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Ensayos aplicables
a más de una matriz
Prueba de toxicidad aguda con Vibrio fischeri 307
Amplia experiencia
con la bacteria Vibrio fischeri
(Photobacterium phosphoreum)
Principio de la prueba
Vibrio fischeri es una bacteria marina luminiscente, gram-negativa, anaerobia
facultativa. En condiciones ambientales favorables estas bacterias emiten luz
naturalmente, requiriendo para esto oxígeno en concentraciones por encima
de 0.5 mg/L.
El empleo de estas bacterias con fines de monitoreo de la contaminación
ambiental se inició en los años 60 y hacia los años 70 se emplearon en la de-
terminación de toxicidad en aguas, sedimentos y productos diversos. Poste-
riormente, estos métodos fueron estandarizados e incluidos como protocolos
normalizados como DIN (norma 38412 parte 34), ISO (norma 11348 parte 1
y SCOFI (NOM NMX-AA-112) en México.
La prueba se basa en la medición de la luminiscencia emitida por las bacterias
V. fischeri después de su exposición a una muestra problema por un período
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Definiciones
Las siguientes definiciones han sido adecuadas a las necesidades de la prueba.
los factores que puedan afectar el resultado, excepto la condición que está
siendo investigada (sinónimo de control negativo).
Cultivo: conjunto de plantas o animales que se mantienen bajo condiciones
definidas y controladas, para producir organismos saludables.
Efecto tóxico agudo: es aquel que es inducido y observado en un período corto, que
puede ser de 5 a 30 minutos para el caso de V. fischeri. Este período de respuesta
óptimo está definido a partir de estudios previos basados en el conocimiento de
biología bacteriana, en conjunto con la química de los compuestos tóxicos. Se
ha observado la existencia de procesos que facilitan el paso de los compuestos
tóxicos al interior de las células bacterianas, siendo más ágiles y rápidos los
relacionados a compuestos orgánicos que los de incorporación de elementos
metálicos (Bulich, 1979; Bulich et. al., 1981; Kauser, 1984; Bulich, 1988).
Liofilizado: congelado y deshidratado al vacío; es aplicado a la bacteria usada
en la prueba Microtox, la cual se comercializa.
Porcentaje (%): es una concentración expresada en partes por ciento. Represen-
ta una unidad o parte del material (por ejemplo efluente o agua receptora)
diluida con agua a un total de 100 partes. Las concentraciones pueden ser
preparadas en volumen-volumen o peso-peso y son expresadas como un
porcentaje de material de prueba en la solución final.
Prueba de toxicidad: también denominada bioensayo o ensayo de toxicidad, la
cual consisten en la exposición de organismos vivos a soluciones preparadas
o muestras naturales con el fin de evaluar en ellas la presencia de algún
compuesto tóxico a través de alteraciones de la vitalidad o funcionamiento
metabólico de los organismos de prueba.
Toxicidad: es la capacidad o potencialidad inherente de un material para causar
efectos adversos en los organismos. El efecto puede ser letal o subletal.
Material
Hielera, hielo o geles refrigerantes, pipetas automáticas de 250, 500 y 1,000
µL (de volumen fijo o ajustable), pipeta automática de 10 µL o de repetición
ajustable a mediciones de10 µL, puntas para micropipetas, jeringas de 0.6 mL
para pipeta de repetición y celdillas de vidrio de borosilicato.
Equipo
Sistema Microtox Modelo 500 constituido por: fotosensor (Luminómetro);
pozos de incubación con temperatura controlada de 15 °C; pozo para reac-
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Reactivos
Reactivo liofilizado (bacteria liofilizada), solución diluente (solución de cloruro
de sodio (NaCl) al 2%), solución de ajuste osmótico (solución de cloruro de
sodio (NaCl) 22 %), solución de reconstitución (agua deionizada).
Procedimiento de prueba
Este ensayo es una versión ampliada y modificada por el Instituto Mexicano de
Tecnología del Agua, basada en MICROBICS (1992) y en la Norma Mexicana
NMX-A-112-1995-SCFI (SECOFI, 1995).
Preparación de la prueba
1. Preparación de la bacteria
Temp. 5.5 ºC
Celdilla
Baterias
reactivo
liofilizadas
Agregar 100 μL
de sol. reconst.
2. Preparación de muestras
Temp. 15 ºC
4. Procedimiento de prueba
Agregar 100 μL de cada celdilla
Preparación de diluciones
Expresión de resultados
Los resultados se expresan a través de la CE50 y las unidades pueden estar en
porcentaje, mL/L, mg/L, eq. mg/mL o cualquier otra unidad acorde con el
tipo y manejo de muestra que se analice.
Los cálculos para la determinación de la CE50, así como la elaboración de
la curva asociada, pueden ser realizados a través de diversas herramientas
como los software MTX 7 o la versión más reciente, ambos producidos
por el fabricante de Microtox® para el registro automático de datos. Estos
programas despliegan la información en pantalla y si se desea puede ser
impresa.
De no contarse con estos programas, también puede emplearse el programa
Probit (versión USEPA 1.5) o cualquier otro que pueda efectuar dicho análisis.
En caso de emplear el Probit será necesario hacer la conversión de los valores
de luminiscencia a porcentajes de efecto los cuales deberán ser capturados en
el programa Probit en los espacios correspondientes al número de organismos
afectados para cada dilución. Para efectuar la corrección deberá realizar los
siguientes pasos:
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Tomar el valor de luminiscencia del control (si es sólo uno) o promediar el valor
de los controles (si se cuenta con más de uno) y hacerlo equivalente a 100%.
Tomar el valor de luminiscencia de cada dilución para obtener su valor en
equivalencia respecto al control, a través de una regla de tres.
Interferencias
• Color en la muestra original y diluida. Si se sospecha de interferencia por
color, hacer la corrección de la lectura de acuerdo a los pasos que se indican
en el manual Microtox (Microbics Corporation, 1992).
• Turbiedad en las muestras diluidas. Dejar sedimentar la muestra y emplear
el sobrenadante.
• Compuestos volátiles. En caso de que la muestra contenga compuestos
volátiles, es factible que la pérdida continua de estos agentes sea un
factor de variabilidad que afecte la estabilidad de la respuesta y puede
generar, en caso de análisis replicados, resultados poco consistentes. Para
evitar dicha alteración se sugiere correr en paralelo a la muestra original
muestras aireadas, de modo que los resultados de toxicidad que así se
obtengan corresponderán a la fracción soluble y no volátil de la muestra.
Si se requiere conocer la toxicidad de muestras con carga volátil sin que
ésta sea removida, la única prueba factible de ser aplicada con V. fischeri
es una con una corta duración (5 minutos), manejando la muestra en
frío y en sistemas parcialmente cerrados. Estas condiciones, manejadas
por técnicos con experiencia, pueden permitir la obtención de lecturas
analíticamente confiables; sin embargo, esta clase de análisis no deben
realizarse rutinariamente y deben ser protocolizados como investigaciones
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