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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS


ÁREA DE CIENCIAS DE LA SALUD
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DEL


LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA GENERAL

SEXTO SEMESTRE
PROGRAMAACADÉMICO
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

Dra. en C. Araceli Gómez Corvera.


Dr. en C. Jorge Luis Ayala Luján
M. en C. Marisa Hernández Barrales
Q.F.B. Ma. del Socorro Martínez Becerra

NOMBRE DEL ALUMNO: _______________________________________________

Edición: Enero de 2014

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

PRACTICA No. 1

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Selección y uso de guantes


Los guantes de uso rutinario en el laboratorio son estériles o no esterilizados para
exploración fabricados de vinilo o látex. Existen diferencias táctiles entre ambos
tipos; los guantes de látex brindan mayor sensibilidad táctil, pero cualquiera de
los dos suele ser adecuado para realizar la flebotomía y como barrera
protectora cuando se realizan procedimientos técnicos.
Los lineamientos generales relacionados con la selección y el uso general de
guantes incluyen los siguientes:
1. Utilizar guantes estériles para procedimientos que implican contacto con
áreas del cuerpo que debe estar estériles o durante procedimientos en los que
se estableció y debe mantenerse la esterilidad. Usar guantes no esterilizados
para exploración durante procedimientos que no requieren el uso de guantes
estériles.
2. Usar guantes para el procesamiento de muestras de sangre, reactivos o
productos sanguíneos. Los guantes deben cambiarse con frecuencia y de
inmediato si presentan contaminación visible con sangre o ciertos líquidos
corporales, o si ocurre algún daño físico.
3. No lavar ni desinfectar los guantes de látex o vinilo para usarlos de nuevo. El
lavado con detergentes pueden permitir una mayor penetración de líquidos a
través de agujeros imperceptibles en los guantes.

Los lineamientos para el uso de guantes durante la flebotomía incluyen los


siguientes:
1. Es obligatorio el uso de guantes cuando el que realiza la flebotomía padece
cortes, rasguños u otras lesiones en la piel. La presencia de lesiones cutáneas
aumenta la probabilidad de infecciones después de una exposición cutánea.
2. Es obligatorio del uso de guantes cuando la persona que realiza la flebotomía
juzga que puede haber contaminación manual (p. ej., cuando se realiza una
flebotomía a un paciente poco cooperador).
3. Deben usarse guantes cuando se realicen punciones en dedos o talón en
lactantes o niños.
4. Deben usarse guantes durante la capacitación para la realización de
flebotomías.
5. Los guantes deben cambiarse entre cada contacto con pacientes.

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Guantes como barrera de protección durante las pruebas


Se utilizan guantes de vinilo cuando:
1. Se manipula sangre, suero, plasma o ciertos líquidos corporales humanos.
2. Se manipula sangre humana o productos sanguíneos potencialmente
infecciosos, como antisueros de origen humano y eritrocitos reactivos.
3. Se realizan pruebas en suero, plasma o eritrocitos humanos.
4. Se utilizan artículos que pudieran estar contaminados con sangre humana o
ciertos líquidos corporales (p. ej., recipientes de muestras, instrumentos de
laboratorio, mostradores.
Hay que tener cuidado de la contaminación indirecta de las superficies u objetos
en el área de trabajo. Los guantes deben retirarse o cubrirse bien con un guante
sin contaminar o toalla de papel antes de responder el teléfono, manejar equipo
de laboratorio o tocar los picaportes de las puertas.

Batas de laboratorio como barreras protectoras


La prenda que se utilice en el laboratorio debe cambiarse o cubrirse con una
bata limpia cuando se salga del área inmediata de trabajo. Las prendas deben
cambiarse de inmediato si se produce contaminación evidente con sangre o
líquidos corporales para prevenir el paso a través de la ropa o la piel.

Lavado de manos
El lavado de manos frecuente es una práctica de seguridad importante. Debe
realizarse después del contacto con pacientes y muestras de laboratorio. Como
mínimo, las manos deben lavarse con agua y jabón (si hay suciedad visible),
realizar antisepsia con una preparación a base de alcohol (si las manos no
tienen suciedad visible), en los siguientes casos:
1. Después de terminar el trabajo de laboratorio y antes de salir del mismo.
2. Después de retirarse los guantes.
3. Antes de comer, beber, aplicar maquillaje y cambiar lentes de contacto, así
como antes y después de usar el sanitario.
4. Antes de todas las actividades que impliquen contacto manual con las
mucosas o lesiones en la piel.
5. Justo después del contacto cutáneo accidental con sangre, líquidos
corporales o tejidos. Si el contacto ocurre por roturas en los guantes, los
guantes deben retirarse de inmediato y las manos se lavan en forma
minuciosa. Si se produce contaminación accidental en un área expuesta de la
piel, o por rotura de los guantes, primero se debe realizar un lavado con jabón
líquido, enjuagar bien con agua y luego se aplica una dilución 1:10 de
blanqueador, isopropilo al 50% o alcohol etílico. El blanqueador o el alcohol se
dejan en la piel por lo menos durante un minuto antes del lavado final con jabón
líquido y agua.

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Descontaminación de superficie de trabajo, equipo y derrames


Todas las superficies de trabajo se limpian e higienizan al principio y al final del
turno con una dilución 1:10 de blanqueador doméstico (1ml de blanqueador y 9
ml de agua). Los instrumentos como tijeras o recipientes para centrífuga se
higienizan a diario con una solución diluida de blanqueador.
El blanqueador doméstico diluido preparado todos los días desactiva al VHB en
10 min y al VIH en 2 minutos. Los materiales desechables contaminados con
sangre deben colocarse en recipientes marcados con “Peligro biológico” para
eliminarse en forma apropiada.
Todos los derrames de sangre se tratan como potencialmente peligrosos. En
caso de derrame de de sangre, se emplea el siguiente procedimiento para
limpiarlo:
1. Usar guantes y bata de laboratorio
2. Absorber la sangre con toallas desechables. Las soluciones de cloro son
menos efectivas en presencia de altas concentraciones de proteínas. Eliminar la
mayor cantidad de sangre líquida o suero antes de la descontaminación.
3. Utilizar una solución de cloro diluido, limpiar el sitio del derrame hasta
eliminar toda la sangre visible.
4. Limpiar el sitio de derrame con toallas de papel empapadas con cloro diluido.
5. Colocar todos los materiales desechables empleados en la descontaminación
en un recipiente para riesgos biológico.

Precauciones con agujas


Para prevenir las lesiones por pinchazo de aguja, nunca debe colocarse de
nuevo el tapón de la misma, no debe separarse de las jeringas, ni manipularse
de alguna otra manera. Las agujas usadas se colocan intactas en recipientes
rojos de diseño especial a pruebas de punciones y designados para objetos con
peligro biológico. Los mismos criterios se aplican a las hojas de bisturí usadas
y cualquier otro objeto afilado que pudiera contaminarse con sangre. El
recipiente debe colocarse lo más cerca posible del área de trabajo. Para
desechar los recipientes, se cierran y se les coloca en el sitio de los desechos
biológicos.

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Preguntas:

1.- Investiga la Norma Oficial Mexicana (NOM), 087 y 166, y describe los
apartados que consideres aplican al desempeño del Laboratorio de
Inmunología.
2.- Mencione algunos métodos que se utilizan para inactivar muestras
biológicas.
3.-Investigue que organismos a nivel nacional e internacional regulan la
bioseguridad.
4.- Realiza un cuadro especificando el tipo de envase y código de color para el
almacenamiento y transporte de RPBIs.

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PRACTICA No. 2

MANEJO DE MICROPIPETAS
Objetivo:

Conocer las principales partes de una micropipeta y las operaciones básicas de


aspirado y dispensado

Introducción:

Las micropipetas son una herramienta de gran utilidad en el laboratorio, su uso


correcto depende del conocimiento de sus componentes, la forma y el principio
de su funcionamiento, por lo que solo deben de ser operadas por personal de
laboratorio calificado con habilidad y destreza.

Metodología básica para el uso y operación de micropipetas:

1. Seleccione la micropipeta del rango adecuado de acuerdo al volumen a


dispensar.
2. Localizar el indicador de volumen así como el número de dígitos que
incluye, éstos se deben de leer de arriba hacia abajo.
3. Ajustar el volumen de la pipeta con el anillo de selección
4. Verifique que los volúmenes no estén situados fuera del rango
especificado en la pipeta. Si se forza excesivamente el giro de la
selección de volumen, se puede hacer saltar los mecanismos de la
pipeta y dañarla.
5. Seleccione la punta adecuada para la micropipeta la cual debe de
ajustarse perfectamente. Aplicar presión con movimiento giratorio.
Nunca usar la pipeta con líquidos sin la punta colocada.
6. Para que el procedimiento de aspirado sea satisfactorio deberá
presionarse el embolo de forma suave y lenta. Pulsar y apretar el
embolo hasta el primer tope. Evitar presionar más allá del primer tope ya
que ocasionara que se aspire mayor cantidad de líquido.
7. Mantenga la micropipeta siempre en posición vertical y sumerja o sitúe la
punta en la muestra entre 1 y 3 mm debajo de la superficie del líquido de
acuerdo a la capacidad de la micropipeta.
8. Relajar lentamente la presión del dedo sobre el embolo para que regrese
a su posición original, esto permitirá la aspiración del líquido en la punta,
no perder de vista la muestra ya que un movimiento brusco genera la
entrada de aire y la cantidad de muestra no es la adecuada. Nunca
invertir o colocar la pipeta de manera horizontal con la punta llena.
9. Presionar suavemente el embolo hasta el primer tope y esperar
aproximadamente un segundo o hasta que el líquido deje de fluir.

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10. Mantenga la presión sobre el embolo en el segundo tope y retirar la


pipeta deslizando la punta por la pared, finalmente soltar el embolo
lentamente.
11. Expulsar o descartar las puntas usadas con el dispositivo.

Material:

Micropipetas varios rangos de volumen


6 microtubos 1.5 ml.
Puntillas para micropipeta
Gradilla para microtubos

Reactivos
Solución de azul de metileno

Metodología para medición de volúmenes

1.- En una gradilla colocar tres microtubos


2.- Seleccione las micropipetas de rango adecuado y ajuste los volúmenes a
medir.
3.- De acuerdo a la serie de pasos descritos anteriormente proceda a realizar la
medición de un volumen de 125 l de azul de metileno.
4.- Verter el volumen medido en un microtubo.
5.- Con las micropipetas de rango adecuado repetir la operación para 12.5 y
1.25 l.
6.- En otra serie de tubos mida 7.5, 75 y 750 l.

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PRÁCTICA Nº3

TALLER TEÓRICO-PRÁCTICO “TOMA DE MUESTRAS SANGUINEAS “

Preguntas para REPORTE:

1.- Describe los tipos de toma de muestra sanguínea que se utilizan en el área
clínica

2.- Elabora un cuadro donde se especifique las características de los diferentes


tipos de tubos para toma de muestra sanguínea

3.-Describe y enumera los pasos a seguir para la toma de muestra sanguínea y


que cumpla con calidad analítica

4.-Menciona las medidas de seguridad básicas a seguir para la toma de


muestra sanguínea

5.-Describe brevemente la opinión que te genera la realización del taller de


toma de muestra como inicio de la formación profesional en el área clínica

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PRÁCTICA Nº 4

IDENTIFICACIÓN DE GRUPOS SANGUINEOS ABO.

Objetivo: Realizar una tipificación ABO en una muestra sanguínea de forma


adecuada y confiable, a través de la técnica de aglutinación directa.

Introducción:

El sistema ABO fue descubierto por Landsteiner en 1900, al observar que los
eritrocitos de algunos individuos eran aglutinados por el suero de otros. Estas
reacciones fueron relacionadas a la presencia de marcadores (antígenos) sobre
la superficie de las células rojas y anticuerpos en el suero. Los antígenos del
grupo sanguíneo ABO son codificados por un locus genético, el cual tiene tres
alelos A, B, y O. Cada progenitor hereda uno de éstos tres alelos a sus
descendientes, lo que da lugar a cuatro posibles tipos sanguíneos (fenotipos) A,
B, AB y O. El grupo sanguíneo A presenta dos fenotipos A1 y A2. Los
anticuerpos anti-A y anti-B aparecen de manera espontánea cuando el antígeno
está ausente en la superficie de los eritrocitos; así una persona del grupo
sanguíneo A poseerá anticuerpos anti-B, etc. Los anticuerpos anti-A y anti-B,
son inmunoglobulinas IgM o IgG, por lo que en las transfusiones sanguíneas
incompatibles, estos anticuerpos provocan una reacción aguda y severa.

Los antígenos de los eritrocitos y los anticuerpos se detectan comúnmente por


aglutinación analizando las células rojas y el suero de los individuos, se pueden
utilizar métodos manuales o automatizados. La velocidad de la reacción Ag-Ac,
así como la intensidad de la aglutinación observada, está influida por muchas
variables como son el isotipo de los anticuerpos, la solución utilizada (isotónica
o coloidal), la centrifugación.

Grupo Antígeno(s) Anticuerpos en Genotipo(s)


sanguíneo sobre los el suero
eritrocitos
A A Anti-B AA o AO
B B Anti-A BB o BO
AB AB - AB
O - Anti-A y Anti-B OO

Material Biológico:
sangre Humana
antisueros anti-A
antisuero Anti-B

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

Material:
portaobjetos
pipetas
aplicadores
tubos de ensayo 10x75 mm
Centrifuga

Reactivos:
buffer de fosfatos (PBS)

 MEDIDAS DE SEGURIDAD:
Antisueros: Los antisueros contienen azida de sodio que puede reaccionar con
las tuberías de cobre induciendo la formación de un metal ácido altamente
explosivo, por lo que para su desecho se deberá diluír 1:100. Además se
deberán de seguir las indicaciones para el manejo de reactivos biológicos ya
que pueden contener partículas virales.

Prueba directa en portaobjetos:


1. Limpiar y secar apropiadamente un portaobjeto.
2. Colocar de izquierda a derecha una gota de anti-A, Anti-B y anti-AB.
3. Depositar al lado de cada reactivo, una gota de sangre del paciente.
4. Mezclar los reactivos con aplicadores hasta obtener un círculo de 2 cm de
diámetro.
5. Oscilar ligeramente la placa por 30 segundos.
6. Esperar 2 min.
7. Leer e interpretar de acuerdo a los resultados.

Prueba directa en tubo:


1. Marcar tres tubos anti-A, anti-B y anti-AB.
2. Colocar en cada tubo una gota del antisuero correspondiente.
3. Adicionar a cada tubo una gota de una suspensión de eritrocitos al 5%
diluidos en solución salina de las células a probar.
4. Mezclar los tubos suavemente y centrifugar de un minuto a 1000 rpm.
5. Resuspender suavemente el botón de las células rojas y examinar la
presencia o ausencia de aglutinación.

Prueba inversa en tubo:


1. Marcar tres tubos A, B y AB.
2. Colocar una gota de suero del paciente a probar en cada uno de los tubos.
3. Agregar una gota de una suspensión de células rojas al 5%, del tipo A, del
tipo B y del tipo AB, a cada uno de los tubos según corresponda.
4. Mezclar suavemente los tubos y centrifugar de un minuto a 1000 rpm.
5. Resuspender el botón de los tubos suavemente y observar la aglutinación.

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Preguntas:

1. Esquematice como se forman los antígenos A y B a partir de la sustancia


H.
2. En que otras células se pueden encontrar los antígenos A y B.
3. Investigue 4 sistemas de grupos sanguíneos presentes en la membrana
de los eritrocitos (no incluír ABO y Rh).
4. Investigue las teorías que se han postulado para explicar la presencia en
los individuos, de anticuerpos anti-A y anti-B de manera natural.
5. Describa una reacción aguda por incompatibilidad ABO.

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PRÁCTICA Nº 5

DETERMINACIÓN DEL SISTEMA Rh.

Objetivo: Identificar la presencia o ausencia del antígeno de D en una muestra


sanguínea, aplicando varias técnicas de aglutinación, para determinar el grupo
sanguíneo completo de un individuo.

Introducción:

En medicina transfusional, después de los grupos sanguíneos ABO, el otro


sistema antigénico principal corresponde a los grupos sanguíneos Rhesus (Rh),
entre los cuales el antígeno D es el de mayores consecuencias para las
reacciones isoinmunes. El sistema Rh es un sistema complejo, además de la
presencia o ausencia del antígeno D, incluye a los antígenos Cc y Ee, sin
embargo se han identificado más de 50 antígenos. La designación de los
individuos como Rh+ y Rh- se refiere solo a la presencia o ausencia del
antígeno D, detectado con un antisuero anti-D. En hemoterapia es necesario
garantizar que los pacientes tipificados como Rh (D) negativos, reciban del
mismo tipo. Este hecho adquiere mayor relevancia en las mujeres en edad
reproductiva, ya que la transfusión de sangre Rh (D) positiva a una niña o
joven Rh (D) negativa, provocaría una sensibilización e inducción de la
producción de anticuerpos anti- D, siendo capaces de atravesar la placenta
durante la gestación de un niño Rh (D) positivo y destruir los glóbulos rojos
fetales provocando la enfermedad hemolítica del recién nacido.

La determinación del antígeno Rh (D), en las células del paciente se lleva a


cabo por aglutinación directa, utilizando anti–Rh (D). Existen algunos individuos
que presentan una débil expresión del antígeno D en sus eritrocitos, los cuales
no pueden ser aglutinados por el anticuerpo anti-Rh (D), al menos que se utilice
la prueba de antiglobulina indirecta (IAT).

Material Biológico:
sangre Humana
antisueros anti-Rh (D)

Material:
portaobjetos
pipetas
aplicadores
tubos de ensayo 10x75 mm
centrifuga
incubadora

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Reactivos:
buffer de fosfatos (PBS)
albúmina bovina
 MEDIDAS DE SEGURIDAD:
Antisueros: Los antisueros contienen azida de sodio que puede reaccionar con
las tuberías de cobre induciendo la formación de un metal ácido altamente
explosivo, por lo que para su desecho se deberá diluír 1:100. Además se
deberán de seguir las indicaciones para el manejo de reactivos biológicos ya
que pueden contener partículas virales.

Prueba en portaobjetos

1. Sobre un portaobjetos limpio y seco, colocar de izquierda a derecha 1 gota


de anti-Rh (D) y en otro lado colocar 1 gota del control Rh (D).
2. Colocar al lado de cada reactivo una gota de sangre
3. Mezclar con un palillo aplicador hasta obtener un circulo de 2 cm de
diámetro.
4. Oscilar ligeramente la placa por 30 segundos.
5. Observar la aglutinación macroscópica después de 2 minutos.

Prueba en tubo
1. Preparar una suspensión de células al 3-5% en solución salina.
2. Mezclar en un tubo una gota de células con una gota de anti-Rh (D).
3. En otro tubo, mezclar una gota de células con una gota de control Rh (D).
4. Centrifugar los tubos un minuto a 1000 rpm
5. Añadir 1 ó 2 gotas de solución salina.
6. Desprender suavemente el botón de células y resuspender.
7. Realizar la lectura macroscopicamente

Prueba de Antiglobulina Indirecta.


1. Depositar en un tubo 100 uL de suero anti-D y 50 uL de la suspensión al
3-5% de glóbulos rojos a investigar.
2. Incubar en baño maría a 37°C durante 45 min.
3. Lavar la pastilla globular en suero fisiológico.
4. Decantar y añadir 100 uL de suero globulina polivalente (anti-IgG).
5. Agitar suavemente y centrifugar 1 minuto a 2200 rpm.
6. Realizar la lectura macroscópicamente

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Preguntas:

1. ¿Cuál es la estructura de los antígenos Rh?


2. En que otras células se pueden encontrar los antígenos del sistema Rh
3. Describa la enfermedad hemolítica del recién nacido
4. ¿Qué es el reactivo de Coombs y para que se utiliza?
5. Investigue porque a este sistema se le denominó Rh

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PRÁCTICA Nº 6

INMUNODIFUSION EN AGAR.

Objetivo: Que los alumnos aprendan la técnica de precipitación en agar, cuantificando


inmunoglobulinas y factores del complemento en suero humano con antisueros
específicos.

Introducción:
La difusión doble en agar es una técnica simple y muy útil que se basa en el principio
de que los antígenos y los anticuerpos difunden a través de un medio semisólido como
el agar y forman complejos Ag-Ac estables, que pueden ser analizados visualmente
como líneas de precipitación. Las líneas de precipitación dependen de la concentración
y del peso molecular de los antígenos y de los anticuerpos, así como de la capacidad de
difusión en el agar.
Las muestras que contienen antígenos y anticuerpos se colocan en pozos opuestos y se
dejan difundir de 24 a 48 horas en una cámara húmeda, hasta que se formen las líneas
de precipitación. Generalmente en esta técnica se emplean antígenos en solución
como por ejemplo: Lisados bacterianos, toxinas, proteínas plasmáticas heterólogas,
extractos de tejidos animales y vegetales, inmunoglobulinas y componentes del
complemento presentes en el suero humano. En esta técnica de doble difusión se
utilizan como anticuerpos Anti-Inmunoglobulinas y Anti-C4 del complemento y como
antígenos suero humano.

Material biológico:
suero humano
antisuero Anti-IgG
antisuero Anti-C3

Reactivos:
agar bacteriológico al 1%
buffer salino de fosfatos (PBS)

Material:
1 caja de petri chica
1 matraz de 125 ml
1 micropipeta de 100 ul
puntillas para micropipetas
1 pipeta de 10 ml
1 pipeta de 5 ml
1 pipeta Pasteur
1 parrilla eléctrica
1 cámara húmeda

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1 centrífuga.
 MEDIDAS DE SEGURIDAD:
Sangre: Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberá de desinfectar el material con cloro al 30 %. En el caso de agujas
depositarlas en los contenedores especiales.
Antisueros: Los antisueros contienen azida de sodio que puede reaccionar con las
tuberías de cobre induciendo la formación de un metal ácido altamente explosivo, por
lo que para su desecho se deberá diluír 1:100. Además se deberán de seguir las
indicaciones para el manejo de reactivos bilógicos ya que pueden contener partículas
virales.
Parrilla eléctrica: No utilizar aparatos eléctricos con las manos mojadas y tener cuidado
de no tocar la superficie de la parrilla para evitar quemaduras.

Metodología:
1. En un matraz Erlenmeyer preparar 10 ml de agarosa en buffer de fosfatos al 1% y
fundir el agar sobre una parrilla eléctrica hasta obtener una solución transparente.
2. Agregar al agar una gota de azul de Evans diluido 1:100.
3. Depositar 10 ml del agar sobre una caja de petri, formando una capa uniforme.
4. Dejar solidificar el agar, colocar los portaobjetos en una cámara húmeda en
refrigeración durante 30 minutos.
5. Con un horadador realizar los diferentes pozos como se indica en la plantilla y
retirar el agar dentro de los pozos con un capilar.
6. Con una micropipeta colocar en cada uno de los pozos los siguientes reactivos:

Pozo central Antisuero (anti-C3 o anti-IgG)


pozo 1 suero humano sin diluir
pozo 2 suero dil. 1:2
pozo 3 suero dil 1:4
pozo 4 suero dil. 1:8
pozo 5 suero dil. 1:16
pozo 6 PBS

1. Colocar la caja de petri en la cámara húmeda y dejarlos a temperatura ambiente de


24 a 48 horas.
2. Observar en los tiempos indicados y realizar un esquema de las líneas de
inmunoprecipitación.

Preguntas:

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1. Esquematice los patrones básicos que se pueden observar con esta


técnica y a que se refieren (Patrones de Identidad, No Identidad,
Identidad Parcial)
2. Describa otros tipos o variantes de Difusión en gel y para que se utilizan.
3. Mencione a que se refieren los términos de Prozona, Post-Zona y Zona
de Equivalencia
Cuál es la importancia del Fenómeno de Zona en las reacciones de
aglutinación y precipitación y que estrategias se utilizan en el laboratorio
para resolver este efecto

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PRÁCTICA Nº 7

GENERACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-A EN CONEJOS.

Objetivo: Que los alumnos realicen un protocolo de inmunización para la obtención de


anticuerpos en conejos, empleando antígenos celulares.

Introducción:
Los eritrocitos sirven como un magnífico sistema antigénico cuando son inyectados en
individuos de otras especies taxonómicamente alejados como el conejo. De esta
manera se pueden obtener anticuerpos contra determinantes antigénicos de la
membrana de los eritrocitos, aplicando una dosis adecuada y siguiendo un esquema de
inmunización, ya que si la dosis del antígeno es pequeña o es una dosis masiva no se
obtienen buenos resultados en los títulos de anticuerpos.
Al finalizar el esquema de inmunización, se debe de cuantificar el grado de respuesta
inmunológica, una forma es valorando los títulos de anticuerpos por la técnica de
hemaglutinación, precipitación en tubo o en agar y fijación de complemento.

Material biológico:
1 conejo
5 ml de eritrocitos humanos de tipo “A”

Reactivos:
buffer salino de fosfatos (PBS)
xileno
alcohol
heparina

Material:
1 jeringa de 5ml
2 tubos cónicos
1 tapón
1 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
1 pipeta Pasteur con bulbo
1 centrifuga

 Medidas de seguridad:
Normas generales para el laboratorio:
1. Usar bata con manga larga.
2. Usar guantes en el desarrollo de las prácticas.
3. No deben ingerir alimentos ni bebidas en el laboratorio.
4. No pipetear con la boca ningún reactivo o solución, se usarán micropipetas, jeringas
o pipetores.

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Las medidasde seguridad anteriores se aplicarán en todas las prácticas de laboratorio.


Manejo de los animales de experimentación: Utilizar bata, guantes, cubrebocas y
recordar que se les debe de brindar un trato adecuado.
Sangre: Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberá de desinfectar el material con cloro al 30 %. En el caso de agujas
deposítelas en los contenedores especiales.
Xileno: Puede provocar irritación al ser inhalado o entrar en contacto con la piel por lo
que se deberá de utilizar bata, cubrebocas y guantes, además de ventilar de forma
adecuada el laboratorio.

Metodología:
1. Obtener 5 ml de sangre tipo “A” por punción venosa y vaciarla a un tubo con
anticoagulante.
2. Centrifugar el tubo a 3000 r.p.m., durante 5 minutos.
3. Retirar con la pipeta Pasteur el sobrenadante y lavar las células, tres veces con
buffer de fosfatos a 1800 r.p.m., durante 10 minutos.
4. Después del último lavado, retirar con la pipeta Pasteur el sobrenadante y preparar
una suspensión de eritrocitos al 10%, en un volumen de 5 ml.
5. Seguir el siguiente esquema de inmunización, aplicando 1 ml de la suspensión de
eritrocitos al 10% por kilogramo de peso del conejo, si hay varios conejos
marcarlos debidamente para identificarlos.

Día Vía de inmunización


1 Intradermica
15 Intramuscular
21 Intramuscular
28 Intramuscular
35 Obtención de suero inmune

6. Hacer las anotaciones indicadas por el profesor en la etiqueta de la jaula del conejo
7. Tomar una muestra de sangre del conejo inmunizado, de la siguiente manera:
a) Colocar el conejo en una trampa.
b) Limpiar las orejas del animal con alcohol al 70%.
c) Aplicar en las orejas xileno con un cotonete y esperar 3 minutos.
d) Tener listos dos tubos de ensaye.
e) Localizar la vena más dilatada e introducirle una aguja.
f) Esperar a que gotee la sangre y recolectarla en los tubos.

8. Centrifugar los tubos a 3000 r.p.m. durante 10 minutos.


9. Recolectar en un tubo pequeño con una pipeta Pasteur todo el suero que se pueda,
cuidando de no contaminarlo con eritrocitos.

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

Preguntas

1.- Cual es el principio de un Adyuvante, como está compuesto y en qué casos


debe de utilizarse?
2.- Del esquema de inmunizaciones realizadas, consideras que proporcionar un
nuevo reto incrementaría la concentración de anticuerpos específicos? Explique
3.-Cual es la importancia de la obtención del suero pre-inmune?
4.-En la administración de antígenos que ventajas y desventajas proporcionan
las siguientes vías: Intramuscular, subcutánea, intradérmica e intravenosa.

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

PRÁCTICA Nº 8

AISLAMIENTO DE LEUCOCITOS

Objetivo: Realizar la separación y cuantificación de leucocitos a partir de


sangre periférica, por medio de sedimentación espontánea.

Introducción:
Las células pueden separarse sobre la base de características físicas como
tamaño, densidad de flotación y adhesividad. La separación de células sobre la
base de su velocidad de sedimentación diferencial, que de manera aproximada
se correlaciona con el tamaño, puede llevarse a cabo por centrifugación a
través de un gradiente de densidad. La centrifugación de sangre entera en
Ficoll-Hypaque de densidad 1,077 g/mL deja a las células mononucleares
(linfocitos, monocitos y células natural killer) flotando en una banda en la
interfase, mientras que los eritrocitos y leucocitos polimorfonucleares, que son
más densos, forman un sedimento en el fondo del tubo. La adherencia a la
superficie del plástico elimina en gran medida a las células fagocíticas.

Otra forma de separar las células sanguíneas, es por medio de la


sedimentación espontánea en base, al tamaño y forma celular. Con este simple
procedimiento pueden ser separados los eritrocitos de las demás células
blancas, ya que en un promedio de tiempo determinado sedimentan más pronto
los eritrocitos que presentan menor tamaño y las células blancas permanecen
en el sobrenadante suspendidas junto con los componentes del suero, ya que
éstas últimas presentan mayor resistencia a sedimentar en un medio coloidal.

Material biológico:
5 ml de sangre periférica

Reactivos:
solución de Hank's
buffer de fosfatos
heparina

Material:
2 tubos cónicos de 15 ml
1 pipeta Pasteur
1 pipeta de células blancas
1 hemocitómetro
1 jeringa de 5 ml
centrífuga
solución de Hank’s
microscopio óptico

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

Metodología:

1. Obtener 5 mL de sangre periférica, utilizando una jeringa.


2. Vaciar la sangre en un tubo cónico con 100 uL de heparina.
3. Adicionar 5 ml de buffer salino de fosfatos, tapar el tubo y mezclar por
inversión suavemente.
4. Incubar el tubo de manera inclinada durante 45 minutos a 37 0C.
5. Sin mover el tubo de la gradilla, con una pipeta Pasteur recolectar el
sobrenadante, que contiene las células blancas y pasarlo a otro tubo
cónico.
6. Centrifugar el tubo a 2000 r.p.m. durante 10 minutos. Retirar el
sobrenadante hasta la marca de un mililitro.
7. Con una pipeta Pasteur resuspender suavemente el botón de células
blancas.
8. Añadir 5ml de solución de Hank’s, tapar el tubo y mezclar por inversión
suavemente.
9. centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m.
10. Realizar un lavado más de las células y resuspender en un volumen final
de un mililitro.
11. Llenar una pipeta de Thomas hasta la marca de 0.5 con las células, en
seguida aspirar sin formar burbujas el colorante azul de tripan hasta la
marca 11. Agitar la pipeta vigorosamente durante 1-2 minutos. En la
pipeta de mezcla se obtiene una dilución 1:20.
12. Colocar una gota en la cámara de Neubauer , cuantificar el número de
células y su viabilidad celular con el objetivo de 20.

Preguntas:
1. ¿Cuál fue el número de células que obtuvo y la viabilidad celular?

2. ¿Qué importancia tiene el conocer el número de células vivas y muertas?

3. Describa dos métodos para el aislamiento de subpoblaciones celulares.

4. Investigue 3 aplicaciones de la utilización de los leucocitos en pruebas


inmunológicas in vitro.

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

PRÁCTICA Nº 9

QUIMIOTAXIS DE LEUCOCITOS

Objetivo: Que los alumnos analicen la capacidad de movimiento de los leucocitos en


respuesta a un gradiente de concentración.

Introducción:
Una característica importante de los leucocitos fagocitarios es su capacidad para
moverse en respuesta a estímulos quimiotácticos. Esta respuesta es una parte esencial
de la defensa del huésped contra las infecciones. La locomoción de las células cuando
es unidireccional en respuesta a un gradiente de concentración químico se le conoce
como “quimiotaxis”.
La fuente más importante de factores quimiotácticos en el cuerpo humano es el
sistema del complemento, el cual genera los fragmentos quimiotácticos C3b y C5a, el
zimosan y algunos péptidos quimiotácticos bacterianos.Existe un factor inactivador
quimiotáctico que interactúa directamente con los factores quimiotácticos. Este factor
sérico ha sido asociado con deficiencias quimiotácticas en pacientes con enfermedad
de Hodgkin, cirrosis, sarcoidosis, lepra lepromatosa y lupus eritematoso sistémico.

Reactivo biológico
Sangre
Medio de cultivo

Reactivos
SLR
Agar Noble
Hank’s
Zimosan
Caseína

Material y equipo
Pipetas pasteur
Jeringa
Tubo con EDTA
Gradilla
Tubo cónico
Pipeta volumétrica 5 ml
Horadador
Caja petri
Centrifuga

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

Cámara húmeda

 MEDIDAS DE SEGURIDAD.
Sangre: Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberán hacer los lavados de las células sobre un recipiente que contenga
cloro al 30 %. En el caso de agujas hay que recordar que hay que depositarlas en los
contenedores especiales.

Metodología:

1. Extraer 5 ml de sangre en un tubo con anticoagulante (EDTA) y


centrifugar 5 minutos a 3400 rpm.
2. Recuperar los leucocitos con pipeta pasteur y depositarlos en un tubo
cónico.
3. Añadir SLR hasta un volumen final de 8 ml, mantener en hielo 5 minutos,
durante la incubación homogenizar 3 veces.
4. Centrifugar 5 minutos a 3400 rpm, decantar.
5. Lavar con 5ml de Hank’s, centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.
6. Resuspender el botón de células en 0.5 ml de Hank’s.
7. En una caja petri, añadir 7 ml de agarosa al 0.9 %, dejar solidificar.
8. Hacer las horadaciones como las indique el Docente con los siguientes
agentes quimiotácticos (10-15 µL):

a. Células obtenidas
b. Control negativo (PBS)
c. Suero
d. Medio de cultivo
e. Zimosan
f. Caseína

9. Incubar la caja de petri 24 hrs en cámara húmeda a temperatura


ambiente.
10. Teñir y observar la migración de las células.

Preguntas:

1. Explique cómo participan los factores quimiotácticos en la inflamación.


2. ¿Cómo se generan los fragmentos quimiotácticos del complemento?.
3. Investigue 3 péptidos quimiotácticos bacterianos.

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

4. Investigue 3 factores quimiotácticos endógenos (no incluir el


complemento).
5. ¿Porqué es importante en ésta técnica valorar la viabilidad celular?.

PRÁCTICA Nº 10

FAGOCITOSIS DE PARTÍCULAS DE LÁTEX.

Objetivo: Que los alumnos realicen la separación de las células fagocíticas de sangre
periférica por medio de su propiedad de adherencia al vidrio y aprendan a evaluar su
función fagocítica, utilizando partículas de látex.

Introducción:
La respuesta inmune es mediada por una gran variedad de células y por sustancias
solubles que liberan estas células. Los leucocitos son uno de los elementos centrales
de la respuesta inmune participando en diferentes tejidos, un grupo importante de
estas células lo constituyen las células fagocíticas en las que se incluyen: monocitos,
macrófagos y polimorfonucleares.
Estas células fagocíticas se unen a microorganismos para internalizarlos y luego
matarlos durante un proceso denominado fagocitosis, el cual constituye una defensa
primaria contra las infecciones. El estudio de la función fagocítica se puede realizar
haciendo reaccionar in vitro a las células fagocíticas con bacterias o partículas de látex,
después de un tiempo se analiza el número de células que fagocitan, el tiempo de
ingestión y el número de partículas ingeridas.
En la función bactericida de los fagocitos, la activación de los metabolitos del oxigeno
es importante en la destrucción de los microorganismos ingeridos. Una de las formas
de medir el peróxido de oxígeno que se genera dentro de las células fagocíticas que se
generan es la reducción del nitroazul de tetrazolio (NBT).
Las pruebas de la función fagocítica son de importancia para la valoración de las
Inmunodeficiencias de los mecanismos fagocíticos, como por ejemplo la Enfermedad
Granulomatosa Crónica.

Reactivo biológico
Sangre

Reactivos
Hank’s
PBS
Látex
Esmalte
Colorante de Wright
Aceite de inmersión

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

Material y equipo
Jeringa de 3 ml
Cubreobjetos
Portaobjetos
Microscopio
Pipetas Pasteur
Caja de petri

 MEDIDAS DE SEGURIDAD.
Sangre: Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberá hacer los lavados de los cubreobjetos sobre un recipiente que
contenga cloro al 30 %. En el caso de agujas recordar que hay que depositarlas en los
contenedores especiales.

Metodología:

1. Marcar dos cubreobjetos uno como Hank’s y el segundo como Hank’s-


látex.
2. Colocar de 1 a 3 gotas de sangre de la jeringa en cada cubreobjetos.
3. Incubar en cámara húmeda 20 minutos a 37° C.
4. Lavar con PBS.
5. Cubrir con Hank’s el cubreobjetos marcado como Hank’s, y el otro
cubrirlo con Hank’s-látex.
6. Incubar 20 minutos a 37° C en cámara húmeda.
7. Lavar con PBS.
8. Teñir con Wright.
9. Montar las preparaciones sobre un portaobjetos colocando esmalte en
las esquinas del cubreobjetos.
10. Contar 100 células con el objetivo de inmersión y anotar cuantas células
fagocitaron partículas de látex y obtener el porcentaje de fagocitosis.
11. Contar las partículas de látex fagocitadas y obtener un promedio por
célula.

IF= % de fagocitosis X Promedio de partículas fagocitadas


100

Preguntas:
1. ¿Cuáles células llevan a cabo la fagocitosis.?

2. Explique cuáles son las fases de la fagocitosis.


3. ¿Cuál propiedad biológica interviene para que las células fagocíticas se adhieran

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

al vidrio.
4. ¿Qué importancia tiene conocer el índice fagocítico (I.F.)
5. Describa la enfermedad granulomatosa crónica

PRÁCTICA Nº11

VALORACIÓN DE ANTICUERPOS DE CONEJO

Objetivo: Que los alumnos aprendan las técnicas de aglutinación, cuantificando los
títulos de anticuerpos en el suero del conejo.

Introducción:
Uno de los métodos para medir el complejo antígeno-anticuerpo, lo constituyen las
reacciones de aglutinación, esta técnica consiste en la agregación de partículas tales
como células, bacterias y partículas de látex sensibilizadas con antígenos por
anticuerpos denominados aglutininas. La combinación del complejo en su primera fase
comprende la reacción antígeno-anticuerpo y la segunda fase consiste en la agregación
visible de partículas formando una aglutinación que puede ser observada a simple vista
o con una lupa. Las pruebas de aglutinación son técnicas semicuantitativas, pero
debido a su sencillez son de gran utilidad para la cuantificación e identificación de
antígenos y anticuerpos.

Material biológico:
eritrocitos tipo “A”
ovoalbúmina
sueros de los conejos inmunizados

Reactivos:
buffer salino de fosfatos

Material:
2 tubos cónicos de 15 ml
10 tubos de vidrio de 10X75
2 pipetas de 1 ml
1 pipeta de 10 ml
2 pipetas Pasteur
bañoMaría

 MEDIDAS DE SEGURIDAD.
Sangre : Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberá de desinfectar el material con cloro al 30 %. En el caso de agujas
deposite las en los contenedores especiales.

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

Suero de conejo: Para el manejo del suero de conejo se deberá de utilizar guantes,
además las diluciones se tienenque desinfectar con cloro al 30 % antes de lavar el
material.

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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.

Metodología:
1. Colocar 3 ml de sangre tipo “A” en un tubo cónico y lavar los eritrocitos 3 veces con
buffer salino de fosfatos, centrifugando a 1800 r.p.m. durante 10 minutos.
2. Preparar una suspensión de eritrocitos al 2%
3. Enumerar los tubos de ensaye del 1 al 8 y hacer diluciones del suero.

No. de tubo PBS Suero de conejo


1 0.1 ml 0.1 ml de suero
2 0.1 ml 0.1 ml del tubo 1
3 0.1 ml 0.1 ml del tubo 2
4 0.1 ml 0.1 ml del tubo 3
5 0.1 ml 0.1 ml del tubo 4
6 0.1 ml 0.1 ml del tubo 5
7 0.1 ml 0.1 ml del tubo 6
8 0.1 ml 0.1 ml del tubo 7
9 0.1ml 0.1 ml del tubo 8
10 0.1ml 0.1 ml del tubo 9
Controles:
11 0.1ml 0.1 ml anti-A
12 0.1ml 0.1ml PBS

4. Adicionar a todos los tubos 0.1 ml de la suspensión de eritrocitos al 2% y mezclar.


5. Colocar los tubos en baño María a 37o C durante 1 hora.
6. Centrifugar los tubos a 1800 r.p.m. durante 1 minuto.
7. Observar cada uno de los tubos y reportar en cuales existe aglutinación de
eritrocitos.

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Preguntas

1. Describa qué tipo de células se estimulan en una inmunización primaria y


cuales en la secundaria?
2. ¿ Con qué finalidad se hacen las diluciones del suero de conejo?
3. ¿ Porqué los primeros tubos presentan hemólisis?.
4. ¿ Hasta que dilución observó aglutinación?.
5. ¿Qué títulos de anticuerpos obtuvieron?.

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