

mineralización, destilación y valoración. El procedimiento a seguir es diferente es
función si en la etapa de destilación el nitrógeno liberado es recogido sobre un
exceso conocido de ácido clorhídrico o sulfúrico o sobre una disolución de ácido
bórico. Ello condicionara la forma de realizar la siguiente etapa de valoración, así
como los reactivos empleados. En este trabajo se realizará la explicación de
cuando el nitrógeno se recoge en ácido clorhídrico o sulfúrico.

a) Etapa de digestión: en tratamiento con ácido sulfúrico concentrado, en

presencia de un catalizador y ebullición convierte el nitrógeno orgánico en
ion amonio, según la siguiente ecuación:
n-C-NH2+H2SO4 CO2+(NH4)2SO4+SO2
procedimiento: se introduce de 1 a 5g de muestra en un tubo de digestión y
se ponen 3gramos de catalizador que suele estar constituido por una
mezcla de sales de K2SO4, Se y CuSO4. Después se adicionan 20ml de
H2SO4 concentrado. Posteriormente se digiere a 420°durante un tiempo
que depende de la cantidad y tipo de muestra hasta que esta se aclare,
seguidamente se añade 1ml de h2o2 y se sabe que la digestión ha
terminado por que la disolución adquiere un color verde esmeralda
característico.
El nitrógeno proteico se ha transformado en sulfato de amonio por acción del
ácido sulfúrico en caliente.

b) Etapa de destilación: se alcaliniza la muestra digerida y el nitrógeno se

desprende en forma de amoniaco(ecuacion2). El amoniaco destilado se
recoge en un exceso conocido de ácido clorhídrico (Ecuación 3).
(NH4) 2SO4+2NaOH 2NH3+Na2SO4+H2O2 (EC.2)
NH3+HCL (exceso) NH4+CL+HCL (EC.3)
Procedimiento: después de enfría se adicionan al tubo de digestión 50ml de
agua destilada, se pone en el soporte del destilador y se adicionan una
cantidad de suficiente de hidróxido de sodio al 50%, en cantidad suficiente
(50ml aprox.) para alcalinizar fuertemente el medio y así desplazar el
amoniaco de las sales amónicas. el amoniaco liberado es arrastrado por el
vapor de agua inyectado en el contenido del tubo durante la destilación, y
se recoge sobre un exceso de una solución valorada de ácido clorhídrico o
sulfúrico.
c) Etapa de valoración: la cuantificación del nitrógeno amoniacal se realiza
por medio de una volumetría acido –base usando como indicador una
solución alcohólica de indicador mixto. Se valora el ácido sulfúrico o ácido
clorhídrico sobrante con una solución de hidróxido de sodio valorada.

METODO KJELDAH MODIFICADO

Los reactivos a preparar

Reactivo Nessler. - Se disuelven 45,5 g de ioduro mercúrico y 35 g de ioduro

de potasio en un volumen pequeño de agua. Esta mezcla se agrega
suavemente y con agitación a una solución de 112 g de hidróxido de potasio y
se lleva a un volumen de 800 ml con agua (esta solución debe ser enfriada) y
aforar a un litro con agua.se deja la solución varios días en reposo y el líquido
claro que sobrenada se decanta y se pasa a un frasco oscuro.

-Soluciones patrones a preparar e cloruro de amonio

 PROCEDIMIENTO

- Digestión: conversión del Nitrógeno (proveniente de las proteínas,

por ejemplo) en ion amonio mediante calentamiento (a una
temperatura de 400º C aproximadamente) en bloque de digestión
con adición previa de ácido sulfúrico y catalizador, que
desencadenan la conversión del nitrógeno de la muestra en amonio.
- Se agrega agua hasta la marca, se añade 5ml de reactivo de
Nessler, se mezcla y se deja reposar durante 25 minutos.
- Transcurrido este tiempo, en que se ha desarrollado completamente
el color, se lee en el espectrofotómetro la absorbancia a 425 nm .

8.2METODO KJEDAHL NORMAL

1.ETAPA DE DIGESTION
 Pesado de muestra de 0,5g de
quinua y agregar al matraz
kjeldahl

Agregar 20ml de acido sulfurico

concentrado

Agregar catalizador de
mezcla de selenio

Se lleva a ebullicion bajo

campana a 400°C hasta que se
aclare

Se deja enfriar los matraces

Una vez ya frios se agrega H2O2

1ml y se lleva a ebullicion por
15 min

Dejar enfriar en baño

arena,agregar un poco de gua y
nuevamente enfriar

En la digestión se produce la descomposición del nitrógeno que contienen las

muestras orgánicas utilizando una solución de ácido concentrado. Esto se obtiene
haciendo hervir la muestra en una concentración de ácido sulfúrico. El resultado
es una solución de sulfato de amonio

2.ETAPA DE DESTILACION
 En pequeños balones
agregar 20ml de HCl 0,02[N]
estandarizado

Agregar gotas de indicador

mixto

poner en el destilador

en los matraces kjeldahl ya

frios agregar 25ml de NaOH
(50%)

Se ponen a destilar a T
300°C hasta obtener unos
20m del destilado
En la etapa de destilación se libera amoniaco, el cual es retenido en una solución
con una cantidad conocida de ácido. Inicialmente se realiza una destilación con
vapor por el método de arrastre de vapor de agua, mediante el cual acelera la
obtención del destilado.

3.ETAPA DE TITULACION

se titula con NaOH

0,02 [N] estandarizado

El color de viraje es de
color lila a verde

Al final se utiliza la titulación para valorar finalmente la cantidad de amonio

presente en la muestra.

METODO KJELDAHL MODIFICADO

 Pesado de muestra de 0,5g de
quinua y agregar al matraz kjeldahl

Agregar 20ml de acido sulfurico

concentrado

Agregar catalizador selenio

Se lleva a ebullicion bajo campana

a 400°C hasta que se aclare

Se deja enfriar los matraces

Una vez ya frios se agrega H2O2

1ml y se lleva a ebullicion por 15
min

Dejar enfriar en baño

arena,agregar un poco de gua y
nuevamente enfriar

Pasar aun matraz y aforarlo a 50ml

(muestra madre)
 Tomar un alicuota de 3ml en un matraz
y agregar agua 80ml aprox.

añadir 5ml del reactivo nessler y aforar

a 100ml con agua destilada

agitar bien y dejar en reposo 25min

Transcurrido este tiempo, en que se ha

desarrollado completamente el color, se
lee en el espectrofotómetro la
absorbancia a 425 nm
Es posible una medida sencilla en aguas potables, aguas subterráneas y de
superficie, pero también en aguas residuales, extractos de suelos y digestiones
Kjeldahl (sin destilación).

Ambos métodos se basan en la determinación de la suma del amoníaco libre y del

nitrógeno orgánico, los cuales son convertidos a sulfato de amonio, bajo las
condiciones de digestión. En presencia de ácido sulfúrico, sulfato de potasio y
sulfato mercúrico, el nitrógeno de compuestos orgánicos es convertido a sulfato de
amonio y determinado espectrofotométricamente (método de Nesslerización).
9.FUENTES DE CONSULTA BIBLIOGRAFICA
[1] AOAC International: “Official Methods of Analysis”. 17aed. Gaithersburg, USA,
2000.
[2] Skoog, D.A.; West, D.M.: “Qu mica analitica”. 4aed, McGraw-Hill, 1989, pág. 231.
[3] Adrián, J.; Potus, J.; Poiffait, A.; Dauvillier, P.: “Análisis nutricional de los alimentos”,
Ed. Acribia, 2000, pag. 41-43.
[4] Nielsen, S.: “Food Analysis”, Ed. Kluwer Academic/Plenum Publ, 2003, pag. 131-
142.
M.L. Jackson –análisis químico de suelos cuarta edición (pág. 270 – 272)
http://www.asociacioncereales.es/cereales-de-desayuno/los-cereales-de-desayuno-y-la-
salud/composicion-y-valor-nutricional/
https://cuidateplus.marca.com/alimentacion/diccionario/proteinas.html
http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html
http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=4822495&fecha=28/10/1975