UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA DE BIOANÁLISIS

CÁTEDRA DE FÍSICA Y ANÁLISIS INSTRUMENTAL

TECNICAS DE SEPARACIÓN DE MUESTRAS

Profesora: Bachiller:

Peláez, Carmen Machiz,

Migliannys

C. I.: 20159585

Julio, 2018
 INTRODUCCIÓN

Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos
clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos
por conocer más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a los
científcos a buscar técnicas, cada vez, más precisas.

Para elegir una técnica de separación, además de tener en cuenta los criterios
económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones:
unas tienen que ver con las propiedades físicas y estructurales de las moléculas que
se pretende separar o de las características de la matriz en que se encuentran ;
otras se derivan de los objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de
análisis, necesidad de una detección específca).

El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación

y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica
adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.

Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos

grandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Las técnicas
espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información
compleja, relacionada con sus características estructurales específcas, por otro lado
las técnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla
y la señal obtenida puede utilizarse con fnes analíticos cuantitativos o cualitativos .

Es precisamente en las técnicas de separación en las que se basa el presente

trabajo, debido a su amplio uso en el campo de la Biotecnología, Biología Molecular
y Bioquímica entre otras ramas de la investigación.
 CENTRIFUGACIÓN

Es una técnica de separación que se utiliza para aislar o concentrar partículas

suspendidas en un líquido aprovechando la diferente velocidad de desplazamiento
según su forma, tamaño o peso al ser sometidas a una fuerza centrífuga. La fuerza
centrífuga es la que se ejerce sobre un cuerpo cuando éste gira alrededor de un eje .
Esta fuerza, cuya magnitud es directamente proporcional a la masa del cuerpo, el
radio de giro y la velocidad de giro (o angular), es perpendicular al eje y tiende a
alejar el cuerpo del mismo. La fuerza centrífuga puede acelerar el proceso de
sedimentación de partículas que tienen tendencia a hacerlo espontáneamente
(densidad superior a la del líquido), o en aquellas que tienden a fotar (densidad
inferior a la del líquido).

FUNDAMENTOS DE LA CENTRIFUGACIÓN

Cuando una partícula de sólido se mueve a través de un medio continuo, su

velocidad se ve afectada por 2 fuerzas :

 Por un lado la partícula se acelera por la fuerza resultante de la diferencia

que existe entre su densidad y la del medio en el cual está sumergida.
 Por otro lado, existe una fuerza de reacción a la acción anterior que tiende a
detener el movimiento de la partícula. Por ej. el caso mas sencillo es el de una
esfera, en la cual podemos ver que la fuerza de empuje viene dada por:

FB = [ π d3 /6 ρs - ρ ] a

Donde:

d: es el diámetro de la esfera

ρs: densidad de la esfera

ρ: es la densidad del fuido

a: aceleración de la partícula

Por su parte, la fuerza que se opone al movimiento de la partícula viene defnida por
la ley de Stokes:

FD = 3π d μ v

Donde:

μ: es la viscosidad del medio

v: es la velocidad de la partícula

Se considera que las aproximaciones anteriores se cumplen para esferas pequeñas :

d ρ v/ μ <1

La relación anterior habitualmente se cumple para los fuidos biológicos. Entonces ,

Cuando la partícula comienza a moverse en la solución, lo hace a baja velocidad y la
FD es pequeña. Luego la partícula se acelera hasta que las fuerzas se igualen : FB =
FD

De allí podemos conocer su velocidad, donde la aceleración (a) será g en la

sedimentación y w2r en la centrifugación.

Algunos aspectos de interés: La efectividad del proceso depende de la velocidad

que alcanza la partícula dentro de la centrífuga, en comparación con lo que ocurriría
bajo infuencia de la gravedad.

USOS: La centrifugación se utiliza para separar partículas en suspensión en el seno

de un líquido o partículas en disolución, siendo éste el caso donde se encuentran
más aplicaciones. Así, se utiliza habitualmente en biología ya que permite separar
células, orgánulos subcelulares o macromoléculas.
 CROMATOGRAFÍA

Comprende un conjunto de técnicas que tienen como fnalidad la separación de

mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de cada componente
en otra sustancia. De forma general, consiste en pasar una fase móvil (una muestra
constituida por una mezcla que contiene el compuesto deseado en el disolvente ) a
través de una fase estacionaria fja sólida. La fase estacionaria retrasa el paso de los
componentes de la muestra, de forma que los componentes la atraviesan a
diferentes velocidades y se separan en el tiempo. Cada uno de los componentes de
la mezcla presenta un tiempo característico de paso por el sistema, denominado
tiempo de retención. Cuando el tiempo de retención del compuesto deseado difere
del de los otros componentes de la mezcla, éste se puede separar mediante la
separación cromatográfca.

FUNDAMENTOS

La separación de los diferentes componentes de una mezcla que se encuentran en

un líquido o gas es el resultado de las diferentes interacciones de los solutos a
medida que se desplazan alrededor o sobre una sustancia líquida o sólida (la fase
estacionaria). Las diversas técnicas para la separación de mezclas complejas se
fundamentan en la diversidad de afnidades de las substancias por un medio móvil
gas o líquido y un medio absorbente estacionario (papel, gelatina, alúmina o sílice ) a
través del cual circulan.

 Cromatografía en capa fna (CCF)

 Cromatografía en columna (CC)

En la cromatografía en capa fna (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa

delgada de un adsorbente (como por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa)
depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio, o una lámina de
aluminio o de plástico.
La CCF es una técnica analítica y tiene como objetivo el análisis de una mezcla de
componentes. El proceso es similar a la cromatografía de papel con la ventaja de
que se desarrolla más rápidamente, proporciona mejores separaciones y se puede
elegir entre diferentes adsorbentes. La CCF es una técnica estándar en el
laboratorio de química orgánica. Debido a su simplicidad y velocidad, la CCF se
utiliza a menudo para monitorizar las reacciones químicas y también para el análisis
cualitativo de los productos de una reacción, puesto que permite conocer de manera
rápida y sencilla cuántos componentes hay en una mezcla.

La cromatografa en columna (CC) es una técnica de purifcación, puesto que

permite aislar los compuestos deseados de una mezcla.

USOS: La cromatografía analítica se utiliza para separar mezclas, y tiene como

principal objetivo determinar la identidad y concentración de los componentes de
una mezcla.

La cromatografía preparativa se emplea para purifcar grandes cantidades de una

especie molecular.

Ventajas y desventajas de la Cromatografía:

 Permite separar mezclas en cualquier estado (sólido, líquido o gas)

 Permite el análisis de muestras muy pequeñas
 Alta resolución: permite el análisis de concentraciones muy bajas
 Permite la separación de mezclas muy complejas
 Es automatizable, lo cual permite abaratar su coste
 Amplio espectro de aplicaciones
 Rapidez: se obtienen resultados más rápidos que con otras técnicas
 Es un método sencillo para identifcar componentes de mezclas

Por otra parte, las desventajas de la cromatografía son la inversión en instrumentos

cromatográfcos especiales que puede resultar muy costosa. En algunos casos
también requiere una formación especializada.
 ELECTROFORESIS

Es una técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución

cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica
fundamentalmente analítica, aunque también se puede realizar con fnes
preparativos.

Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente

una velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo
eléctrico) con la resistencia al avance (fuerza de fricción o rozamiento)
impuesta por el medio en el que se desplaza.

En biología molecular una gran cantidad de técnicas que se realizan

comúnmente requieren el uso de la electroforesis, lo que supone una parte
importante del procedimiento sistemático del análisis (separación,
purifcación, preparación) de los ácidos nucleicos y las proteínas.

FUNDAMENTOS

Descripción dinámica del movimiento

Una carga eléctrica inmersa en un campo eléctrico experimenta una fuerza de

atracción o repulsión , como describe la Ley de Coulomb:

La carga se desplazará en el medio hacia el polo que posee carga opuesta como
consecuencia de la fuerza de atracción eléctrica: las moléculas cargadas
positivamente se desplazarán hacia el cátodo (polo negativo) y las cargadas
negativamente se desplazarán hacia el ánodo (polo positivo).
En un medio donde el campo eléctrico es homogéneo, el módulo de la fuerza
eléctrica que resulta sobre la carga depende tanto de la intensidad
del campo eléctrico como del valor de la carga en estudio.

En un primer instante, como consecuencia de la fuerza eléctrica, la partícula

cargada experimenta una aceleración inicial y como resultado la misma comienza a
moverse. La segunda ley de Newton describe la relación entre la aceleración y la
fuerza:

Cuando la partícula se encuentra inmersa en un fuido (en el caso de la

electroforesis, este medio corresponde al bufer de corrida) aparece sobre ella una
fuerza de rozamiento, ya que el fuido en el que se mueve la partícula se opone a su
movimiento. La fuerza de rozamiento es proporcional a la
velocidad de la partícula, tiene igual dirección que la fuerza eléctrica pero
sentido opuesto.
Siendo k el coefciente de proporcionalidad o coefciente de fricción , en el cual
están incluidas variables como la viscosidad del medio, el tamaño y la forma de la
partícula. La fuerza de rozamiento dependerá entonces de estas tres variables,
además de la velocidad de la partícula.

Si consideramos una partícula esférica que se mueve en

condiciones en las que se cumpla la Ley de Stokes, la expresión para la fuerza de
rozamiento puede escribirse como:

Siendo η: la viscosidad del medio a la temperatura de trabajo; r el radio y v la

velocidad de la partícula respectivamente.

Apenas la molécula
comienza a moverse en el
bufer a causa de la fuerza eléctrica
, aparece la fuerza de
rozamiento que se opone al
movimiento. Es así que la fuerza neta que actúa sobre la partícula será entonces la
resultante entre la fuerza eléctrica y la de rozamiento, y resulta igual a la diferencia
entre ambas. Esta resultante será la que determinará su migración en el medio de
corrida.

Fuerzas involucradas en el movimiento de una partícula cargada positivamente

cuando está inmersa en un medio donde existe un campo eléctrico. Las fechas
representan la dirección y sentido de los vectores y en cada caso las longitudes de
los vectores fuerza son proporcionales a sus respectivos módulos. Ahora bien , la
fuerza de rozamiento no es constante ya que se incrementa a medida que aumenta
la velocidad de la partícula, y consecuentemente disminuye progresivamente la
aceleración. Llega un momento en
que la fuerza de rozamiento
adquiere la misma magnitud
que la fuerza eléctrica. Dado
que ambas fuerzas tienen
igual dirección pero sentidos contrarios, la resultante sobre la partícula será igual a
cero.

Situación de equilibrio en una partícula cargada positivamente inmersa en un medio

donde hay un campo eléctrico uniforme. El módulo de la fuerza eléctrica resulta
igual al de la fuerza de rozamiento, , por lo que la sumatoria de fuerzas en el
equilibrio es igual a cero. es la fuerza eléctrica, es la fuerza de rozamiento y
vector campo eléctrico. En consecuencia, a partir de este momento, la partícula no
experimentará aceleración alguna y se moverá a velocidad constante siendo esta
velocidad la máxima que alcanza en el seno del fuido bajo un campo eléctrico
uniforme. Dado que esta situación se alcanza a los pocos segundos, se puede
asumir que la velocidad es constante durante todo el desplazamiento.

USOS:

 Análisis de ADN
La electroforesis es una forma de analizar el ADN, o ácido desoxirribonucleico , que
es el código que contiene todas las características que heredas de tus padres . El
ADN se organiza en secuencias, por ejemplo, una secuencia representa el color de
tus ojos y otra secuencia representa el color de tu piel. Mediante electroforesis, las
secuencias específcas de ADN pueden ser analizadas, aisladas y clonadas. El ADN
analizado se puede utilizar en investigaciones forenses y pruebas de paternidad .

 Análisis de proteínas

La electroforesis ha desarrollado nuestro conocimiento sobre la estructura y función

de las proteínas. Estas moléculas son necesarias para las células de nuestro cuerpo
y pueden ser analizadas, por ejemplo, obteniendo muestras de sangre y orina.
Luego, a través de la electroforesis, la cantidad de proteínas en la sangre o en la
orina se mide y se compara con los valores normales establecidos, los inferiores o
superiores a los niveles normales por lo general indican una enfermedad .

 Análisis de antibióticos

La aplicación de la electroforesis en los estudios de los antibióticos se remonta a la

década de 1950. Otros estudios se efectuaron para mejorar las técnicas
electroforéticas y antibióticos nuevos. Estos medicamentos, como la penicilina, se
encuentran entre los fármacos ampliamente prescritos en contra de las infecciones
bacterianas. Con la electroforesis, los expertos no sólo son capaces de sintetizar
nuevos antibióticos, también son capaces de analizar qué tipos de bacterias son
resistentes a los antibióticos.

 Análisis de vacuna

La vacuna es un análisis de las muchas aplicaciones importantes de la

electroforesis. Hay varias vacunas que han sido purifcadas, procesadas y analizadas
a través de la electroforesis, como la vacuna contra la infuenza, la vacuna contra la
hepatitis y la vacuna contra la polio. Los pasos exactos realizados en el análisis de la
vacuna, sin embargo, no se pueden determinar debido a razones de
confdencialidad de las empresas farmacéuticas. Sin embargo, los informes de datos
de los fabricantes de vacunas, como Wyeth, Merck y Sanof-Aventis presentan la
electroforesis como un método de análisis efcaz de la vacuna.

DESVENTAJAS: según el tipo de electroforesis

Electroforesis de zona:

 Si el papel es fno se puede desgarrar con facilidad.

 Si el papel es grueso, las bandas se distorsionan
 Se produce interacción entre las proteínas y los grupos hidroxilos de la
celulosa del papel, por lo tanto la migración se frena

Según el tipo de soporte

 Papel: en desuso
 Acetato de celulosa: débil resolución y electro ósmosis. Se ha quedado
obsoleta. Captan poca agua y son más susceptibles a la evaporación que el
papel. Son también más susceptibles al fujo electro-endosmótico.

CONCLUSIÓN

En la industria actual la necesidad de resultados rápidos y fables hacen que el

mercado de instrumental de laboratorio sea cada día más dinámico. Por este
motivo, los proveedores están dando una rápida respuesta a las exigencias de
automatización, permitiendo determinaciones a niveles inferiores, mayor
especifcidad y mayor facilidad en la detección de cualquier fallo que pueda
presentar un producto.

En esta última época en ámbitos de análisis como la industria alimentaria o

farmacéutica, se están introduciendo nuevos equipos. Los equipos son mucho más
sofsticados, permitiendo acortar el tiempo en la generación de resultados, además
de procesar un mayor número de muestras con un mismo equipo.

Hoy en día, todos los centros de análisis comienzan a disponer de equipos

sofsticados. En la instrumentación, la investigación se enfoca en dotar al mercado
de nuevos equipos que permiten conocer los resultados en tiempo real y cada vez
con más precisión.

Este tema es importante para los que estamos en plena formación del Bioanálisis ya
que nos permite conocer, comprender y analizar cada método de separación de
muestras con las cuales nos desempeñaremos a futuro en nuestra profesión
enlazando a conocimientos anteriores por pequeños conceptos, logrando
familiarizarnos con estas técnicas y así facilitarnos poco a poco el manejo de éstas y
dándole cabida a la precisión que otorgan.