TITULO

RESUMEN

1. INTRODUCCION
2. OBJETIVOS
3. MARCO TEORICO
3.1 QUE ES BIOLIXIVIACION
3.2 CULTIVO DE BACTERIAS
3.2.1 MEDIOS DE CULTIVO[1]
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos.

CONSTITUYENTES HABITUALES DE UN MEDIO DE CULTIVO

AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo
EXTRACTOS. Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos animales o
vegetales (p.e. carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor y
posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados
deshidratados son a menudo empleados en la elaboración de los medios de cultivo. Los
más utilizados son el extracto de carne, de levadura y el de malta.
PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos, nitrogenados y sales
minerales, que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o
vegetales (soja caseína carne, etc.).
SISTEMAS AMORTIGUADORES. Para mantener el pH dentro del
rango optimo del crecimiento bacteriano a veces, es necesario añadir
algunos componentes al medio de cultivo
AGENTES SELECTIVOS. La adición de determinadas sustancias a un medio de cultivo puede
convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta, sales biliares, azida
sodica, telurito potasico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada hará que actúen
como agentes selectivos frene a determinados microorganismos.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS GENERALES. Son aquellos que permiten el crecimiento de una gran variedad de
microorganismos.
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. Son aquellos que favorecen el crecimiento de u
determinado tipo de microorganismo sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento de los
demás.
MEDIOS SELECTIVOS. Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo de
microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.
MEDIOS DIFERENCIALES. Son aquellos en los que se pone de manifiesto propiedades que
un determinado tipo de microorganismos posee
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados,
normalmente como productos liofilizados que es necesario hidratar. En general la
preparación de un medio de cultivo consiste en pesar la cantidad necesaria del polvo
liofilizado, disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las
instrucciones del fabricante y esterilizar la disolución, previa comprobación y corrección
del pH si es necesario. Antes de ser esterilizados en autoclave, los medios líquidos se
distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces) y se tapan; en ningún caso la
altura del líquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de éste. Si se
trata de un medio que contenga agar (sólido o semisólido) suele ser preciso calentarlo (al
baño María o al microondas) para fundir el agar antes de esterilizarlo en el autoclave. Una
vez fundido se reparte, en caliente, en matraces o tubos (nunca en placas de Petri), se
tapa y se esteriliza

3.2.2 FASES DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO BACTERIANO[2]

Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial
prolongado. Si ello ocurriera en poco tiempo la tierra estaría tapada de una masa
microbiana mayor que la de la tierra misma. El crecimiento está normalmente limitado por
el agotamiento de nutrientes o por la acumulación de productos del mismo metabolismo
microbiano, que les son tóxicos a la población. La consecuencia es que el crecimiento al
cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta detenerse.
Es posible distinguir cuatro fases:
1) fase de latencia o de retardo
2) fase exponencial
3) fase estacionaria
4) fase de muerte
En la fase de latencia existe un aparente reposo en el que las células sintetizan las enzimas
necesarias para la actividad metabólica que deben llevar adelante. Cuando se hacen
mediciones del número de células en distintos tiempos dentro de esta fase, el valor no
cambia sustancialmente. En cambio, interiormente las células trabajan activamente
adaptando el equipo enzimático al medio de cultivo. La bacteria se prepara para hacer uso
de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase de adaptación al medio,
con aumento de la masa celular pero no del número de células. La edad del inóculo va a
influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la acumulación de materiales
tóxicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la célula durante el crecimiento
anterior. En general, inóculos viejos alargan la fase de latencia.
 figura 1. curva de crecimiento bacteriano
FIGURA TOMADA DE
https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/153084/mod_resource/content/
1/2018%20TP3%20BIOQ%20Y%20LCTA.pdf

Pasado este período, el cultivo entra en la denominada fase de crecimiento exponencial,

donde la velocidad de crecimiento es máxima. La velocidad de crecimiento que alcanza un
cultivo, depende del tipo de microorganismo que se trate y diversos factores ambientales
como son la temperatura, el pH, oxigenación, etc.
La velocidad de crecimiento comenzará a disminuir hasta hacerse nula cuando alcance la
fase estacionaria, ya que cambios en la composición y concentración de nutrientes entre
el cultivo del inóculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la regulación de
la actividad enzimática.
Esta fase se presenta por agotamiento del suministro de algún nutriente esencial o por
acumulación de productos metabólicos que sean tóxicos. También puede ser por la
disminución de la oxigenación o cambios en las condiciones de pH del medio de cultivo
(acidificación o alcalinización): En esta fase se equilibran el número de células nuevas con
el número de células que mueren. Por último, el cultivo entra en la fase de muerte, en la
que el número de células que mueren se va haciendo mayor.

3.2.3 METODOS DE MEDICION DEL CRECIMIENTO

El crecimiento se evalúa haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de

la población en estudio. En cada momento se evalúa cual es la población en ese
instante. Existen diversas formas de evaluar una población bacteriana.

a. Conteo microscópico directo: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un
equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología, ya que
consiste en contar con un microscopio la cantidad de células presentes en un
volumen determinado.
Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos ( cámara de
Petroff Hauser, cámara de Neubaver ). Una de las mayores ventajas del recuento
 microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de
los objetos contados.
La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en medio líquido), o
puede prepararse una dilución.

figura 2. camara de neubaver

b. Conteo de células viables: El método se basa en la consideración que el

crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar
colonias. Este método puede hacerse con medios sólidos o líquidos. El método
más frecuentemente empleado es el conteo en placas (medios sólidos) formando
colonias. Por lo tanto se determinan por este método sólo las células microbianas
VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmósfera, temperatura). Para
ello se siembra una cantidad conocida de la suspensión bacteriana cuyo número
se desea conocer. En un medio sólido cada bacteria se multiplicará formando una
colonia visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden
originarse tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término:
UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.), y esto puede constituir una
desventaja ya que si dos bacterias no se separan darán una sola colonia,
subestimando de esta forma el número de microorganismos en la suspensión.
Además, a los efectos de que todas las células que queden en una placa tengan
una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean
menores, se establece que las condiciones óptimas de conteo se dan cuando
desarrollan entre 30 y 300 colonias.
c. Medición de la densidad bacteriana: Es una técnica en la que se mide la masa de
microorganismos en una suspensión. Para ello se utiliza un espectrofotómetro y se
mide la cantidad de luz que atraviesa en una suspensión de microorganismos, en
comparación con un blanco que es el medio esterilizado y sin sembrar. Cuanto
mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el porcentaje de luz
que atraviesa el medio. Para relacionar la transmitancia con al densidad
bacteriana se requiere de hacer curvas patrón de densidad conocidas.
 d. Otros métodos de recuento
Determinación de ATP: Es una técnica que permite determinar indirectamente la
masa de una población bacteriana. Se considera que la proporción de ATP
encontrado en una muestra es proporcional con la presencia de células vivas
Recuento electrónico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de
bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y
microorganismos filamentosos o miceliares
3.2.4 CINETICA DEL CRECIMIENTO CELULAR

Si un medio líquido es inoculado con un cultivo semilla, las células comenzarán a

crecer exponencialmente después de la fase de lag. La velocidad de crecimiento
celular sigue la cinética de Monod, como se expresa a continuación:

Donde 𝜇𝑚á𝑥 es la constante de velocidad máxima, 𝐶𝑠 es la concentración de sustrato,

𝐶𝑥 es la concentración de células, y 𝐾𝑠 es la constante de Monod.

4. METODOLOGIA
4.1 Cultivo

Preparación del medio de cultivo

Todos los elementos y productos químicos utilizados para la preparación de medio de

cultivo se esterilizaron en autoclave durante 15 minutos a 120 ° C. Todas las soluciones
acuosas se prepararon usando agua destilada. Todos los reactivos utilizados fueron de
grado analítico

Como medio de cultivo se utilizó medio 9k el cual fue preparado a partir de las siguientes
proporciones encontradas en la literatura
 Medio 9k liquido Cantidad
Solucion A
(NH4)2 SO4 3g
K2HPO4 0.5g
KCL 0.1g
MgSO4 7H2O 0.5g
Ca(NO3)2 0.01
Agua destilada 700ml
Solucion B ( fuente de energía)
FeSO4 7H2O 44.8g
Agua destilada 300ml
Se ajustan ambas soluciones al pH deseado con H2SO4 10N

Tabla 1. Formula para la preparación del medio 9K liquido. Fuente: Merino & Saez. 1973

La solución A contenía 3 g de (NH4) 2SO4, 0,1 g de KCl, 0,5 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4H2O y 0,01
g de Ca (NO3) 2, se diluyó esta mezcla de sales básicas en 700 ml de agua destilada y se sometió a
autoclave a 120 ° C durante 15 minutos.

La solución B preparada con 44.8g de FeSO4 7H2O se filtro en una cabina de esterilización

Figura 3. Preparacion de solución B en cabina de esterilizacion

 Figura 4. Medio 9K preparado

4.1.1. Consorcio

Observamos en la siguiente tabla algunos de los microorganismos que conforman el

consorcio con el cual se trabajó. Commented [SG1]: Si tienes fotos de las balitas,
enganchalas aqui, plissssssssssssssssss

Rango T/
Tipo Organismo Rango pH Agente lixiviante
°C
Bacterias Leprospirillum Ferrodidans 2,5-3 30°C Fe (III)
Quimioli- Thiobacillus ferroxidans 1,4-6 28-35°C Fe (III),H2SO4
trotoficas Thiobacillus thiooxidans 0,5-6 10-37°C H2SO4
Bacterias Pseudomonas putida Citrato
heterotrofas Acetobacter methanolicus Acidofila Gluconato
Acidiphilum cryptum 2,0-6 Mesofilica Acidos organicos
Hongos Aspergillus niger 30 Cistrato
heterotrofi- Penicilium simplicissimum 22-30 Oxalato
cos Cladosporium resinae 28 Lactato

Tabla 2. Consorcio de bacterias para este trabajo

4.1.2 Sustrato

El disulfuro de hierro (FeS2) se puede encontrar en abundancia en

yacimientos minerales.
Morfológicamente se distinguen dos tipos: la pirita de estructura cúbica y la
marcasita de
estructura ortorrómbica. Esta diferencia les proporciona además propiedades
termodinámicas diferentes.
En particular la pirita tiene un 53,4% de azufre y un 46,4% de hierro y es
comúnmente conocida como “oro falso” por su brillo y color similar al metal
noble. En los yacimientos se pueden encontrar otros minerales con el mismo
contenido de hierro y azufre pero asociados a otros elementos, tales como la
calcopirita (CuFeS2) y la arsenopirita (FeAsS2). (Lowson 1982). [3]

La lixiviación de pirita ocurre con alta recuperación en presencia y en

ausencia de bacterias bajo diversas condiciones de estudio. Análisis de la
velocidad de reacción como función de la concentración de ión férrico indican
que el orden de la reacción es el mismo en presencia y
en ausencia de bacterias, el orden de reacción es 0,5. Sin embargo, el orden
de reacción con respecto a la concentración de protones (H+) es -0,5 en
ausencia de bacterias, y -0,39 en presencia
de actividad biológica. Esto sugiere que la presencia de bacterias no cambia
el mecanismo de lixiviación de pirita, pero en cierta forma afecta el pH en la
superficie del mineral (Fowler et al,1999).

4.2 ADAPTACIÓN CONSORCIO AL MINERAL DE PIRITA

Se tomaron microorganismo preservados en las instalaciones del laboratorio

de bioprocesos de la Universidad del Atlántico, los cuales se sabía de ante
mano eran bacterias acidófilas, estas se reactivaron metabólicamente en
medio 9K, se tomó 2 ml de este preservado, para un volumen de trabajo de
80 ml en un Erlenmeyer.
I FASE
La primera etapa consistió en una recuperación metabolica en la cual se tomó
el consorcio de microrganismos y se empezó una inoculación con el medio
9K, para ello se tomaron tubos de ensayo en los cuales se cultivaron los
microorganismos.
El medio 9k del cual se disponía de 1L, se distribuyó de manera equivalente
Se realiza los respectivos cálculos de acuerdo al volumen manejado por los
tubos de ensayo llegando a la conclusión de que se podía trabajar en
volúmenes de 10ml
Medio 9k
Para 1L de medio se requiere 700mL de solución A, para un volumen mas
pequeño de medio en este caso 60mL(trabajando en 5 tubos de ensayo de
10ml cada uno) se necesita 42ml de solución A
De igual manera para la solución B serian 18ml, luego el medio ya preparado
se procede a ajustar buscando tener un pH acido

Figura 5. Ajuste de pH
Esta recuperación se realizó durante dos semanas renovando el medio
bacteriano cada 3 días, tomando alícuotas de 10 micro litros para la siguiente
etapa de recuperación, y realizando el mismo procedimiento en 5 tubos de
ensayo con el medio 9K

II FASE
Para esta fase se usaron Erlenmeyer de 150 y 200 ml, con volúmenes de
muestra de 80 ml, procurando tener un volumen mucho mayor ya que se
quiere un crecimiento bacteriano suficiente
La adaptación de los microorganismos se realizó de manera lenta y
progresiva, suministrándole a los microrganismos todas las condiciones
necesarias para su correcto funcionamiento (35°C de temperatura, 2.4 de pH,
aire, nutrientes provenientes del medio 9k y oscuridad).
 Se realizó resembrados cada 8 días durante 4 semanas, aumentando la
cantidad del sustrato y disminuyendo el (FeSO 4) 7H2O, fuente de energía
original del medio 9k y se llevó a cabo de la siguiente manera:

Siembra 1: 44.8 g de (FeSO4)7.H2O y 0 g mineral de pirita

Siembra 2: 29.86 g de (FeSO4)7.H2O y 6.25 g mineral de pirita
Siembra 3: 14.93 g de (FeSO4)7.H2O y 12.5 g mineral de pirita
Siembra 4: 0 g de (FeSO4)7.H2O y 18.75 g mineral de pirita

Nota: Todos estos valores fueron para un valor de 1 litro de medio.

Figura 6. Muestras de trabajo

5. RESULTADOS

5.1 CINÉTICA DE CRECIMIENTO

Información tomada de:

http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Cell_counts_SPA.pdf
Para obtener la dinámica o cinética de crecimiento del cultivo se eligió hacerlo por
medio de la técnica directa de conteo por cámara de Neubauer, siguiendo el
siguiente procedimiento:
 1) Se tomó una alícuota de 10 µL del cultivo a las 0, 24, 48, 72, 96, 120 y 144
horas
2) Se diluyó la alícuota del paso anterior dependiendo de la concentración
celular del momento; a las 0 y 24 hora no se diluyó, a las 48 horas se diluyó
a la 10-1 y a partir de las 72 hasta las 144 horas se diluyó hasta 10 -2.
3) Se tomó 10 µL del paso anterior y se mezcló con otros 10 µL de azul de tripán
al 0.4%.
4) Se homogenizó esta mezcla por pipeteo unas 8 veces.
5) Se tomo 10 µL de esta mezcla y se sirvió en la cámara de Neubauer
6) Se enfoco el microscopio en el objetivo X4, así hasta encontrar el objetivo
hasta X40.
7) Se deja reposar alrededor de 1 minuto la suspensión celular para que se
asienten mejor las células.
8) Se procedió a contar
9) Se calculó el número de células vivas por mililitro, teniendo en cuenta la
dilución por azul de tripán
Siguiendo todos estos pasos, se obtuvo este resultado:

Figura7. Celulas observadas antes de realizar el conteo

 Muestra 1
Hora
Conteo Camara Factor de dilución # de microorganismos/ml

0 164 1 820000

24 182 1 910000

48 105 10 5250000

72 53 1,00E+02 26500000

96 72 1,00E+02 36000000

120 69 1,00E+02 34500000

144 65 1,00E+02 32500000

Tabla 3. Datos experimentales de crecimiento bacteriano

A partir de la información de la tabla 3, se obtuvo la siguiente curva de crecimiento

bacteriano

Curva de crecimiento bacteriano

40000000

35000000

30000000
#Celulas /ml

25000000

20000000

15000000

10000000

5000000

0
0 24 48 72 96 120 144 168
Tiempo(h)

Figura 4. Curva de crecimiento bacteriano hallada después del conteo

 5.2 DETERMINACION DE PARAMETROS CINETICOS

Para hallar el µmáx del cultivó se procedió identificar la zona de crecimiento y obtener
la pendiente del siguiente sistema.

𝑑𝑁 𝑁 𝑑𝑁 𝑇
= 𝜇𝑛 𝑁 → ∫𝑁 = ∫0 𝜇𝑛 𝑑𝑡 = 𝜇𝑛 𝑡 = 𝑙𝑛(𝑁/𝑁0 )
𝑑𝑡 0 𝑁

Donde:
N: Número de células (células/ml)
N0: Numero de células iniciales (células/ml)
t: tiempo(h)
µn : Velocidad de crecimiento (h-1)
A partir de los siguientes datos:

µrelativo
Hora ln(N/N0)
24 0
48 1,752538756
72 3,371455412
96 3,677829618
µ(hr^-1) 0,0527

Tabla 4. Datos para hallar µmáx

Este sistema es idéntico a una línea recta, donde hay una variable dependiente una
independiente y una constante por tal motivo la pendiente o constante de este
sistema es igual a la velocidad de crecimiento µn desde que hay suficiente sustrato
µn = µmáximo
 µ (hr^-1)
4.5
4
3.5
3
ln(N/N0)

2.5
2
1.5
1
y = 0.0527x + 0.3026
0.5 R² = 0.9311
0
0 24 48 72 96
Tiempo (h)

Figura 5.

µ= 0.0527 h-1

5.3 SEGUIMIENTO DE PH

El sistema presentó un comportamiento en donde se acidifico el cultivo, lo mas

probable es que existan bacterias productoras de acidó sulfúrico, es decir el sistema
se encuentra regido por un mecanismo indirecto de lixiviación

pH
Hora Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
0 2,4 2,4 2,4
24 2,38 2,35 2,35
48 2,32 2,33 2,34
72 2,29 2,29 2,33
96 2,2 2,21 2,25
120 2,16 2,18 2,23
144 2,12 2,14 2,16
168 2,25 2,38 2,41
Tabla 5. Resultados de la medición de Ph para cada muestra
A partir de estos datos, obtenemos la grafica
 Seguimiento pH
2.45

2.4

2.35

2.3
pH

2.25

2.2

2.15

2.1
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
tiempo (h)

Figura 6. Grafica pH vs t obtenida a partir de los datos anteriores

[1] https://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf
[2]
http://www.fca.uner.edu.ar/files/academica/deptos/catedras/microbiologia/unidad_3_cr
ecimiento_bacteriano
[3] Arias A., V., Lovera D., D., Quiñones L., J., Flores P., A., Gil R., J., Ramírez, L., &
Cayo, H. (2016). Biolixiviación de cobre a partir de minerales sulfurados con altos
tenores de pirita y arsenopirita. Revista del Instituto de Investigaciones de la Facultad
de Geología, Minas, Metalurgia y Ciencias Geográfica, 18(36). Recuperado
de http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/iigeo/article/view/12164