Síntesis de organoborano quiral programada genéticamente

SB Jennifer Kan, Xiongyi Huang, Yosephine Gumulya, Kai chen y Frances H. Arnold

Nature volumen 552 , páginas132 - 136 (07 de diciembre de 2017) |

Resumen

Los avances recientes en ingeniería y diseño de enzimas han ampliado el repertorio catalítico de
la naturaleza a funciones que son nuevas para la biología 1 , 2 , 3 . Sin embargo, solo un subconjunto
de estas enzimas diseñadas puede funcionar en los sistemas vivos 4 , 5 , 6 , 7 . Encontrar rutas
enzimáticas que forman enlaces químicos que no se encuentran en la biología es particularmente
difícil en el entorno celular, ya que esto depende del descubrimiento no solo de nuevas
actividades enzimáticas, sino también de reactivos que son suficientemente reactivos para la
transformación deseada y estables en vivo. Aquí presentamos el descubrimiento, la evolución y la
generalización de una plataforma totalmente codificada genéticamente para producir
organoboranos quirales en bacterias. Se encontró que las células de Escherichia coli que albergan
el citocromo c de tipo salvaje de Rhodothermus marinus 8 ( Rma cyt c ) forman enlaces carbono-
boro en presencia de complejos de bases de borano-Lewis, a través de la inserción de carbeno en
los enlaces boro-hidrógeno. La evolución dirigida de Rma cyt c en el catalizador bacteriano
proporcionó acceso a 16 nuevos organoboranos quirales. El catalizador es adecuado para la
biosíntesis a escala de gramo, proporcionando hasta 15,300 pérdidas de balón, una frecuencia de
rotación de 6,100 h –1., una relación enantiomérica 99: 1 y 100% de quimioselectividad. La
enantiopreferencia del biocatalizador también podría ajustarse para proporcionar cualquiera de
los enantiómeros de los productos de organoborano. Evolucionadas en el contexto de los
catalizadores de células completas, las proteínas eran más activas en el sistema de células
completas que en las formas purificadas. Este estudio establece una plataforma bacteriana
codificada por el ADN y fácil de diseñar para la borylación; la ingeniería se puede lograr a un ritmo
que compita con el desarrollo de métodos químicos sintéticos, con la capacidad de lograr pérdidas
de balón de dos órdenes de magnitud (más de 400 veces) mayores que las de catalizadores
quirales conocidos para la misma clase de transformación 9 , 10 , 11. Este método sintonizable para
manipular el boro en las células podría ampliar el alcance de la química del boro en los sistemas
vivos.

Los productos naturales que contienen boro son sintetizados en el suelo por el myxobacterium
Sorangium cellulosum como antibióticos contra las bacterias Gram-positivas12. En el mar, estas
moléculas le dan a la alga roja jurásica Solenopora jurassica su distintiva coloración rosada13; también
son producidos por la bacteria bioluminiscente Vibrio harveyi para la comunicación célula-célula14
(Datos ampliados Fig. 1). Para preparar biomoléculas que contienen boro, los organismos vivos
producen moléculas pequeñas que reaccionan espontáneamente con el ácido bórico disponible en
el medio ambiente15,16. Aunque este método no enzimático para capturar boro es suficiente para la
supervivencia de un organismo, está limitado por la afinidad inherente de un sustrato hacia el ácido
bórico, y carece de capacidad de ajuste y generalidad para aplicaciones de biología sintética. Además,
los organismos que producen organoboranos (compuestos que contienen enlaces carbono-boro) son
desconocidos.
Imaginamos que la borylación catalizada por enzimas podría proporcionar a los organismos vivos la
capacidad de producir productos que contienen boro adaptados a nuestras necesidades. Tal enzima
no se conoce en la naturaleza, pero planteamos la hipótesis de que las proteínas naturales existentes
podrían ser reutilizadas y diseñadas para realizar esta tarea. En el pasado, nosotros y otros hemos
explotado la promiscuidad de las proteínas hemo naturales y diseñadas para diversas reacciones no
naturales 4,6,7,17. Las enzimas resultantes están totalmente codificadas genéticamente y llevan a cabo
sus funciones sintéticas en sus huéspedes de expresión bacteriana. Aquí, nos centramos en la
introducción de motivos de boro en moléculas orgánicas enantioselectivamente, ya que esto
generaría estereocentros de carbono que contienen boro, que son características estructurales
importantes en los organoboranos funcionales como la Administración de Drogas y Fármacos de EE.
UU. (FDA, por sus siglas en inglés). También son precursores versátiles para la derivación química a
través de la conversión de enlaces estereoespecíficos carbono-boro a carbono-carbono o carbono-
heteroátomo19–21.

Aunque los reactivos de boro aplicables a la formación de enlaces carbono-boro en el agua son
conocidos22,23, su biocompatibilidad, permeabilidad celular, estabilidad y reactividad en sistemas
vivos, que contienen una gran cantidad de biomoléculas, ácidos nucleicos e iones metálicos, son
inciertas. Sin embargo, como los reactivos de boro diseñados para aplicaciones de biología química
in vivo están precedidos24–26, razonamos que podrían encontrarse reactivos adecuados para la
borylación biológica. Identificamos los complejos de base de borano-Lewis como posibles candidatos
debido a su estabilidad acuosa y reactividad hacia la inserción del carbenoide B–H 9–11,27 (Datos
extendidos, Fig. 2), una vía mecánica que pensamos que podría adaptarse para su uso en el entorno
biológico debido a su ortogonalidad a la bioquímica existente de los sistemas vivos.

Primero nos propusimos evaluar si la producción biológica de organoborano podría ser factible en
una célula bacteriana. Se incubaron células E. coli BL21 (DE3) que albergan citocromo c de tipo salvaje
de la bacteria Gram-negativa termohalofílica Rhodothermus marinus8 (Rma cyt c) con carbeno
borano N-heterocíclico28,29 (NHC-borano) 1 y 2-diazopropanoato de etilo (Me-EDA) 2 en tampón
neutro (medio mínimo M9-N, pH 7,4). Después de la incubación a temperatura ambiente, se observó
la producción in vivo de organoborano 3, con 120 pérdidas de balón (calculadas con respecto a la
concentración de Rma cyt c expresada en E. coli, Fig. 1a, b) y una relación enantiomérica (er) de 85 :
15 (isómero R / S = 6, Fig. 1c). Debido a que el sistema de expresión pET22b / pEC86 transloca Rma
cyt c al periplasma de E. coli para la maduración postraduccional (durante el cual el cofactor del hemo
se liga covalentemente a la apoproteína cyt c) 30, asumimos que la borylación tiene lugar en el
compartimento periplasmático. En ausencia de Rma cyt c, E. coli produjo solo una cantidad traza de
producto de borylation con muy baja estereoselectividad (Tabla de datos extendida 1). Tanto los
sustratos como el producto de organoborano se mantuvieron estables en estas condiciones. El solo
cofactor del hemo también podría promover la reacción de borilación, aunque sin
estereoselectividad. Otras proteínas del citocromo c, los citocromos P450 y las globinas también
demostraron capacidad de formación de enlaces carbono-boro, pero sus selectividades no fueron
satisfactorias (Tabla de datos ampliados 1).

Para mejorar el rendimiento de este catalizador de células completas, sometimos el Rma cyt c de tipo
salvaje (en lo sucesivo, BORWT) a mutagénesis de saturación de sitio, dirigiéndonos secuencialmente
a los residuos de aminoácidos del sitio activo M100, V75 y M103, que son los más cercanos para el
hierro de haem en BORWT (dentro de 7 Å, Fig. 1d). Cada biblioteca de mutagénesis de saturación de
sitio único se clonó utilizando el método de truco 22c31, se seleccionó como catalizadores de células
enteras en placas de 96 pocillos para mejorar la enantioselectividad de la borilación y se usó la mejor
variante para organizar la siguiente ronda de mutación y selección. Con una única mutación M100D
que reemplaza al ligando axial distal, el biocatalizador de primera generación exhibió una mejora de
16 veces en el volumen de negocios en comparación con el tipo salvaje (número de volumen de
negocios total (TTN) 1,850, Fig. 1b), con 88:12 e.r. (Isómero R / S = 7; Fig. 1c). La mutación M100D
también mejoró sustancialmente la reactividad de transferencia de carbeno para la inserción de SiH
catalizada por Rma cyt c6. Esta mejora en el rendimiento catalítico se debe probablemente a la
eliminación del ligando axial del hierro hemo, que abre un sitio preparado para la formación de
carbenoides de hierro y la posterior formación de productos32. Dos rondas posteriores de
mutagénesis y detección condujeron a la variante BORR1 (V75R M100D M103T), que exhibió un
volumen de negocios de 2,490 y un e.r. de 97.5: 2.5 (isómero R / S = 39). Esta función biológica
genéticamente programada es fácilmente escalable desde una escala analítica a una milimolar, con
sustratos de 0,5 mmol, BORR1 produjo organoborano 3 en 97.5: 2.5 e.r. y 75% de rendimiento
aislado, con un TTN de 3.000. La configuración absoluta del producto 3 se asignó sin ambigüedad
como R por cristalografía de rayos X.

Con una excelente bacteria de borilación en la mano, se evaluaron las propiedades y el potencial del
sistema. Caracterizamos las tasas iniciales de borylation in vivo y encontramos que la detección de la
enantioselectividad mejorada también condujo a una mejora general de la tasa: BORR1 de células
completas es 15 veces más rápido que BORWT, con una frecuencia de rotación de 6,100 h – 1. En
particular, como proteína purificada o en lisado celular, tanto BORR1 como BORWT son órdenes de
magnitud más lentas que in vivo (Fig. 1e). Cuando la proteína BORR1 aislada y BORR1 de células
completas se preincubaron con Me-EDA2 antes de la reacción de borylation, la proteína aislada
retuvo solo alrededor del 50% de su actividad, mientras que BORR1 de células completas retuvo más
del 90% de actividad (Fig. 1f). El NHC-borano 1 y el producto 3 de organoborano no inactivaron la
enzima. La Me-EDA probablemente inactiva BORR1 a través de la transferencia de carbeno al cofactor
del hemo y/o las cadenas laterales nucleófilas de la proteína, un mecanismo que estudiamos
previamente en detalle para una carbeno transferasa basada en el citocromo P45033. El periplasma
intacto aparentemente protege a BORR1 de la inactivación por Me-EDA, y la transferencia de carbeno
para producir el producto de organoborano generalmente es más rápida que las vías de inactivación
de proteínas en esas condiciones. Se han reportado observaciones similares para otros sistemas de
reacción de transferencia de carbeno basados en proteínas7,34. El análisis de las unidades formadoras
de colonias muestra que la producción in vivo de organoborano no reduce notablemente la viabilidad
de la E. coli (Datos extendidos, Fig. 3).

A continuación, exploramos el alcance de los reactivos de boro que podrían funcionar en el entorno
celular. Se probaron diez reactivos de boro en condiciones optimizadas para la rotación: aunque el
tamaño, la solubilidad y la lipofilicidad de estos reactivos variaron, se encontró que todos permearon
la membrana celular y dieron los productos deseados con excelentes selectividades y cambios de
volumen (Fig. 2a). Se toleran varias sustituciones en el nitrógeno del NHC (3-10). La reacción es
quimioselectiva en presencia de olefinas terminales (5), que podrían funcionar como un mango de
reacción adecuado para derivatización biológica o bioortogonal aguas abajo. También se aceptan los
NHC sustituidos con tetra y penta más exigentes (7-10). Además de los reactivos de boro a base de
imidazol, triazolilideno borano y picolina borano también podrían usarse para la borylación in vivo,
produciendo los productos 11 y 12 en 1.070 TTN y 2.440 TTN, respectivamente, con selectividades
uniformemente altas (96: 4 e.r). En la escala de gramos, la borylation in vivo produjo 740 mg de
organoborano de picolina 12 con 2,910 TTN, 96: 4 e.r. y 42% de rendimiento aislado (64% basado en
material de partida recuperado, Fig. 2b). La configuración absoluta de 12 se asignó como R por
cristalografía de rayos X. Cuando los sustratos se agregaron en porciones a intervalos regulares de
tiempo a E. coli que expresaba BORR1 (probamos la adición secuencial de hasta ocho equivalentes
de sustratos durante un período de 12 h, Fig. 2c; Tabla de Datos Extendidos 2), el organoborano 3
fue producido con 10,400 pérdidas de balón (50% de rendimiento, 96: 4 er), mientras que el
organoborano 9 se obtuvo con 15,300 pérdidas de balón (73% de rendimiento, 96: 4 er). No se
observó una pérdida sustancial de actividad o enantioselectividad, lo que demuestra el potencial de
este catalizador bacteriano para la biosíntesis y la incorporación a vías metabólicas naturales o
modificadas por ingeniería genética.

La modificación sistemática de los sustituyentes diazo éster de Et a Me, i-Pr o Bn reveló que la
capacidad de borylation de BORR1 no se limita a Me-EDA (3, 13–15, Fig. 2d). La relativa insensibilidad
de la proteína al volumen estérico del éster podría indicar que, en el supuesto intermediario
carbenoide de hierro, este resto está expuesto a solvente en lugar de incrustado dentro del sitio
activo. Al volver a la aleatorización de la posición 103 en BORR1, un residuo que pensamos podría
modular la dinámica del bucle para mejorar la unión de este sustrato, la rotación de la borilación de
15 mejoró (de 2,560 a 4,200 TTN) usando el mutante triple V75R / M100D / M103D (BORR2 Fig. 3a).
De la misma biblioteca de saturación de sitios, también se descubrió un catalizador de borylacion
para diazo éster sustituido con trifluorometilo (CF3-EDA) (V75R / M100D / M103F, BORR3). Los
reactivos diazo aceptores-aceptadores como CF3-EDA son menos reactivos a la formación de
carbenoides debido a su naturaleza deficiente en electrones y no se han utilizado antes para
reacciones enzimáticas de transferencia de carbeno. El sistema actual tolera esta clase de sustratos
y produjo el producto 16 con 95: 5 e.r. y 1.560 TTN.

Para ampliar aún más la generalidad de esta plataforma de borylation, reexaminamos el panorama
evolutivo de BORWT a BORR1 para buscar mutantes promiscuos que podrían desbloquear nuevas
reactividades. El doble mutante V75P / M100D (BORP *) se destacó como altamente productivo pero
poco selectivo (69:31 e.r.) para la borylación de Me-EDA en la biblioteca de saturación de sitios
M100D / V75X. Como la hélice mediada por la hélice, se sabe que las torceduras inducen cambios
estructurales y dinámicos a las proteínas, al espacio de reacción. El etil 2-diazofenilacetato (Ph-EDA)
es un voluminoso reactivo diazo-donante-aceptor inactivo hacia BORWT, pero cuando se agrega a E.
coli que contiene BORP * con NHC-borano 1, Ph-EDA se transformó en organoborano 17 en 100 TTN
y 75 : 25 er (Fig. 3a). Al acumular tres mutaciones de bucle adicionales a través de la evolución dirigida
(M99Y, T101A y M103F, Tabla de Datos Extendidos 3), BORP * se convirtió en un catalizador
sintéticamente útil (BORP1) para la borylación de Ph-EDA, soportando 340 pérdidas de balón con un
e.r. de 94: 6.

BORP * también nos permite ir más allá de los sustratos basados en diazo éster y aplicar la producción
bacteriana a una clase diferente de organoboranos quirales: aunque inactivo hacia BORWT, CF3-
sustituido (diazometil) benceno (CF3-DMB) reaccionó con NHC-borano 1 en el presencia de BORP *
para producir organoborano (R) -18 in vivo con 74 pérdidas de balón y selectividad modesta (79:21
er). Mejoramos esto a través de tres mutaciones de cisteína en Y71, M89 y M99 (BORP2, Tabla de
datos extendidos 3) para producir organoborano (R) -18 en 96: 4 e.r. y 1.010 TTN. A través de la
cristalografía de rayos X, la configuración absoluta de (R) -18 se asignó de manera inequívoca.

Finalmente, preguntamos si se podía cambiar la preferencia estereoquímica de la borylación

biológica. Con este fin, el examen de la biblioteca de saturación de sitio M100D V75X para determinar
la borylación de CF3-DMB nos llevó a identificar una variante (V75G M100D; BORG *) que tiene una
preferencia estereoquímica invertida a BORP * en la etapa de formación de enlaces carbono-boro
(31 : 69 er para el isómero R / S; 340 TTN). La selectividad de BORG * se ajustó aún más a través de
las mutaciones M89F, T98V, M99L, T101L y M103F (BORG1, Tabla de datos extendidos 3) para
producir organoborano (S) -18 con 90:10 e.r. y 1.120 TTN.

Los organoboranos α-trifluorometilados quirales son bloques sintéticos útiles que combinan las
propiedades únicas de los motivos fluorados con las aplicaciones sintéticas versátiles de los
organoboranos35. Sin embargo, los métodos para su preparación asimétrica son raros11,36. Nuestra
capacidad de biosintetizar ambos enantiómeros de estas moléculas puede tener aplicaciones en la
síntesis farmacéutica y agroquímica. Por ejemplo, el producto (R) -18 se convirtió en borato de
pinacol 19 con retención del centro de carbono estereogénico (Fig. 3b). A través de transformaciones
estereoespecíficas bien establecidas19-21, los boronatos de pinacol se pueden diversificar en una
amplia gama de compuestos quirales. Demostramos la transformación de 19 en alcohol 20, un motivo
encontrado en compuestos útiles para el tratamiento del cáncer37 y enfermedades
neurodegenerativas38, y el producto de homologación-oxidación de Matteson 21, ambos obtenidos
con buen estereocontrol.

En conclusión, presentamos una plataforma para la borylación biológica, que se puede ajustar y
configurar a través de la manipulación del ADN. Los microorganismos son alternativas poderosas a
los métodos químicos para producir productos farmacéuticos, agroquímicos, materiales y
combustibles. Están disponibles por fermentación a gran escala y a bajo costo, y sus capacidades
sintéticas codificadas genéticamente pueden modificarse y optimizarse sistemáticamente. La
química de la borilación ahora se puede agregar al vasto repertorio sintético de la biología.

Descubrimiento, evolución y caracterización de un catalizador bacteriano para la borylación. a, El

esquema de reacción muestra una reacción de borylation in vivo representativa entre NHC-borano 1
y diazo éster 2 para producir organoborano 3. La carga de sustrato estándar es 10 mM tanto para 1
como para 2. La configuración absoluta de biosintetizado 3 se asignó como R por X Cristalografía de
rayos. b, c, mutagénesis secuencial de saturación del sitio de Rma cyt c que se dirige a los residuos
de aminoácidos del sitio activo M100, V75 y M103 mejoraron el recambio (b) y la enantioselectividad
(c) de la producción bacteriana de organoborano 3. Variantes de células completas Rma cyt c se
compararon utilizando células de E. coli con una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 15. Se
calcularon los números de rotación total (TTN) con respecto a la concentración de Rma cyt c
expresada en E. coli y representan el número total de pérdidas de balón obtenidas del catalizador
bajo las condiciones de reacción establecidas. d, estructura cristalina de rayos X de Rma cyt c de tipo
salvaje (PDB: 3CP5). e, Frecuencias de rotación (h − 1, en escala logarítmica) de BORWT y BORR1
como catalizadores de células completas, lisados celulares o proteínas purificadas para la producción
de organoborano 3. f, BORR1 purificado y de células completas se preincubaron con NHC-borano 1,
Me-EDA 2 u organoborano 3 antes de que se usaran como catalizadores de borylación para
determinar los efectos de inactivación de 1-3. Los números mostrados representan el% de TTN
retenido después de la preincubación y son relativos a un control (sin incubación) del mismo tipo de
catalizador (proteína purificada o célula completa). Las barras y los números sobre las barras
representan los valores medios promediados en cuatro réplicas biológicas. Los puntos de datos
individuales se muestran como superposiciones. BSA, albúmina de suero bovino; NHC, carbeno N-
heterocíclico.