Vous êtes sur la page 1sur 49

USULAN PENELITIAN

UJI EFEK PROTEKTIF KOMBINASI MINYAK JINTAN HITAM (Nigella sativa)


KOMERSIL DAN MADU PADA JARINGAN DUODENUM TIKUS JANTAN
GALUR WISTAR YANG DIBERI PAJANAN CISPLATIN

KHUSNUL WASILAH

I1011161047

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS TANJUNGPURA

PONTIANAK

2018
UJI EFEK PROTEKTIF KOMBINASI MINYAK JINTAN HITAM (Nigella
sativa) KOMERSIL DAN MADU PADA JARINGAN DUODENUM TIKUS
JANTAN GALUR WISTAR YANG DIBERI PAJANAN CISPLATIN

Tanggung Jawab Yuridis Material Pada

KHUSNUL WASILAH
I1011161047

Disetujui oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

dr. M. In’am Ilmiawan, M. Biomed dr. Mitra Handini, M. Biomed

NIP. 197910182006041002 NIP. 198509082009122005

Mengetahui,

Ketua Program Studi Pendidikan Dokter

Fakultas Kedokteran Universitas Tanjungpura

dr. Wiwik Windarti, Sp.A

NIP. 198210162008012006
DAFTAR ISI
DAFTAR SINGKATAN

AED : Animal Equivalent Dose


ATP : Adenosine Triphosphate
CAT : Catalase
CI : Combination Index
CCL4 : Carbon Tetrachloride
DNA : Deoxyribonucleic Acid
FDA : Food and Drug Administration
GSH : Reduced Glutathione
GSH-Px : Glutathione Peroxidase
HED : Human Equivalent Dose
HMP : Hexose Monophosphate
K : Kontrol
M : Madu
MJH : Minyak Jintan Hitam
NADPH : Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate
NS : Nigella sativa
P : Perlakuan
PUFA : Polyunsaturated Fatty Acids
ROS : Reactive Oxygen Species
SOD : Superoxide Dismutase
TQ : Thymoquinone
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR TABEL
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Kanker merupakan salah satu penyebab kematian di seluruh dunia,
menurut WHO kanker menempati posisi kedua pada tahun 2010 setelah penyakit
kardiovaskuler.1Penyebab terbesar kematian akibat kanker sebanyak 70% ialah
terjadi di negara yang berpenghasilan rendah.2 Seiring dengan berjalanannya
waktu serta berkembangnya kemajuan teknologi, para penderita kanker diobati
dengan kemoterapi.3 Cisplatin merupakan salah satu obat atau agen antineoplastik
poten yang sering digunakan sebagai kemoterapi untuk penderita yang telah
terdiagnosis kanker.4,5

Cisplatin adalah obat antineoplastik berbahan dasar platinum.6 Kerja dari


cisplatin ialah secara sistemik, kanker adalah salah satu yang menjadi tergetnya,
akan tetapi semua sel-sel lain dapat terpapar oleh cisplatin.7 Cisplatin telah
digunakan secara luas terutama untuk pengobatan kanker testis, ovarium kandung
kemih, pengobatan kanker esofagus, lambung, kepala, leher, genitorinari dan
pengobatan kanker paru sel kecil, kanker paru non-sel-kecil.8,9 Penggunaan
cisplatin dapat membentuk radikal bebas, sehingga cisplatin dengan dosis tinggi
serta dosis rendah yang berjangka panjang dapat memicu terjadinya
toksiksitas.10,11

Jintan hitam (Nigella sativa) merupakan salah satu tanaman obat yang
telah lama digunakan sebagai terapi berbagai macam penyakit. Biji jintan hitam
ini banyak mengandung senyawa bioaktif seperti thymoquinone dan asam lemak
tak jenuh ganda ( Polyunsaturated Fatty Acids / PUFA) yang memiliki berbagai
efek positif sebagai antioksidan, perbaikan membran sel serta terhadap
penyembuhan berbagai penyakit.12

Madu adalah substansi alami yang dihasilkan oleh lebah madu dari nektar
atau sekresi yang dikumpulkannya dari tanaman. Madu memiliki aktivitas
antioksidannya diperkirakan berasal dari beberapa senyawa yang mengandung
flavonoid, asam fenolat dan berbagai enzim.13. Noor et al14 membuktikan bahwa
madu dapat melindungi tubuh dari efek toksik bahan kimia.

Dalam sistem gastrointestinal terdapat duodenum yang merupakan salah


satu segmen usus halus yang berperan penting dalam absorbsi nutrisi dan
mentralkan asam lambung. Proses absorbsi di duodenum dilakukan melalui
reseptor-reseptor spesifik yang terdapat pada membran mukosa duodenum. Selain
itu, duodenum juga berfungsi untuk menetralkan asam lambung melalui sekresi
bikarbonat oleh kelenjar Brunner. Secara histologi, struktur duodenum sama
seperti segmen usus halus lain, tersusun atas membran mukosa yang terdiri dari
epitel dan lamina propia, membran submukosa, tunika muskularis, dan tunika
serosa.15

Cidera gastrointestinal merupakan salah satu efek samping dari


kemoterapi. Beberapa peneliti juga menunjukkan bahwa toksisitas cisplatin
memiliki kolerasi yang dekat dengan densitas mitokondria dan sensitivitas sel.
Mitokondria memiliki pengaruh besar terhadap induksi kematian sel terhadap
daerah dengan sel yang memiliki banyak mitokondria seperti duodenum. Sel
mukosa yang kaya mitokondria mengalami derajat apoptosis yang tinggi pada
pemberian cisplatin.16
Berdasarkan uraian singkat yang telah dipaparkan diatas, penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui efek protektif dari kombinasi jintan hitam dan madu
pada jaringan tubuh yang diberi pajanan cisplatin, dikarnakan duodenum
mempunyai fungsi pencernaan dan absorbsi awal di usus halus.

1.2 Rumusan Masalah


Apakah kombinasi minyak jintan hitam dan madu dapat memberikan efek
protektif pada jaringan doudenum tikus yang diberi pajanan cisplatin?

1.3 Tujuan Penelitian


1.3.1 Tujuan Umum
Mengetahui efek protektif kombinasi minyak jintan hitam dan madu pada
jaringan duodenum tikus yang diberi pajanan cisplatin.
1.3.2 Tujuan Khusus
1) Mengetahui pengaruh minyak jintan hitam dan madu serta kombinasinya
terhadap gambaran histopatologi dudoenum tikus yang diberi pajanan
cisplatin.

2) Mengetahui kelompok dosis yang memberikan efek protektif paling baik


terhadap jaringan duodenum yang diberi pajanan cisplatin.

3) Mengetahui sinergisitas efek protektif kombinasi minyak jintan hitam dan


madu terhadap organ duodenum yang diinduksi cisplatin.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Bagi Peneliti


Menjadi sarana latihan dalam melakukan penelitian dan menyusun
karya tulis ilmiah, serta menambah pengetahuan peneliti mengenai
mekanisme kerusakan yang terjadi pada duodenum akbiat pengaruh
pajanan cisplatin.

1.4.2 Bagi Intitusi Pendidikan Kedokteran


Menambah wawasan dan ilmu pengetahuan di bidang histopatologi
tentang efek protektif yang disebabkan oleh pajanan cisplatin serta sebagai
sumber data dan rujukan bagi penelitian selanjutnya.

1.4.3 Bagi Masyarakat


1. Memberikan informasi kepada masyarakat mengenai pengaruh cisplatin
terhadap penderita kanker.
2. Memberikan informasi kepada masyarakat mengenai kombinasi minyak
jintan hitam dan madu dapat memberikan efek protektif terhadap organ
duodenum yang diberi pajanan cisplatin.
1.5 Keaslian Penelitian

Nama Peneliti Judul penelitian Metode Penelitian Perbedaan

Danladi J, Akpulu S. Histological Effect of Variabel bebas : Pada penelitian ini


P., Owolagba G. K., Oral Administration minyak jintan hitam variabel bebasnya
Afuwai V. K., of Ccl4-Induced dan Ccl4- adalah madu dan
Hadiza R. A., T. Stomach and jintan hitam,
Murdakai. Duodenum Damage Variabel terikat : sedangkan variabel
and the Protective gambaran histologi terikatnya adalah
Effect of Nigella lambung dan gambaran
Sativa in Adult duodenum histopatologi
Wistar Rats duodenum tikus.

Innocentia Botlhale Effect of in victro Variabel bebas : Pada penelitian ini


Magoshi simulated gastro- Madu Fynbos variabel bebasnya
duodenal digestion adalah madu dan
on the antioxidant Variabel terikat : jintan hitam,
and anti- efek secara in vitro sedangkan variabel
inflammatory pada gastro-duodenal terikatnya adalah
activity of South gambaran
African Fynbos histopatologi
honey duodenum tikus.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Duodenum
2.1.1 Anatomi
Proses penyerapan terhadap sistem pencernaan terbanyak terjadi di usus
kecil. Pada usus kecil, yang pertama kali dilewati makanan adalah duodenum
yang memiliki panjang paling pendek diantara usus kecil lainnya. Duodenum
adalah bagian dari yang terletak setelah lambung. Struktur duodenum berbentuk
seperti huruf C dan bersebelahan dengan pankreas. Panjang duodenum sekitar 20-
25 cm dan berada di atas umbilicus. Struktur ini terletak retroperitoneale kecuali
bagian awalnya, yang dihubungkan dengan hati oleh suatu ligamentum
hepatoduodenale, yang merupakan bagian dari omentum minus. Duodenum dibagi
atas 4 bagian atau pars yaitu pars superior, pars desendens, pars inferior, dan pars
asendens. Bagian distal pylorus, atau 2 cm pertama duodenum, memiliki
mesenterium sementara 3 cm distal duodenum pars superior dan bagian-bagian
duodenum lainnya tidak memiliki mesenterium. 17

Gambar 2.1 Anatomi Duodenum.18

2.1.2 Fisiologi
Pada dasarnya usus halus mempunyai beberapa peran dalam sistem
pencernaan yaitu untuk penyerapan dan sekresi. Duodenum melanjutkan proses
pencernaan yang dilakukan sebelumnya oleh organ gaster.19 Mekanisme
penyerapan oleh duodenum seperti karbohidrat, lemak, dan protein membutuhkan
enzim-enzim dari pankreas untuk mengubahnya ke bentuk yang lebih sederhana.
Pada pencernaan lemak dibutuhkan garam empedu untuk proses penyerapanya,
proses kontraksi empedu ini terjadi ketika lemak menyentuh permukaan mukosa
duodenum yang menyebabkan kolesistokinin yang mana merupakan hasil dari
sekresi duodenum untuk memengaruhi kontraksi kantung empedu.19,20 Proses
selanjutnya yaitu absorbsi zat-zat penting dari makanan yang telah dicerna
sebelumnya. Absorbsi gula, asam amino, dan lemak sebagian besar terjadi di
duodenum dan jejunum.21

2.1.3 Histologi

Gambar 2.2 Histologi Duodenum, kelenjar Brunner (Pembesaran 40x). 22

Tunika mukosa diliputi epitel selapis torak yang mempunyai mikrovili. Di antara
sel epitel terdapat sel piala yang jumlahnya belum begitu banyak. Tunika mukosa
membentuk vilus intestinal yang gemuk-gemuk. Lamina propria terdapat di
bawah epitel vilus maupun di sekitar kriptus Lieberkuhn. Pada dasar kriptus dapat
ditemukan sel Paneth, berupa sel berbentuk limas dengan puncaknya menghadap
lumen. Di dalam sitoplasmanya terdapat granula kasar berwarna merah.22

Tunika muskularis mukosa tidak ikut membentuk vilus intestinal. Lapisan


otot ini sering terlihat terpenggal-penggalkarena ditembusi perluasan masa
kelenjar Brunner. Tunika submukosa dipenuhi kelenjar Brunner. Tunika mukosa
dan submukosa bersama-sama membentuk lipat-lingkat plika sirkular. Dengan
kata lain, pada setiap plika sirkulat terdapat banyak vilus intestinal. Pleksus saraf
Meissner juga dapat ditemukan disini. Tunika muskularis terdiri atas lapisan
sirkularis dan longitudinal; di antaranya terdapat pleksus saraf Auerbach. Tunika
adventisia berupa jaringan ikat longgar, kadang disebut serosa (biasa dilapisi oleh
mesotel) karena sebagian lainnya terletak ekstraperintoneal.22

Lapisan dinding pada saluran pencernaan tersususun atas 4 lapisan dari


luar ke dalam yaitu serosa, muskuler, submukosa, dan mukosa. 23,24
Dinding duodenum terdiri atas empat lapisan konsentris :
1. Lapisan paling luar yang dilapisi peritoneum diebut serosa. Lapisan
ini merupakan kelanjutan dari peritoneum yang tersusun atas selapis
pipih sel-sel mesothelial di atas jaringan ikat longgar san pembuluh
darah.
2. Lapisan muskuler disebut juga tunika muskularis yang tersusun atas
serabut otot longitudinal (luar) dan sikuler (dalam). Pleksus mienterikus
Aurbach terletak di antara kedua lapisan ini dan berfungsi mengatur otot
di sepanjang usus.
3. Lapian submukosa terdapat kelenar duodenal tubuler yang sangat
bercabang. Kelenjar ini juga dapat disebut kelenjar brunner yang meru-
pakan ciri khas dari duodenum. Kelenjar brunner bermuara ke krypta
Lieberkuhn melalui duktus sekretorius. Sekresi dari kelenjar brunner
bersifaqt visceus, jernih, dengan pH alkalis (pH 8,2- 9,3). Kelenjar
brunner berguna melingdungi mukosa duodenum terhadap sifat korosif
dari getah lambung yang asam dan mengoptimalkan pH usus bagi kerja
enzim pankreas.
4. Mukosa merupakan lapisan dinding yang paling dalam. Terdiri dari 3
lapisan, yaitu lapisan salam (muskularismukosa), lapisan tengah (lamina
propria), dan lapisan terdalam yang terdiri dari selapis sel-sel epitel
kolumnar yang melapisi krypte dan vili-vilinya.
Duodenum memiliki banyak kelenjar mukosa tubular pada bagian
proksimalnya. Kelenjar duodenal ini disebut dengan kelenjar Brunner, memiliki
muara duktus ekskretorius di antar kriptus intestinal. Hasil sekresi kelenjar yang
bersifat basa berfungsi untuk melindungi membran mukosa duodenum serta
menjaga pH usus agar enzim pankreas bekerja secara optimal.15 Kelenjar
Brunner secara histologis dapat dilihat pada gambar 2.3.25

Gambar 2.3 Histologi Duodenum meliputi kelenjar Brunner.25 Kelenjar Brunner ditandai
dengan lingkaran berwarna merah
2.1.4 Histopatologi pada Duodenum
Para peneliti telah melakukan penagamatan untuk menilai perubahan epitel
mukosa pada duodenum yaitu pengaruh pemberian formaldehid terhadap organ
duodenum. Penilitian pada mencit yang diberikan pajanan selama 12 minggu
menjukkan perubahan epitel mukosa meliputideskuamasi erosi, dan ulserasi epitel
(Gambar 2.4). 26

1 2

3 4

3 Gambar 2.4 Hasil Pengamatan Mikroskopik Epitel Duodenum Tikus Wistar 26

(1) Gambaran normal pada epitel; (2) Gambaran deskuamasi dengan


adanya pelepasan elemen epitel; (3) Gambaran erosi dengan menunjukkan
hilangnya sebagian dari ketebalan mukosa; (4) Gambaran ulserasi menunjukkan
hilangnya seluruh tebal mukosa atau putusnya permukaan epitel mukosa.

2.1.5 Jejas pada duodenum


Sel dapat bereaksi berupa perubahan fungsi atau perubahan struktur sel .
Perubahan tersebut disebabkan apabila sel terkena rangsangan patologis yang
berupa jejas . Reaksi perubahan fungsi atau perubahan struktur sel yaitu
retrogesif, progesif dan adaptatif yang berupa atrofi, hipertrofi, dysplansia dan
metaplasia. Efek yang ditimbulkan pada gastrointestinal akibat dari adanya jejas
tergantung dari kedalaman jejas tersebut. Reaksi yang ditimbulkan berupa erosi
mukosa yaitu kehilangan sebagian ketebalan mukosa dan ulserasi mukosa yaitu
kehilangan seluruh ketebalan mukosa bahkan terkadang terjadi defek yang lebih
dalam lagi hingga mencapai muskularis propia.24
Adanya stimulus berupa eksogen maupun endogen yang menimbulkan
jejas pada sel dapat mengakibatkan reaksi radang yaitu berupa reaksi kompleks
pada jaringan yang memiliki vaskularisas.Duodenitis memiliki manifestasi klinik
yaitu berupa nyeri atau rasa tidak nyaman di epigastrium.27 Rasa tidak nyaman di
epigastrium disebut juga syndrom dyspepsia. Hasil gambaran histologis
ditemukan gambaran sel radang hingga mukosa lamina propia , desquamasi epitel,
erosi, ulserasi pada mukosa duodenum.24

2.2Cisplatin
2.2.1 Pengguanaan Cisplatin sebagai Pengobatan Kanker
Cisplatin merupakan salah satu agen kemoterapi yang sering digunakn
pada penderita kanker. Cisplatin juga telah digunakan secara luas terutama untuk
pengobatan kanker testis, ovarium dan kandung kemih, serta pengobatan kanker
esofagus, lambung, kepala, leher, genitorinari dan pengobatan kanker paru sel
kecil, kanker paru non-sel-kecil.6,8,9 Struktur kimia cisplatin dapat dilihat pada
gambar 2.5

Gambar 2.5 Struktur kimia cisplatin.28

2.2.2 Farmakokinetik
Jalur intravena dapat digunakan dalam rute pemberian cisplatin. Efek
kadar cisplatin yang tinggi dapat ditemukan pada ginjal, hepar, usus dan testis,
setelah obat diberikan.29 Infusi IV biasanya digunakan sebagai jalur administrasi
cisplatin, pemberiannya juga dapat dilakukan secara intraperitoneal untuk kanker
ovarium dan intra-arterial yang bertujuan sebagai perfusi cisplatin pada organ
tertentu. Sifat untuk dapat berikatan pada protein plasma dengan cepat merupakan
sifat umum yang dikenal dari cisplatin. Setelah penginjeksian pada tikus, platinum
bebas pada total platinum dalam plasma setelah injeksi platinum sekitar 25%
dalam 45 menit dan 0% dalam 1 jam.30,31

2.2.3 Farmakodinamik
Cisplatin merupakan sebuah komplek larut air, mengandung atom
platinum ditengah dengan susunan koordinasi planar dengan dua atom klorin dan
dua gugus amonia disekelilingnya. Aktivitas reaksinya mirip dengan agen
pengalkilasi. Cl- akan mengalami disosiasi apabila zat ini memasuki sel, Cl-akan
meninggalkan sebuah kompleks reaktif yang bereaksi dengan air dan berinteraksi
dengan DNA dan membentuk suatu ikatan silang untai dalam dan antar untai
(intrastrand dan interstrand) dengan berikatan dengan N7 dan O6 pada molekul
guanin di sekitar sehingga dapat menyebabkan denaturasi DNA lokal.30,32 Oleh
sebab itu, salah satu obat kanker yang sangat efektif adalah cisplatin.33

2.2.4 Efek Samping Cisplatin terhadap Duodenum


Mitokondria banyak terdapat di duodenum16. Cidera gastrointestinal
merupakan salah satu efek samping utama kemoterapi.34 Mitokondria memainkan
peran penting dalam induksi kematian sel.35 Penelitian yang dilakukan oleh qian
etal16 menunjukkan bahwa densitas mitokondria dan sensitifitas sel terhadap
toksisitas cisplatin memiliki kolerasi yang dekat, yang dibuktikan dengan
kematian sel yang lebih banyak di daerah dengan sel yang lebih kaya mitokondria
seperti duodenum dibanding ileum yang lebih sedikit. Selmukosa yang kaya
mitokondria mengalami derajat apoptosis yang tinggi pada pemberian cisplatin.16
Cisplatin dihidrolisis untuk membentuk metabolic yang bermuatan positif.36
Karena potensial membran mitokondria lebih negative maka mitokondria banyak
mengakumulasi metabolic cisplatin dan meningkatkan derajat disfungsi
mitokondria.16
Mitokondria yang dalam kondisi patologis cenderung memproduksi ROS
lebih banyak. Cisplatin menyebabkan peningkatan produksi ROS dan
mengganggu rantai pernapasan mitokondria37. Produksi ROS yang tak terkontrol
memicu terbukanya pori-pori mitokondria sehingga memicu apoptosis dan
nekrosis. 38,39
Farooqui al dalam penelitiannya mengenai toksisitas cisplatin pada sel
hepar mengungkapkan bahwa disfungsi mitokondria juga menyebabkan gangguan
pada jalur metabolisme energi seperti HMP shunt, siklus Krebs dan glikolisis
yang berdampak pada penurunan ATP. HMP shunt yang terganggu berdampak
pada penurunan NADPH yang diperlukan untuk daur ulang GSH. Stres oksidatif
dan penurunan ATP akan menyebabkan berbagai abnormalitas sel.40

2.3 Jintan Hitam (Nigella sativa)


2.3.1 Morfologi
Jintan hitam (Nigella sativa) merupakan tanaman berbunga tahunan yang
tumbuh dengan tinggi sekitar 20-90 cm,bunga jintan memiliki 5-10 kelopak
dengan tekstur yang halus, biasanya berwarna kuning, putih, biru pucat, merah
muda dan ungu pucat. Buah jintan berbentuk seperti kapsul besar yang terdiri dari
3-7 folikel, dengan masing-masing folikel berisi banyak biji.41 Bijinya memiliki
bentuk seperti buah pir (segitiga) dengan ujung biji runcing dan s melengkung,
berwarna hitam, bagian satu sisinya datar dan yang lainnya cembung, serta
permukaan biji jintan agak menonjol dan teratur.42 Contoh tanaman dan biji jintan
hitam dapat diihat pada gambar 2.6

Gambar 2.6 Jintan Hitam (Nigella sativa)43

2.3.2 Toksonomi
Klasifikasi taksonomi Nigella sativa adalah sebagai berikut:44
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Ranunculales
Famili : Ranunculaceae
Genus : Nigella
Spesies : Nigella sativa

2.3.3 Kandungan Kimia


Biji jintan hitam sangat kaya dan memiliki beragam komposisi kimia yang
aktif. Biji jintan hitam mengandung 36%-38% fixed oil, protein, tanin, alkaloid,
saponin, dan 0,4% - 2,5% minyak esensial yang bersifat volatile (mudah
menguap). Bahan fenol aktif yang paling penting adalah thymoquinone (30%-
48%), thymohydroquinone, dithymoquinone, p-cymene (7%-15%), carvacrol (6%-
12%), 4-terpineol (2%-7%), t-anethol (1%-4%), sesquiterpenelongifolene (1%-
8%).46 Pada jintan hitam, juga terkandung 2 jenis alkaloid yang berbeda; yakni
isoquinolinealkaloids (contohnya adalah nigellicimine dan nigellicimine-N-oxide)
dan pyrazolalkaloid atau alkaloid yang mengandung cincin indazole (contohnya
adalah nigellidine dan nigellicine). Minyak jintan hitam kaya akan asam lemak tak
jenuh jamak (PUFA: polyunsaturated fatty acids) yang juga berperan penting
dalam memberikan efek antioksidan selain dari thymoquinone.47

2.3.4 Distribusi
Jintan hitam biasa dikenal sebagai black seeds atau black cumin dalam
bahasa Inggris, Habat el Baraka atau Habbatussauda dalam bahasa Arab.48 Nama
lain jintan hitam di Pakistan dan India disebut sebagai kalonji.49 Peranan penting
jintan hitam dalam pengobatan Nabi Muhammad SAW. Bukhari dan Muslim
meriwayatkan bahwa Nabi Muhammad SAW mengatakan di dalam jintan hitam
terdapat penyembuh bagi segala macam penyakit, kecuali kematian.50 Jintan
hitam didalam alkitab dikatakan sebagai black cumin sebagai Melanthion oleh
Hippocrates.

2.3.5 Efek Farmakologi


Ekstrak NS mempunyai kandungan sifat antioksidan yang kuat.
Thymoquine adalah unsur utama yang aktif dalam NS, yang berperan melindungi
dan menjaga sel dari kerusakan oksidatif yang dapat disebabkan oleh berbagai
agen yang memproduksi radikal bebas, seperti karbon tetraklorida, termasuk aden
alkilasi seperti cisplatin, dan doksorubisin. TQ, Dithymoquinone, dan timol yang
memiliki efek radikal bebas dapat dilakukan uji terhadap beberapa spesies oksigen
reaktif (ROS).Senyawa-senyawa yang dilakukan uji dari NS menghasilkan efek
antioksidan yang kuat, seperti menurunkan kadar radikal bebas dan meningkatkan
aktivitas enzim hati, superoksida dismutase (SOD). Selain unsur aktif NS seperti
thymoquinone, PUFA memiliki peranan dalam meregenerasi membran yang
mengalami kerusakan dan mempercepat proses perbaikan dengan cara yaitu
mengganti komponen PUFA yang teroksidasi oleh ROS.47,51

2.4 Madu
2.4.1 Definis Madu
Madu lebah, dibentuk dari nektar oleh lebah madu (Apis millifera), adalah
satu dari beberapa produk natural yang baru-baru ini sering diperhatikan oleh
karena banyak efek terapi yang dapat ditunjukkan. Telah dilaporkan, bahwa madu
rata-rata memiliki sekitar 200 jenis substansi. Sejak dahulu, telah dilihat bahwa
madu dapat digunakan untuk mengatasi permasalahan hati, kardiovaskuler, dan
saluran pencernaan.52

2.4.2 Kandungan Kimia


Madu mengandung sekitar 200 zat dan sebagian besar terdiri dari gula, air,
asam amino, protein (enzim), asam organik, vitamin (B,C,E), mineral (kalsium,
tembaga, besi, magnesium, mangan, fosfor, kalium, natrium dan seng) dan senyawa
fenolat.53
Komposisi madu bervariasi tergantung dari tanaman yang dikonsumsi oleh
lebah tersebut. Namun, hampir semua madu natural mengandung zat-zat yang
sama. Karbohidrat merupakan unsur yang terutama, berisikan sekitar 95% dari
berat kering madu, yakni fruktosa (33-38%) dan glukosa (29-31%).47,54
2.4.3 Efek Farmakologi
Manfaat kesehatan madu dalam mengobati banyak penyakit dikaitkan
dengan berbagai konstituen aktifnya, terutama flavonoid dan asam fenolat.
Campuran kompleks berbagai zat pada madu bekerja secara sinergis untuk
memberikan efek antioksidan.55,56
Madu kaya akan flavonoid dan asam fenolat. Senyawa-senyawa tersebut
merupakan senyawa fungsional utama yang ada di madu dan termasuk dalam
senyawa fenolat.57 Flavonoid berperan dalam eleminasi radikal bebas, inhibisi
enzim pembentuk radikal bebas, dan pengikat ion logam. Sedangkan asam fenolat
berperan dalam eliminasi radikal bebas, inhibisi enzim peroksidase, dan
58,59
meningkatan sistem pertahanan antioksidan enzimatik dan non enzimatik.
Madu memiliki efek antimikroba, mempercepat penyembuhan luka,
antivirus, antijamur, antikanker, antiinflamasi, dan antioksidan.60 Madu juga
digunakan secara luas untuk mengobati berbagai permasalahan optalmologi
(seperti blefaritis, keratitis, konjungtivitis, kerusakan kornea, hingga terbakarnya
mata oleh karena kimia ataupun suhu)61,62, membatasi peningkatan kadar gula
dalam darah pada penderita diabetes63, penyakit-penyakit saluran pencernaan dan
kardiovaskuler.60

2.5 Konversi Dosis dengan Skla Alometri


Studi skala alometri antar spesies untuk konversi dosis manusia dan hewan
merupakan salah satu area yang sering dipelajari dan diteliti dalam ilmu
farmakologi klinis. Pendekatan alometri mempertimbangkan perbedaan area
permukaan tubuh, yang berhubungan dengan berat badan, untuk menghitung dosis
agen terapi antar spesies. Pendekatan ini mengasumsikan bahwa terdapat beberapa
karakteristik unik pada proses anatomi, fisiologi, dan biokimia antar spesies yang
akan mempengaruhi farmakokinetik suatu obat.64
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam memperkirakan suatu dosis, antara
lain:64
a. Hewan yang lebih besar memiliki kecepatan metabolisme yang lebih
lambat.
b. Proses fisiologis hewan yang lebih besar lebih lambat.
c. Hewan yang lebih besar membutuhkan dosis obat yang lebih kecil
berdasarkan berat.
d. Perbedaan waktu fisiologis diantara spesies disebabkan oleh faktor alometri
e. Skala alometri tidak digunakan untuk mengkonversi dosis dewasa menjadi
dosis anak.

Dosis suatu spesies berkaitan erat dengan berat badan meskipun hal tersebut
bukan merupakan satu-satunya faktor yang mempengaruhi perhitungan dosis.
Terdapat istilah yang disebut faktor koreksi (Km) yang didapat dengan membagi berat
badan rata-rata sebuah spesies dengan luas permukaan tubuhnya (m 2). Sebagai
contoh, berat badan rata-rata manusia adalah 60 kg, dan luas permukaannya adalah
1,62 m2, maka faktor Km untuk manusia dihitung dengan 601,62⁄=37.106 Kalkulasi
dosis ekuivalen manusia dan hewan berdasarkan luas permukaan tubuh dapat
dilihat pada tabel 2.1. dan tabel 2.2.

Tabel 2.1. Kalkulasi dosis ekuivalen manusia.


Konversi dosis hewan
Luas
Referensi Rentang menjadi HED
Spesies permukaa Km
berat badan berat badan Dosis hewan Dosis hewan
n badan
dibagi dengan dikali dengan
Manusia 60 - 1,62 37 - -
Mencit 0,02 0,011 - 0,034 0,007 3 12.3 0,081
Hamster 0,08 0,047 - 0,157 0,016 5 7.4 0,135
Tikus 0,15 0,08 - 0,27 0,025 6 6.2 0,162
Ferret 0,3 0,16 - 0,54 0,043 7 5.3 0,189
Guinea pig 0,40 0,208 - 0,700 0,05 8 4,6 0,216
Rabbit 1,8 0,90 - 3,0 0,15 12 3,1 0,324
Dog 10 5 - 17 0,50 20 1,8 0,541
Monkey
3 1,4 - 4,9 0,25 12 3,1 0,324
(Rhesus)
Marmoset 0,35 0,14 - 0,72 0,06 6 6,2 0,162
Squirrel
0,60 0,29 - 0,97 0,09 7 5,3 0,189
monkey
Baboon 12 7 - 23 0,60 20 1,8 0,541
Micro pig 20 10 - 33 0,74 27 1,4 0,730
Mini pig 40 25 - 64 1,14 35 1,1 0,946
*Data didapat dari panduan FDA.64 FDA: Food and Drug Administration, HED: Human
Equivalent Dose

Berdasarkan kalkulasi pada tabel 2.1. nilai faktor Km dari berbagai spesies
hewan digunakan untuk menghitung dosis ekuivalen manusia (HED), antara lain
sebagai berikut:
mg mg K m Hewan
HED ( ) = Dosis Hewan ( ) × Eq. 1
kg kg K m Manusia
Faktor Km untuk tiap spesies selalu konstan, rasio Km digunakan untuk
menyederhanakan kalkulasi, sehingga persamaan 1 dapat dimodifikasi sebagai
berikut:
mg mg
HED ( ) = Dosis Hewan ( ) × Rasio K m Eq. 2
kg kg
Nilai rasio Km yang tersedia pada tabel 2.1. didapat dengan mudah dengan
cara membagi faktor Km manusia dengan faktor Km hewan atau sebaliknya.
Serupa dengan estimasi HED, dosis ekuivalen hewan (AED) dapat
dihitung dengan cara membagi atau mengkalikan dosis manusia dengan rasio Km
yang terdapat pada Tabel 2.2.
Dosis ekuivalen hewan dikalkulasikan dengan sedikit modifikasi dari
persamaan 2 menjadi :
mg mg
AED ( ) = Dosis Manusia ( ) × Rasio K m Eq. 3
kg kg
Sebagai contohnya, jika dosis sebuah obat tertentu pada manusia sebesar
10 mg/kgBB, maka AED dihitung dengan cara mengkalikan HED dengan 6,2 atau
membagi HED dengan 0,162, sehingga hasil perhitungannya adalah 62 mg/kg.
Konversi unit (mg/kg menjadi mg/m2) dosis hewan atau manusia dapat
dihitung menggunakan faktor Km (Tabel 1) seperti berikut:
mg mg
⁄m2 = K m × ⁄kg Eq. 4

Namun, konversi antar spesies berdasarkan mg/m2 tidak berlaku untuk


obat-obat yang diadministrasikan melalui jalur topikal, nasal, subkutan atau
intramuskular serta protein yang diadministrasikan secara parenteral dengan berat
molekul > 100.000 Dalton.64
Tabel 2.2. Kalkulasi dosis ekuivalen hewan.
Konversi dosis manusia
Referensi menjadi AED
Spesies Km
berat badan Dosis manusia Dosis manusia dibagi
dikali dengan dengan
Manusia 60 37 - -
Mencit 0,02 3 12.3 0,081
Hamster 0,08 5 7.4 0,135
Tikus 0,15 6 6.2 0,162
Ferret 0,3 7 5.3 0,189
Guinea pig 0,40 8 4,6 0,216
Rabbit 1,8 12 3,1 0,324
Dog 10 20 1,8 0,541
Monkey
3 12 3,1 0,324
(Rhesus)
Marmoset 0,35 6 6,2 0,162
Squirrel
0,60 7 5,3 0,189
monkey
Baboon 12 20 1,8 0,541
Micro pig 20 27 1,4 0,730
Mini pig 40 35 1,1 0,946
*Data didapat dari panduan FDA.64FDA: Food and Drug Administration, AED: Animal
Equivalent Dose

2.6 Kombinasi Obat


Di dalam suatu studi mengenai kombinasi obat, setiap obat tunggal harus
memiliki efek. Maka dalam kombinasinya, mereka akan menghasilkan salah satu
dari ketiga efek kombinasi obat yaitu efek sinergis,adiktif atau antagonis. Untuk
menentukan efek kombinasi, dapat digunakan metode indeks kombinasi. Namun,
jika terdapat salah satu obat yang tidak memiliki efek terapi; jika obat A memiliki
efek dan obat B tidak, dan jika dalam kombinasi mereka memiliki efek yang lebih
besar dari obat A, maka itu adalah efek potensiasi/enhancement.65
Menurut definisi, sinergis adalah efek yang lebih dari aditif, sedangkan
antagonis adalah efek yang kurang dari aditif. Sinergis pada dasarnya merupakan
hukum massa-aksi fisikokimia, bukan statistik. Menentukan efek sinergis adalah
dengan nilai CI (combination index), tidak dengan nilai-nilai P. Efek kombinasi yang
lebih besar dari efek masing-masing obat tidak selalu berarti sinergis. Kadang ini
merupakan hasil dari efek aditif atau bahkan sedikit antagonis. A + B > A atau A
+ B > B adalah aksioma sederhana yang tidak memerlukan bukti rumit, seperti
nilai-nilai P. Dengan demikian, jika efek gabungan lebih besar dari efek masing-
masing obat maka tidak harus berarti sinergis.65
Efek aditif dari dua obat bukan merupakan penjumlahan aritmatika
sederhana dari efek kedua obat tersebut. Jika (D)1 dan (D)2 masing-masing
menghambat 30% dan 40%, efek aditif bukanlah 70%, karena jika mereka
menghambat masing-masing 60% dan 70%, efek aditif tidak dapat menjadi 130%.
Sehingga untuk menentukan apakah suatu kombinasi obat menghasilkan efek
sinergis, aditif atau antagonis harus ditentukan dengan nilai CI.65

2.7 Indeks Kombinasi


Indeks kombinasi (CI) digunakan untuk kuantifikasi sinergisme atau
antagonisme pada dua obat. Persamaan indeks kombinasi untuk dua obat dapat
dilihat pada gambar 2.6.
(𝐷)1 (𝐷)2 (𝐷)1 (𝐷)2
CI = + = +
(𝐷𝑥 )1 (𝐷𝑥 )2 (𝐷𝑚 )1 [𝑓𝑎 ⁄(1 − 𝑓𝑎 )] 1 (𝐷𝑚 )2 [𝑓𝑎 ⁄(1 − 𝑓𝑎 )]1⁄𝑚2
1⁄𝑚

Gambar 2.7 Persamaan umum indeks kombinasi untuk dua obat.65

Nilai CI > 1, CI = 1 dan CI > 1 masing-masing menunjukkan efek sinergis,


aditif dan antagonis. Di bagian penyebut, (Dx)1 adalah D1 tunggal yang
menginhibisi suatu sistem sebesar x%, dan (Dx)2 adalah D2 tunggal yang
menginhibisi suatu sistem sebesar x%. Nilai (Dx)1 dan (Dx)2 dapat
dikalkulasikan dari persamaan D = Dm [fa/(1 - fa)]l/m, dimana D adalah dosis
obat, fa adalah efek yang dipengaruhi D, Dm adalah dosis efek median yang
menghambat sistem sebesar 50%, dan m adalah koefisien yang menandakan
bentuk hubungan efek-dosis yang mana m = 1, > 1, dan <1 masing-masing
menunjukkan kurva efek-dosis hiperbolik, sigmoid, dan sigmoid datar. (D)1 +
(D)2 dalam kombinasi juga menghambat sistem sebesar x%. Jika penjumlahan
kedua fraksi ini dalam persamaan CI adalah sama dengan 1, maka menunjukkan
efek aditif. Jika nilai CI adalah lebih kecil dari 1, maka menunjukkan efek
sinergis, dan jika nilai CI lebih besar dari 1, maka menunjukkan efek
antagonis.107 Interpretasi nilai CI dapat dilihat pada table 2.3
Tabel 2.3. Interpretasi nilai CI.
Nilai CI Interpretasi
<0,1 Sinergis sangat kuat
0,1 – 0,3 Sinergis kuat
0,3 – 0,7 Sinergis
0,7 – 0,85 Sinergis moderat
0,85 – 0,9 Sinergis ringan
0,9 – 1,1 Mendekati aditif
1,1 – 1,2 Antagonis ringan
1,2 – 1,45 Antagonis moderat
1,45 – 3,3 Antagonis
3,3 – 10 Antagonis kuat
> 10 Antagonis sangat kuat
2.8 Kerangka Teori
Cisplatin

- - -
Antioksidan Antioksidan Disfungsi
nonenzimatik enzimatik: SOD, Mitokondria
yaitu GSH CAT, GSH-PX
- +
+ +
-
ROS +

-
+
Thymoquinon
Minyak Stress Oksidatif ATP ↓
e
jintan hitam PUFA

-
Gangguan Proteolisis Kerusakan
Asam fenolat,
Integritas Intraseluler DNA
flavonoid,
Membran
vitamin C,
Madu

Karotenoid,
vitamin E Jejas sel

Kerusakan histologi
jaringan duodenum ;
deskuamasi, erosi, ulserasi

Gambar 2.8 Kerangka Teori

Keterangan : + : Meningkatkan
- : Menurunkan
: Pajanan cisplatin
: Pajanan Bahan uji
2.9 Kerangka Konsep

MJH/ MADU MJH + Madu

Cisplatin Cisplatin Cisplatin

Gambaran histopatologis jaringan duodenum

Gambar 2.9. Kerangka Konsep.

2.10 Hipotesis
Kombinasi minyak jintan hitam dan madu dapat memberikan efek
nefroprotektif pada tikus jantan galur Wistar yang diberi pajanan cisplatin.
BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian


Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental dengan desain
randomized post test only control group. Hewan uji yang digunakan sebagai
subjek penelitian yaitu tikus jantan galur Wistar.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian


Perlakuan pada tikus dan pengambilan organ dilakukan di Laboratorium
Mikroskopik Fakultas Kedokteran Universitas Tanjungpura. Adapun organ yang
digunakan merupakan organ tersimpan yang telah dilakukan perlakuan
sebelumnya. Sementara proses pembuatan sedian dilakukan di Laboratorium
Patalogi Anatomi RSUD Soedarso. Waktu penelitian dapat dilihat pada tabel 3.1
Tabel 3.1 Jadwal Penelitian

Januari -
Kegiatan/ Maret April Mei Juni Juli Agustus
Pelaksanaan 2018 2018 2018 2018 2018 2018
Penyusunan
proposal
Seminar Proposal

Pembuatan
preparat histologi
dari organ
tersimpan
Pembacaan
preparat histologi

Pengolahan data
dan pelaporan
3.2 Subjek Penelitian
Menggunakan bahan biologis tersimpan dari penelitian sebelumnnya66
dengan rincian sebagai berikut :
3.2.1 Populasi Penelitian
Pada penelitian ini, hewab coba yang digunakan adalah tikus ( Rattus novergicus)
jantan galur Wistar yang berumur 2-3 bulan dengan berat badan 180-220 gram.

3.2.2 Besar Sampel Penelitian


Kelompok perlakuan terdiri dari 10 kelompok. Jumlah sampel penetilian yang
digunakan dihitung dengan menggunakan rumus Federer, yaitu 67

(n-1) (t-1) ≥ 15
Keterangan :
t = Jumlah kelompok perlakuan
n = Jumlah ulangan pada masing-masing kelompok
Berdasaekan rumus diatas, dengan t = 10, didapatkan sampel pada
percobaan ini :

(n-1)(t-1) ≥ 15
(n-1)(10-1) ≥ 15
(n-1)9 ≥ 15
n-1 ≥ 1,67
n ≥ 2,67
n ≥3

Jadi, jumlah subjek yang digunakan dalam penelitian ini adalah 3 tikus (ditambah
1 tikus sebagai cadangan) pada tiap – tiap kelompok.
3.2.3 Cara Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan dengan cara simple randam sampling
dengan kriteria :
a. Kriteria Inklusi
Bahan Biologis Tersimpan jaringan duodenum penelitian sebelumnya
yang seluruh bagiannya terendam formalin

b. Kriteria Ekslusi
1. Jaringan duodenum mengalami kerusakan
2. Pewarnaan hematoxylin-eosin tidak merata

3.3 Variabel Penelitian


3.3.1 Variabel Bebas
Variabel bebas penelitian ini adalah dosis minyak jintan hitam dan madu
dalam bentuk kombinasi dan tunggal.
3.3.2 Variabel Terikat
Variabel terikat penelitian ini adalah gambaran histopatologi duodenum
tikus jantan galur Wistar

3.4 Pengamatan Histopatologi pada Duodenum


Pengamatan Histopatologi Duodenum terhadap perubahan struktur epitel
diamati secara mikroskopik dengan perbesaran 40x dan menggunakan skors
integritas mukosa Barthel Manja.68 ; (1: normal, 2: deskuamasi, 3: erosi 4:
ulserasi)

Tabel 3.2 Skor Intregritas Epitel Mukosa Barthel Manja

Tingkat Perubahan Skor


Tidak ada perubahan patologis 1
Deskuamasi epitel 2
Erosi permukaan epitel 3
Ulserasi epitel 4
3.5 Defini Operasional
Tabel 3.3 Definisi operasional

NO Variabel Definisi Operasioanl Cara Pengukuran Skala


Penelitian
1 Pengamatan terhadap Dilakukan Numerik
Perubahan perubahan struktur epitel perhitungan skor
Histopatologi mukosa doudenum tikus kumulatif terhadap
Duodenum Tikus wistar yang diamati secara perkelompok
Wistar mikroskopik dengan HE perlakuan setiap
mikroskop cahaya dengan lima lapang
perbesaran 40x diamati pandang
dengan membandingkan
antara kelompok
perlakuan dengan
kelompok kontrol
menggunakan skor
integritas mukosa Barthel
Manja 68 ;
(1: normal, 2: deskuamasi,
3: erosi, 4: ulserasi )
2 Dosis Dosis kombinasi diberikan Nominal
Kombinasi terpisah yang terdiri dari
Jintan Hitam empat kelompok yaitu
dan Madu MJH1MI1, MJH2M1,
MJH1M2, dan MJH2M2.
Dosis MJH1 1 mL/KgBB,
MJH2 2 mL/KgBB, M1 3,7
mL/KgBB, dan M2 7,4
mL/KgBB.
3.6 Instrumen Penelitian
3.6.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas kimia, kaca objek,
kaca penutup, rak tabung reaksi, tabung reaksi, pipet tetes, pipet ukur, sonde oral,
spuit 3 ml, jarum suntik ukuran 22 G, timbangan analitik, timbangan hewan,
Handscoon, mikroskop, mikrotom, bak bedah, alat bedah minor, staining jar,
piranti komputer ImageJ dan Axioca,. kandang hewan uji

3.6.2 Bahan
Alkohol 70%, 80%, 95%, 96%, larutan xylol, parafin cair (histoplast),
hematoxylin-eosin, larutan asam periodat, larutan schiff dan eter, NaCl 0,9%,
NaOH 1 N, FeCl3, HCl pekat, logam Mg, madu, cisplatin, minyak jintan
hitam,organ hepar tikus percobaan, serbuk kayu, makanan dan minuman standar.
Madu yang berasal dari lebah Trigona incisa dibeli dari peternak madu di
Kecamatan Paloh, Kabupaten Sambas. Sedangkan minyak jintan hitam dibeli dari
PT. Habbatussauda International dengan merek dagang “Habbat’s Blackseed Oil”
dan nomor BPOM TR083697951.

3.7 Perhitungan Dosis


3.7.1 Cisplatin
Pengobatan rekomendasi Cisplatin untuk kanker serviks stadium IB dan
IIA adalah sebesar 50-75 mg/m2. 69
Dengan konversi dosis skala alometri, dosis
tersebut dapat dikonversi menjadi dosis ekuivalen tikus sebesar8 mg/kgBB.
Pertama, dilakukan konversi unit dari dosis berdasarkan luas permukaan
menjadi dosis berdasarkan berat badan menggunakan persamaan 3, yakni sebagai
berikut:
mg mg
⁄m2 = K m × ⁄kg

mg
50 mg⁄m2 = 37 × ⁄kg

2
mg 50 mg/m
⁄kg =
37

mg
⁄kg = 1.3514 mg⁄kg
Kemudian, dosis tersebut diubah menjadi dosis ekuivalen tikus
menggunakan persamaan 4, yakni sebagai berikut:

mg mg
AED ( ) = Dosis Manusia ( ) × Rasio K m
kg kg

mg
AED ( ) = 1.3514 mg⁄kg × 6,2
kg

mg
AED ( ) = 8.378 ≈ 𝟖𝐦𝐠⁄𝐤𝐠𝐁𝐁
kg

3.7.2 Minyak Jintan Hitam ( Nigella sativa )


Dosis Nigella sativa yang digunakan adalah 2 mL/kg. Dosis tersebut
didapat dari penelitian sebelumnya mengenai efek protektif Nigella sativa
terhadap toksisitas yang diinduksi cisplatin pada organ hati dan ginjal tikus.47
Pada manusia, dosis ekuivalennya adalah sebesar 19,44,68 mL yang didapat dari
perhitungan sebagai berikut:

mL mL
HED ( ) = Dosis Hewan ( ) × Rasio K m
kg kg

mL
HED ( ) = 2 mL⁄kg × 0,162
kg

mL
HED ( ) = 0,324 mL/kg
kg

HED
= 0,324 mL⁄kg × 60
70kgBB

HED
= 𝟏𝟗, 𝟒𝟒𝐦𝐋
60kgBB

Dosis 19,44 mL ini sesuai dengan dosis terapi yang dianjurkan oleh
produk komersil Nigella sativa secara umum.

3.7.3 Madu
Dosis madu yang digunakan adalah 3,7 dan 7,4 mL/kg. Dosis tersebut
didapat dari penelitian sebelumnya mengenai efek protektif madu pada organ hati
tikus terhadap toksisitas yang diinduksi paracetamol.70 Dengan konversi dosis
skala alometri, dosis tersebut dapat dikonversikan menjadi dosis ekuivalen
manusia melalui rumus yang telah dijabarkan pada tinjauan pustaka.
Pada manusia, dosis ekuivalen dari 3,7 mL/kg adalah sebesar 36 mL yang
didapat dari perhitungan sebagai berikut.

mL mL
HED ( ) = Dosis Hewan ( ) × Rasio K m
kg kg

mL
HED ( ) = 3,7 mL⁄kg × 0,162
kg

mL
HED ( ) = 0,6 mL/kg
kg

HED
= 0,6 mL⁄kg × 60
60kgBB

HED
= 𝟑𝟔𝐦𝐋
60kgBB

3.8 Tahap Penelitian


3.8.1 Aklimatisasi Hewan Coba
Tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar yang memenuhi
kriteria inklusi diaklimatisasi dengan lingkungan laboratorium selama 1 minggu
dan diberi diet (makan dan minum) standar ad libitum.66

3.8.2 Perlakuan pada Hewan Coba


Perlakuan diberikan setelah dilakukan aklimatisasi selama 1 minggu.
Pengelompokan subjek perlakuan terdiri dari 10 kelompok yang dipilih secara
acak
yaitu:66
1) Kelompok Kontrol (K)
Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang bebas terhadap
pemberian minyak jintan hitam, madu dan cisplatin.
2) Kelompok Perlakuan 1 (MJH1)
Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi minyak jintan
hitam secara oral dengan dosis 1 ml/kgBB 1 kali sehari pada hari ke-1
sampai 21 dan cisplatin secara intraperitoneal dengan dosis8 mg/kgBB 1
kali pada hari ke-18

3) Kelompok Perlakuan 2 (MJH2)


Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi minyak jintan
hitam secara oral dengan dosis 2 ml/kgBB 1 kali sehari pada hari ke-1
sampai 21 dan cisplatin secara intraperitoneal dengan dosis8 mg/kgBB 1
kali pada hari ke-18.
4) Kelompok Perlakuan 3 (M1)
Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi madu secara oral
dengan dosis 3,7 ml/kgBB 1 kali sehari pada hari ke-1 sampai 21 dan
cisplatin secara intraperitoneal dengan dosis 8 mg/kgBB 1 kali pada hari
ke-18.
5) Kelompok Perlakuan 4 (M2)
Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi dosis madu
secara oral dengan dosis 7,4 ml/kgBB 1 kali sehari pada hari ke-1 sampai
21 dan cisplatin secara intraperitoneal dengan dosis 8 mg/kgBB 1 kali pada
hari ke-18.
6) Kelompok Perlakuan 5 (MJH1-M1)
Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi dosis kombinasi
minyak jintan hitam dan madu masing-masing 1 ml/kgBB dan 3,7
ml/kgBB 1 kali sehari pada hari ke-1 sampai 21 dan cisplatin secara
intraperitoneal dengan dosis 8 mg/kgBB 1 kali pada hari ke-18.
7) Kelompok Perlakuan 6 (MJH1-M2)
Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi dosis kombinasi
minyak jintan hitam dan madu masing-masing 1 ml/kgBB dan 7,4
ml/kgBB 1 kali sehari pada hari ke-1 sampai 21 dan cisplatin secara
intraperitoneal dengan dosis 8 mg/kgBB 1 kali pada hari ke-18.
8) Kelompok Perlakuan 7 (MJH2-MI)
Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi dosis kombinasi
minyak jintan hitam dan madu masing-masing 2 ml/kgBB dan 3,7
ml/kgBB 1 kali sehari pada hari ke-1 sampai 21 dan cisplatin secara
intraperitoneal dengan dosis 8 mg/kgBB 1 kali pada hari ke-18.

9) Kelompok Perlakuan 8 (MJH2-M2)


Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi dosis kombinasi
minyak jintan hitam dan madu masing-masing 2 ml/kgBB dan 7,4
ml/kgBB 1 kali sehari pada hari ke-1 sampai 21 dan cisplatin secara
intraperitoneal dengan dosis 8 mg/kgBB 1 kali pada hari ke-18.
10) Kelompok Cisplatin (CP)
Terdiri dari 3 tikus jantan galur Wistar yang diberi dosis cisplatin 8
mg/kgBB pada hari ke- 18.

Minyak jintan hitam dan madu diberikan secara terpisah. Cisplatin dalam
sediaan vial (1mg/ml) diberikan 1 jam setelah pemberian minyak jintan hitam dan
madu. Pada hari ke-22 tikus dieuthanasia dan sebelumnya dianestesi dengan
tabung berisi eter. Selanjutnya organ hepar diambil dari tikus untuk pembuatan
preparat histopatologi.47,71

3.8.3 Pengambilan Organ Duodenum


Organ duodenum yang diambil segera dicelupkan ke dalam larutan NaCl
0,9% 100 mL. Tujuannya adalah untuk menghilangkan darah yang menempel.
Selanjutnya digunakan kertas saring untuk mengeringkan duodenum. Duodenum
ditimbang dengan timbangan analitik. Bentuk organ diamati, kemudian dipotong
organ yang diperkirakan dapat menghasilkan sediaan secukupnya.

3.8.4Pembuatan Preparat Histopatologi


Preparat histopatologi dibuat dengan pewarnaan hematoxylin-eosin. Proses
Pewarnaan dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu:
1) Fiksasi
Organ yang diangkat diletakkan pada cawan petri kecil dan dicuci
dengan NaCl 0,9% dan dimasukkan dalam larutan formalin buffer (larutan
formalin 10% dalam buffer natrium asetat mencapai pH 7,0). Waktu fiksasi
jaringan 18-24 jam. Setelah fiksasi selesai, jaringan dimasukkan dalam
larutan akuades selama 1 jam untuk proses penghilangan larutan fiksasi.
2) Dehidrasi
Potongan organ dimasukkan ke dalam larutan formalin selama 2
jam. Setelah itu secara bertahap dimasukkan ke dalam larutan alkohol 70%
selama 1 jam, alkohol80% selama 2 jam, alkohol95% selama 2 jam,
alkohol96% I selama 2 jam, alkohol96% II selama 1 jam dan alkohol96%
III selama 2 jam.Jaringan menjadi lebih jernih dan transparan.

3) Penjernihan
Organ dimasukkan ke dalam larutan xylol I, xylol II, xylol III.
Xylol Iselama 1 jam, xylol II selama 2 jam, dan xylol III selama 2 jam.
4) Impregnasi
Organ dimasukkan ke dalam parafin cair (58-60oC) selama 2jam
dan dimasukkan lagi ke dalam parafin cair (58-60oC)yang baru selama 2
jam.

5) Embedding
Alat cetak disusun di alas yang permukaannya halus dan rata.
Siapkan dua tempat parafin cair dengan suhu optimum (cukup air) tetapi
tidak mengembangkan alat cetak blok (logam) yang berakibat
merembesnya parafin cair pada alat tersebut. Tempat I, parafin sebagai
bahan embedding, tempat II, parafin sebagai media penyesuaian suhu
jaringan yang akan ditanam. Tuangkan parafin (tempat I) ke dalam alat
cetak hingga penuh pada permukaannya. Letakkan posisi jaringan yang
sesuai. Bila parafin pada alat pencetak sudah cukup keras, alat cetak
dilepas dan lakukan pemotongan blok dengan silet pada ukuran tertentu.
Organ dalam parafin dipotong setebal 3-5 mikron dengan
mikrotom. Jaringan pada kaca obyek dipanaskan dalam Airplate sampai
parafin mencair.
6) Pewarnaan dengan HE
Pada pewarnaan HE, ada beberapa tahapan yaitu:

a. Deparafinisasi
Preparat dimasukan ke dalam xylol I, xylol II, dan xylol
IIImasing-masing selama 5 menit.

b. Hidrasi
Preparat dimasukkan ke dalam alkohol96% I selama 2
menit, alkohol96% II selama 2 menit dan alkohol80% selama 2
menit. Kemudian dilakukan pengecatan dengan Mayer’s
hematoksilin selama 15 menit atau dengan Harris’s Hematoksilin
selama 10 menit. Setelah itu dicuci dengan air mengalir selama 20
menit dan dicat dengan Eosin 1 % selama 0,5-1 menit.
c. Dehidrasi
Preparat dimasukkan ke dalam alkohol 80% selama 2 menit,
alkohol96% I selama 2 menit dan alkohol96% II selama 2 menit.
d. Penjernihan
Preparat dimasukan ke dalam xylol I, xylol II, dan xylol III
masing masing selama 5 menit.
3.9 Alur Penelitian

Tikus (Rattus novergicus) jantan galur Wistar

Minyak jintan hitam dan madu


Adaptasi selama 7 hari

Skrining fitokimia
Randomisasi

K MJH1 MJH2 M1 M2 MJH1 MJH1 MJH2 MJH2 CP

- 21 Hari -
+M1 +M2 + M1 +M2
Cisplatin 8 mg/kgBB pada hari ke-18

Euthanasia pada hari ke-22

Pengambilan jaringan duodenum

Bahan Biologi Tersimpan

Pengamatan Histopatologi

Analisis data

Uji Beda Uji CI

Gambar 3.1.Alur penelitian

Keterangan: Penelitian yang dilakukan


3.10 Analisis Data
3.10.1 Uji Beda
Data yang diperoleh akan dianalisa menggunakan uji statistik. Analisis
data dilakukan dengan menggunakan Statistical Product and Service Solution
(SPSS) 23 for windows.Uji statistik yang akan digunakan yaitu:

1. Uji statistik One-way Anova, untuk menguji rata-rata perbandingan data


tiap kelompok (jika tidak memenuhi syarat uji maka dilakukan uji
alternatif yaitu uji statistikKruskal Wallis dan dilanjutkan dengan uji
statistik Mann Whiteney).
2. Uji statistik Post Hoc LSD, untuk menguji signifikansi dari perbedaan
rata-rata data antar kelompok perlakuan.

3.10.2 Uji Indeks Kombinasi Obat


Perhitungan indeks kombinasi obat dilakukan dengan menggunakan
Compusyn 2005 for windows. Interpretasi hasil perhitungan yaitu: 65

1. Indeks kombinasi kurang dari satu adalah sinergis.


2. Indeks kombinasi sama dengan satu adalah adiktif.
3. Indeks kombinasi lebih dari satu adalah antagonis.

3.11 Etika Penelitian.


Penelitian ini dilakukan setelah lolos kaji etik oleh Komisi Etik Penelitian
Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Tanjungpura.
DAFTAR PUSTAKA

1. Depkes RI. Penderita Kanker Diperkirakan Menjadi Penyebab Utama


Beban Ekonomi Terus Meningkat. Available from:
http://www.depkes.go.id/index. php?vw=2&id=1937
2. Stewart BW, Wild C. , International Agency for Research on Cancer, Worl
Health Organization. Lyon, France: World Cancer Report; 2014. 630 p.
3. Muthalib A. Prinsip Dasar Sistemik Pada Kanker Buku Ajar Ilmu Penyakit
Dalam Jilid III. Jakarta: Interna Publishing; 2014. 2884 p.
4. Abdel Moneim AE, Othman MS AA. Azadiractha indica Attenuates
Cisplatin-Induced Nephorotoxixity and Oxidative Stress. 2014;1–11.
5. Brockstein BE VE. Principles of chemotherapy in the management of head
and neck cancer. 4th ed. Head and Neck Surgery-Otolaryngology, editor.
Philadelphia: Lippincot- William&Wilkins; 2006. 1428–41 p.
6. Al-Kharusi N, Babiker HA, Al-Salam S, Et al. Ellagic acid protects against
cisplatin-induced nephrotoxicity in rats: A dose-dependent study. Eur Rev
Med Pharmacol Sci. 2013;17:299–310.
7. Lee KJ. Chemotherapy of head and neck cancer. In: Lee KJ.Essential
Otolaryngology Head & Neck surgery, editor. North America: McGraw-
Hill; 2003. 371–80 p.
8. Terada Y, Inoue K MT, Ishihara M, Hamada K, Shimamura Y, et al.
Aminolevulinic acid protects against cisplatin-induced nephoroxicity
without compromisingthe anticancer efficiency of cisplatin in rats in vitro
and in vivo. In: Sands JM, editor. PloS ONE; p. 80850.
9. Katzung BG TA, editor. Basic& clinical pharmacology. 13th ed. New
York: McGraw-Hill Education; 2015. 1203 p.
10. Naqshbandi A, Khan W, Rizwan S, Khan F. Studies on the protective effect
of flaxseed oil on cisplatin-induced hepatotoxicity. Hum Exp Toxicol.
2012;31(4):364–75.
11. Johnson S, O’Dwyer P. Cisplatin and its analogues. 7th ed. In : DeVita V,
Hellman S RS, editor. Philadelphia: Lippincott; 2005. 344–54 p.
12. Ahmad A. Husain A. Mujeeb M. Khan SA. Najmi AK. Siddique et al. A
review on therapeutic potential of Nigella sativa. A miracle herb Asian Pac
J Trop Biomed. 2013;3(5):337–352.
13. Carnwath R, Graham EM, Reynolds K. Pollock PJ. The antimicrobial
activity of honey against common equine wound bacterial isolates. Vet J.
2014;199(1):110–4.
14. Noor N, Sarfraz RA, Ali S, Shahid M. Antitumour and antioxidant
potential of some selected Pakistani honeys. Food Chem. 2014;143:362–
366.
15. Anthony LM. Histologi Dasar JUNQUEIRA: Teks & Atlas. 12th ed.
Jakarta: Penerbit buku Kedokteran EGC; 2009. 245-71 p.
16. Qian W, Nishikawa M, Haque AM, Hirose M, Mashimo M, Sato E, et al.
Mitochondrial density determines the cellular sensitivity to cisplatin-
induced cell death. Am J Physiol Cell Physiol [Internet].
2005;289(6):C1466-75. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16107504
17. Drake RL, Wayne V, Adam WMM. Gray Dasar-Dasar Anatomi. 1st ed.
Kalanjati VP, editor. Singapore: Elsevier; 2014. 155 p.
18. Tate, Philip. Seeley’s principles of anatomy & physiology. 2nd ed.
McGraw-Hill, editor. New York; 2012. 661 p.
19. Price, S & Wilson L. Patofisiologi: Konsep Klinis Proses-Proses Penyakit.
6th ed. Jakarta: EGC; 437-443 p.
20. Guyton A, John E Hall. Textbook of medical physiology ed 11 terjemahan.
Setiawan. 1st ed. jakarta: EGC; 2007. 814-859 p.
21. Eroschenko v. diFiore’s Atlas of Histology with Functional Correlations.
12th ed. Tambayong J, editor. Jakarta: EGC; 2015. 196-197 p.
22. Wonodirekso S, Martoprawiro M, Siswojo SK, Guritnoko I, Al E.
Penuntun Praktikum Histologi. 2nd ed. Jakarta: Dian Rakyat; 2013. 118 p.
23. Ross MH & Pawlina W. A Text and Atlas. 6th ed. Lippincott Williams &
Wilkins; 2011.
24. Fawcett D. textbook of hystologi. 12th ed. Tambayong J ed., editor.
Jakarta: EGC; 2008. 552-569 p.
25. Tortora GJ, Derrickson B. The principles of anatomy and physiology. 12th
ed. New Jersey: John Wiley and Sons; 2014. 949-953 p.
26. Wahab Abdi Ridha. PENGARUH FORMALIN PERORAL DOSIS
BERTINGKAT SELAMA 12 MINGGU TERHADAP GAMBARAN
HISTOPATOLOGIS DUODENUM TIKUS WISTAR. Diponegoro Univ
[Internet] [Internet]. Available from:
about:reader?url=http%3A%2F%2Feprints.undip.ac.id%2F37755%2F
27. Underwood. J.C.E. General and Systematic Pathology. 6th ed. Churchill
Livingstone: Elsevier; 2013.
28. Amptoulach S, Tsavaris N. Neurotoxicity caused by the treatment with
platinum analogues. Chemother Res Pr. 2011;1–5.
29. Chabner BA, Bertino J, Cleary J, Ortiz T, Lane A, Supko JG, and Ryan D.
Cytotoxic agents. In: Goodman & Gilman’s the pharmacological basis of
therapeutics,. 12th ed. New York: McGraw-Hill; 2011. 1677–1730 p.
30. Whalen K, Finkel R, Panavelil TA. Pharmacology. 2014.
31. Siddik. Z. H. S. E. Dible. F. E. Boxall & K. R. Harrap. Renal
pharmacokinetics and toxicity of cisplatin and carboplatin in animals.
Biochemical mechanisms of platinum antitumor drugs. IRL press, Oxford;
1986. 171-198 p.
32. Rang HP, Dale MM. Additional online content: [student consult, activate at
studentconsult.com, searchable full text online. In: Rang and Dale’s
pharmacology, editor. 7th ed. Edinburgh: Elsevier, Churchill Livingstone;
2012. p. 777.
33. Malik S, Suchal, Gamad N, Dinda AK, Arya DS, Bhatia J. Telmisartan
ameliorates cisplatin-induced nephrotoxicity by inhibiting MAPK mediated
inflammation and apoptosis. Eur J Pharmacol. 2015;54–60.
34. Bearcroft CP, Domizio P, Mourad FH, EA A, Farthing A. Cisplatin impairs
fluid and electrolyte absorption in rat small intestine: a role for 5-
hydroxytryptamine. 1999;Gut 44:174–179.
35. Grad JM, Cepero E, and Boise LH. Mitochondria as targets for established
and novel anti-cancer agents. Drug Resist Updat. 2001;4:85–91.
36. Kartalou M and Essigmann JM. Mechanisms of resistance to cisplatin.
Mutat Res. 2001;478:23–43.
37. Meijera C, van Luyn MJ, Nienhuis EF, Blom N, Mulder NH, De A, et al.
Ultrastructural morphology and localisation of cisplatin-induced platinum-
DNA adducts in a cisplatin-sensitive and -resistant human small cell lung
cancer cell line using electron microscopy. 2001;Biochem Ph:573–578.
38. Green DR and Reed JC. Mitochondria and apoptosis. 1998;281:1309–1312.
39. Kroemer G and Reed JC. Mitochondrial control of cell death. 2000;6:513–
519.
40. Waseem M, Pandey P, Tomar B, Raisuddin S, Parvez S. Ameliorative
action of curcumin in cisplatin-mediated hepatotoxicity: an in vivo study in
Wistar rats. Arch Med Res. 2014;45.
41. Abdelaziz I, Kandeel M. The protective effects of nigella sativa oil and
allium sativum extract on amikacin-induced nephrotoxicity. Int J
Pharmacol. 2011;7 (6):697–703.
42. Delphine M, Mary TK, Sylvie M, Doris A. Morphological, microscopic
and chemical comparison between Nigella sativa L. cv (black cumin) and
Nigella damascena L. cv. WFL. 2013;11 (1):165–171.
43. Eid AM, Elmarzugi NA, Abu Ayyash LM, Sawafta MN, Daana HI. A
Review on the Cosmeceutical and External Applications of Nigella sativa. J
Trop Med. 2017;2017:7092514.
44. Karna SKL. Phytochemical screening and gas chromatography-mass
spectrometry and analysis of seed extract of Nigella sativa, Linn. Int J
Chem Stud. 2013;1(4):183–7.
45. Ashok Kumar, Bashir Ahemad, Sanum Ali, Mumtaz Ali. Effect Of Nigella
Sativa On Histomorphometric Changes Treated With Doxorubicin In Testis
Of Albino Rats. Med Channel. 2016;22(1):59–65.
46. Ahmad A, Husain A, Mujeeb M, Khan SA, Najmi AK, Siddique NA, et al.
A review on therapeutic potential of Nigella sativa: A miracle herb. Asian
Pac J Trop Biomed. 2013 May;3(5):337–52.
47. Farooqui Z, Ahmed F, Rizwan S SF, Khan AA KF. Oral administration of
Nigella sativa oil ameliorates the effect of cisplatin on membrane enzymes,
carbohydrate metabolism and oxidative damage in rat liver. Toxicol Rep.
2016;3:328–35.
48. Ismail MYM. Therapeutic role of prophetic medicine habbat el baraka
(Nigella sativa L.)-A review. World Appl Sci J. 2009;7:1203–8.
49. Gilani A, Jabeen Q, Khan M. A review of medicinal uses and
pharmacological activities of Nigella sativa. Pak J Biol Sci. 2004;7:441–51.
50. Al-Bukhari MI. The collection of authentic sayings of Prophet Mohammad
(Peace be Upon Him), Division 71 on Medicine. 2nd ed. Al-Bukhari S,
editor. Turkey: Ankara; 1976.
51. Leong X-F, Rais Mustafa M, Jaarin K. Nigella sativa and Its Protective
Role in Oxidative Stress and Hypertension. Evid Based Complement
Alternat Med. 2013;
52. Ezz El-Arab AM, Girgis SM, Hegazy ME, Abd El-Khalek AB. Effect of
dietary honey on intestinal microflora and toxicity of mycotoxins in mice.
BMC Complement Altern Med. 2006;6:1–13.
53. Rahmi Mustaba, Idabagus Oka Winaya, I Ketutberata. Studi Histopatologi
Lambung pada Tikus Putih yang Diberi Madu sebagai Pencegah Ulkus
Lambung yang Diinduksi Aspirin. Indones Med Veterinus. 2012;1(4):471–
82.
54. Moundoi MA, Padila-Zakour OI, Worobo RW. Antimicrobial activity of
honey against food pathogens and food spoilage microorganisms.
NYSAES. 2001;1:61–71.
55. Blasa M, Candiracci M, Accorsi A, Piacentini MP. Raw Millefiori honey is
packed full of antioxidants. Food Chem. 2006;97(2):217–222.
56. Johnston JE, Sepe HA, Miano CL, Brannan RG. Honey inhibits lipid
oxidation in ready-to-eat ground beef patties. Meat Sci. 2005;70(4):627–
631.
57. Silva PM, Gauche C, Gonzaga LV, Costa ACO. Honey: Chemical
composition, stability and authenticity. Food Chem. 2016;196:309–23.
58. Mansouri MT, Farbood Y, Sameri MJ, Sarkaki A. Neuroprotective effects
of oral gallic acid against oxidative stress induced by 6-hydroxydopamine
in rats. Food Chem. 2013;138(2-3):1028–1033.
59. Schmidt CG, Gonçalves LM, Prietto L, Hackbart HS. Antioxidant activity
and enzyme inhibition of phenolic acids from fermented rice bran with
fungus Rizhopus oryzae. Food Chem. 2014;146:371–377.
60. Eteraf-Oskouei T, Najafi M. Traditional and Modern Uses of Natural
Honey in Human Diseases: A Review. Iran J Basic Med Sci. 2013;16:731–
42.
61. Meda A, Lamien EC, Millogo J, Romito M, Nacoulma OG.
Ethnopharmacological communication therapeutic uses of honey and
honeybee larvae in central Burkina Faso. J Ethnopharmacol. 2004;95:103–
7.
62. Shenoy R, Bialasiewicz A, Khandekar R, Al Barwani B, Al Belushi H.
Traditional medicine in Oman: its role in ophthalmology. Middle East Afr J
Ophthalmol. 2009;16:92–96.
63. Bansal V, Medhi B, Pandhi P. Honey -A remedy rediscovered and its
therapeutic utility. Kathmandu Univ Med J. 2005;(3):305–9.
64. Nair A, Jacob S. A simple practice guide for dose conversion between
animals and human. J Basic Clin Pharm. 2017;7(2):27.
65. Chou T-C. Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized
Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies.
Pharmacol Rev. 2006;58(3):621–81.
66. Alkadri SLF. Uji Efek Protektif Kombinasi Minyak Jintan Hitam (Nigella
sativa) Komersil dan Madu Pada Jaringan Hepar Tikus Jantan Galur Wistar
Yang Diberi Pajanan Cisplatin. 2017;
67. Sastroasmoro S. Dasar-dasar metodologi penelitian klinis. Jakarta: Bagian
Ilmu Kesehatan Anak, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia; 1995.
68. Barthel M, Hapfelmeier S, Kremer M, Rohde M, Hogardt M, Pfeffer K, et
al. Pretreatment of Mice with Streptomycin Provides a Salmonella enterica
Serovar Typhimurium Colitis Model That Allows Analysis of Both
Pathogen and Host Pretreatment of Mice with Streptomycin Provides a
Salmonella enterica Serovar Typhimurium Colitis Model .
2003;71(5):2839–58.
69. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. Cerv Cancer. 2015;VI.
70. Galal RM, Zaki HF, Seif EMM, Agha AM. Potential protective effect of
honey against paracetamol-induced hepatotoxicity. Arch Iran Med.
2012;15(11):674–80.
71. Cagin YF, Erdogan MA, Sahin N, Parlakpinar H, Atayan Y, Polat A.
Protective effects of apocynin on cisplatin-induced hepatotoxicity in rats.
Arc Med Res. 2015;46(7):517–26.