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UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

INFORME 1

LABORATORIO X TALLER SIMULACIÓN CAMPO

NOMBRES: Ariana Alban, Leslie Barros y Ana Villacís Arcos


CARRERA: Ingeniería Bioquímica
ASIGNATURA: Ingeniería de las Enzimas
NIVEL: 8 PARALELO: Único
ÁREA ACADÉMICA: Profesional DOCENTE: Ing. Cecilia Carpio
CICLO ACADÉMICO: Marzo 2019-SEPTIEMBRE 2019

TEMA:

“AISLAMIENTO DE ENZIMAS”
1. OBJETIVOS:

General:

Aislar la enzima invertasa de los extractos de la levadura Saccharomises cereviciae a partir de un


método simple.

Específicos:

 Determinar la actividad total mediante las UI y rendimiento de la enzima invertasa aislada.


 Realizar la prueba de Biuret para detectar la presencia de proteínas en la enzima.

2. CÁLCULOS Y RESULTADOS
Tabla N°1 “Datos obtenidos de todos los grupos –Medición de Abs – Cuantificación de la actividad
enzimática”
N°Grupo 1 2 3
Tiempos(min) Abs (nm) Abs(nm) Abs(nm)
1' 0,178 0,191 0,195
2' 0,339 0,372 0,315
3' 0,489 0,501 0,499
4' 0,576 0,708 0,579
5' 0,611 0,768 0,729

Tabla N°2 “Datos curva estándar de la glucosa”

Peso Glc (g) Peso total (g) Absorbancia [Glucosa]


(nm) (mg/ml)
0,0993 0,9879 0,099 0,201
0,2904 0,9814 0,316 0,592
0,4926 0,987 0,560 0,998
0,6863 0,9871 0,773 1,391
0,8935 0,9963 1,000 1,794

1.200

1.000 y = 0,5671x - 0,0146


R² = 0,9998
Absorbancia (nm)

0.800

0.600

0.400

0.200

0.000
0 0.5 1 1.5 2
[Glucosa] (mg/ml)

Figura N°1. “Curva de concentración del estándar de glucosa”

CÁLCULO DEMOSTRATIVO DE LA CONCETRACIÓN DE LA GLUCOSA EXPERIMENTO- GRUPO 1

 ECUACIÓN DE LA RECTA y = 0,5671x - 0,0146

Donde:

y= Absorbancia
x= [Glucosa]
𝐴𝑏𝑠 + 0,0146
[𝐺𝑙𝑐] =
0,5671
.
0,178 + 0,0146
[𝐺𝑙𝑐] =
0,5671

[Glc]=0,339 mg/ml //

Tabla N° 3 “Concentraciones de glucosa obtenidas de todos los grupos”

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3


Tiempos(min) [Glucosa] [Glucosa] [Glucosa]
(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)
1' 0,340 0,363 0,370
2' 0,624 0,682 0,581
3' 0,888 0,909 0,906
4' 1,041 1,274 1,047
5' 1,103 1,380 1,311

1.600

1.400 y = 0.2627x + 0.1333


R² = 0.9796
1.200
[Glucosa] (mg/ml)

1.000

0.800

0.600

0.400

0.200

0.000
0 1 2 3 4 5 6
Tiempos(min)

Figura N° 2. “Gráfica de [Glucosa] experimental vs Tiempo del Grupo 2”


1.600
y = 0.2627x + 0.1333
1.400 R² = 0.9796
[Glucosa] (mg/ml)

1.200
y = 0.2349x + 0.1382 Grupo 1
1.000 R² = 0.9899
Grupo 2
0.800
y = 0.1945x + 0.2157 Grupo 3
0.600
R² = 0.9433 Linear (Grupo 1)
0.400
Linear (Grupo 2)
0.200
Linear (Grupo 3)
0.000
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min)

Figura N° 3. “Gráfica de [Glucosa] experimental vs Tiempo del todos los grupos”

CÁLCULO DEMOSTRATIVO ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y RENDIMIENTO- GRUPO 1

 ECUACIÓN DE LA RECTA y = 0,2627x + 0,1333

Donde:

y=[Glucosa]
x= Tiempo
m=AE(Actividad Enzimática) = 0,2627mg/ml (min)

[𝐺𝑙𝑐] = 𝑚[𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜] + 𝑏

0,2627𝑚𝑔 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 1𝑚𝑚𝑜𝑙 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 103 𝑢𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 0,4 𝑢𝐿


𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 = ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ 10
𝑚𝑙(𝑚𝑖𝑛) 180𝑚𝑔 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 2𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 0,2𝑢𝐿

𝑢𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎
𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 = 14,5944
𝑚𝑙(𝑚𝑖𝑛)
𝑢𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑼𝑰
𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 = 14,594 = 𝟏𝟒, 𝟓𝟗𝟒𝟒
𝑚𝑙(𝑚𝑖𝑛) 𝒎𝒍

 Cálculo demostrativo para determinar el rendimiento


𝑉 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝑈𝐼 ∗
𝑔 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎

𝑈𝐼 27,6𝑚𝑙
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 14,5944 ∗
𝑚𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 14𝑔
𝑼𝑰
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝟐𝟖, 𝟕𝟕𝟏𝟖
𝒈 𝒍𝒆𝒗𝒂𝒅𝒖𝒓𝒂

Tabla N° 4 “Datos de actividad enzimática de la invertasa de todos los grupos, volumen del
sobrenadante y rendimiento obtenido de la invertasa”

N° Ecuación Pendiente AE(𝐔𝐈⁄𝐦𝐋) Vol. Rendimiento


Grupo Sobrenadante invertasa
(mL) (𝐔𝐈⁄𝐠)
1 y = 0,1945x + 0,2157 0,1945 𝟏𝟎, 𝟖 26,7 20,597
2 y = 0,2627x + 0,1333 0,2627 𝟏𝟒, 𝟓𝟎𝟕 27,6 28,77
3 𝑦 = 0,2349𝑥 + 0,1382 0,2349 𝟏𝟑, 𝟎𝟓 27,6 25,727

CÁLCULO DEMOSTRATIVO

Tabla N°5 “Datos pepsina estándar”

Conc-Std
Estándar Pepsina Absorbancia
P. total (g)
Pepsina (g) (nm)
mg/(mL)
0 0 0 0
0,0508 0,253 3,51 0,111
0,0957 0,2485 6,74 0,215
0,1497 0,2509 10,44 0,333
0,2001 0,2518 13,91 0,434
0,24 0,2496 16,83 0,514

[Pepsina]: 17,5 mg/mL

0.6

0.5
y = 0,0307x + 0,0043
R² = 0,9992
Absorbancia (nm)

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
[Pepsina] (mg/ml)
Figura N°4. “Gráfica Abs. Vs [Pepsina] estándar”

Tabla N° 6 “Datos de medición de absorbancias de Biuret y concentración de pepsina de todos los


grupos ”

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3


Abs 1 (nm) 0,575 0,562 0,517
Abs 2 (nm) 0,577 0,575 0,55
Abs 3 (nm) 0,588 0,549 0,599
Promedio 0,58 0,562 0,55533333

 Cálculo demostrativo para determinar el contenido de proteína (Grupo 1)

ECUACIÓN DE LA RECTA y = 0,0307x + 0,0043

Donde:

Y: Absorbancia
X: Concentración de proteína
𝑦 − 0,0043
𝒙=
0,0307
0,58 − 0,0043
𝒙=
0,0307
𝑚𝑔
𝒙 = 18,7524 𝑚𝑙
𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 //

 Cálculo para determinar la actividad específica del extracto (AE)- Grupo1


𝑈𝐼
𝑨𝑬 =
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
𝑈𝐼
10,8
𝑨𝑬 = 𝑚𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
𝑚𝑔
18,7524 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
𝑚𝑙
𝑈𝐼
𝑨𝑬 = 0,5767
𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎

Tabla N°7 “Datos obtenidos de todos los grupos de AE”

Actividad específica
𝒎𝒈
N° de Grupo Concentración ( 𝒎𝒍 ) del extracto
(𝑼𝑰⁄𝒎𝒈)
Grupo 1 𝟏𝟖, 𝟕𝟓𝟐𝟒 𝟎, 𝟓𝟕𝟔𝟕
Grupo 2 18,166 0,798
Grupo 3 17,938 0,7275
3. DISCUSIÓN

4. CONCLUSIONES
Se aisló la enzima invertasa mediante un método simple como el de agitación el cual rompió la pared
celular y la invertasa pudo ser liberada a su vez se pudo comparar su actividad en los diferentes grupos.
La cual vario significativamente entre algunos grupos.

Se determino la actividad total de la enzima obteniendo un valor de 12,1867 UI/ml y rendimiento de


12,6664 UI/ g levadura. Los valores obtenidos son un poco bajos, quizás en alguno de los pasos de
aislamiento de la enzima no se llevó a cabo correctamente por lo que se perdió muestra.

Se realizo la prueba de Biuret para detectar la presencia de la proteína en S. cerevisiae obteniendo una
concentración de 0,8827 UI/mg. A pesar de que se cumplió con el objetivo el valor obtenido fue el
más bajo entre todos los grupos esto pudo ocasionarse por errores humanos al momento de realizar el
proceso para el aislamiento de la enzima o a factores de almacenamiento y manejo de los extractos en
el transcurso de la semana de práctica.

5. RECOMENDACIONES

Se recomienda tomar muy en cuenta los datos obtenidos de la absorbancia ya que si estos fueran
datos bajos se debería someter a mayor cantidad de muestra de incubación y al ser un valor muy alto
se debe diluir el extracto enzimático convenientemente.

Si el experimento no es terminado en el tiempo determinado se debe tener las enzimas almacenada


en refrigeración, no en si en congelación ya que se podría someter a la enzima a estrés térmico que
podría afectar su actividad de la enzima.

Se recomienda utilizar material totalmente limpio, y en caso de medir la actividad enzimática tener
en cuenta los tiempos y tratar de manejarlos en forma exacta para evitar posibles errores a futuro.

6. BIBLIOGRAFÍA

Chaplin MF (1986) Monosaccharides. En Chaplin MF, Kennedy JF (eds.): “Carbohydrate Analysis: A


Practical Approach”. IRL Press (Oxford, England) pp. 1-36. Descripción muy simple pero bastante
completa de los principales métodos de análisis de monosacáridos.

Franco.L (2007) “ENZIMAS: QUÉ SON Y PARA QUE SIRVEN”. Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp). Vol.
101, Nº. 2, pp 399-417, 2007. VIII Programa de Promoción de la Cultura Científica y Tecnológica.
Creative Commons Attribution-Share. “ENZIMAS” Obtenido en:
https://www.uaz.edu.mx/histo/Biologia/Wiki/Enzima.pdf el 14/10/2018

Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle
of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248- 254.