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SEXTO SEMESTRE
PROGRAMAACADÉMICO
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO
1
Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.
PRACTICA No. 1
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.
Lavado de manos
El lavado de manos frecuente es una práctica de seguridad importante. Debe
realizarse después del contacto con pacientes y muestras de laboratorio. Como
mínimo, las manos deben lavarse con agua y jabón (si hay suciedad visible),
realizar antisepsia con una preparación a base de alcohol (si las manos no
tienen suciedad visible), en los siguientes casos:
1. Después de terminar el trabajo de laboratorio y antes de salir del mismo.
2. Después de retirarse los guantes.
3. Antes de comer, beber, aplicar maquillaje y cambiar lentes de contacto, así
como antes y después de usar el sanitario.
4. Antes de todas las actividades que impliquen contacto manual con las
mucosas o lesiones en la piel.
5. Justo después del contacto cutáneo accidental con sangre, líquidos
corporales o tejidos. Si el contacto ocurre por roturas en los guantes, los
guantes deben retirarse de inmediato y las manos se lavan en forma
minuciosa. Si se produce contaminación accidental en un área expuesta de la
piel, o por rotura de los guantes, primero se debe realizar un lavado con jabón
líquido, enjuagar bien con agua y luego se aplica una dilución 1:10 de
blanqueador, isopropilo al 50% o alcohol etílico. El blanqueador o el alcohol se
dejan en la piel por lo menos durante un minuto antes del lavado final con jabón
líquido y agua.
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Preguntas:
1.- Investiga la Norma Oficial Mexicana (NOM), 087 y 166, y describe los
apartados que consideres aplican al desempeño del Laboratorio de
Inmunología.
2.- Mencione algunos métodos que se utilizan para inactivar muestras
biológicas.
3.-Investigue que organismos a nivel nacional e internacional regulan la
bioseguridad.
4.- Realiza un cuadro especificando el tipo de envase y código de color para el
almacenamiento y transporte de RPBIs.
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PRACTICA No. 2
MANEJO DE MICROPIPETAS
Objetivo:
Introducción:
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Material:
Reactivos
Solución de azul de metileno
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PRÁCTICA Nº3
1.- Describe los tipos de toma de muestra sanguínea que se utilizan en el área
clínica
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PRÁCTICA Nº 4
Introducción:
El sistema ABO fue descubierto por Landsteiner en 1900, al observar que los
eritrocitos de algunos individuos eran aglutinados por el suero de otros. Estas
reacciones fueron relacionadas a la presencia de marcadores (antígenos) sobre
la superficie de las células rojas y anticuerpos en el suero. Los antígenos del
grupo sanguíneo ABO son codificados por un locus genético, el cual tiene tres
alelos A, B, y O. Cada progenitor hereda uno de éstos tres alelos a sus
descendientes, lo que da lugar a cuatro posibles tipos sanguíneos (fenotipos) A,
B, AB y O. El grupo sanguíneo A presenta dos fenotipos A1 y A2. Los
anticuerpos anti-A y anti-B aparecen de manera espontánea cuando el antígeno
está ausente en la superficie de los eritrocitos; así una persona del grupo
sanguíneo A poseerá anticuerpos anti-B, etc. Los anticuerpos anti-A y anti-B,
son inmunoglobulinas IgM o IgG, por lo que en las transfusiones sanguíneas
incompatibles, estos anticuerpos provocan una reacción aguda y severa.
Material Biológico:
sangre Humana
antisueros anti-A
antisuero Anti-B
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Material:
portaobjetos
pipetas
aplicadores
tubos de ensayo 10x75 mm
Centrifuga
Reactivos:
buffer de fosfatos (PBS)
MEDIDAS DE SEGURIDAD:
Antisueros: Los antisueros contienen azida de sodio que puede reaccionar con
las tuberías de cobre induciendo la formación de un metal ácido altamente
explosivo, por lo que para su desecho se deberá diluír 1:100. Además se
deberán de seguir las indicaciones para el manejo de reactivos biológicos ya
que pueden contener partículas virales.
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Preguntas:
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PRÁCTICA Nº 5
Introducción:
Material Biológico:
sangre Humana
antisueros anti-Rh (D)
Material:
portaobjetos
pipetas
aplicadores
tubos de ensayo 10x75 mm
centrifuga
incubadora
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Reactivos:
buffer de fosfatos (PBS)
albúmina bovina
MEDIDAS DE SEGURIDAD:
Antisueros: Los antisueros contienen azida de sodio que puede reaccionar con
las tuberías de cobre induciendo la formación de un metal ácido altamente
explosivo, por lo que para su desecho se deberá diluír 1:100. Además se
deberán de seguir las indicaciones para el manejo de reactivos biológicos ya
que pueden contener partículas virales.
Prueba en portaobjetos
Prueba en tubo
1. Preparar una suspensión de células al 3-5% en solución salina.
2. Mezclar en un tubo una gota de células con una gota de anti-Rh (D).
3. En otro tubo, mezclar una gota de células con una gota de control Rh (D).
4. Centrifugar los tubos un minuto a 1000 rpm
5. Añadir 1 ó 2 gotas de solución salina.
6. Desprender suavemente el botón de células y resuspender.
7. Realizar la lectura macroscopicamente
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Preguntas:
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PRÁCTICA Nº 6
INMUNODIFUSION EN AGAR.
Introducción:
La difusión doble en agar es una técnica simple y muy útil que se basa en el principio
de que los antígenos y los anticuerpos difunden a través de un medio semisólido como
el agar y forman complejos Ag-Ac estables, que pueden ser analizados visualmente
como líneas de precipitación. Las líneas de precipitación dependen de la concentración
y del peso molecular de los antígenos y de los anticuerpos, así como de la capacidad de
difusión en el agar.
Las muestras que contienen antígenos y anticuerpos se colocan en pozos opuestos y se
dejan difundir de 24 a 48 horas en una cámara húmeda, hasta que se formen las líneas
de precipitación. Generalmente en esta técnica se emplean antígenos en solución
como por ejemplo: Lisados bacterianos, toxinas, proteínas plasmáticas heterólogas,
extractos de tejidos animales y vegetales, inmunoglobulinas y componentes del
complemento presentes en el suero humano. En esta técnica de doble difusión se
utilizan como anticuerpos Anti-Inmunoglobulinas y Anti-C4 del complemento y como
antígenos suero humano.
Material biológico:
suero humano
antisuero Anti-IgG
antisuero Anti-C3
Reactivos:
agar bacteriológico al 1%
buffer salino de fosfatos (PBS)
Material:
1 caja de petri chica
1 matraz de 125 ml
1 micropipeta de 100 ul
puntillas para micropipetas
1 pipeta de 10 ml
1 pipeta de 5 ml
1 pipeta Pasteur
1 parrilla eléctrica
1 cámara húmeda
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1 centrífuga.
MEDIDAS DE SEGURIDAD:
Sangre: Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberá de desinfectar el material con cloro al 30 %. En el caso de agujas
depositarlas en los contenedores especiales.
Antisueros: Los antisueros contienen azida de sodio que puede reaccionar con las
tuberías de cobre induciendo la formación de un metal ácido altamente explosivo, por
lo que para su desecho se deberá diluír 1:100. Además se deberán de seguir las
indicaciones para el manejo de reactivos bilógicos ya que pueden contener partículas
virales.
Parrilla eléctrica: No utilizar aparatos eléctricos con las manos mojadas y tener cuidado
de no tocar la superficie de la parrilla para evitar quemaduras.
Metodología:
1. En un matraz Erlenmeyer preparar 10 ml de agarosa en buffer de fosfatos al 1% y
fundir el agar sobre una parrilla eléctrica hasta obtener una solución transparente.
2. Agregar al agar una gota de azul de Evans diluido 1:100.
3. Depositar 10 ml del agar sobre una caja de petri, formando una capa uniforme.
4. Dejar solidificar el agar, colocar los portaobjetos en una cámara húmeda en
refrigeración durante 30 minutos.
5. Con un horadador realizar los diferentes pozos como se indica en la plantilla y
retirar el agar dentro de los pozos con un capilar.
6. Con una micropipeta colocar en cada uno de los pozos los siguientes reactivos:
Preguntas:
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PRÁCTICA Nº 7
Introducción:
Los eritrocitos sirven como un magnífico sistema antigénico cuando son inyectados en
individuos de otras especies taxonómicamente alejados como el conejo. De esta
manera se pueden obtener anticuerpos contra determinantes antigénicos de la
membrana de los eritrocitos, aplicando una dosis adecuada y siguiendo un esquema de
inmunización, ya que si la dosis del antígeno es pequeña o es una dosis masiva no se
obtienen buenos resultados en los títulos de anticuerpos.
Al finalizar el esquema de inmunización, se debe de cuantificar el grado de respuesta
inmunológica, una forma es valorando los títulos de anticuerpos por la técnica de
hemaglutinación, precipitación en tubo o en agar y fijación de complemento.
Material biológico:
1 conejo
5 ml de eritrocitos humanos de tipo “A”
Reactivos:
buffer salino de fosfatos (PBS)
xileno
alcohol
heparina
Material:
1 jeringa de 5ml
2 tubos cónicos
1 tapón
1 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
1 pipeta Pasteur con bulbo
1 centrifuga
Medidas de seguridad:
Normas generales para el laboratorio:
1. Usar bata con manga larga.
2. Usar guantes en el desarrollo de las prácticas.
3. No deben ingerir alimentos ni bebidas en el laboratorio.
4. No pipetear con la boca ningún reactivo o solución, se usarán micropipetas, jeringas
o pipetores.
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Metodología:
1. Obtener 5 ml de sangre tipo “A” por punción venosa y vaciarla a un tubo con
anticoagulante.
2. Centrifugar el tubo a 3000 r.p.m., durante 5 minutos.
3. Retirar con la pipeta Pasteur el sobrenadante y lavar las células, tres veces con
buffer de fosfatos a 1800 r.p.m., durante 10 minutos.
4. Después del último lavado, retirar con la pipeta Pasteur el sobrenadante y preparar
una suspensión de eritrocitos al 10%, en un volumen de 5 ml.
5. Seguir el siguiente esquema de inmunización, aplicando 1 ml de la suspensión de
eritrocitos al 10% por kilogramo de peso del conejo, si hay varios conejos
marcarlos debidamente para identificarlos.
6. Hacer las anotaciones indicadas por el profesor en la etiqueta de la jaula del conejo
7. Tomar una muestra de sangre del conejo inmunizado, de la siguiente manera:
a) Colocar el conejo en una trampa.
b) Limpiar las orejas del animal con alcohol al 70%.
c) Aplicar en las orejas xileno con un cotonete y esperar 3 minutos.
d) Tener listos dos tubos de ensaye.
e) Localizar la vena más dilatada e introducirle una aguja.
f) Esperar a que gotee la sangre y recolectarla en los tubos.
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Preguntas
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PRÁCTICA Nº 8
AISLAMIENTO DE LEUCOCITOS
Introducción:
Las células pueden separarse sobre la base de características físicas como
tamaño, densidad de flotación y adhesividad. La separación de células sobre la
base de su velocidad de sedimentación diferencial, que de manera aproximada
se correlaciona con el tamaño, puede llevarse a cabo por centrifugación a
través de un gradiente de densidad. La centrifugación de sangre entera en
Ficoll-Hypaque de densidad 1,077 g/mL deja a las células mononucleares
(linfocitos, monocitos y células natural killer) flotando en una banda en la
interfase, mientras que los eritrocitos y leucocitos polimorfonucleares, que son
más densos, forman un sedimento en el fondo del tubo. La adherencia a la
superficie del plástico elimina en gran medida a las células fagocíticas.
Material biológico:
5 ml de sangre periférica
Reactivos:
solución de Hank's
buffer de fosfatos
heparina
Material:
2 tubos cónicos de 15 ml
1 pipeta Pasteur
1 pipeta de células blancas
1 hemocitómetro
1 jeringa de 5 ml
centrífuga
solución de Hank’s
microscopio óptico
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Metodología:
Preguntas:
1. ¿Cuál fue el número de células que obtuvo y la viabilidad celular?
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PRÁCTICA Nº 9
QUIMIOTAXIS DE LEUCOCITOS
Introducción:
Una característica importante de los leucocitos fagocitarios es su capacidad para
moverse en respuesta a estímulos quimiotácticos. Esta respuesta es una parte esencial
de la defensa del huésped contra las infecciones. La locomoción de las células cuando
es unidireccional en respuesta a un gradiente de concentración químico se le conoce
como “quimiotaxis”.
La fuente más importante de factores quimiotácticos en el cuerpo humano es el
sistema del complemento, el cual genera los fragmentos quimiotácticos C3b y C5a, el
zimosan y algunos péptidos quimiotácticos bacterianos.Existe un factor inactivador
quimiotáctico que interactúa directamente con los factores quimiotácticos. Este factor
sérico ha sido asociado con deficiencias quimiotácticas en pacientes con enfermedad
de Hodgkin, cirrosis, sarcoidosis, lepra lepromatosa y lupus eritematoso sistémico.
Reactivo biológico
Sangre
Medio de cultivo
Reactivos
SLR
Agar Noble
Hank’s
Zimosan
Caseína
Material y equipo
Pipetas pasteur
Jeringa
Tubo con EDTA
Gradilla
Tubo cónico
Pipeta volumétrica 5 ml
Horadador
Caja petri
Centrifuga
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Cámara húmeda
MEDIDAS DE SEGURIDAD.
Sangre: Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberán hacer los lavados de las células sobre un recipiente que contenga
cloro al 30 %. En el caso de agujas hay que recordar que hay que depositarlas en los
contenedores especiales.
Metodología:
a. Células obtenidas
b. Control negativo (PBS)
c. Suero
d. Medio de cultivo
e. Zimosan
f. Caseína
Preguntas:
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PRÁCTICA Nº 10
Objetivo: Que los alumnos realicen la separación de las células fagocíticas de sangre
periférica por medio de su propiedad de adherencia al vidrio y aprendan a evaluar su
función fagocítica, utilizando partículas de látex.
Introducción:
La respuesta inmune es mediada por una gran variedad de células y por sustancias
solubles que liberan estas células. Los leucocitos son uno de los elementos centrales
de la respuesta inmune participando en diferentes tejidos, un grupo importante de
estas células lo constituyen las células fagocíticas en las que se incluyen: monocitos,
macrófagos y polimorfonucleares.
Estas células fagocíticas se unen a microorganismos para internalizarlos y luego
matarlos durante un proceso denominado fagocitosis, el cual constituye una defensa
primaria contra las infecciones. El estudio de la función fagocítica se puede realizar
haciendo reaccionar in vitro a las células fagocíticas con bacterias o partículas de látex,
después de un tiempo se analiza el número de células que fagocitan, el tiempo de
ingestión y el número de partículas ingeridas.
En la función bactericida de los fagocitos, la activación de los metabolitos del oxigeno
es importante en la destrucción de los microorganismos ingeridos. Una de las formas
de medir el peróxido de oxígeno que se genera dentro de las células fagocíticas que se
generan es la reducción del nitroazul de tetrazolio (NBT).
Las pruebas de la función fagocítica son de importancia para la valoración de las
Inmunodeficiencias de los mecanismos fagocíticos, como por ejemplo la Enfermedad
Granulomatosa Crónica.
Reactivo biológico
Sangre
Reactivos
Hank’s
PBS
Látex
Esmalte
Colorante de Wright
Aceite de inmersión
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Material y equipo
Jeringa de 3 ml
Cubreobjetos
Portaobjetos
Microscopio
Pipetas Pasteur
Caja de petri
MEDIDAS DE SEGURIDAD.
Sangre: Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberá hacer los lavados de los cubreobjetos sobre un recipiente que
contenga cloro al 30 %. En el caso de agujas recordar que hay que depositarlas en los
contenedores especiales.
Metodología:
Preguntas:
1. ¿Cuáles células llevan a cabo la fagocitosis.?
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al vidrio.
4. ¿Qué importancia tiene conocer el índice fagocítico (I.F.)
5. Describa la enfermedad granulomatosa crónica
PRÁCTICA Nº11
Objetivo: Que los alumnos aprendan las técnicas de aglutinación, cuantificando los
títulos de anticuerpos en el suero del conejo.
Introducción:
Uno de los métodos para medir el complejo antígeno-anticuerpo, lo constituyen las
reacciones de aglutinación, esta técnica consiste en la agregación de partículas tales
como células, bacterias y partículas de látex sensibilizadas con antígenos por
anticuerpos denominados aglutininas. La combinación del complejo en su primera fase
comprende la reacción antígeno-anticuerpo y la segunda fase consiste en la agregación
visible de partículas formando una aglutinación que puede ser observada a simple vista
o con una lupa. Las pruebas de aglutinación son técnicas semicuantitativas, pero
debido a su sencillez son de gran utilidad para la cuantificación e identificación de
antígenos y anticuerpos.
Material biológico:
eritrocitos tipo “A”
ovoalbúmina
sueros de los conejos inmunizados
Reactivos:
buffer salino de fosfatos
Material:
2 tubos cónicos de 15 ml
10 tubos de vidrio de 10X75
2 pipetas de 1 ml
1 pipeta de 10 ml
2 pipetas Pasteur
bañoMaría
MEDIDAS DE SEGURIDAD.
Sangre : Se debe de hacer un manejo cuidadoso de todo el material que tenga contacto
con la sangre humana, ya que es un producto biológico potencialmente infeccioso, por
lo que se deberá de desinfectar el material con cloro al 30 %. En el caso de agujas
deposite las en los contenedores especiales.
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Araceli Gómez Corvera, Jorge Luis Ayala Luján, Marisa Hernández Barrales, Ma. del Socorro Martínez Becerra.
Suero de conejo: Para el manejo del suero de conejo se deberá de utilizar guantes,
además las diluciones se tienenque desinfectar con cloro al 30 % antes de lavar el
material.
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Metodología:
1. Colocar 3 ml de sangre tipo “A” en un tubo cónico y lavar los eritrocitos 3 veces con
buffer salino de fosfatos, centrifugando a 1800 r.p.m. durante 10 minutos.
2. Preparar una suspensión de eritrocitos al 2%
3. Enumerar los tubos de ensaye del 1 al 8 y hacer diluciones del suero.
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Preguntas
30