Fundamento, etapas, estandarización y

tipos de la pruebas de ELISA

Armando Reyna
Universidad Simón Rodríguez –IDECYT, Centro de Estudios Biomédicos y
Veterinarios, Laboratorio de Inmunobiología
areyna@inmunobiologia.net.ve

Universidad De las Fuerzas Armadas ESPE

Departamento de Ciencias de la Vida
Grupo de Investigación en Salud Animal y Humana
GISAH
 Ensayo inmunoenzimático
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ELISA
 Ensayo inmunoenzimático para la detección de
anticuerpos (ELISA)

•Fue introducida por Voller en 1.977

•Es la prueba más empleada comercialmente para el diagnóstico de diferentes
enfermedades, dopin, tecnología de los alimentos para buscar patógenos o
subproductos.
•Puede llegar a utilizarse de rutina en laboratorios especializados y aplicarla a gran
escala
•Varias modalidades:
•ELISA Indirecto (para la detección de Ac)
•ELISA COMPETITIVO
•ELISA SANDWICH (para la detección de antígeno)
 ELISA

ELISA Indirecto (Voller 1.977)

•Utiliza como antígenos extractos de microorganismos ó fracciones de los

mismos absorbidas a microplacas., proteínas purificadas o recombinantes, LPS,
Carbohidratos, etc.
•Muy sensible y puede detectar subtipos de anticuerpos, dependiendo del
conjugado
•Es una prueba de rutina hoy día en muchos laboratorios
•En laboratorios veterinarios, se utiliza menos, pero cada vez más empresas
emiten pruebas diagnóstica en formato ELISA y cada vez más son empleados
 El conjugado es un anticuerpo unido
covalentemente con una molécula marcadora (por
ejem. Peroxidasa), el cual reconoce a su vez otra
molécula de anticuerpo

IgG

Peroxidasa, sulfatasa,
oro, etc
ELISA INDIRECTO
 Pasos del ELISA Indirecto

1. Sensibilización con antígeno

2. Bloqueo con leche descremada al 5%

3. Adición de los sueros (bovinos y ovinos)

4. Adición de la anti-IgG unida a peroxidasa

5. Adición del sustrato (ABTS o TMB)

Lector de ELISA
 ELISA Indirecto

-
 ELISA

ELISA COMPETITIVO

Utiliza un Ac monoclonal específico que reconoce al antígeno. Es una técnica muy

comúnmente utilizada en estuches comerciales, debido a su gran especificidad
•Ampliamente distribuida.
•Alta sensibilidad
•Alta especificidad (discriminativa)
Anticuerpos Monoclonales
 1927-2002

Anticuerpos monoclonales (1975)

Georges Köhler y Cesar Milstein
Premio nobel 1984

Objetivo:

Estudiaban la recombinación genética

entre celulas
 Definición
Inmortalización de clones de células B
secretoras de anticuerpos

Anticuerpos monoclonales
homogéneos y específicos

Anticuerpos secretados por un solo clon

de hibridoma ya que cada clon se deriva
de una sola célula B.

TODOS los anticuerpos

secretados son idénticos.
Células de Bazo del animal inmunizado

* Capaces de secretar anticuerpos con

especificidad definida

* Vida media limitada in vitro

* HGPRT + (gen de la enzima Hipoxantina-Guanina-

Fosforibosil-Transferasa (HGPRT)
 Células tumorales: mielomas

- Adaptados a crecer in vitro exponencialmente

- Marcador de selección: deficiencia en el gen de la

enzima Hipoxantina-Guanina-Fosforibosil-Transferasa
(HGPRT)

- No sintetizan ni secretan Igs propias

- Fenotipo para la alta secreción de Igs

- Capacidad para inducir tumores in vivo

Ejemplos: P3/x63.Ag8.653, Sp2/0-Ag14, NS-1, NS-0

G. Köhler & C. Milstein (1975). "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefined specificity". Nature 256 (5517): 495.
Etapas para la producción de anticuerpos monoclonales

II
Fusión
I
Inmunización

IV III
Screening Cultivo
(plaqueo)
 III
Cultivo
(plaqueo)

20 días Clones viables,

Cultivo en P96 (placas cultivo en medio HT.
de ELISA con tapa) P12
Medio HAT
IV Screening
IV Screening

15 días

V IV
Congelación Screening
10 días
Clones viables,
cultivo en medio HT.
Placas de Petri
 Pasos del ELISA Competitivo (cELISA)

1. Sensibilización con antígeno

2. Bloqueo con leche descremada al 5%

3. Adición de los sueros + Mab

4. Adición de la anti-IgG de raton unida a peroxidasa

5. Adición del sustrato (ABTS o TMB)

Lector de ELISA
ELISA COMPETITIVO
 ELISA

ELISA SANDWICH
Antigenemia:

•Ag de secreción
•Microorganismos lisados por el sistema Inmune
•Menos empleado
•Más dificil de estandarizar comparándolo con otros ELISA
ELISA SANDWICH
 Influencia del antígeno y del suero
para la estandarización de la prueba
de ELISA
 ELISA

ELISA CONVENCIONAL (Voller 1.977)

Antígenos utilizados:

•Extractos totales.
Soluble
•Proteínas recombinantes
•Proteínas purificadas
•Extractos parciales purificados
Prueba de diferentes concentraciones del antígeno frente a dos
diluciones del suero

1,6
1,4
Absorbancias a 450 nm 1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
(1:100) (1:200) (1:100) (1:200) (1:100) (1:200)
(0,5 mg/ml) (1 mg/ml) (2 mg/ml)
Sueros
 Influencia del Conjugado y del
cromógeno para la estandarización
de la prueba de ELISA
 Empleo de dos sustratos (ABTS y TMB) en el ELISA
utilizando la MSP5r como antígeno y diferentes
concentraciones del conjugado

3,5

3
3
2,5

D.O (595-450 nm)

D.O. (405nm)

2
2
1,5

1 1

0,5

0 0
1/ 2.500 1/ 5.000 1/10000 1/20000 1/2500 1/5000 1/10000 1/20000
Conjugate dilution Conjugate dilutions
ABTS TMB
ABTS TMB
 Empleo de dos sustratos (ABTS y TMB) en el ELISA
utilizando la T. evansi como antígeno y diferentes
concentraciones del conjugado

ABTS TMB
1,6 1,6

O.D (450-630 nm)

O.D. (405 nm)

1,1 1,1

0,6 0,6

0,1 0,1
S1 + S2 + S3 - S4 -
S1+ S2+ S3- S4-
Ovine serums
Ovine Serums

ABTS TMB
 Estudio por ELISA de la cinética de
anticuerpos anti-MSP5r de tres bovinos infectados
experimentalmente

3,0

2,5
Densidad óptica a 450

2,0

1,5

1,0

0,5 Punto de corte

0,0
0 10 20 30 40 50 60 70
Días post infección
Estudio por ELISA de la respuesta anti-MSP5r de
una población bovina de origen venezolano

2,5 36% 49%

Densidad óptica a 405 nm

1,5

Punto de corte
0,5

0
0 20 40 60 80 100 120
Sueros bovinos de zonas endémicas
Epidemiología
 Epidemiología

Ensayo inmunoenzimático
de sueros Bovinos de la E.E. La Iguana
Seroprevalencia de 93,7 %

1,6
1,4
D .O (450 nm)

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 10 20 30 40 50 60
N úmero de sueros

(Eleizalde et al. 2003)

 Epidemiología

Ensayo inmunoenzimático
de sueros Bovinos de Rio Chico, Edo. Miranda

Seroprevalencia de anaplasmosis
1.8
1.6
1.4
1.2
D.O.

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80
Nº de animales

57,53 % Seropositivos a anaplasmosis

 Epidemiología

Ensayo inmunoenzimático
de sueros ovinos de la E.E. La Iguana
Seroprevalencia de 80.46 %

2,0

1,5
DO 450 nm

1,0

0,5

0,0
Sueros

(Tavares et al. 2002)

 Epidemiología

Ensayo inmunoenzimático
de sueros de caprinos de la E.E. La Iguana

Seroprevalencia 59,25 %

1,5
Abs (450

0,5

Sueros

(Nuñez et al. 2002)

PCR anaplasmosis
 Epidemiología

Sueros de sus respectivas descendencia a diferentes horas.

Análisis por ELISA de los promedios de los calostro de las
vacas y de los becerros

Calostros Sueros de becerros

0,6
Densidad óptica

0,4

0,2

0
0 10 20 30 40 50 60
Horas después del parto
MSP5 purificada por la columna de afinidad

179
115
83
62
49
37
25

19

14

MSP5r
Estandarización del ELISA utilizando la proteína
recombinante y el suero de conejo anti E. coli

Sensibilización con MSP5

Bloqueo con leche descremada 5%

Adición de suero de conejo anti E. coli

Adición de sueros Bovinos positivos (anti MSP5)

y negativos
Adición de anti IgG bovino unido a peroxidasa

Adición del sustrato TMB

MSP5r

Contaminantes E. coli
Estandarización del ELISA utilizando la proteína
recombinante y el suero de conejo anti E. coli

Sensibilización con MSP5 1μg/ml

Bloqueo

Adición de suero anti E. coli 1/25, 1/50, 1/100

Adición de suero Bovino 1/100, 1/200, 1/400

Conjugado 1/5000, 1/10000, 1/20000,1/40000

Adición del sustrato TMB

MSP5r
Adición de solución STOP
Contaminantes E. coli
Lectura a 450 nm
 Resultados

Determinación de la concentración óptima de suero anti E. colii

Conjugado 1/10000. Antígeno 2 µg/ml

Suero bovino 1/100 Suero bovino 1/200

ABCDE ABCDE
1
0,9 1
0,8
0,8
D.O (450 nm)

D.O (450 nm)

0,7
0,6
0,6
0,5
0,4 0,4
0,3
0,2 0,2
0,1
0
0
0,04 0,02 0,01 Sin S.C
0,04 0,02 0,01 Sin S.C
Diluciones de suero anti E.coli
Dilucion de suero anti E.coli

A suero hiperinmune
B suero bovino infectado
C D E sueros negativos franceses

Eleizalde et al, 2004

 Resultados
Curso temporal de infección seguida por ELISA con y sin suero
anti E. coli. Cromógeno TMB.

2
1,8
1,6
1,4
D.O (450 nm)

1,2
+ Suero
1
- Suero
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 5 10
Se manas de infección

Eleizalde et al, 2004

Otras pruebas serológicas que atizan conjugados.
Bell et al. Nature Reviews Microbiology 4, S7–S20 (September 2006) | doi:10.1038/nrmicro1525
1

4
Principio de la fluorescencia polarizada
Principio de la fluorescencia polarizada
Principio de la fluorescencia polarizada
Principio de la fluorescencia polarizada