ÍNDICE 1. Fundamentos del cultivo celular. Técnica aséptica. Preparación de medios y material estéril. Condiciones generales de cultivo……………………………….3
1.1. Día 1. Comienzo y preparación de los “flask” de cultivo necesarios…………..3
2. Subcultivo celular. Curva de crecimiento. Valoración de la viabilidad celular..6
2.1. Día 2. Realización de la primera medida para la curva de crecimiento………...6
2.2. Día 3. Realización de la segunda medida para la curva de crecimiento………..7
2.3. Día 4. Realización de la tercera medida para la curva de crecimiento………….7
3. Caracterización de líneas celulares. Técnicas de inmunomarcado para la
observación de estructuras subcelulares. Realización de un cariotipo………….9
3.1. Día 2. Realización de un cariotipo……………………………………………...9
3.2. Día 3. Tinción de cariotipos…………………………………………………...10
3.3. Día 3. Realización de una inmunofluorescencia………………………………10
3.4. Día 4. Visualización de cariotipos e inmunofluorescencia……………………11
2 1. FUNDAMENTOS DEL CULTIVO CELULAR. TÉCNICA ASÉPTICA. PREPARACIÓN DE MEDIOS Y MATERIAL ESTÉRIL. CONDICIONES GENERALES DE CULTIVO Al comienzo, se realizó una breve explicación sobre el funcionamiento, las normas de actuación y el equipamiento del laboratorio de cultivos de la Universidad de Alicante, nivel 2 de bioseguridad, (nevera, congelador, baño termostático, incubador de CO2, microscopio invertido, autoclave, etc). Así mismo, se explicaron las técnicas básicas para el mantenimiento de las células en cultivo, con especial atención en el seguimiento de la “Técnica Aséptica” y a la propia seguridad biológica del experimentador 1.1.Día 1: Comienzo y preparación de los “flask” de cultivo necesarios Se comenzó a partir de un subcultivo previamente preparado para realizar un stock de células con las que se trabajaron a lo largo de los cuatro días de prácticas. En este caso, el subcultivo fue a partir de células HeLa, (células de neuroblastoma). Este stock fue manipulado en grupos de tres personas y con él fue con el que se comparó el recuento celular tras una curva de crecimiento, y la viabilidad. Estas células en cultivo se adhieren al sustrato y tienden a estirarse y crecer de manera notable cuando su recuento celular es bajo. Cuando las células van a dividirse, se separan del sustrato volviéndose más esféricas para, tras la mitosis, volver a adherirse. Otro dato para mencionar es que estas células se comportan como células nerviosas indiferenciadas, (neuritas), generando proyecciones para localizarse unas con otras y así contactar. Atendiendo al procedimiento en el laboratorio, comenzamos extrayendo una alícuota de 100 µL, (que previamente pasa por un tubo) para calcular la concentración y viabilidad de la suspensión previamente preparada, (Figura 1).
Calcular viabilidad y volumen a inocular en nuestros “flask” de T-175 x6 Alícuota cultivo.
T-25 Figura 1.- Esquema sobre la manipulación del subcultivo previamente preparado por el profesor, desde el Flask T-175 hasta la alícuota (100µL) pasando por el tubo falcon.
Se añade una misma cantidad de azul tripán (100 µL) y se resuspende. De esta solución se usaron aproximadamente 10 µL para cubrir la Cámara de Newbawer y proceder al conteo de células vivas transparentes y células muertas azules, (Figura 3).
3 Se deben contar 3 regiones A con el aumento x10 del microscopio aumentando el contraste (cerrando el diafragma o abriendo el condensador) y con la luz al máximo, (Figura 2).
Figura 2.- Hemocitómetro / Cámara de Figura 3.- Representación de cómo se visualizan las Newbawer, medidas y distribución de células muertas (arriba) y vivas (abajo) en el las regiones en la gradilla. . hemocitómetro al microscopio óptico convencional. .
Las fórmulas aplicadas para dichos cálculos son las siguientes:
A partir de ahí, mediante los cálculos necesarios, se prepararon 6 “flask” T-25 de 4 ml
(volumen final) y una concentración de células conocida (300.000), para su posterior uso en las medidas de la curva de crecimiento. VIVAS = 106 x 10 x 2 x 1000 = 2,12x106 células/mL MUERTAS = 12 x 10 x 2 x 1000 = 2,4x105 células/mL %VIVAS = (2,12x106) / (2,12x106 + 2,4x105) x 100 = 89,8% 2,12x106 células vivas ________ 1 mL 300.000 células vivas _________ X mL = 0,14 mL / El dato correcto = 0,44 mL
4 Todos los procedimientos se realizan en la cabina de flujo laminar, tomando todas las medidas de seguridad posibles para evitar la contaminación, como rociar las manos con etanol 70% antes de empezar a trabajar, así como todo recipiente que entra en la cabina y procurando tener las cosas ordenadas. Las pipetas usadas son de un solo uso, abiertas dentro de la cabina. Después de realizar los flasks, éstos se llevarán al incubador de CO2, dónde estarán a la temperatura óptima (37ºC) para su crecimiento.
5 2. SUBCULTIVO CELULAR. CURVA DE CRECIMIENTO. VALORACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR A lo largo de las sesiones de prácticas se resuspenden las células de los 2 flasks correspondientes sembrados el primer día para calcular la concentración y el número total de células presentes en el cultivo. Con todo esto, se pretende acercar a las rutinas de trabajo habituales en un laboratorio de cultivos celulares animales y tener cierta habilidad para realizar los cálculos necesarios para determinar el número celular del cultivo y el subcultivo.
Figura 4.- A la izquierda, subcultivado de los 6 flasks t-25 iniciales que se usarán a lo largo de todas las prácticas. A la derecha, cabina de flujo laminar ordenada con el flask inicial T-175.
2.1. Día 2: Realización de la primera medida para la curva de crecimiento
Antes de empezar, se cogen los 6 flasks del incubador y se observan en el microscopio invertido para ver si ha habido crecimiento y si se han adherido correctamente las células al sustrato. Se seleccionan los del día 1. Tras esto, se comienza con el proceso de tripsinización: • Verter el medio de cultivo de los flasks T-25 y decantarlo en un vaso de residuos. • Lavar el flask con PBS, lavamos y eliminamos en el vaso de residuos. • Añadir la tripsina caliente, (que previamente se encuentra en un baño termostático), y mirar en el microscopio invertido hasta que aproximadamente el 80% de las células estén esféricas, (1 – 4 minutos). A
Figura 5.- Visualización en el microscopio invertido de la actuación de la tripsina en las células HeLa. Las células levantadas son esféricas y brillantes (A) mientras que las adheridas son alargadas (B). 6 • Sin eliminar la tripsina realizar la técnica del “Shake-Off” golpeando unas cuantas veces el flask con la mano para ayudar de forma mecánica. • Añadir nuevo medio, resuspender y recoger todo el volumen en un tubo falcon. Se vuelven a realizar las medidas de viabilidad celular y concentración ayudándonos de la Cámara de Newbawer y de la tinción con azul tripán previamente descrita en este porfolio. Se prepara una alícuota de 100 μl de suspensión celular y 100 μl de azul tripán, se resuspende y se usan aproximadamente 10 μl para proceder al conteo.
VIVAS = 4 x 10 x 2 x 1000 = 80.000 células/mL
MUERTAS = 1 x 10 x 2 x 1000 = 20.000 células/mL %VIVAS = (80.000) / (80.000 + 20.000) x 100 = 80% En este caso el error fue el tiempo de actuación de la tripsina (2’). Nº CÉLULAS TOTALES VIVAS = 80.000 células/mL x 4 mL = 320.000 células totales vivas.
2.2. Día 3: Realización de la segunda medida para la curva de crecimiento
Se sigue exactamente el mismo protocolo que en el día 2 pero con los dos siguientes flasks de cultivo. VIVAS = 9 x 10 x 2 x 1000 = 180.000 células/mL MUERTAS = 4 x 10 x 2 x 1000 = 80.000 células/mL %VIVAS = (180.000) / (180.000 + 80.000) x 100 = 69,2% Se ve una viabilidad muy baja, esto puede ser debido de nuevo por error en el tiempo de actuación de la tripsina, (en este caso 4’) o por algún error en la técnica que no haya permitido extraer todas las células viables del flask. Nº CÉLULAS TOTALES VIVAS = 180.000 células/mL x 4 mL = 720.000 células totales vivas.
2.3. Día 4: Realización de la tercera medida para la curva de crecimiento
Se sigue exactamente el mismo protocolo que en el día 2 pero con los dos últimos flasks de cultivo. VIVAS = 15 x 10 x 2 x 1000 = 300.000 células/mL MUERTAS = 5 x 10 x 2 x 1000 = 100.000 células/mL %VIVAS = (300.000) / (300.000 + 100.000) x 100 = 75% Nº CÉLULAS TOTALES VIVAS = 300.000 células/mL x 4 mL = 1.200.000 células totales vivas.
7 DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 DÍA 4 [ ] (células/mL) 725.000 80.000 180.000 300.000 Vol. Final (mL) 0,44 4 4 4 Nº Total células 300.000 320.000 720.000 1.200.000
Tabla 1.- Recopilatorio de las medidas del número total de células viables tras 4 sesiones de prácticas obtenidas a partir de las concentraciones por volúmenes finales de muestra. .
Curva de Crecimiento y = 154919e0,497x
R² = 0,9219 1400000 1200000 1000000 Nº total células
Figura 6.- Resultados de la curva de crecimiento. La proliferación de las células HeLa tiene una tendencia positiva exponencial.
Los resultados obtenidos muestran que las células se adaptan a un crecimiento
exponencial presentando un relativo buen ajuste con una R2 superior al 90%. Podría ser mejor si el día 2 no hubiera tenido un recuento tan bajo, infravalorando los cálculos del número total de células debido a una mala manipulación.
8 3. CARACTERIZACIÓN DE LÍNEAS CELULARES. TÉCNICAS DE INMUNOMARCADO PARA LA OBSERVACIÓN DE ESTRUCTURAS SUBCELULARES. REALIZACIÓN DE UN CARIOTIPO 3.1. Día 2: Realización de un cariotipo La función más importante de los cariotipos es la caracterización de líneas celulares, en nuestro caso, se caracterizará cromosómicamente hablando el cultivo de células HeLa. Se debe tener en cuenta que las células transformadas que pasan a formar una línea estable suelen presentar alteraciones en el número y composición de los cromosomas, (característica común a células tumorales). Se comienza con una serie de cálculos de los reactivos a utilizar tales como: • Colcedmida: retiene a las células en metafase ya que inhibe la despolarización de los microtúbulos y queremos una concentración final de 0,4 μg/mL, partiendo de una solución Stock a 10 μg/mL. (La añadimos durante las últimas horas de cultivo). o C1 · V1 = C2 · V2 ; 10 μg/mL · V1 = 0,4 μg/mL · 20 mL ; V1 = 0,8 mL Colcemida. • KCl: en disolución para lisar las células y liberar el material genético, (solución hipotónica). Queremos preparar 50 mL y lo tenemos a 75 mM, (PM = 74,55). 𝒎⁄ m⁄ 𝒏𝒔 𝑴𝒎 74,55 o 𝑴= = ; 0,075 = ; m = 0,3 g KCl. 𝑽𝒐𝒍 𝑳 𝑽𝒐𝒍 𝑳 0,05 • Carnoil: consiste en una mezcla de metanol y ácido acético (3:1) que sirve para fijar la preparación. Queremos preparar 20 mL de volumen final así que pondremos 15 mL de metanol y 5 mL de ácido acético. Tras los cálculos y las horas de cultivo, se recogen las células mediante “Shake-Off”, se centrifugan y resuspenden, (unas cuantas veces) y se realiza la extensión lanzando la preparación sobre el porta y secar. 3.2. Día 3: Tinción de cariotipos Para observar de forma correcta los cariotipos realizados el día 2 se realiza una tinción simple con Giemsa al 3% en los portas del día anterior ya secos y listos. Tras la tinción se montan las preparaciones con medio de montaje Eukitt, colocando una gota entre la muestra y el cubreobjetos. Tras 5 minutos de espera, se pueden observar al microscopio.
Figura 7.- Portaobjetos con la solución de Giemsa al 3%.
9 3.3. Día 3: Realización de una inmunofluorescencia Otro método de caracterización de líneas celulares es la determinación de la expresión de proteínas particulares o el estudio del material genético. Para observar la expresión de determinadas proteínas, la técnica más habitual es el marcaje con anticuerpos o imnunomarcaje por inmunofluorescencia existiendo dos tipos: 1. Directa: una única capa de anticuerpos ya conjugados. 2. Indirecta: dos capas de anticuerpos. La primera con anticuerpos específicos frente a la proteína de interés y la segunda con anticuerpos conjugados con fluorocromos que se unen de forma específica sobre la primera capa.
Figura 8.- Esquema de las diferencias entre inmunofluorescencia directa e
indirecta.
Se marcará la α-tubulina como proteína de interés. Esta proteína junto con la subunidad β, forma los microtúbulos, (componentes esenciales del citoesqueleto celular). El procedimiento comienza con la realización de una serie de cálculos de los reactivos a utilizar tales como: • Fijador: paraformaldehído al 4% (Stock al 16%) con 10 mL de volumen final. o C1 · V1 = C2 · V2 ; 16 % · V1 = 4 % · 10 mL ; V1 = 2,5 mL. • Detergente TRITON-X100: al 1% en PBS (Stock al 10%) con 10 mL de volumen final. o C1 · V1 = C2 · V2 ; 10 % · V1 = 1 % · 10 mL ; V1 = 1 mL. • Tampón de bloqueo: se bloquea con albúmina de suero bovino al 5%. Contiene como aditivo interesante FCS. Queremos 50 mL de volumen final, (mezcla ya preparada de 5% BSA + 3% FCS). o C1 · V1 = C2 · V2 ; 100 · X = 50 · 2 ; X = 1 mL FBS. o Regla de 3: (5 · 50)/100 = 2,5 g BSA. A partir de aquí, teniendo los datos, lo único que queda es seguir los pasos del protocolo de la inmunofluorescencia indicados en el propio guión de prácticas de la asignatura.
10 Destacamos el uso de una IgG anti-tubulina como anticuerpo primario y el Fluorocromo Alexa488 como anticuerpo secundario. Además, se usó DAPI para poder visualizar los núcleos celulares.
Figura 9.- Incubación de cubreobjetos con el tampón de bloqueo mediante la
técnica de la “microgota”.
3.4. Día 4: Visualización de cariotipos e inmunofluorescencia
Se realizará la observación de los resultados de las diferentes técnicas realizadas mediante el uso de las técnicas de microscopía necesarias, (microscopio óptico y microscopio de fluorescencia).
A B
Figura 10.- Cromosomas de neuroblastoma. Imágenes tomadas al microscopio óptico a 100X. En A
tenemos 2 sets de cromosomas bien diferenciados, donde se facilita su recuento. En B por el contrario vemos un único set mal diferenciado para una caracterización.
11 Figura 11.- Resultados del inmunomarcaje. En A se observa el citoesqueleto gracias a Alexa 488, que emite en verde, mientras que en B se observa el material genético gracias a DAPI, que emite en azul. En C se observan las imágenes A y B superpuestas para diferenciar la fase del ciclo celular en la que se encuentran las células, (en este caso metafase). En D se observa una clara anafase en el centro y otra más a la derecha.
