UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

ISABELE PANDOLFO BECKER

MELHORAMENTO DE MICRORGANISMOS DE INTERESSE INDUSTRIAL

CURITIBA
2019

ISABELE PANDOLFO BECKER

MELHORAMENTO DE MICRORGANISMOS DE INTERESSE INDUSTRIAL

Revisão bibliográfica apresentada

na disciplina TEB054 – Processos
Fermentativos Industriais:
Fundamentos e Aplicações do
departamento de Engenharia de
Bioprocessos e Biotecnologia da
Universidade Federal do Paraná.
Professor: Dr. Carlos Ricardo
Soccol.

CURITIBA

2019
1 INTRODUÇÃO

Microrganismos de interesse podem ser obtidos das seguintes maneiras:

isolamento a partir de recursos naturais, compra em coleções de culturas, obtenção de
mutantes naturais, obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais,
obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética
(BORZANI et. Al, 2008; Stanburry et. al., 1995)

Quando uma célula prolifera ocorre, há sempre uma possibilidade remota de

que ocorra o surgimento de mutantes naturais, esses que podem ser isolados e
ensaiados buscando verificar qual seu potencial máximo para produção. Mas esperar
o surgimento de mutante naturais que tenham interesse prático não é viável, por isso a
alternativa é a utilização de métodos que forcem o aparecimento de células mutadas
através de agentes mutagênicos. Entretanto, essa técnica é aleatória, mas podemos
induzir o isolamento desses microrganismos levando em conta o que se deseja
(BORZANI et. Al, 2008; Stanburry et. al., 1995, TORTORA et al, 2012).

Pode-se também usar algumas técnicas de engenharia genética para obter

células que tenham sua produtividade aumentada. ou ainda, células que produzem
substancias que normalmente não produzem. Para que isso ocorra pode-se utilizar
técnicas de melhoramento para atingir essas características desejadas. O uso de um
microrganismo em um processo biotecnológico envolve geralmente a produção de
algum composto de interesse. No entanto, as espécies que são encontradas
naturalmente na natureza, normalmente, não produzem quantidades suficientemente
grandes de metabolitos, somente o suficiente para sobrevivência. Então a função que
cabe ao biotecnologista é melhorar essa produção para conseguir aplicar em escala
industrial (BORZANI et. Al, 2008; Stanburry et. al., 1995, TORTORA et al, 2012).

Uma maneira eficaz de manter ou introduzir um processo fermentativo que

tenha capacidade de competir e ainda gere lucro é através do melhoramento do
microrganismo, aumentar sua produtividade e o rendimento da produção, ou ainda em
outras palavras, atingir a superprodução de algum metabolito. Também, permitir a
síntese de novas moléculas, produzir um produto que normalmente é produzido por
outras culturas, diminuir o número de produtos secundários e reações colaterais. Além
disso, tentar aumentar a resistência e especificidade do microrganismo (BORZANI et.
Al, 2008; Stanburry et. al., 1995, TORTORA et al, 2012).

Em condições normais de crescimento, o metabolismo do microrganismo

ocorre de modo que a produção energética e biossíntese mantenham um equilíbrio,
possibilitando o crescimento e reprodução. Essa condição de equilíbrio faz com que a
produção de certos metabólitos seja demasiadamente pequena. O melhoramento
genético tem como objetivo desviar o equilíbrio metabólico, fazendo com aconteça
mudanças nas vias metabólicas de modo que aumente a produção de metabólitos
primários ou produzi-los por vias alternativas, gerar diferentes biomoléculas daquelas
produzidas pelas vias comumente usadas pelo organismo em condições normais
(BORZANI et. Al, 2008; Stanburry et. al., 1995, TORTORA et al, 2012).
2 MÉTODOS CLÁSSICOS

2.1 MUTAÇÃO POR AGENTES FÍSICOS

2.1.1 MUTAÇÃO POR UV

A radiação ultravioleta é uma radiação não ionizante que cobre uma região do
espectro eletromagnético que fica entre 100nm e 400nm. É muito utilizada na
inativação de microrganismos, onde seu efeito germicida atinge eficiência máxima em
260nm. A luz uv atua principalmente na dimerização de bases nitrogenadas no DNA e
RNA (SKOOG; WEST; HOLLER, 1994).

A absorção da luz uv por pirimidinas adjacentes na mesma fita causa uma

fotodimerização, ou seja, forma dímeros de pirimidinas através de ligações covalentes
(citosina ou timina). Dos três tipos possíveis de dímeros de pirimidina (C-C, C-T ou T-
T), o dímero de timina (T-T) é o que se forma com maior frequência. Esse dímero não
é reconhecido pela DNA polimerase, impedindo a replicação do material genético
(NELSON et al, 2013).

O sistema SOS é um mecanismo de correção ou amenização dos danos

causados pela luz UV, encontrado em procariotos. Esse sistema é composto por
várias proteínas e DNA polimerase de alta taxa de erros, que permite a replicação
mesmo com a fotodimerização (NELSON et al, 2013). Certos microrganismos também
possuem enzimas reparadoras fotoliases que são capazes de reparar os danos
causados pela radiação UV. Essas enzimas fazem o reparo em presença de luz
através da retirada dos nucleotídeos danificados pelos dímeros de pirimidina
(TORTORA et al, 2012).

A mutação por UV é uma técnica barata e uma das mais utilizadas na indução
de mutações. Suas desvantagens estão na baixa especificidade e na alta taxa de
morte celular.

Figura 1: mutação por luz uv. Fonte: e-disciplinas USP

 2.1.2 MUTAÇÃO POR RADIAÇÕES IONIZANTES

São radiações de alta energia que incluem os raios alfa, beta, gama, raios x,
raios cósmicos e feixes de nêutrons. As radiações ionizantes atuam na ionização dos
compostos químicos celulares que podem danificar o DNA. A exposição do DNA
também pode causar formação de radicais hidroxila que ocasionam o rompimento das
ligações entre a desoxirribose e o fosfato do DNA, danificando seriamente a célula
(TORTORA et al, 2012).

2.1.3 TEMPERATURA

A alta temperatura pode ocasionar a quebra das ligações glicosídicas que

unem a base nitrogenada ao carboidrato dos nucleotídeos, causando a desnaturação
do DNA. (Lehninger et. al., 2003).

2.2 MUTAÇÃO POR AGENTES QUÍMICOS

2.2.1 ANÁLOGOS DE BASE

Os análogos de base são substâncias químicas estruturalmente semelhantes

as quatro bases nitrogenadas padrão do DNA (citosina, guanina, adenina e timina).
Devido à sua semelhança, os agentes mutagênicos podem ser incorporados ao DNA
no lugar das bases nitrogenadas, substituindo-as durante a replicação. (Djalma, 2011;
Fontes, 2016).

Entre os principais análogos de base, destaca-se o 5-bromouracil, que possui 2

tautômeros. Na forma de ceto, é análogo da timina que normalmente se liga à
adenina. Quando sofre alterações estruturais e está na forma enol, passa a parear
com a guanina, tornando-se análogo da citosina. Esse tipo de mutação gênica é
conhecida como transição. (DJALMA, 2011; WILLEY et al., 2013).

Outro importante análogo de base é o 2-aminopurina, que quando formada,

modifica a adenina que começa a parear com a citosina, em vez da timina, levando a
mutações durante a replicação do DNA (TORTORA et al, 2012).

Os análogos de base são muito utilizados como drogas antivirais, destacando-

se o tratamento de pacientes portadores de HIV com administração de azidotimidina
(AZT) (TORTORA et al, 2012).
Figura 2: Análogos de Base. Fonte: Fontes, 2016

2.2.2 AGENTES INTERCALANTES

Os agentes intercalantes são substâncias químicas geralmente planares que

produzem mutações ao se intercalarem entre as bases adjacentes no DNA, causando
leve distorção da dupla hélice, produzindo uma protuberâncias ou um certo intervalo
entre as fitas, levando a inserção e deleções de pares de base. Quando a mutação for
múltipla de três, a fase de leitura do DNA é alterada (TORTORA et al, 2012).

Os principais agentes intercalantes são a proflavina, a laranja de acridina e o

brometo de etídeo. (Renan Savieri Carniello, mutação e mutagênese). O brometo de
etidio é utilizado como corante fluorescente para a visualização dos fragmentos de
DNA pela eletroforese em gel de agarose (BAIRD et al.,1996). É um produto de alta
periculosidade de caráter mutagênico e moderadamente toxico.

Figura 3: Agentes intercalantes. Fonte:Apuntes de Biología Molecular

 2.2.3 AGENTES ALQUILANTES:

São substâncias químicas que reagem com o DNA, doando grupos alquila às
bases dos nucleotídeos, como metila (CH3) ou etila (CH3-H2). Como consequência,
há um mau pareamento ou total perda da base modificada, criando uma falha.
(Djalma, 2011; FONTES, 2016).

Todas as bases podem ser alquiladas, entretanto a principal afetada é a

guanina. Entre os agentes alquilantes, destacam-se o DES (dietilsulfato), EMS
(etilmetanossulfonato), enxofre nitrogenado e gás mostarda. O gás mostarda foi
descoberto durante a Segunda Guerra Mundial, caracterizando-se como um dos
primeiros mutagênicos químicos (FONTES, 2016).

O EMS adiciona um grupo etil a guanina, fazendo que no próximo ciclo de

replicação, ela se ligue a timina em vez da citosina (FONTES, 2016).

Figura 4: Etilmetanosulfonato (SEM). Fonte: Tortora, 2012

2.2.4 DESAMINAÇÃO

A desaminação é a perda do grupo amino (NH2) que certas bases podem

sofrer como resultado de reações de hidrólise. Certas substâncias químicas podem
induzir a base a sofrer desaminação, como o ácido nitroso (HNO2). O HNO2 desamina
a citosina criando uma uracila, que pareia com a adenina. A desaminação da adenina
é menos frequente e resulta na hipoxantina que pareia com a citosina (FONTES, 2016;
wikipedia).
 Figura 5: Substâncias químicas que causam desaminação e o produto das
desaminações. Fonte: e-disciplinas USP

2.2.5 HIDROXILAÇÃO

Algumas substâncias químicas podem adicionar um grupo hidroxila as bases

nitrogenadas. Esses agentes mutagênicos são conhecidos como substâncias que
causam hidroxilação. A hidroxilamina (NH2OH) converte a citosina em
hidroxilaminacitosina, produzindo um tautômero raro que pareia com a adenina ao
invés da guanina (FONTES, 2016).

Figura 6: Hidroxilação da citosina. Fonte: Fontes,2016

2.2.6 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO

São substâncias químicas produzidas durante o metabolismo aeróbico normal

e são as principais causas de mutação espontânea do DNA. Esses agentes
mutagênicos convertem a guanina em 8-oxi-7,8-di-hidrodesoxiguanina (FONTES,
2016).
3. MÉTODOS MOLECULARES

Os métodos moleculares são utilizados para o melhoramento direcionado de

microrganismos. Envolvem técnicas avançadas como CRISPR e a engenharia
genética.

Chama-se engenharia genética ao conjunto de técnicas que tornam possível a

criação de novas combinações gênicas, inexistentes na natureza. A vantagem da
engenharia genética está na especificidade da técnica que permite alterações
direcionadas parar uma região que se deseja alterar do genoma, diferente dos
métodos clássicos onde a mutação é aleatória. Na natureza, a recombinação genética
ocorre somente entre microrganismos de uma mesma espécie ou entre espécies muito
próximas. A engenharia genética permitiu a construção de novas espécies de material
genético, através da recombinação artificial realizada em laboratório, utilizando DNA
isolado de cepas não relacionadas (BORZANI et. Al, 2008).

Para a recombinação genética entre espécies distantes, alguns parâmetros são

necessários, como enzimas de restrição que clivam as moléculas de DNA e voltam a
ligar originando uma molécula de DNA recombinante. É necessário ainda, um
elemento transportador de genes, ou seja, o vetor genético, um meio de introduzir o
vetor numa célula viva capaz de multiplica-lo e uma maneira de selecionar as células
que tiveram efetivamente o DNA recombinante incorporado (BORZANI et. Al, 2008).

As modificações direcionadas são muito vantajosas industrialmente, pois

possibilitam, por exemplo, o bloqueio de vias metabólicas do microrganismo que
possam produzir metabólitos secundários prejudiciais para o processos industrial.
Pode-se ainda estimular vias metabólicas de modo a aumentar a produtividade do
metabólito de interesse, entre outros. (NELSON et al, 2013)

3.1 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

As enzimas de restrição ou também denominadas endonucleases de restrição

(clivam ligações fosfodiéster no interior da cadeia nucleotídica), clivam a molécula de
DNA em pontos específicos, em reconhecimento a determinadas sequencias de
nucleotídeos. São altamente específicas: cada tipo de enzima reconhece e corta
apenas uma determinada sequência de nucleotídeos (CRUZ, L. M., 2018).

Estas enzimas funcionam nas células bacterianas como parte de um

mecanismo de proteção ao ataque de bacteriófagos. Uma molécula de DNA viral que
contenha sítios para uma endonuclease bacteriana, ao ser injetada na bactéria, é
prontamente clivada nesses pontos e deixa de funcionar. O DNA da própria célula
bacteriana é protegido por metilação, catalisada por DNA metilases (CRUZ, L. M.,
2018).

As endonucleases de restrição são divididas em 3 classes, de acordo com o

seu mecanismo de clivagem. Estas classes são: tipo I, tipo II e tipo III. Tipos I e III
apresentam atividade de endonuclease e de metilase. Tanto o tipo I quanto III se
movem ao longo do DNA, e para isto necessitam da energia originada da quebra do
ATP. As endonucleases do tipo II não necessitam da quebra de ATP, e clivam o DNA
dentro da sequência de reconhecimento, e por este motivo, esta classe de
endonucleases é utilizadas na engenharia genética (CRUZ, L. M., 2018).
3.2 VETORES

Vetores são moléculas de DNA usadas como veiculo para transferir material
genético exógeno para outra molécula (CRUZ, L. M.). O gene ou fragmento de DNA a
ser retirado do genoma pode ser obtido por meio de clones em bibliotecas de DNA,
DNA complementar ou PCR . O novo DNA no qual o gene será inserido é chamado de
vetor de clonagem. A escolha de um deles depende basicamente do tamanho do
fragmento de DNA a ser inserido. Entre os vetores mais utilizados, estão os
plasmídeos, os bacteriófagos, fago lambda, cosmídeos, YAC e BAC (CRUZ, L. M.,
2018).
Plasmídeos são moléculas de DNA dupla fita que se replicam
independentemente do cromossomo principal da célula. Podem conter genes que
conferem vantagens adaptativas ao microrganismo, como resistência a alguns
antibióticos (NELSON et. al., 2013).

Os bacteriófagos proporcionam maior facilidade de isolamento das moléculas

hibridas. Quando o fago conclui seu ciclo lítico, partículas fágicas contendo DNA
recombinante são liberadas. O tamanho do DNA que se deseja clonar é limitado, pois
a molécula é empacotada na cabeça do fago (BORZANI et. al., 2008).

Cosmídeos são plasmídeos nos quais foram inseridas pequenas sequências do

DNA do bacteriófago lambda necessárias para o empacotamento do DNA do fado na
cabeça, assim como sequencias de replicação e genes de resistência a antibióticos
para identificar as células hospedeiras (BORZANI et. al., 2008).

Os BACs são conhecidos como cromossomos artificiais bacterianos, pois

apresentam um segmento muito longo de DNA. São adaptações de plasmídeos
desenvolvidos para a inserção de grandes quantidades de pares de bases, que variam
até 300.000 pb. As colônias que receberam o vetor BAC cujo DNa recombinante foi
corretamente inserido, é facilmente identificado, uma vez que estas bactérias passam
a expressar genes de resistência ao antibiótico clorafenicol. Podem ser identificados
também através da produção de ß-galactosidade pelo gene lacz, onde as cepas não
eficientes apresentam coloração azul (NELSON et al, 2013). Os YAC, cromossomos
artificiais de levedura possuem o mesmo princípio dos BACs, sendo utilizados
entretanto para leveduras. Para se manterem estáveis, possuem origem de replicação
de levedura, dois marcadores de seleçãoo e sequências derivadas de telômeros e
centrômeros (NELSON et. al., 2013).

Uma origem de replicação compatível com o sistema hospedeiro (oriC) e

marcadores, para que as células que tiverem incorporado o DNA novo possam ser
identificadas, conferindo às células uma nova característica facilmente detectável. Os
marcadores mais utilizados são os genes de resistência a drogas. Além disso,
precisam apresentar replicação autônoma. Os vetores de expressão, quando se
deseja expressar um gene, precisam ter também um promotor e um terminador de
transcrição entre o inserto (sequências reconhecidas pela RNA-polimerase da célula
hospedeira), sítios rbs (de ligação ao ribossomo) e algumas vezes, genes de
regulação de transcrição (indução ou repressão) (NELSON et. al., 2013; BORZANI et.
al., 2008; CRUZ, L. M., 2018).
 Figura 7: técnica de clonagem e DNA recombinante. Fonte: Tortora, 2012.

3.3 TRANSPOSONS

Os transposons são pequenos segmentos muito repetitivos de DNA que

podem se mover (ser “transpostos”) de uma região do genoma para outra. São
chamados de sequências saltitantes e são mediados por enzimas (endonucleases). A
transposase simplesmente quebra a fita de DNA nas extremidades onde estão
localizadas as repetições terminais e insere o transposon em um outro local dentro do
genoma. Os retrotransposons são segmentos de DNA que são copiados através de
um RNA intermediário,a produção do DNA a partir do RNA é catalisada pela enzima
transposomerase reversa. A duplicação dos transposons é catalisada pela enzima
transposomerase. Os transposons promovem uma diversidade e flexibilidade
genômica. (CHIRLEI, 2019; BORZANI et. al., 2008).

Há duas formas de transposição: a) Mecanismo corta e cola (transposição

conservativa) onde o transposon abandona um segmento do DNA e se insere em
outro segmento; b) Mecanismo copia e cola (transposição replicativa) onde o
transposon é copiado e a cópia é inserida em outra região do DNA do mesmo
cromossoma ou de outro cromossomo. (CHIRLEI, 2019).

Os transposons podem ser utilizados para impedir a expressão de genes,

interromper ou duplicar genes reguladores, influenciar genes próximos, além de
inativar vias metabólicas alternativas que competem por precursores importantes.
(chirlei, 2019; BORZANI et. Al, 2008)
Figura 8: Transposição conservativa e replicativa. Fonte:broad institute

3.4 RNAs SILENCIADORES E RNAs ANTISENSE

A interferência por RNA (RNAi) é um mecanismo celular responsável pelo

silenciamento gênico pós-transcricional que atua sobre o RNA mensageiro (mRNA)
(França et. al., 2010).

Nos processos de transcrição e tradução, existem algumas moléculas que

estão relacionadas com o resultado final da síntese proteica, além do mRNA, rRNA e
tRNA, entre elas os denominados micro RNAs (miRNAs) e os pequenos RNAs de
interferência (siRNAs). As células podem utilizar miRNAs ou siRNAs para realizarem o
silenciamento de genes com ação indesejada em um determinado momento
fisiológico. Estas pequenas moléculas são capazes de inativar o mRNA necessário
para a tradução de proteínas específicas. Este mecanismo de silenciamento gênico é
conhecido como RNAi, ou interferência de RNA mediada por RNAi (França et. al.,
2010).
O mecanismo acontece do seguinte modo: Primeiramente há um microRNA
ou dsRNA (que são pequenos RNAs de fita dupla ) que as proteínas argonautas vão
reconhecer e promover a sua clivagem, transformando-o em 2 moléculas de RNA fita
simples, formando os pequenos RNAs de interferência. Essas fitas simples vão se
complexar a um outro complexo de proteínas chamado complexo RISC, que permite o
pareamento entre a fita do miRNA incorporada e a região homóloga do mRNA-alvo por
complementaridade de bases. O complexo vai então degradar o mRNA (França et. al.,
2010).
 Como exemplos de aplicações do silenciamento de genes, pode-se citar:
tolerância aos estresses abióticos e bióticos, deleção de alergênicos, alteração na
produção de metabólitos secundários, uso de terapias em muitas doenças graves (por
exemplo essa técnica tem sido utilizada na busca do tratamento da Síndrome de
Down, nessa doença há trissomia no cromossomo 21), entre outros. (França et. al.,
2010).
Os RNAs antisense bloqueiam a atuação da RNA polimerase ao se ligarem a
uma fita de mRNA com alto grau de complementariedade. Esse mecanismo impede a
tradução do RNA (Heringer, 2011).

Figura 9: RNAs silenciadores. Fonte: Cruz, 2018.

3.5 FUSÃO DE PROTOPLASTOS

Os protoplastos são células cuja parede celular foi removida

enzimaticamente, permitindo assim um acesso mais direto à membrana plasmática.
Os protoplastos em solução se fundem com uma frequência baixa, porém significativa.
Durante o período em que a célula está sem a parede celular, pode-se introduzir
material genético estranho (transformação) ou conseguir a fusão de protoplastos de
diferentes culturas ou espécie (hibridização somática) (Otoni et. al.,1996).
Algumas das células expressam o DNA introduzido como se fosse delas
próprias. Esse método é especialmente importante para a manipulação genética de
células vegetais e de algas. A fusão de protoplastos pode ocorrer também em fungos
(Otoni et. al.,1996; BORZANI et. Al, 2008).

3.6 CRISPR/ CAS9

É uma ferramenta da engenharia genética utilizada para editar DNA baseada

no sistema de defesa das bactérias contra vírus invasores. A sigla significa “Conjunto
de Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Espaçadas“. As sequências
CRISPR são regiões de sequências repetitivas dentro do genoma bacteriano onde
material genético exógeno pode ser incorporado e Cas são regiões próximas ao
CRISPR que codificam para proteínas (CRUZ, L. M, 2018; Christin et. al., 2016;
(CHRISTIAN, BECKERT, 2017).
 Esse sistema é composto por duas partes, a proteína Cas9 (endonuclease) e
o RNA guia, sendo a combinação dos dois chamado de CRISPR. A única parte
modular do sistema é o RNA guia. O RNA guia e a proteína Cas9 formam um
complexo que salta pelo genoma e quando é encontrado um ponto em que o RNA
pode se combinar, ele se insere entre as duplas fitas do DNA, rompe a ligação,
estimulando a proteína CAs9 a cortar o DNA. A célula recorre então a dois
mecanismos de reparo. O primeiro junta os dois fragmentos do DNA novamente, por
junção de extremidades não homólogas. Entretanto esse mecanismo não é muito
eficiente O segundo mecanismo de reparo pega um fragmento homólogo de DNA para
reparar (Por homologia). Esse mecanismo pode ser burlado, inserindo um fragmento
falso de DNA (que seja homólogo nas duas extremidades mas diferente no meio
(CRUZ, L. M, 2018; Christin et. al., 2016; (CHRISTIAN, BECKERT, 2017).
A técnica permite manipular qualquer gene de interesse, ativar ou inativar a
expressão de qualquer gene. Possibilidades de inserção ou deleção de bases no DNA
de qualquer organismo alvo; inserção ou mesmo a troca de sequências específicas no
genoma; produção de grandes deleções ou rearranjos genômicos (inversões,
translocações); ativação e repressão gênica; modificação de histonas; metilação de
DNA; produção de proteínas fluorescentes e localização de genes no genoma. Entre
as aplicações de CRISPR/Cas9, destacam-se as alterações da expressão gênica
(silenciamento, repressão, indução e ganho de função), alterações em aminoácidos
para modular e alterar a atividade de proteínas, introdução de genes exógenos para
gerar novas características em espécies cultivadas, identificação e análise de módulos
gênicos determinantes de características fenotípicas de interesse agrícola para
acelerar a domesticação de plantas, e sua aplicação na biologia sintética (CRUZ, L. M,
2018; Christin et. al., 2016; CHRISTIAN, BECKERT, 2017).

Figura 10: CRISPR e sistema de reparo do DNA. Fonte: Christin, 2017.

3.7 ZNF E TALEN

ZNF também conhecida como dedos de zinco é uma endonuclease artificial

com domínios de reconhecimento de DNA, tipicamente trincas de bases, sendo
utilizada em técnicas de identificação de genes alvo em diversos genomas. Pode ser
acoplada com sistemas homólogos, onde é possível inserir do microrganismo
segmentos de bases exógenos, ou não-homólogos, usado quando não se tem um
segmento de DNA que se deseja inserir no genoma da cepa (GILLES, AVEROF,
2014).

O ZNF possui desvantagens, pois, não pode ser usados para todas as partes
do genoma, já que não é capaz de identificar todas as trincas de nucleotídeos. Além
disso, sua especificidade pode ser influenciada por domínios proteicos vizinhos
(GILLES, AVEROF, 2014).

TALENs (Transcription Activator Like Effector Nucleases) são endonucleases

compostas de diversas regiões TAL, fatores de transcrição capazes de identificar um
único nucleotídeo, em tandem acopladas em um domínio de restrição Os fatores TAL
apresentam a vantagem de não interferirem uns com os outros, como no caso das
repetições em dedos de zinco (NATURE VIDEO, 2011). È uma técnica muito eficiente,
onde os domínios em repetição são simplificados, não interagindo entre si, diminuindo
a especificidade do reconhecimentos de bases nitrogenadas (GILLES, AVEROF,
2014).

Figura 11: ZNF e TALEN. Fonte: Wikimedia

3.8 MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO

Transformação genética é o processo de introdução de genes de interesse

em organismos alvo. O gene transferido para o organismo é chamada de transgene,
enquanto os organismo modificados geneticamente são denominados de
transformados ou transgênicos (Souza, 2016).

Os métodos de síntese de DNA recombinante são feitos fora das

células. Essas moléculas não atravessam espontaneamente a membrana plasmática
das células devido ao grande tamanho. A entrada do material genético na célula
hospedeira é feita através de tratamento químicos, físicos e biológicos (WILLEY et al,
2013).

3.8.1 Transformação via Agrobacterium

Agrobacterium são bactérias do solo gram-negativas utilizadas na

transformação de células de plantas. As bactérias utilizadas portam vetores pDM805
contendo o gene que se deseja inserir nas células de plantas (GAO et al, 2013; Souza,
2016).
A inoculação das células bacterianas é feito em pequenos callus
embriogênicos de plantas, que são incubados na ausência de luz a temperatura ideal
(GAO et al, 2013).
3.8.2 Transformação por agentes químicos
Tratamentos químicos podem ser utilizados para induzir maior permeabilidade
da membrana plasmática das células de leveduras. As células são cultivadas em
solução contendo metais e plasmídeos que se desejam inserir. Tubos contendo a
solução são submetidos a choques térmicos e então são resfriados em temperatura
ambiente, lavados com água também em temperatura ambientes e ressuspensas em
água (ITO et al, 1983).

3.8.3 Biobalística
Caracteriza-se como um método de transferência físico e direto, pois não
necessita de suporte biológico para a inserção. O DNA é integrado diretamente no
genoma das células hospedeiras, através de microesferas metálicas. As esferas são
geralmente de outro, acarretando à técnica um alto custo GAO et al, 2013; Souza,
2016).
Essa técnica possibilita a co-transformação, ou seja, a inserção de múltiplos
genes de interesse de uma só vez, requerendo somente um marcador de seleção
(GAO et al, 2013).

4 REFERÊNCIAS
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<&lt;https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/1720661/course/section/530614/aula%20
12%20%20M%C3%A9todos%20de%20transforma%C3%A7%C3%A3o%20gen%CA9t
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OTONI, W.C.; CASALI, V.W.D.; POWER, J.B.; DAVEY, M.R. Isolamento
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