ANALISIS BAHAN AKTIF DALAM

SAMPEL BIOLOGIS

Gretta Niken Purbosari

1
 SAMPEL BIOLOGIS
• Sampel biologis adalah sampel dari makhluk hidup (manusia,
hewan, tanaman, mikroorganisme, dll)
• Bentuk sampel biologis, terdiri dari:
– Cairan
– Padatan
• Sampel biologis manusia, terdiri dari:
– Darah
– Urine
– Feses
– Saliva, dll
• Sebagian besar sampel biologis mengandung banyak komponen
(kompleks)  diperlukan penanganan khusus  preparasi sesuai
karakteristik sampel biologis yang hendak dianalisis
2
 PREPARASI SAMPEL

Koleksi Pengambilan sampel Preparasi

(Collection) (Harvesting) (Preparation)

Perhatian:

Prosedur koleksi spesimen penting untuk analisis

kuantitatif dan harus reprodusibel

Sampel darah diusahakan tidak mengalami hemolisis,

karena akan berpengaruh pada senyawa aktif yang
terkandung di dalamnya (serum/plasma)

Sel yang lisis akan memberikan hasil positif palsu

3
WADAH SPESIMEN

4
PELABELAN SPESIMEN

5
 CAIRAN BIOLOGIS

Darah Urine Keringat Saliva

Cairan
ASI Sperma Cairan Folikel
Cerebrospinal

Cairan Biologis merupakan cairan sederhana yang kompleks

6
 SAMPEL DARAH
• Darah merupakan cairan biologis yang kompleks  mengandung banyak
komponen, meliputi:
– Protein (sebagian besar)  sering kali mengganggu proses analisis
– Lemak
– Hormon, senyawa endogen, senyawa metabolit
– Garam dan elektrolit

• Darah terdiri dari:

– Sel darah merah
– Plasma / serum

• Plasma : Darah ditampung dalam wadah yang mengandung antikoagulan,

cairan supernatan kuning jernih adalah plasma

• Serum : Darah ditampung dalam wadah yang tidak mengandung

antikoagulan, cairan supernatan kuning jernih adalah serum

7
 SERUM VS PLASMA

Antikoagulan:
Heparin Na; EDTA (Garam disodium); Oksalat (Garam kalium)
8
 PREPARASI SAMPEL DARAH
• Konsentrasi senyawa aktif dalam plasma / serum menurun karena
lamanya plasma / serum kontak dengan sel darah merah  sangat
berpotensi menurunkan konsentrasi senyawa aktif  penting untuk
segera memisahkan sampel darah untuk mendapatkan plasma / serum

• Untuk menghindari hemolisis pada sampel darah:

– Pengambilan darah menggunakan jarum atau kateter
– Transfer sampel ke dalam wadah koleksi (harus inert)
– Penambahan anti-koagulan (bila diperlukan)
– Tidak boleh dikocok

• Penyimpanan plasma / serum:

o (- 80oC)
o 4 – 6oC (senyawa obat yang akan dievaluasi)

9
 PROTEIN PADA SAMPEL DARAH
• Terdapat dua alternatif dalam analisis kuantitatif sampel darah, yaitu:
– Protein dipisahkan
• Dilakukan dengan pengendapan protein menggunakan:
– Gol. Asam (20 – 40%): TCA, Asam tungstat, Asam perklorat
– Gol. Garam (2g/5ml): Ammonium sulfat, Aluminium klorida, Natrium
sulfat
– Gol. Pelarut Organik (2 kali vol. sampel): Metanol, Alkohol, Asetonitril,
dll
– Gol. Enzim: Enzim proteolitik
• Kerugian pengendapan protein: Bahan aktif terkopresipitasi (sebagian
 % recovery rendah
– Protein tidak dipisahkan
• Syarat: Pelarut organik pengekstraksi yang digunakan harus sangat
melarutkan senyawa atau bahan aktif yang akan diekstraksi

10
 SAMPEL URINE

• Urine merupakan cairan biologis yang kompleks dengan sifat:

– Mengandung bahan yang larut air
– Tidak mengandung protein atau lipid (pada faal ginjal normal)
– Komposisi dan pH urin tergantung diit makanan
– Bahan aktif yang diekskresi melalui urin dalam bentuk terkonjugasi,
antara lain:
• Glukoronat (sebagian besar)
• Asetat
• Sulfat
• Merkapturat (detoksifikasi)

• Hidrolisis merupakan tahap pertama yang harus dilakukan pada analisis

kuantitatif dengan sampel urine

11
 SAMPEL URINE

• Wadah sampel urine

– Inert
– Mengandung pengawet  untuk menghambat pertumbuhan bakteri
yang mempunyai potensi merusak/mendegradasi senyawa yang
terkandung dalam urine. Pengawet yang biasa digunakan adalah:
Timol, Toluen, Formaldehid, Asam Borat, Kloroform, dll

• Volume sampel urine untuk analisis:

– Untuk analisis bahan aktif: 10 – 15 ml
– Untuk penelitian metabolisme: diperlukan total volume

• Penyimpanan sampel urine

– (-20) – (-70)oC
– Senyawa aktif terdegradasi pada suhu kamar  disimpan pada suhu
4 – 6oC

12
 SAMPEL ASI

• ASI banyak mengandung protein

• Terjadi ekskresi obat dari plasma ke ASI, dengan kondisi:
– Tidak tergantung volume ASI
– Tergantung pada:
• partisi obat terkait dengan derajat ionisasi (pH)  pH ASI: 6,8 – 7,3
• Berat molekul obat
• Kelarutan obat dalam lemak
– Konsentrasi obat asam lemah dalam ASI rendah bila dibandingkan di
dalam plasma
– Konsentrasi obat basa lemah dalam ASI lebih besar dibandingkan di
dalam plasma
– Obat yang diekskresi melalui ASI kurang dari 1%

13
 SAMPEL SALIVA
• Saliva merupakan cairan biologis yang sederhana dan komplek
• Saliva banyak mengandung: elektrolit, karbohidrat, ptialin, lipid
• pH Saliva: 5,5 – 8,4

SAMPEL KERINGAT
• Keringat merupakan cairan biologis yang mengandung: elektrolit, garam
terlarut, dan bahan aktif / senyawa yang terlarut

SAMPEL SPERMA
• Sperma terdiri dari sel sperma (spermatozoa) dan cairan sperma (plasma
sperma)
• Spermatozoa: 20jt/ml atau 40jt/ejakulat (WHO)
• Plasma sperma: mengandung nutrisi yang diperlukan spermatozoa untuk
mempertahankan hidup

14
 PADATAN BIOLOGIS
SAMPEL JARINGAN
• Jaringan mengandung: protein, lipid, elektrolit, senyawa
endogen, dll

SAMPEL ORGAN FUNGSIONAL TUBUH

• Organ mengandung: protein, lipid, elektrolit, senyawa
endogen, dan diit makanan

SAMPEL FESES
• Wadah: Metal pail, plastic tube

15
 PREPARASI SAMPEL PADATAN
• Homogenizer
• Lysis (SDS 10%)
• Ekstraksi  analisis kuantitatif

ANALISIS KUANTITATIF
• Validasi metode penting untuk dilakukan, guna mengantisipasi
pengaruh senyawa endogen
• Konsentrasi senyawa dalam sampel biologis kecil, sehingga
diperlukan pertimbangan:
– LOD/LOQ
– Akurasi
– Terkadang diperlukan teknik adisi untuk meningkatkan
kepekaan  perlu divalidasi

16
17