Resistencia de Biopelículas de Pseudomonas Aeruginosa

Maestría en Ciencias con Mención en Microbiología
MONOGRAFÍA
RESISTENCIA DE BIOPELÍCULAS Y POBLACIONES

PLANCTÓNICAS DE Pseudomonas aeruginosa
AUTORA:
- Lic. Johana Edith Aparicio Sigueñas
ASESORAS:
- Dra. Nancy Llalud Malca Tello

- Dra. María del Socorro Vásquez del Castillo
Trabajo como requisito de la asignatura

Metodología de la Investigación Científica
Lambayeque, 27 de Enero de 2013

RESISTENCIA DE BIOPELÍCULAS Y POBLACIONES PLANCTÓNICAS DE Pseudomonas aeruginosa
ÍNDICE
Resumen 3
Abstract 3
Introducción 4
Resultados
BIOPELÍCULAS 6
¿Qué son Biopelículas? 6
Formación de Biopelículas 8
Importancia en la Infección 9
Mecanismos de Resistencia de las Biopelículas 11
Metodología para el estudio de las biopelículas 12
Pseudomonas aeruginosa 14
Características Generales 14
Patogenicidad 15
Mecanismo de Resistencia a Quinolonas en P. aeruginosa 16
Conclusiones 18
Referencias Bibliográficas 19
2
RESUMEN
Problema: ¿Cuál es la resistencia in vitro de biopelículas y poblaciones planctónicas de

Pseudomonas aeruginosa intrahospitalaria frente a Ciprofloxacino? Objetivo: Evaluar in
vitro la resistencia de biopelículas y poblaciones planctónicas de Pseudomonas
aeruginosa intrahospitalaria frente a Ciprofloxacino. Resultados: Fueron revisadas 20
fuentes bibliográficas relacionadas con el tema tratado. Se comprobó que las biopelículas
son poblaciones de células que crecen unidas a superficies inertes o vivas envueltas en
una matriz de exopolisacáridos que las protege del ataque de los antibióticos. Asimismo
se encontró que Pseudomonas aeruginosa produce infecciones en pacientes con
defensas inmunológicas deficientes y es un patógeno nosocomial importante. Además
investigaciones in vitro han determinado que la capacidad de formación de biopelículas y
que las bacterias asociadas a estas estructuras fueron mucho menos sensibles a la
acción de los antimicrobianos que sus correspondientes células planctónicas.
Conclusiones: Una misma cepa, como en el caso de la Pseudomonas aeruginosa, tiene
un comportamiento distinto frente a Ciprofloxacino, de acuerdo a su forma de crecimiento.
Palabras Claves: biopelículas, infección, resistencia, antibióticos.
ABSTRACT
Problem: What is in vitro the resistance of biofilms and planktonic populations of

Pseudomonas aeruginosa in a hospital against Ciprofloxacin? Objective: To assess in
vitro resistance of biofilms and planktonic populations of Pseudomonas aeruginosa in a
hospital against ciprofloxacin. Results: We review 20 bibliography sources about our
topic. We got that biofilms are a cell population which grows up together in a wrapped
surface in a exopolysaccharide matrix which protects them of antibiotic attacks. Also we
found that Pseudomonas aeruginosa is the cause of infections in immunosupressed
patients and it is an important nosocomial pathogen. Furthermore, investigations in vitro
has determined that the capacity to produce biofilms and that sessile bacteria were much
less sensible to antimicrobial action that their corresponding planktonic cells.
Conclusions: The same strain, as in case of Pseudomonas aeruginosa, has a different
response to ciprofloxacin, according to its growth.
Key Words: biofilms, infection, resistance, antibiotics.
3
INTRODUCCIÓN
La percepción de la bacteria como una forma de vida unicelular, la cual podemos

cultivar en un medio líquido y analizarle su comportamiento, es el método más usado para
el estudio de muchas actividades bacterianas como la patogénesis y la fisiología
microbiana entre otras, pero la realidad es que el crecimiento planctónico puro es poco
común, las bacterias frecuentemente se desarrollan en complejas comunidades y son las
responsables del mantenimiento biogeoquímico de la biosfera. (1)
Se calcula que en 75% de las infecciones bacterianas intervienen biopelículas,

colonias de bacterias adheridas a las superficies, protegidas por una matriz extracelular.
Las bacterias protegidas en las biopelículas son hasta 1 000 veces más resistentes a los
antibióticos que si flotaran libremente (es decir, que si fueran planctónicos), lo cual
(2)
complica gravemente las opciones de tratamiento. Tal es el caso de Pseudomonas
aeruginosa que forma biopelículas en dispositivos médicos, siendo además agente causal
de la fibrosis quística, cuyo tratamiento se asocia regularmente al desarrollo de resistencia
a Ciprofloxacino. (3)
Una de las proezas de la medicina moderna como resultado de la investigación

científica ha sido el progreso en el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad
infecciosa con antibióticos, lo que ha permitido controlar efectivamente infecciones
agudas. Sin embargo, hay dos excepciones: las bacterias que son innatamente
resistentes a los medicamentos y las bacterias que residen dentro de biofilms que
presentan una resistencia a los antimicrobianos mil veces mayor a las que viven en forma
planctónica. (1)
El objetivo del presente trabajo es evaluar in vitro la resistencia de biopelículas y

poblaciones planctónicas de Pseudomonas aeruginosa intrahospitalaria frente a
Ciprofloxacino. Siendo este trabajo de gran importancia ya que las infecciones producidas
por biopelículas de P. aeruginosa son cada vez mayores en la actualidad en los diferentes
hospitales de Chiclayo.
4
Para demostrar dicha resistencia en las diferentes formas de crecimiento de

Pseudomonas aeruginosa me he planteado buscar información acerca de los
antecedentes de diferentes estudios relacionados con la formación de biopelículas,
importancia en la infección y su resistencia, características generales de la bacteria antes
mencionada, sus mecanismos de resistencia frente a quinolonas, además de pruebas
realizadas a éstas, y los puntos de vista de diferentes investigadores como también las
acciones de estos frente a la situación.
5
I. BIOPELÍCULAS
1.1. ¿Qué son Biopelículas?
Las biopelículas son comunidades complejas de microorganismos presentes en

ambientes naturales formadas por asociaciones de una o múltiples especies con una
organización semejante a la de los organismos multicelulares. Están compuestas
principalmente por polisacáridos, proteínas y algunas veces pueden contener lípidos,
ácidos nucleicos y otros biopolímeros. (4)
Las biopelículas o también llamadas “biofilms” crecen embebidos en una matriz de

exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o a un tejido vivo. También se definen
como una comunidad estructurada de microorganismos inmovilizados, adheridos a una
superficie inerte o viva, encapsulados en una matriz polimérica orgánica de origen
bacteriano, que representa una forma de crecimiento protegida en un medio hostil. Las
comunidades microbianas mantienen una forma de comunicación a través de la detección
del quórum, emplean diferentes señales químicas para supervisar su entorno, alterar la
expresión genética y obtener ventaja sobre sus competidores. (5)
Un biofilm es una comunidad sésil derivada de microbios caracterizada por células

irreversiblemente unidas a un sustrato o interfaz o entre sí, embebidas en una matriz
extracelular de sustancias polimerizadas por ellas producidas y que exhiben un fenotipo
alterado con respecto al índice de crecimiento y trascripción de genes”. Las colonias de
microbios que crecen en un medio sólido como el agar forman matriz extracelular pero no
son biofilms porque conservan el fenotipo de las planctónicas, son planctónicas
encalladas y no tienen, en la colonia o libres, la resistencia característica en la comunidad
sésil. . Los biofilms son formas de vida adaptadas para sobrevivir en medios hostiles y los
(6)
medios de cultivo, a menos que elijamos lo contrario, son ricos en nutrientes.
El biofilm estructuralmente está constituido por tres componentes: la masa de

células la cual puede estar formada por una sola especie o por múltiples especies
microbiológicas, los espacios intercelulares o canales, los cuales se han comparado con
el sistema circulatorio de organismos superiores y la matriz extracelular que lo rodea
compuesta por una mezcla de exopolisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y otras
sustancias. El componente mejor estudiado es el exopolisacárido, muchas bacterias son
6
capaces de producir exopolisacáridos (cápsulas) o excreciones celulares que rodean los

ambientes. Es posible que el exopolisacárido juegue varios papeles en la estructura y
función del biofilm o que los exopolisacáridos tengan un papel diferente en comunidades
microbiológicas similares bajo condiciones ambientales diferentes. (1)
Las biopelículas que se encuentran en la naturaleza consisten en comunidades de

microorganismos primarios viables y no viables protegidos por sustancias poliméricas
extracelulares (EPS) polianiónicas fijadasa la superficie. Las EPS pueden contener
polisacáridos, proteínas, fosfolípidos, ácidos nucléicos, ácidos teicoicos y otras sustancias
poliméricas hidratadas con un porcentaje de agua entre 85 y 95%. Las EPS protegen a
los microorganismos que hacen parte de la biopelícula contra agentes antimicrobianos,
previenen al acceso de biocidas, secuestrantes metálicos, toxinas, evitan la
deshidratación, refuerzan la resistencia de la biopelícula al estrés ambiental y permiten a
los microorganismos capturar los nutrientes. (7)
Los biofilms que crecen bajo corrientes terminales se observan poco uniformes y
están constituidos por células redondas, irregulares, agregados separados por espacios
intersticiales; los que crecen bajo corrientes turbulentas se observan disparejos,
elongados, en serpentina y oscilan en la mayor parte del fluido y el biofilm estratificado y
compacto crece sobre los dientes. (1)
El estudio de estas biopelículas ha demostrado que se componen de 97% de agua,

el resto son células microbianas y productos derivados de éstas. Se ha reportado que son
estructuras heterogéneas con tres patrones químicos, que corresponden a diferencias en
gradientes de concentraciones desde el exterior al interior de la biopelícula. El patrón de
sustrato metabólico determina mayor concentración en el exterior y menor en el interior, el
patrón de producto metabólico es inverso al anterior y el patrón de intermediarios
metabólicos muestra mayor concentración entre la parte limítrofe de la biopelícula en la
fase acuosa. Estos patrones traen como consecuencia que dentro de estas estructuras se
establezcan diferencias de gradientes de pH y oxigenación, lo que permite que se instalen
poblaciones microbianas aerobias, anaerobias o facultativas dentro de los diferentes
estratos de la biopelícula, así como poblaciones microbianas que pueden considerarse
para entender las diferencias de susceptibilidad al tratamiento con antibióticos, ya que es
(8)
diferente la respuesta a las formas libres (planctónicas) que a las adheridas (sésiles).
7
1.2. Formación de Biopelículas
El biofilm o biopelícula se forma cuando la bacteria detecta ciertos parámetros

ambientales; disminución o aumento de la disponibilidad de nutrientes y de hierro,
cambios en la osmoralidad, el pH, la tensión de oxígeno y la temperatura, que disparan la
transición de la forma planctónica a un crecimiento sobre una superficie. El ambiente que
desencadena esta transición varía de un organismo a otro. Las bacterias pueden
colonizar una amplia variedad de superficies en ambientes bióticos o abióticos habitados
por formas superiores de vida y espacios adversos; su habilidad para persistir en la
(1)
biosfera obedece en parte a su versatilidad metabólica y su plasticidad genotípica.
El principio de la formación de una biopelícula se establece como parte de los

procesos que se pueden presentar en el mecanismo conocido como quórum sensing
(QS). Las bacterias mantienen una comunicación permanente entre ellas, dentro de los
diferentes ambientes o microambientes donde permanecen y conviven. Los mecanismos
de comunicación, le permiten reconocer cuando se alcanza el umbral o nivel de
presencia, para desarrollar nuevas funciones, especialmente un comportamiento social,
simbiótico y de permanente reconocimiento, útil para las tareas que adquieren en el
mecanismo de QS. (5)
Las biopelículas pueden desarrollarse por medio de dos procesos:

 A partir de una célula planctónica, ciertas bacterias tienen la capacidad de
desarrollar estructuras de superficie que favorecen la adhesión de las mismas a
una superficie sólida, tales como fimbrias y fibrillas. Así los colonizadores
primarios como Actinomyces naeslundii, varias especies de estreptococos, como
Streptococcus salivarius, Streptococcus parasanguis, Streptococcus mitis,
muestran fimbrias y fibrillas en su superficie. Otro factor que favorece la adhesión
de las bacterias a una superficie es la capacidad de movimiento de algunas
especies, como la Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
Escherichia coli, o la expresión de proteínas en su superficie celular,
denominadas adhesinas.
 También se pueden desarrollar a partir de células desprendidas de una
biopelícula o de partes de la propia biopelícula. En cualquier caso, estas células
desprendidas mantendrían todas las propiedades de la biopelícula de donde
8
proceden. También se producen fenómenos de movimiento de la biopelícula

sobre la superficie a la que se encuentra adherida. (5)
Otros mecanismos utilizados por las bacterias para fijarse a una superficie en
respuesta a un ambiente son: la síntesis de celulosa, la cual ayuda a la unión a
superficies de plantas, la modulación de su densidad en orden de posición sobre sí
mismas, formando diferentes niveles de columnas las cuales se sumergen en el agua
para producir vesículas de gas, síntesis de carbohidratos o formar agregados, los
magnetosomas, estructuras intracelulares consideradas de cristal o de mineral magnético
rodeado por una membrana que causa el pasivo alineamiento de las células, la
congregación la cual incrementa la interacción célula a célula así como la tasa de
sedimentación celular; esta agrupación no solo favorece la unión a la superficie sino que
brinda beneficios adicionales como la versatilidad fenotípica de las células hijas y las
adhesinas las cuales les permite adherirse no solo a superficies sino interactuar con otras
bacterias. (1)
1.3. Importancia en la Infección
La importancia del biofilm radica en su papel en la producción y degradación de

(1)
materia orgánica, la degradación de contaminantes ambientales y la infección. Dado
que los biofilms son una forma de resistencia o de supervivencia de los microorganismos,
hay bastantes casos y situaciones en que pueden constituir un problema para nuestra
especie. (5)
Las biopelículas son muy difíciles de erradicar y son una fuente de infecciones
persistentes. Su presencia en implantes médicos se debe al contacto de estos con fluidos
corporales y a la reducción de la respuesta inmune en las proximidades de cuerpos
extraños. (3)
La característica que mejor distingue las infecciones crónicas relacionadas con

biofilms de las infecciones agudas es su respuesta a tratamientos antibióticos. Mientras
que las infecciones agudas pueden ser eliminadas tras un breve tratamiento antibiótico,
las infecciones por biofilms normalmente no consiguen ser completamente eliminadas,
producen episodios recurrentes y la mayoría de las veces deben resolverse sustituyendo
9
el implante. Esto se debe a que las biopelículas pueden ser hasta 1000 veces más
(9)
resistentes a los antibióticos que esas mismas bacterias crecidas en medio líquido.
El biofilm es la causa de infecciones comúnmente repetitivas del tracto urinario,

causadas por E. coli y otros patógenos, infecciones de oído medio en niños causadas por
Haemophilus influenzae, la formación de placa bacteriana, la gingivitis y la peridontitis
causada por biofilms formados por Streptococcus, Fusobacterium y Porphyromona que
produce la inflamación crónica de los tejidos que soportan la encía y pueden
eventualmente generar la pérdida de los dientes y la infección pulmonar en pacientes con
fibrosis quística causada por Pseudomonas aeruginosa, donde una infección con
respuesta inflamatoria hiperactiva que destruye la función pulmonar puede generar la
muerte del paciente. (1)
Las biopelículas son una causa significativa del retraso en la curación de las heridas
y son causa potencial de la separación de sus bordes y retraso en el cierre de las heridas
quirúrgicas, debido a que las estrategias que se usan para curar las heridas causadas por
bacterias planctónicas fallan para eliminar a las bacterias adheridas que tienen el fenotipo
de biopelícula. (20)
De igual forma, el papel del biofilm en la contaminación de los implantes médicos ha

sido bien establecido en válvulas cardiacas, catéteres de línea central, intravenosos y
urinarios que pueden conducir a bacteremia o sepsis, e infección de lentes de contacto. (1)
Como ya se ha mencionado, el tema más importante son las infecciones. La

formación de biofilms en el organismo hace a los patógenos más inaccesibles, más
resistentes a los mecanismos defensivos naturales y a los tratamientos con antibióticos u
otros biocidas, cronificando la infección. También han sido muy estudiados los biofilms
que se desarrollan en los grandes quemados, con mucha superficie corporal expuesta a
las infecciones y un sistema inmune desbordado. Una colonización con grandes costes
para el sistema sanitario es la de los catéteres e implantes, que con cierta frecuencia han
de ser sustituidos por esta razón, particularmente en el caso de pacientes
inmunodeprimidos. Aparte de los biofilms que crecen en el interior del cuerpo, interesan
mucho en el mundo sanitario los que pueden crecer en equipos e instalaciones
(quirófanos, unidades dentales, unidades de diálisis, etc.) ya que los distintos fluidos y
materiales a los que se pueden transferir fragmentos de biofilm, pueden entrar en
contacto con heridas abiertas. (10)
10
1.4. Mecanismos de Resistencia de las Biopelículas
Las infecciones por el Staphylococcus aureus que colonizan los catéteres y otros
dispositivos médicos permanentes eran tratadas con el antibiótico novobiocina hasta que
surgieron cepas de Staphylococcus aureus resistentes a los fármacos. La tobramicina es
un antibiótico inhalado que se utiliza en la actualidad para tratar las infecciones por
Pseudomonas aeruginosa, las cuales obstruyen los pulmones de los pacientes con
fibrosis císticas. (1)
Las bacterias biofilm presentan una organización estructural que las hace
resistentes a los mecanismos de defensa del huésped. Los biofilms, revestidos con SPE y
conteniendo múltiples microcolonias bacterianas en su interior, se convierten en
estructuras demasiado grandes como para ser fagocitadas, reduciendo la accesibilidad
del sistema inmune a las bacterias. Por añadidura, el biofilm provee de una barrera física
que aumenta la resistencia de patógenos a las defensas del huésped, como opsonización,
lisis por complemento, y fagocitosis. (11)
Son tres los posibles mecanismos por los que la biopelícula brinda resistencia a las
bacterias. El primero es la penetración lenta o incompleta del antibiótico a través de la
matriz extracelular. El antibiótico es degradado antes de llegar a la pared celular
impidiendo su acción. El segundo es la alteración química del antibiótico dentro de la
biopelícula. En el interior de la matriz se consume el oxígeno, dejando un ambiente
anaerobio en el que las bacterias producen desechos ácidos, que pueden cambiar el pH
del microambiente; situación que no favorece a la acción de algunos antibióticos o hace
más lento el crecimiento bacteriano. El tercero consiste en que una pequeña población de
la biopelícula está altamente protegida, semejante a la esporulación y permanecen las
bacterias intactas, a pesar de la continua exposición al antibiótico. (12)
El biofilm en su interior contiene una gran cantidad de agua y solutos del tamaño de
los antibióticos, por lo cual estos podrían difundirse fácilmente dentro de la matriz. Sin
embargo, la movilidad física de los antibióticos en el biofilm no asegura que el antibiótico
penetre dentro de este. La penetración es restringida debido a que la matriz de
exopolisacáridos limita la difusión de sustancias y la unión del antimicrobiano
proporcionando una efectiva resistencia a las células en su interior, contra grandes
moléculas como antimicrobianos, proteínas, lisozimas y complemento. (1)
11
En otros casos, como en biofilms formados por Pseudomonas, se ha podido

demostrar un sinergismo entre la difusión retardada del antibiótico y la degradación de
este en el interior. La matriz de exopolisacáridos puede actuar como una barrera
retardando la difusión del antimicrobiano lo que disminuye la concentración del antibiótico
que ingresa al biofilm, para que en su interior enzimas semejantes a las lactamasas lo
destruyan, logrando así una resistencia efectiva. (1)
Otro factor considerado como responsable de la resistencia del biofilm es la

disminución de la tasa de crecimiento, virtualmente todos los antibióticos son muy
efectivos en el ataque rápido de las células en crecimiento, condición que es
absolutamente requerida por algunos antibióticos para poder atacar. La Penicilina y la
Ampicilina no atacan células que no estén en crecimiento y la tasa de ataque es
proporcional a la tasa de crecimiento. Algunos de los más avanzados Lactámicos,
Cefalosporinas, Aminoglucósidos y Fluoroquinolonas pueden atacar células en fase
estacionaría, pero ellos son indistintamente más efectivos en el ataque rápido de células
en división. (1)
1.5. Metodología para el estudio de las biopelículas
Hay una serie de condiciones experimentales que favorecen la formación de

biopelículas. Como consecuencia de la diversidad de técnicas y de microorganismos
como objeto de estudio, además de la necesidad de reproducibilidad de los experimentos
entre distintos laboratorios, cuatro sistemas generales han sido rutinariamente empleados
por los investigadores: (1) cultivos continuos asociados a visualizaciones por microscopía
confocal, (2) cultivos estáticos en placas microtiter, (3) obtención de biopelículas flotantes
en interfase líquido-aire y (4) visualización de la morfología de colonias en la superficie de
medios sólidos. (13)
El aumento en el conocimiento de las biopelículas ocurre paralelamente a la

implementación de nuevos métodos de estudio. Actualmente los métodos más utilizados
comprenden técnicas de observación directa con la visualización microscópica de la
biopelícula o técnicas de observación indirecta con método convencional de recuentos
bacterianos o el uso de indicadores de metabolismo. Las técnicas que se basan en la
observación directa de la adherencia y colonización microbiana utilizan microscopios
12
ópticos, confocales o electrónicos. Los primeros consisten en la opción más antigua y

asequible para estudio de las biopelículas, además es considerada una de las más
versátiles pese que presente limitaciones como la necesidad de tinción y/o fijación de las
muestras y consecuente muerte de los microorganismos, producción de artefactos e
imposibilidad de estudiar la estructura tridimensional de la biopelícula. (13)
Los métodos indirectos permiten la cuantificación de microorganismos adheridos a

superficies por su retirada en etapas abrasivas con rascados, agitación o sonicación de
los materiales y posterior dilución y recuentos bacterianos. Las principales limitaciones
residen en el hecho de que esas técnicas no permiten el análisis de la estructura de la
biopelícula, las etapas abrasivas podrían resultar en injurias y disminución del número de
células viables además de que no todos microorganismos de la biopelícula son
cultivables. La utilización de tinciones y de indicadores metabólicos se presenta como
alternativa viable para el estudio y cuantificación de la formación biopelículas por diversos
microorganismos. Estos ensayos son ejecutados en placas microtiter para determinar
tanto la biomasa total (matriz, células vivas y muertas), componentes específicos de la
matriz por su tinción, o para la cuantificación de viabilidad. Los ensayos para
cuantificación de formación de biopelícula en placas microtiter son empleados para
diversos microorganismos. Un particular enfoque ha sido dado al uso del cristal violeta
como indicador de biomasa total para distinguir entre cepas parentales de E. coli y
mutantes con adhesión alterada, y también para clasificar en categorías de formación de
biopelículas cepas de Staphylococcus epidermidis y Vibrio spp. Los ensayos que miden
la biomasa total tienen limitaciones en los estudios de disrupción de biopelículas una vez
que no permiten la diferenciación entre células viables y muertas lo que dificulta la
evaluación de la acción de antimicrobianos contra las bacterias asociadas a biopelícula.
Para la discriminación entre células viables y muertas se emplean técnicas que
cuantifican la actividad metabólica con tinciones vitales como las sales de tetrazolio,
diacetato de fluoresceína y resazurina o azul de alamar, el cual viene siendo modificado
con el objetivo de mejorar su precisión y aplicabilidad en la determinación de la CMIs de
diversos compuestos. Ese método permite determinar la viabilidad en sistemas de cultivo
planctónico o sésil, no simplemente la biomasa, además es un método fiable, reproducible
y que tiene una excelente correlación con la determinación de los recuentos bacterianos.
Las principales limitaciones del método son la sensibilidad del colorante-vital a la luz y al
(13)
calor, condiciones que son fácilmente controlables en el laboratorio.
13
II. Pseudomonas aeruginosa
2.1. Características Generales

Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram negativo, aerobio estricto, oportunista,
miembro de la γ-subdivisión de las Proteobacteria. Estos bacilos miden de 0.5 a 0.8 x 1.5-
8 μm, y son móviles en virtud a la presencia de un simple flagelo polar. Muchas cepas de
P. aeruginosa elaboran pigmentos que pueden participan en la toxicidad de las células
eucariotas como la piocianina (azul), que puede inhibir la respiración celular mediante la
alteración del ciclo Redox y el incremento del estrés oxidativo. Otros de los pigmentos que
pueden producir son la pioverdina (verde fluorescente), piorrubina (rojo oscuro),
piomelanina (negro). (14)
Tiene una extraordinaria capacidad para adaptarse a diversos ambientes y tiene,

además, la particularidad de no presentar una población clonal típica. Esto es, su
población tiene una estructura clonal superficial que participa muy frecuentemente en
eventos de recombinación, de los que ocasionalmente surgen clonas que compiten
favorablemente con otras y las desplazan. Estas características poblacionales plantean
(15)
una serie de interrogantes acerca de la manera en que esta bacteria ha evolucionado.
La temperatura óptima de crecimiento de esta bacteria es 37 °C pero puede crecer

a temperaturas superiores como los 42 °C, y aunque so n considerados como aerobios
estrictos tiene la habilidad de crecer en condiciones anaeróbicas en presencia de arginina
o nitratos como aceptores terminales de electrones. P. aeruginosa también presenta una
notable versatilidad nutricional lo que les permite utilizar alrededor de 80 compuestos
orgánicos como fuente de energía y carbono, por lo que puede habitar en una gran
variedad de nichos ecológicos. Esta bacteria ha sido aislada de agua (dulce o salada),
aire, suelo, animales, y plantas. Se ha sugerido que esta versatilidad es consecuencia del
tamaño del genoma (6,264 kb, 5,570 genes codificantes), así como a la complicada red
de regulación celular, como se observa en los más de 90 sistemas reguladores de dos
componentes en el genoma bacteriano. (14)
Tiene la capacidad de formar una biopelícula, que lleva a una tolerancia

antimicrobiana y disminución de la concentración de oxígeno en su interior, produciendo
un crecimiento bacteriano lento en fase estacionaria. La formación de la biopelícula se
relaciona con la patogenia de infecciones pulmonares crónicas en pacientes con fibrosis
quística y bronquiectasias, así como también a infecciones asociadas a dispositivos como
14
catéteres intravasculares o prótesis, interfiriendo con la llegada del antimicrobiano al sitio

y la eliminación bacteriana.(16)
P. aeruginosa es una cepa de bacterias que pueden formar una biopelícula sobre
las superficies en contacto con agua. Tal como se conoce bien en el arte, las biopelículas
son más resistentes a la acción de microbicidas que las bacterias planctónicas, es decir
las bacterias que no están pegadas a una superficie. En este contexto, dicha bacteria es
un formador de biopelícula especialmente tenaz en el sentido de que es altamente
resistente a la remoción química. Adicionalmente, tiene la habilidad de protegerse a sí
misma contra la acción de microbicidas formando capas de baba extracelular de
polisacáridos que resisten la penetración de microbicidas cargadas en agua. La tasa a la
que tales capas de baba se forman es muy rápida en el caso de la P. aeruginosa; se
pueden formar capas de baba altamente resistentes sobre una superficie limpia en menos
de una semana. Adicionalmente, las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa
típicamente albergan patógenos peligrosos y causan daños a las superficies a las cuales
se llegan a pegar. (17)
2.2. Patogenicidad
Aunque los seres humanos están en frecuente contacto con P. aeruginosa, las
infecciones ocasionadas por ésta rara vez son adquiridas por pacientes
inmunocompetentes; no obstante, cuando se alteran las barreras normales de la piel y
mucosas, frente a estados de inmunodepresión o cuando el paciente es expuesto a
reservorios del ambiente hospitalario, puede actuar como patógeno primario. Con base a
esto, P. aeruginosa puede provocar infecciones graves como: neumonía (por el uso del
tubo endotraqueal y ventilación), bacteriemia, infecciones del tracto urinario, ulceración de
la córnea (de usar lentes de contacto), infecciones del sistema nervioso central y
septicemia aguda en pacientes con quemadura o infección de la herida quirúrgica. Estas
infecciones, generalmente nosocomiales, tienen un curso fulminante y una letalidad
(14)
extremadamente alta a pesar de un tratamiento adecuado con antibióticos.
La P. aeruginosa es una bacteria oportunista gram negativa, patógeno

intrahospitalario en pacientes inmunodeficientes o con brechas en las defensas físicas del
cuerpo, como las producidas por heridas, quemaduras o úlceras. Forma biopelículas en
dispositivos médicos, siendo además agente causal de la fibrosis quística, cuyo
15
tratamiento se asocia regularmente al desarrollo de resistencia a ciprofloxacina y a

aminoglicósidos. El incremento de la resistencia en biopelículas da como resultado la falla
usual de los antibacterianos para su erradicación, aunque las pruebas de laboratorio
demuestren sensibilidad a los antibióticos utilizados, por lo que se ha propuesto el
desarrollo de biopelículas para usarlas en la determinación de la susceptibilidad a
antibióticos. (3)
Existe evidencia que los genes transcritos en la fase planctónica son diferentes a
los transcritos en el biofilm de acuerdo a la característica fenotípica requerida, por
ejemplo, en Pseudomonas aeruginosa una vez se transcribe el gen alg, el cual es
responsable de la producción del alginato, un exopolisacárido que cimienta la estructura
del biofilm, la síntesis del flagelo es reprimida debido a que su presencia podría
desestabilizar dicha estructura. Por otra parte algunos genes pueden expresarse en
respuesta específica a la superficie que la bacteria ha escogido para establecerse y los
genes que se expresan para adherirse a las superficies abióticas son diferentes
dependiendo si estas son nutritivas o no. (1)
2.3. Mecanismo de resistencia a quinolonas en P. aeruginosa
P. aeruginosa es naturalmente resistente a muchos de los antimicrobianos de uso

habitual en la práctica clínica, debido a la barrera de permeabilidad ofrecida por su
membrana externa de LPS y a plásmidos de resistencia antimicrobiana, entre otros
factores. (18)
Las infecciones graves y nosocomiales por esta bacteria requieren, generalmente,

un tratamiento con antibióticos combinados con el fin de lograr un mayor efecto
bactericida y reducir la aparición de resistencia. (19)
Existen varios mecanismos de resistencia bacteriana a las quinolonas, pudiendo

coexistir varios en una misma cepa e interactuar de forma sinérgica, incrementando
significativamente los niveles de resistencia. Los principales mecanismos de resistencia
descritos son: (1) Mutaciones en los genes que codifican las topoisomerasas bacterianas
16
II y IV; (2) Disminución de la permeabilidad de la pared bacteriana por alteraciones en la

expresión de proteínas de la membrana externa (porinas), (3) excreción activa del
antimicrobiano por sobre-expresión de sistemas de expulsión y (4) resistencia mediada
por plásmidos. En P. aeruginosa, al igual que otras bacterias, el mecanismo más
importante que confiere resistencia a las quinolonas son las mutaciones en los genes que
codifican para las subunidades A y B de la ADN-girasa. La resistencia a fluoroquinolonas
también es resultado de la disminución de la acumulación del fármaco al interior de la
célula bacteriana. Se han establecido dos principales mecanismos: la disminución de
porinas en la membrana externa, y sistemas de expulsión activa. En P. aeruginosa este
tipo de resistencia es inducible y permite una supervivencia inmediata. Todas las
quinolonas pueden cruzar la membrana externa a través de las porinas, pero solamente
las más hidrofóbicas pueden atravesar la capa lipídica. Las alteraciones en la expresión
de porinas, sobretodo de OmpF, o mutaciones, suponen una disminución en la entrada
de la quinolona dentro de la célula, aunque otros antimicrobianos y sustancias puedan
ser afectados. El segundo mecanismo de resistencia, común en especies de
grampositivas y gramnegativas, son los sistemas de expulsión activa, aunque más
complejos en las segundas por las características estructurales de la pared celular.
Ejemplos de sistemas de expulsión activa responsables de resistencia intrínseca y
adquirida a las quinolonas son Me MexCD-OprJ y MexEF-OprN, entre otros en
Pseudomonas aeruginosa. La expulsión activa es responsable de bajos niveles de
resistencia, pudiendo actuar como un primer paso en la selección de resistencias; su
ausencia puede hacer más difícil la selección de cepas resistentes. En algunos casos los
sistemas de expulsión activa pueden por si mismos ser responsables de niveles de
resistencia clínicamente relevantes. Un factor importante a tener en cuenta es que estos
sistemas de expulsión activa permiten la supervivencia bacteriana en la presencia de
concentraciones sub-óptimas de antimicrobianos. xAB-OprM, MexCD-OprJ y MexEF-
OprN, entre otros en Pseudomonas. (14)
17
CONCLUSIONES
 Los microorganismos pueden tener una existencia planctónica independiente, pero

también pueden tener un ciclo de vida interdependiente en el cual funcionan como
una parte integral de un sistema biológico con un alto nivel de organización
formando estructuras coordinadas y comunidades funcionales llamadas
biopelículas.
 Las biopelículas juegan un papel importante en la infección, entender el

comportamiento del biofilm permitirá un mejor manejo de las patologías que él
causa, así como la implementación de medidas que conduzcan a su prevención y
a la generación de medicamentos para su tratamiento.
 Las bacterias biofilm presentan una organización estructural que las hace
resistentes a los mecanismos de defensa del huésped.
 Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram negativo, oportunista que tiene una

extraordinaria capacidad para adaptarse a diversos ambientes formando
biopelículas; que lleva a una tolerancia antimicrobiana y disminución de la
concentración de oxígeno en su interior.
 P. aeruginosa es un patógeno intrahospitalario que infecta a pacientes

inmunodeficientes y es naturalmente resistente a muchos de los antimicrobianos
de uso habitual en la práctica clínica.
18
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22

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Maestría en Ciencias con Mención en Microbiología

RESISTENCIA DE BIOPELÍCULAS Y POBLACIONES

- Lic. Johana Edith Aparicio Sigueñas

- Dra. Nancy Llalud Malca Tello

Trabajo como requisito de la asignatura

Lambayeque, 27 de Enero de 2013

¿Qué son Biopelículas? 6

Mecanismos de Resistencia de las Biopelículas 11

Metodología para el estudio de las biopelículas 12

Mecanismo de Resistencia a Quinolonas en P. aeruginosa 16

Problema: ¿Cuál es la resistencia in vitro de biopelículas y poblaciones planctónicas de

Palabras Claves: biopelículas, infección, resistencia, antibióticos.

Problem: What is in vitro the resistance of biofilms and planktonic populations of

Key Words: biofilms, infection, resistance, antibiotics.

La percepción de la bacteria como una forma de vida unicelular, la cual podemos

Se calcula que en 75% de las infecciones bacterianas intervienen biopelículas,

Una de las proezas de la medicina moderna como resultado de la investigación

El objetivo del presente trabajo es evaluar in vitro la resistencia de biopelículas y

Para demostrar dicha resistencia en las diferentes formas de crecimiento de

1.1. ¿Qué son Biopelículas?

Las biopelículas son comunidades complejas de microorganismos presentes en

Las biopelículas o también llamadas “biofilms” crecen embebidos en una matriz de

Un biofilm es una comunidad sésil derivada de microbios caracterizada por células

El biofilm estructuralmente está constituido por tres componentes: la masa de

capaces de producir exopolisacáridos (cápsulas) o excreciones celulares que rodean los

Las biopelículas que se encuentran en la naturaleza consisten en comunidades de

El estudio de estas biopelículas ha demostrado que se componen de 97% de agua,

1.2. Formación de Biopelículas

El biofilm o biopelícula se forma cuando la bacteria detecta ciertos parámetros

El principio de la formación de una biopelícula se establece como parte de los

Las biopelículas pueden desarrollarse por medio de dos procesos:

proceden. También se producen fenómenos de movimiento de la biopelícula

1.3. Importancia en la Infección

La importancia del biofilm radica en su papel en la producción y degradación de

La característica que mejor distingue las infecciones crónicas relacionadas con

El biofilm es la causa de infecciones comúnmente repetitivas del tracto urinario,

De igual forma, el papel del biofilm en la contaminación de los implantes médicos ha

Como ya se ha mencionado, el tema más importante son las infecciones. La

1.4. Mecanismos de Resistencia de las Biopelículas

En otros casos, como en biofilms formados por Pseudomonas, se ha podido

Otro factor considerado como responsable de la resistencia del biofilm es la

1.5. Metodología para el estudio de las biopelículas

Hay una serie de condiciones experimentales que favorecen la formación de

El aumento en el conocimiento de las biopelículas ocurre paralelamente a la

ópticos, confocales o electrónicos. Los primeros consisten en la opción más antigua y

Los métodos indirectos permiten la cuantificación de microorganismos adheridos a

II. Pseudomonas aeruginosa

2.1. Características Generales

Tiene una extraordinaria capacidad para adaptarse a diversos ambientes y tiene,

La temperatura óptima de crecimiento de esta bacteria es 37 °C pero puede crecer

Tiene la capacidad de formar una biopelícula, que lleva a una tolerancia

catéteres intravasculares o prótesis, interfiriendo con la llegada del antimicrobiano al sitio

La P. aeruginosa es una bacteria oportunista gram negativa, patógeno

tratamiento se asocia regularmente al desarrollo de resistencia a ciprofloxacina y a

2.3. Mecanismo de resistencia a quinolonas en P. aeruginosa

P. aeruginosa es naturalmente resistente a muchos de los antimicrobianos de uso

Las infecciones graves y nosocomiales por esta bacteria requieren, generalmente,

Existen varios mecanismos de resistencia bacteriana a las quinolonas, pudiendo

II y IV; (2) Disminución de la permeabilidad de la pared bacteriana por alteraciones en la

 Los microorganismos pueden tener una existencia planctónica independiente, pero

 Las biopelículas juegan un papel importante en la infección, entender el

 Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram negativo, oportunista que tiene una

 P. aeruginosa es un patógeno intrahospitalario que infecta a pacientes