TOXICOLOGIA Y QUIMICA LEGAL (http://www.biol.unlp.edu.

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1 - FUNDAMENTOS DE TOXICOLOGIA EXPERIMENTAL

CUESTIONARIO 1) Discuta conceptualmente cuál es la importancia de las relaciones dosis respuesta en el campo de la toxicología.

2) (a) ¿Qué clase de respuestas debe ser provocada por una sustancia tóxica en un organismo parta que pueda determinarse su toxicidad? (b) ¿Qué tipo de coordenadas se utilizan en
las curvas de toxicidad? ¿Porqué deben utilizarse las mismas?.

3) (a) Defina los siguientes parámetros: DE, DE50, DL50. DL100 CL50y TV50.
(b)Cómo determina el parámetro DL50 en animales de exposición y en seres humanos

4) En el marco del estudio de la droga A para su potencia empleo a nivel terapéutico, se obtuvieron las siguientes curvas dosis - efecto.

(a) Cuál de las dos curvas corresponde a la DL y cuál a la DE? (b) Indique si la sustancia A puede considerarse o no segura. (c) Las curvas deben ser de la misma especie o no
necesariamente?

5) En una planta de síntesis orgánica se han obtenido tres pesticidas (A, B, C) con costos equivalentes en lo que se refiere a su producción. Las curvas dosis/respuesta se presentan a
continuación:

a) en virtud de dicha información, qué sustancia elegiría para su incorporación al mercado?

b) ¿Cómo modificarla su respuesta a la pregunta anterior en los siguientes casos:
c)

 i) Coeficiente de selectividad = CS
 CS= DL50vertebrados / DL50 Insectos
 (ii) El pesticida A se degrada más rápidamente por acción de la luz solar y el objetivo es aplicarlo a cultivos de cereales.
 (iii) Los plaguicidas A y B son altamente persistentes y provocan trastornos neurológicos severos en mamíferos.

6) Los siguientes datos de mortalidad se obtuvieron en un estudio de toxicidad aguda. Calcular la DL 50, el SE de DL50 y la pendiente de la curva dosis - respuesta.

Dosis (mg/Kg) 1 2 4 8 16 32
Mortalidad 0/10 1/10 3/10 4/10 7/10 10/10
7) En un estudio realizado sobre la sustancia X se obtuvo la siguiente curva dosis - respuesta:

Que modificaciones pueden registrarse en dicha figura contemplando las siguientes situaciones
a) presencia de una sustancia que facilita la absorción de X
b) presencia de una sustancia que facilita la metabolización de X en un producto fisiológico no activo
c) Presencia de una sustancia sinergista.

Considere en todos los casos que no se modifica el mecanismo de acción de X. Justifique su respuesta en cada caso.

8) Estudio de la toxicidad del clorhidrato de cocaína. Fabre, R. & Truhaut, R. Toxicología.(1976)

Estudio de la toxicidad del clorhidrato de cocaína.

Dosis en mg./Kg) Número de Número de Porcentaje
por 20gr. ratones inyectados muertos de mortalidad
0,8 20 20 100
0,7 24 20 84
0,6 30 24 77
0,5 50 26 52
0,4 30 5 16,4
0,3 20 0 0

En este caso el número de animales por lote es diferente, pero no importa. Los valores de probits correspondientes al 0 y 100% de la mortalidad no se calculan y se estudia la recta con
los restantes 4 puntos. Establézcase la LD50 con su intervalo de confianza.
¿Cómo se obtiene la curva de Trevan?
¿Cómo se obtendría la curva de Gauss (histograma no acumulativo) a partir de los datos de la curva de Trevan?
¿Qué es la NED y qué relación tiene con los Probits?

2- TOXICOS VOLATILES Y GASEOSOS

Se denominan tóxicos gaseosos a todas aquellas sustancias que a temperatura ambiente se encuentran en estado gaseoso. Ello determina el medio en que preferentemente se
encuentran (aire), así como su vía de ingreso más importante (pulmones). Se consideran como tales al CO, HCN, SH 2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2.

Se denominan tóxicos volátiles a todas aquellas sustancias que independientemente de su estado físico pueden separarse del material que las contiene a través de los siguientes
métodos: destilación simple destilación por arrastre con vapor, microdifusión, espacio cabeza Comprenden, entre otros, compuestos tales como alcoholes primarios, aldehídos, cetonas,
fenoles y solventes orgánicos como éter, cloroformo, tetracloruro de carbono, etc.

Es necesario tener en cuenta que los tóxicos volátiles al ingresar al organismo pueden sufrir una serie de modificaciones en su estructura de manera tal que, dichas sustancias pueden
convertirse en metabolitos atóxicos o bien aumentar notablemente su toxicidad.

En los casos de Intoxicaciones, para realizar la correspondiente investigación se emplea una alícuota acorde con el volumen total de la muestra recogida. En muestras destinadas a la
peritación, generalmente se utiliza un octavo de la cantidad total de la muestra disponible. En las pericias se emplean vómitos, restos de medicamentos, alimentos, vísceras (estómago,
hígado, bazo, riñones, cerebro), sangre u orina. Se procede entonces a tomar una porción reducida de ellos sobre la que se efectúan reacciones preliminares con papeles reactivos previo
al aislamiento del o de los tóxicos, tratando de analizar la sección del tracto digestivo donde presumiblemente, se encuentre la mayor concentración de los sustancias de interés.

INVESTIGACION

Las condiciones de recolección de las muestras deben contemplar no utilizar alcohol como antiséptico local ni otras soluciones constituidas por sustancias reductoras que puedan interferir
en la determinación posterior. Se recomienda usar solución jabonosa o solución acuosa de bicloruro de mercurio 0.5%.

La conservación de las muestras requiere el empleo de recipientes de plástico con tapa hermética (no usar tapones de goma) conteniendo 2- 5 mg de fluoruro de sodio (anticoagulante y
conservador) o bien oxalato y citrato. Asimismo, se deben realizar rápidamente las determinaciones o en su defecto, someter a las mismas a un almacenamiento refrigerado a 4ºC,
sellando el recipiente y se deben tener contramuestras.

Es importante el aislamiento de dichos compuestos separables del material que lo contienen a través de los distintos métodos citados previamente, los cuales se desarrollarán a
continuación. Posteriormente al aislamiento, se realiza la cuantificación de las sustancias en estudio mediante el empleo de diversas metodologías como cromatografía gaseosa (CG),
cromatografía gaseosa de alta resolución (HRCG) con empleo de columnas capilares, métodos enzimáticos, métodos acoplados, etc.

Destilación

A través de la destilación simple y fraccionada pueden separarse sustancias volátiles de mezclas homogéneas. Pueden separarse sustancias solubles en el medio en que se encuentran,
generalmente. acuoso (tejido, orina, sangre, etc.). La destilación simple presenta aplicación limitada debido a que los puntos de ebullición de las sustancias a separar deben diferir en a lo
menos, 30ºC y por otra parte, se requiere una cantidad de muestra considerable. En cambio, a través de la destilación fraccionada pueden separarse sustancias cuyos puntos de
ebullición se encuentren más cercanos.

En Toxicología una técnica muy apropiada es la destilación con arrastre por vapor dado que proporciona varias ventajas con respecto a las anteriores. Es de suma importancia en el caso
en que sea necesario separar una pequeña porción de un compuesto débilmente volátil de un material no volátil. Como técnica, puede ser directa o indirecta. En el caso de la destilación
con arrastre por vapor directa, el vapor de agua se genera en el mismo recipiente que contiene la muestra, mientras que en la indirecta el vapor se genera en un recipiente y se hace
burbujear en otro que contiene la muestra con el material biológico (por ejemplo, vísceras). Se recomienda el empleo de la destilación indirecta en el caso en que puedan registrarse
proyecciones o carbonización de la muestra.

Fundamento de la destilación con arrastre por vapor

Si dos sustancias (un compuesto débilmente volátil y agua del material biológico) son insolubles, las presiones parciales de ambas sustancias se suman para dar una presión de vapor
total. Cuando la suma de estas presiones es iguala a la presión atmosférica ambas destilarán juntos. Así, la mezcla destilará por debajo del punto de ebullición de cada una de las
sustancias presentes. Este hecho hace posible la separación de sustancias con alto punto de ebullición a bajas temperaturas, resultando muy adecuada su aplicación a sustancias que se
descomponen. La recolección del destilado puede realizarse a través de una fracción única o varias de menor volumen. En esta última modalidad, las primeras fracciones tendrán una alta
concentración de los tóxicos más volátiles y las posteriores estarán más enriquecidas en los menos volátiles.

Estos conceptos se aplican a menudo en toxicología al separar compuestos volátiles ácidos y básicos. Al respecto, se realizan dos destilaciones: una en medio ácido en la que se recogen
los tóxicos volátiles ácidos y neutros y otra en medio alcalino en la que se separan los tóxicos volátiles alcalinos.

Destilación en medio ácido

A partir de alrededor de 100 gr de material (almacenado a bajas temperaturas para evitar pérdidas por volatilización) se procede a la maceración con igual cantidad de agua destilada a fin
de obtener una papilla fluida. Se incorpora la misma a un balón de destilación, se acidifíca con ácido tartárico 10% y se adicionan gotas de silicona como antiespumante. El balón se
coloca en un manto calefactor o en un baño de agua, conectándose al refrigerante por un lado y al generador de vapor por otro (en el caso de una destilación indirecta). Se coloca un
pequeño volumen de agua en el tubo colector el que puede refrigerarse exteriormente con hielo efectuándose la destilación hasta recoger un volumen de destilado similar al de la muestra
original.

Mediante la acidez tartárica se logra un pH adecuado y se evitan alteraciones eventuales de ciertos complejos; en algunos casos (fenoles), aconsejándose el tratamiento con solución de
ácido sulfúrico 20%. El aspecto del destilado es generalmente límpido salvo en el caso de vísceras o del material biológico por destilación de ácidos grasos de bajo peso molecular o por
solventes no miscibles con agua.

Destilación en medio alcalino

La solución remanente de la destilación en medio ácido se deja enfriar, se trata con solución de NaOH 10% hasta pH 10 o bien con un exceso de OMg. Es aconsejable el agregado de un
antiespumante también en esta destilación. Dado que el tratamiento con NaOH puede dar lugar a descomposiciones se prefiere el agregado de OMg, aunque con este agente no se
obtiene una destilación completa. El destilado se recoge en ClH 2N, lo que permite fijar las bases volátiles. Es importante controlar el pH del destilado ya que puede requerir un agregado
posterior de HCI. Se continúa hasta la obtención de 80 - 100 ml. Dicho destilado, además de contener las bases volátiles salificadas, presenta cierta proporción de NH4CI y un exceso de
ácido fijador.

OTROS MÉTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE TOXICOS GASEOSOS Y VOLÁTILES

Existen otros métodos de aislamiento e identificación de tóxicos gaseosos y volátiles, siendo los más importantes los de microdifusión y espacio cabeza. Cada uno de ellos tendrá una
aplicación óptima según el tóxico que se quiera investigar y la matriz desde la que se quiera separar.

MICRODIFUSION

Con respecto a la microdifusión, se trata de otro procedimiento muy útil para aislar a identificar Tóxicos volátiles, pudiendo aplicarse a muestras de sangre, orina, saliva.

Fundamento

Si una solución de una sustancia volátil y un solvente puro se mantienen en compartimentos separados pero en contacto con la misma atmósfera, el soluto volátil tenderá a disolverse en
el solvente puro. De esta manera, se logra la difusión del soluto volátil desde la solución inicial al solvente hasta que se llegue a un equilibrio. Si se dispone de una sustancia que convierta
el soluto volátil en no volátil, la difusión ocurre hasta que la presión de vapor en la atmósfera disminuya hasta casi cero.

ESPACIO CABEZA "head space"

Mediante la técnica del espacio cabeza ("head space") se puede realizar en forma rápida y sencilla el aislamiento e identificación de un tóxico volátil contenido en un material biológico.

Fundamento

A una temperatura dada existe un equilibrio de partición (aire material biológico) para una sustancia volátil determinada, utilizándose agentes liberadores del tóxico. Luego, el tóxico
presente en la fase vapor es analizado por cromatografía gaseosa (CG).

CROMATOGRAFIA GASEOSA (CG)

La cromatografía gaseosa es un método de gran valor para la dosificación del alcohol en sangre dado que presenta rapidez, especificidad y gran sensibilidad. En Inglaterra, se utiliza
como el método oficial para la determinación de la alcoholemia (tenor de alcohol en sangre) especialmente en aquellos sujetos en los cuales la prueba con un analizador de aire espirado
se traduce en la sospecha que se encontraban bajo la influencia del alcohol.

3 - ETANOL
INTRODUCCION
Dentro de los tóxicos volátiles, los alcoholes Etanol y Metanol son sustancias de Importancia toxicológica dada su acción farmacológica depresora del sistema nervioso central (SNC) y el
abuso creciente del consumo de bebidas alcohólicas. Esto último, presenta importancia médico - social debido a que los individuos alcoholizados pueden ser causa de trastornos y
accidentes, de. los cuales son imputables.

Las vías de penetración posibles de los alcoholes son la digestiva, la respiratoria, y la absorción a través de la piel. En el caso del etanol, la intoxicación más frecuente ocurre cuando el
individuo ingiere cantidades excesivas de esta sustancia por el consumo de bebidas alcohólicas fermentadas y/o destiladas.

Los tipos de muestras generalmente usados para estas determinaciones son: sangre (alcoholemia) , orina, otros fluidos biológicos, vísceras, alimentos, etc.
Las muestras de sangre se obtienen por punción venosa, teniendo la precaución de no utilizar alcohol como antiséptico local ni otras soluciones constituidas por sustancias reductoras
que puedan interferir en la determinación posterior. Se recomienda usar solución jabonosa o solución acuosa de cloruro mercúrico 0.05%.
La conservación de las muestras de sangre requiere el empleo de recipientes de plástico con cierre hermético (no usar tapones de goma) conteniendo fluoruro de sodio (anticoagulante y
preservador) o bien oxalato y citrato (anticoagulante) y su almacenamiento refrigerado a T = 4ºC.
El fluoruro de sodio impide el desarrollo de microorganismos que pueden consumir o generar etanol. Los tapones de goma contienen vulcanizantes que son sustancias reductoras
capaces de dar falsos positivos en los métodos químicos. El cierre hermético es necesario dado el carácter volátil del etanol y además, es importante que no exista cámara de aire en el
recipiente de recolección de las muestras dado que el oxígeno presente podría oxidar al etanol y también para minimizar pérdidas por volatilización.
En el caso de muestras de orina, se aplicaría una metodología similar para la recolección y conservación de las mismas, pero cabe considerar que dicho fluido biológico no presenta una
correlación apreciable con una intoxicación debida a etanol.
Para su, determinación, las metodologías basadas en la oxidación bajo ciertas condiciones son útiles para la dosificación de los alcoholes pero no para su identificación ya que no
dosifican el alcohol como tal sino a tus productos de oxidación. Por ejemplo, la determinación de ácido acético (CH 3COOH), posterior a la oxidación completa del etanol, significaría un
error por exceso si un licor a ser analizado tuviera en su composición además acetaldehido.

El alcohol etílico se separa de las vísceras y tejidos mediante la técnica de destilación ácida. A continuación, se procede a la dosificación del alcohol sobre una alícuota del destilado
mediante el método de Nicloux (actualmente en desuso).

METODO DE NICLOUX

Fundamento

Se basa en la dosificación del alcohol sobre una alícuota del producto de la destilación por oxidación con mezcla sulfocrómica en caliente.

3C2H5OH + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 3CH3COOH + 2Cr2(S04)3 + 2K2SO4 + 11 H20

Muestras: destilado de sangre, orina, contenido de vísceras

Técnica

En un matraz de destilación de 250 ml se colocan 10 ml de sangre u orina, una pequeña cantidad de ácido pícrico y 65 ml de agua. Si se trata de orina se toman 10 ml de muestra, se
agregan 25 ml de solución saturada de ácido pícrico y 40 ml de agua. Se destila recogiendo sobre 5 ml de ácido sulfúrico 3 N hasta un volumen de 40 ml. Se toman 5 ml del destilado, se
agregan 6 ml de ácido sulfúrico concentrado y se titula con solución de dicromato de potasio 19 por mil hasta viraje del color verde azulado a verde amarillento, manteniendo la
temperatura del tubo de reacción en (90-100ºC).

Es Importante que la titulación se realice a (90-100ºC), dado que a temperaturas menores (60ºC) el etanol se oxida a su correspondiente aldehído (acetaldehído).

Expresión de resultados

Alcoholemia (ml etanol/1000 ml sangre) 4 x Volumen Cr 204K2

MICRODIFUSION

La microdifusión se realiza en cámaras de Conway que poseen en el compartimiento externo muestra y agente liberador (C0 3K2) y en el interno el agente atrapante Cr 207K2 + H2SO4
0.01N. En este caso, se produce la captación y oxidación del etanol hacia ácido acético, forzándose la remoción completa del primer compuesto al cabo de un tiempo y temperatura
previamente determinados.

Las muestras sobre las que se utiliza esta técnica son sangre, orina, saliva y otros fluidos biológicos.

Técnica

Se colocan en el compartimiento interno de la cámara de Conway 0.5 ml de una solución de dicromato de potasio 0.4 N en ácido sulfúrico 10 N; en el compartimento externo 0.5 - 1.0 ml
de sangre u orina y (0.5 - 1.0 ml) del reactivo liberador (solución saturada de carbonato de potasio). Efectuar paralelamente un blanco con agua. destilada. Se deja difundir 2 horas a 50ºC.
Una vez cumplido dicho tiempo, se procede a la microtitulación directamente en el compartimiento interno.

Para ello, se agregan 0.5 ml de la solución de ioduro de potasio 3 N, se agita con varilla y se titula rápidamente al principio y más lentamente luego, con la solución valorada de tiosulfato
de sodio, 0.1 N colocada en una microbureta. Al observarse el comienzo de la aparición del color celeste verdoso del Cr +3 se adiciona una gota de la solución de almidón, continuándose
ahora gota a gota la titulación hasta la desaparición del color azul del iodo. Se titula el blanco de manera similar anotando los volúmenes de tiosulfato consumidos en cada uno de los
casos.
Expresión de resultados

Etanol (g/l sangre) = N (Vb - VM ) / Vs . 11,51

donde: N = normalidad del tiosulfato

Vb ml tiosulfato consumidos en el blanco
VM ml tiosulfato consumidos en la muestra
Vs ml de sangre u orina colocados en la cámara de Conway
11.51= PM etanol / 4 de acuerdo a la reacción redox

Mediante esta expresión puede evidenciarse la relación de concentraciones de etanol en sangre y en orina. En la microdifusión interfieren acetaldehído, alcohol metílico, alcohol
isopropílico, propanaldehído, alcohol amílico, octanol, éter etílico, etc.
No interfieren cloroformo, benceno, tetracloruro de carbono, tricloroetileno, etc.

- Otra alternativa aplicando la técnica de microdifusión sería la siguiente:

Reactivos

- Solución de Cr207K2 0.106 N en H2SO4 22.08 N ( Pesar 5.2 gr de Cr207K2 en 400 ml de H20 (d) y llevar a 1 L en H2SO4 (c) )
Solución saturada de C03K2

Muestras

-sangre anticoagulada y en recipiente con cierre hermético

Curva de calibración

-soluciones de sangre con concentraciones conocidas de alcohol etílico: 0.25 g/l; 0.50 g/l,
1. 25 g/l ; 2.50 g/l ; 5. 00 g/l

Procedimiento

Se colocan en el compartimento interno de la cámara de Conway (tamaño pequeño), 0.5 ml de la solución ácida de Cr 207K2. En un extremo del compartimento externo, se agregan 0.2 ml
de sangre y en el otro extremo del mismo 0.2 ml de la solución saturada de C0 3K2, Tapar la cámara y hacerla girar cuidadosamente (en forma horizontal) sobre la mesa de trabajo, para
poner en contacto los reactivos colocados en el compartimento externo.

Dejar difundir 1 hora a temperatura ambiente. Luego, destapar la cámara y recoger la solución del compartimento interno.

Proceder a la lectura espectrofotométrica a 620 nm.

En el caso de utilizar cámaras de Conway (tamaño grande) los volúmenes de los reactivos a utilizar serían los siguientes: 3 ml de la solución ácida de Cr207K2, 1 ml de sangre y 1 ml de la
solución saturada de C03K2.

Resultados

Valores de alcoholemia a partir de 0.5 g/ l tienen importancia médico legal.

Determinación de etanol en sangre

CG/head space

Se trabajará en la identificación y cuantificación de etanol en muestras de sangre mediante cromatografía gaseosa, utilizando la técnica del espacio cabeza “head space” para separar los
analitos de la matriz, previo a la inyección en el cromatógrafo.
A continuación, puede observarse un esquema del equipo para la toma de muestra desde espacio cabeza:

PC: control de flujo

P: regulador de Presion
0: medidor de presion
R: restrictor
8: valvula solenoide
V: valvula muestreadora de gas
SN: aguja de muestreo
SV: vial de muestra
T: línea de transferencia

Materiales y reactivos

a ) Solución tipo de etanol 1%.

b) Sangre libre de etanol. 5.0, 1.0, 2.0 y 3.0 g/l
c) Agente liberante: solución saturada de carbonato de potasio.
d) Octanol utilizado como patrón interno 0.5 g/l.
e) Viales de vidrio de 10 ml de capacidad, cerrados con tapón de goma
y arandela de aluminio con sellador manual.

Condiciones del espacio cabeza (HP 7694E)

Incubación a 60ºC durante 10 minutos, presurización carrier N2 14.4 psi, presión en vial 14.0 psi. Tiempo presurización: 0.2 min, tiempo loop: 0.01 min, tiempo inyección: 0.2 min.
Temperatura loop: 102ºC, temperatura línea 100ºC.

Condiciones cromatográficas (PE 8000)

Columna de vidrio (1.20 m largo, 114 de pulgada con relleno de Porapak Q), temperatura columna 110ºC, detector de ionización de llama (temperatura = 250ºC), temperatura de inyección
= 250ºC. Tiempo de retención etanol: 2.31min, tiempo de retención standard interno: 4.88.

Elaboración de la curva patrón

Se preparan viales con 1 ml de sangre con agregado de la solución tipo de etanol para alcanzar concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/l. Se agregan a cada uno 0.5 ml de solución del
patrón interno y 1 ml de la solución del agente liberador. Se tapan herméticamente.

A partir del cromatograma resultante se obtienen las áreas bajo la curva del etanol y del patrón interno. Se grafica concentración de etanol en sangre vs. AEtOH/API, en donde AEtOH es el
área bajo la curva del pico de etanol y API es el área bajo la curva del patrón interno.

Determinación de la concentración de etanol en la muestra de sangre

Se prepara un vial de 10 ml con 1 ml de sangre a analizar, 1 ml de la solución del standard interno y 1 ml del agente liberador, agregados en ese orden. Se sella rápidamente el vial para
su disposición en el equipo.

Los cálculos se realizan por interpolación a partir de los datos obtenidos para la curva patrón, considerando siempre la relación AEtOHAPI. Se expresan los resultados en gramos de etanol/l
de sangre o en mg/100 ml.

Métodos bioquímicos

Los métodos bioquímicos permiten la dosificación del alcohol en la sangre u otros fluidos biológicos a efectos de inferir la impregnación alcohólica del organismo. Entre ellos se
encuentran los métodos enzimáticos (método de la alcohol deshidrogenasa ADH) y métodos acoplados (enzimático - electroquímicos) (biosensores).

Determinación de etanol en muestras de alimentos. Método Enzimático / UV

Fundamento

El etanol es oxidado a acetaldehído en presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) por nicotinamida / adenina dinucleótido (NAD).

Etanol + NAD+ acetaldehido+ NADH + H+

El acetaldehido formado puede ser desplazado totalmente hacia la derecha en condiciones alcalinas atrapando el acetaldehído formado.

El acetaldehido es oxidado en presencia de aldehído dehidrogenasa (Al DH)cuantitativamente a ácido acético

Acetaldehído + NAD+ + H20 ácido acético +NADH + H*

NADH es determinado por la medida de su absorbancia a 334, 340 ó 345 nm.

Ensayo

Botella 1: 100 ml de buffer difosfato de potasio pH 9

Botella 2: 30 tabletas , cada tableta contiene NAD 4 mg, aldehido dehidrogenasa aprox. 0.8 W estabilizada.
Botella 3: 1.5 ml de suspensión ADH de 7000U. Etanol estandard: usar sin diluir. Se utiliza para el control del proceso.

Preparación de las soluciones

1. Use el contenido de la botella 1 sin diluir

2. Disuelva 1 tableta en 2 ó 3 ml de solución de la botella 1 en un tubo de centrífuga por cada ensayo (blanco o muestra dependiendo del número de determinaciones). Usar pinzas para
tomar las tabletas. Esta es la solución 2*

3. Use el contenido de la botella sin diluir

Procedimiento
Longitud de onda 340nm ó 365 nm ó 334 nm
Cubetas de vidrio: 1 cm paso óptico
Temperatura > 20 / 25ºC
Volumen final: 3.150 ml. Leer contra aire (sin cubeta en el paso de luz, contra agua o contra blanco (cuando se usa fotómetro de doble haz).
Solución de muestra: 0.3 12 µl etanol /cubeta (en 0.100 0.500 ml de volumen de muestra)

Pipetear en la cubeta blanco

Reaccion mezcla 2* 3.000 ml 3.000 ml
Agua redestilada 0.100 ml ------------
Solucion muestra ------------ 0.100 ml
Mezclar aproximadamente 3 minutos y leer la absorbancia de la solución (A1)
Solución 3 0.050 ml 0.050 ml

Mezclar, después de completa reacción (5 a 10 minutos) leer la absorbancia de la solución inmediatamente una después de la otra. (A2)

Es absolutamente necesario tapar la cubeta con parafilm durante la medida

Determinar la diferencia de absorbancia (A2 - A1) para ambos, blanco muestra.

A = (A2 - A1) muestra (A2 - A1) blanco

La medidas de absorbancia deben arrojar como regla, una diferencia de al menos 0.100 unidades de absorbancia para obtener resultados suficientemente precisos.

Cálculos

De acuerdo a la ecuación general para calcular la concentración en la reacción en la cual la cantidad de NADH formado es estequiométricamente igual a la mitad de la cantidad de
sustrato:

V . PM A
C= [g/l]
E . d . v x 2 . 1000

V: volumen final, 3.150 mI.

v: volumen de muestra, 0.100 ml
PM: peso molecular del etanol (g/mol). 46.07
d: paso óptico, 1.00 cm
E: coeficiente de extinción molar del NADH
340 mn: 6.3 (l.mol -1. cm)
365mm: 3.4 (l.mol -1. cm)
334 nm: 6.18 (l.mol -1. cm)

Si la muestra ha sido diluida considerar aplicar a los resultados el correspondiente factor de dilución

Sí se analiza un sólido y/o muestra semi sólida, la cual es pesada para la preparación, los resultados se expresan por cantidad de muestra pesada.

[etanol] (g/l sol.muestra) x 100

contenido etanol = (g/100)
peso muestra (g/l sol.muestra)

INTERPRETACION DE RESULTADOS

La relación entre alcoholemia y los efectos farmacológicos producidos presenta variaciones según factores individuales tales como edad, hábito, sexo, etc.

Dada su acción farmacológica depresora del sistema nervioso central (SNC), el etanol produce una parálisis descendente del mismo, luego la depresión continúa sobre los centros
subcorticales y el cerebelo, después sobre la médula espinal y finalmente sobre el bulbo, con depresión de los centros vitales, respiratorio y vasomotor llevando a la muerte al individuo.

La acción farmacológica del etanol comprende 4 períodos, cuyas manifestaciones están en relación con su concentración en sangre (alcoholemia).

Período I: (50 - 150) mg/100 cm3 sangre. Alteraciones funcionales de la corteza cerebral (memoria, atención, asociación de ideas están perturbadas). Liberación del tono emocional,
malhumor, exceso de confianza.

Período II: (150 - 250) mg/100 cm3sangre. Ebriedad manifiesta. Trastornos de la palabra, postura y marcha, pérdida de la coordinación, depresión de los centros posturales, incluyendo el
cerebelo.

Período III: (250 - 350) mg/100 cm3 sangre. Sueño profundo, inconsciencia, estupor, coma. Se afectan los centros espinales.

Período IV: (350 - 450) mg/100 cm3 sangre. Depresión de centros bulbares, vasomotor, respiratorio. Existe peligro de muerte. Coma profundo. Piel húmeda y fría, pulso acelerado, pupilas
dilatadas y respiracion lenta. La muerte se produce por parálisis respiratoria principalmente con concentraciones mayores a 500 mg/100 cm3 sangre.
El alcohol produce o constituye un caso típico de Toxicomanía (dependencia física, psíquica y tolerancia).

CUESTIONARIO

1) Qué métodos conoce para determinar etanol?. Indique los principios en que se basa cada uno de ellos y sobre qué tipo de muestras se aplica cada uno. Cómo se realiza la expresión e
interpretación de los resultados en cada caso?

2) Cuál es el criterio de selección de muestras para la determinación de etanol que permite determinar en forma retrospectiva la alcoholemia? Ventajas y desventajas en cada caso.

3) Respecto a los biosensores: a) Cuál es la ventaja de su empleo?. b)En qué principio se basa?. c) Qué parámetros son importantes considerar para lograr un diseño eficiente?.

4) Respecto a la técnica espacio - cabeza: a) Cuáles son las ventajas que presenta la determinación de etanol por esta técnica?. b) Qué precauciones deben tomarse para procesar las
muestras destinadas a tal fin?

5) Cite los fundamentos de la determinación de etanol por la técnica de microdifusión y mencione sus ventajas.

6) Cómo se realiza el diagnóstico químico de ebriedad?.

7) Qué vinculación ha podido encontrar en función de las experiencias registradas entre las ocurrencias de accidentes de tránsito y el consumo de alcohol?. Cuál es su Implicancla?. Cite
ejemplos de cómo puede diseñarse una experiencia para su estudio y que Información puede obtenerse de la misma.

8) Al cabo de ocho horas de haberse producido un asesinato se presenta detenido un joven con manifestaciones de incoordinacíón en la marcha, exageración en la palabra y pérdida de
control. El análisis de sangre aportó una concentración de 1,80 g/1. En base el interrogatorío efectuado, declaró haber ingerido, poco antes del hecho, una cantidad considerable de una
bebida alcohólica. Siendo su contextura física asténica y su peso de 70 kg, calcular la cantidad de bebida ingerida en el momento del hecho. Sabiendo que r = 0,85 l/kg y 0 = 0,17 g/l h, en
qué período de intoxicación se encontraba y qué sector del SNC estaba afectado en el momento del hecho?. Justifique sus afirmaciones.

4 - METANOL

INTRODUCCION
El metanol es el principal componente del destilado en seco de la madera. Es uno de los disolventes más universales y encuentra aplicación, tanto en el campo industrial como en
diversos productos de uso doméstico.Dentro de los productos que lo pueden contener se encuentra el denominado “alcohol de quemar” constituido por alcoholes metílico y etílico,
solvente en barnices, tintura de zapatos, limpiavidrios, líquido anticongelante, solvente para lacas etc. Además, los combustibles sólidos envasados también contienen metanol.

Este alcohol se utiliza también para degradar soluciones de alcohol etílico, lo que ha dado lugar a numerosas intoxicaciones de carácter masivo dado el uso fraudulento de estas mezclas
en bebidas alcohólicas.

La fermentación de jugos azucarados implementada para la obtención de bebidas alcohólicas, además de etanol, produce también cantidades variables de metanol y otros compuestos
volátiles. El contenido de metanol en vino tinto es de 43 122 mg metanol/l, en vino blanco 38 118 mg/ml, en brandy 1500 mg/l, en wisky 1000 mg/l y en ron 800 mg/l.

La intoxicación por metanol ocurre entonces frecuentemente por vía digestiva en el caso de bebidas alcohólicas adulteradas con alcohol desnaturalizado o por vía respiratoria, digestiva o
a través de la piel intacta en el caso de exposición en ambientes laborales, desde donde se pueden originar intoxicaciones graves y aún mortales. El o los individuos pueden sobrevivir
dejando como secuela la ceguera irreversible pues la retina, es el sitio de manifestación de la toxicidad del metanol.

La mayor parte de los métodos usados en la determinación de metanol se basan en su oxidación a formaldehído y la posterior determinación de éste último.

Metabolismo

El alcohol metílico se absorbe por todas las vías (oral, dérmica y respiratoria), aunque la absorción por piel difícilmente pueda dar lugar a intoxicaciones agudas. Con frecuencia se plantea
el problema bajo la forma de intoxicación crónica. Su carácter irritante genera frecuentes lesiones de entrada, muy típicas en la contaminación crónica por vía respiratoria, como bronquitis
crónicas, frecuentemente con componentes asmatiformes, y alteraciones en la mucosa de las vías respiratorias altas. Esta vía de absorción es propia de los lugares de trabajo.

El metanol se distribuye rápidamente en los tejidos de acuerdo al contenido acuoso de los mismos. El volumen de distribución es de 0.6 l/Kg de peso. La mayor parte del metanol circula
en el agua plasmática.

Una vez absorbido se dirige al hígado donde sufre procesos de oxidación a una velocidad 7 veces menor comparada con las del alcohol etílico o etanol. La enzima responsable de su
transformación es la alcohol deshidrogenasa que lo oxida a formaldehído y éste a su vez es oxidado a ácido fórmico por la aldehído deshidrogenasa.

La eliminación se realiza lentamente por vía respiratoria a través de los pulmones, pudiendo permanecer en el organismo hasta 4 días después de una dosis única. Alrededor de 3 a 5%
se elimina sin metabolizar.

Intoxicación aguda

La vía más frecuente de absorción en una intoxicación aguda es la digestiva. La dosis letal varía entre 20 y 100 ml aunque algunos autores informan dosis letales de 240 ml. La muerte
por metanol va siempre precedida de ceguera. Se sabe que incluso 15 ml de metanol han causado ceguera y el responsable de ello es el formaldehído. De acuerdo a la dosis absorbida,
las formas de presentación son las siguientes:

Forman leve: sensación nauseosa, molestias epigástricas y cefaleas. Si el tiempo de absorción es de algunas horas se presenta visión borrosa

Forma moderada:se producen vómitos. Hay taquicardia y depresión del sistema nervioso central. Si se produce el cuadro de embriaguez, es poco intenso y corto en su duración. La piel
está fría y sudorosa, la visión es borrosa y hay taquipnea.
Forma grave: el paciente está en coma y presenta acidosis metabólica. La respiración es superficial y rápida. El color de la piel y las mucosas es francarnente cianótico. Las dificultades
para respirar pueden llegar al edema agudo de pulmón. La orina y el aliento huelen a formaldehído. Se presenta edema cerebral ; coma y a veces convulsiones. Las intoxicaciones graves
presentan insuficiencia renal aguda.

Intoxicación crónica

La exposición crónica al metanol, fundamentalmente por vía respiratoria, produce alteraciones mucosas en las vías respiratorias superiores y en la conjuntiva. Se favorecen
extraordinariamente los procesos alérgicos respiratorios, que mejoran en cuanto se evita el contacto con la sustancia. Si la cantidad absorbida es suficientemente alta, pueden producirse
trastornos de la visión que oscilan desde la pérdida de la agudeza visual hasta la ceguera.

Relación entre la oxidación de etanol y metanol

El metanol ocasiona menos ebriedad que el etanol y de hecho, este signo no es importante en la intoxicación por alcohol metílico, salvo que se consuma una cantidad muy grande o se
ingiera además etanol. Hay un período de latencia asintomático de 8 a 36 hs. antes de que surjan los síntomas de la intoxicación.

Si el sujeto bebió etanol simultáneamente en volúmenes suficientes, puede retrasarse en grado extraordinario y a veces, abortarse la aparición de signos y síntomas de intoxicación por
metanol. En tales casos, es notoria la intoxicación por etanol y quizás no se sospeche que el sujeto ingirió metanol.

El alcohol etílico compite con el alcohol metílico por la enzima alcohol deshidrogenasa, teniendo el primero mucha mayor afinidad por la enzima. De esta manera, el metanol se desvía de
su ruta metabólica y no se biotransforma a formaldehído y ácido fórmico, responsables de su toxicidad.

Por los motivos mencionados, se utiliza etanol (alcohol puro) diluido en agua o en alguna bebida gaseosa para administración oral o soluciones adecuadas para administración
intravenosa como tratamiento en una intoxicación con metanol. Se realiza un tratamiento alcalino (bicarbonato) para combatir la acidosis metabólica.

Anatomía patológica

Anatomopatológicamente, se observaron hemorragias cerebrales, edema del encéfalo, áreas necróticas del putamen y desmielinización del nervio óptico. En otros órganos, se observó
necrosis pancreática e infiltración grasa de hígado y riñones. En pulmón y corazón se observaron alteraciones inespecíficas.

Determinación de metanol

Muestras

En general se trabaja con sangre de pacientes intoxicados con metanol o bien con sangre cadavérica de personas fallecidas por intoxicación metanólica. El método se puede aplicar
también tanto a otros fluidos biológicos como a homogenatos de vísceras.

Sangre: no se debe usar alcohol corno antiséptico, se recomienda cloruro mercúrico al 0,5%. Usar fluoruro de sodio 1% como anticoagulante para inhibir el desarrollo microbiano dado que
al inhibir la glicólisis se evita la formación de sustancias oxidantes que podrían actuar sobre el metanol. Tampoco debe usarsr EDTA ni heparina. Transvasar a un tubo plástico, llenar
completamente el tubo y cerrar. Conservar en heladera ( 4ºC)

Orina, Líquido Cefalorraquídeo: recoger sobre fluoruro de sodio 1%. Conservar en heladera a 4ºC en recipiente similar al de la muestra de sangre.

Investigación

La mayor parte de los métodos usados en la determinación de metanol se basan en su oxidación a formaldehído y una posterior determinación de este último. Para evitar interferencias se
trabaja con destilados de las muestras.

Identificación de metanol en fluidos biológicos

Sobre 2 ml de destilado se agrega gota a gota permanganato de potasio 5% acidificado hasta color rosado (ligero exceso). Agitar y esperar diez minutos.

Decolorar con ácido oxálico al 10%. Esperar unos minutos.

Agregar 0.2 ml de ácido cromotrópico al 0.5% en solución acuosa. Luego agregar 2 ml de ácido sulfúrico concentrado por las paredes del tubo. Un anillo de separación púrpura indica
presencia de alcohol metílico. Calentar a 60ºC.

Interferencias: gliceraldehído, arabinosa, fructosa y sacarosa dan un color amarillo para la reacción. Concentraciones considerables de furfural dan lugar a la aparición de un color rojizo.

Cuantificación de metanol. Técnica del ácido cromotrópico

Técnica:

La solución tipo de metanol, se prepara tomando 0,25 ml de metanol (concentración: 0,801 g/ml) y llevando a 100 ml con agua destilada. De este modo, se obtiene una solución de 2000
/ml. Luego, mediante una dílucíón 1/10 se obtiene la solución tipo requerida de 200 /ml.

A partir de la solución tipo de metanol, se preparan soluciones patrón de metanol de las siguientes concentraciones: 200, 150, 100, 50 y 25 /ml, empleándose alrededor de 10 ml de
cada una. Se dispondrá también de 10 ml de agua destilada, la cual se utilizará como blanco.

Metanol (200 /ml) Agua destilada Dilución Concentración final

2,5 ml 7,5 ml ¼ 50 /ml

5,0 ml 5,0 ml ½ 100 /ml

7,5 ml 2,5 m ¾ 150 /ml

Reacción Colorimétrica:

Colocar 0,5 ml de destilado en un tubo de ensayo. Agregar una gota de permanganato de potasio al 5%. Dejar en reposo 10 minutos, agregar una gota de solución saturada de bisulfito de
sodio para decolorar. Luego, añadir 0.1 ml de ácido cromotrópico al 0,5%. Colocar el tubo en un baño de hielo y agregar agitando 2 ml de ácido sulfúrico concentrado. Observar los
colores y colocar el tubo en baño de agua a ebullición durante 15 minutos, enfriar y diluir con agua a un volumen de 5 ml empleando el baño de hielo.

Proceder en forma equivalente y simultánea con los patrones. Leer en el espectrofotómetro a 580 nm contra el blanco.

Expresión de los resultados: en mg/l de sangre ó en /ml de sangre.

Método del reactivo de Schiff

A 4 ml de destilados se agregan 2 ml de etanol, 2 ml de permanganato de potasio al 5% y 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Dejar 10 minutos.
Agregar luego 2 ml de ácido oxálico al 10%, dejando reposar otros 5 minutos.
Agregar 4 ml del reactivo de Schiff y mezclar. Al cabo de 1 hora medir a 510 nm.
Se realiza una curva de calibración con soluciones de concentración conocida de metanol en forma similar a lo descripto anteriormente.

Interferencias: cuerpos cetónicos arrojan resultados falsos positivos.

Interpretación de resultados: Una concentración de 80 mg/100 ml (800 gamas / ml ) es peligrosa para la vida. Conversión de unidades: 1gramo = 106 gammas.

CUESTIONARIO

1) Respecto al metanol, describa su absorción, distribución, excresión, catabolismo celular y efectos metabólicos.

2) Qué tipo de tóxico es el metanol ?

3) Cuál es la vía de absorción más frecuente ?Cómo se distribuye y metaboliza en el organismo? Cómo se elimina ?

4) Qué características clínicas conducen a la sospecha de intoxicación metanólica? Cómo los relaciona con el mecanismo de acción del metanol?

5) Qué datos de laboratorio permiten confirmar el diagnóstico? Cómo los relaciona con el mecanismo de acción del metanol ?

6) Porqué se usa corno tratamiento la etilterapia ?

7) Con respecto a los trabajos entregados, detalle claramente objetivos, metodología, resultados y conclusiones.

8) Indique la acción del folato y el disulfuram.

9) Cuando una muestra llega al laboratorio para dosar metanol: qué requisitos debe cumplir para aceptarla ? (tener en cuenta el tipo de muestra, conservación, rotulación, volumen etc. ).

10) En el presente trabajo práctico, se realiza la investigación de metanol por el método del ácido cromotrópico. Puede utilizar este mismo reactivo para dosar Etanol ? Por qué ? Cuál es
el esquema de reacción?

11) La técnica elegida por su sensibilidad y especificidad para la investigación de alcoholes es la cromatografía gaseosa. En qué consiste dicha técnica? Se suele utilizar un estándar
interno (generalmente alcohol isopropilíco ) qué función cumple?

12) La concentración máxima permisible de metanol en aire es de 260 mg/ m 3 para 8 Hs de trabajo (según ley 19.587 decreto 351 de 1979. Cómo se controla dicho nivel?

5 - MONÓXIDO DE CARBONO

Características generales de la intoxicación y mecanismo de acción.

El monóxido de carbono es un gas incoloro, inodoro, insípido y no irritante que se origina durante la combustión incompleta del carbón. Las fuentes productoras más frecuentes son
estufas, calefones, hornos, incineradores, automóviles etc en mal funcionamiento. La toxicidad del monóxido de carbono (CO) se debe a su combinación con la hemoglobina para formar
carboxihemoglobina (COHb). En dicha forma la hemoglobina no transporta oxígeno, dado que ambos gases (O2 y CO) reaccionan con el grupo hemo en la molécula tetramérica de la
hemoglobina. Sin embargo, la afinidad del monóxido de carbono por la hemoglobina es cerca de 240 veces mayor que por el oxígeno, de esta manera, la intoxicación puede ocurrir aún
cuando pequeñas cantidades de CO se encuentren presentes en la atmósfera. Cuando el paciente es removido del ambiente contaminado, la carboxihemoglobina desaparece
rápidamente, particularmente cuando el oxígeno es administrado. Solo trazas pueden ser detectadas cuando el paciente alcanza el hospital y de esta manera la medida de
carboxihemoglobina es raramente justificada en la clínica toxicológica.

CO +Hb.Fe.O2 <=======> Hb.Fe.CO + O2

La formación de oxihemoglobina (Hb.Fe.O2) como de carboxihemoglobina (Hb.Fe.CO) son reacciones reversibles y dependen principalmente de la presión parcial de los gases y del pH
sanguíneo aunque otros factores como la temperatura y la concentración iónica tienen también incidencia.
La toxicidad del monóxido de carbono se manifiesta no sólo de la interferencia en el aporte de oxígeno por la sangre sino también ejerce efecto directo al unirse a los citocromos celulares
como los presentes en las enzinas respiratorias y la mioglobina.

Consideraciones generales en la analítica toxicológica

El aspecto del cadáver y el color carminado de las vísceras constituyen manifestaciones propias de la intoxicación oxicarbonada aguda. Dicho color resulta visible en los órganos como
cerebro, corazón, pulmones y musculatura voluntaria. En los casos en que el sujeto está vivo, la sangre deberá extraerse, a lo sumo hasta dos horas después de la exposición, puesto que
gran parte del monóxido resulta eliminado por vía pulmonar. Para casos mortales, la muestra de sangre deberá extraerse lo más rápido posible antes que se inicien los procesos
putrefactivos. Se ha demostrado que el monóxido de carbono no se absorbe post-mortem constituyendo su determinación un índice del contenido en el momento de la muerte. La
carboxihemoglobina es un derivado muy estable y su presencia en sangre puede demostrarse después de la descomposición cadavérica así como en cadáveres sometidos a altas
temperaturas. El color carminado típico de la carboxihemoglobina se observa en muestras de sangre cuando el porcentaje de saturación es del 30% o superior, distinguiéndose fácilmente
de la oxihemoglobina o de la hemoglobina misma.

Toma de muestra

La recolección de la muestra de sangre debe ser obtenida por punción venosa con anticoagulante (heparina) evitando la formación de burbujas o la entrada de aire a la jeringa. Se
recomienda obtener sangre del corazón o de las venas gruesas como la femoral. El recipiente a utilizar para la conservación de la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y
cerrado en forma hermética.

Determinación analítica de carboxihemoglobina.

La determinación cuantitativa de la carboxihemoglogina en sangre puede realizarse por métodos espectroscópicos que se basan en los diferentes espectros de absorción que presentan
la carboxihemoglobina respecto de la hemoglobina. En todos ellos se realizan medidas de absorción a distintas longitudes de onda de diluciones adecuadas de la sangre en estudio. Estas
longitudes de onda corresponden a los máximos, mínimos o puntos isosbésticos de absorción de cada una de las especies de hemoglobinaque coexisten en la muestra.
Otra propiedad que es aprovechada por estos métodos es la gran estabilidad que presenta la carboxihemoglobina respecto de la oxihemoglobina frente a reactivos reductores o
metahemoglobinizantes. A ojo desnudo, la sangre con alto contenido de carboxihemoglobina presenta un marcado tono carmín, mientras que la sangre con alto contenido de
metahemoglobina es chocolate.
Algunos métodos además implican la medida de la absorción de la muestra a longitudes de onda que corresponden a puntos isosbésticos de los espectros correspondientes a los efectos
de realizar correcciones a las relaciones encontradas para los máximos de absorción.
Se describen a continuación ensayos de tipo cualitativos que presentan carácter práctico para su identificación.

a)Ensayo de dilución
El ensayo de dilución consiste en preparar soluciones sanguíneas al 1% de muestra a analizar y de sangre normal. Se observa simultáneamente ambos tubos de ensayo con luz natural
difusa. La sangre normal presenta color rojo amarillento, mientras la muestra, si contiene carboxihemoglobina, presenta color carminado neto. Este ensayo es seguro y práctico. Este
ensayo es estable con concentraciones de hemoglobina superiores al 20%

b) Ensayo alcalino
Se basa en la mayor estabilidad de la carboxihemoglobina con respecto a la hemoglobina en similares condiciones alcalinas.
En un tubo de ensayo colocar 3 a 4 gotas de la sangre a analizar y en otro tubo similar colocar igual número de gotas de sangre normal, agregar 15 ml de agua destilada y mezclar bien.
Agregar a cada tubo 5 gotas de solución de hidróxido de sodio al 10% y mezclar bien. La sangre normal adquiere color castaño a castaño verdoso (hematina alcalina), mientras que la
sangre oxicarbonada permanece inalterada (color carminado durante cierto tiempo). El ensayo ofrece un neto contraste y resulta positivo cuando la concentración de carboxihemoglobina
es superior al 10%. La sangre fetal interfiere en este ensayo dado que última produce una transformación retardada frente al hidróxido de sodio.
A continuación se describen diferentes métodos para la identificación y cuantificación de carboxihemoglobina en sangre: examen espectroscópico, espectrofotométrico, cromatografía
gaseosa e infra rojo.
Identificación de carboxihemoglobina por el método espectroscópico

El examen espectroscópico se basa en la absorción selectiva que, a determinadas longitudes de onda del espectro visible, presentan la hemoglobina y sus derivados en diluciones
convenientes.
Las soluciones de oxihemoglobina al 1-2% observadas al espectroscopio presentan características identificativas de aplicación práctica que, en la zona visible se destacan entre las rayas
D y E del espectro. La carboxihemoglobina, en similar dilución presenta un espectro de absorción muy similar aunque desplazado en su posición con respecto a la oxihemoglobina.
La dilución de oxihemoglobina presenta dos bandas de absorción, cuyas posiciones son: banda (izquierda): 586-566 nm, banda ß (derecha): 550-528 nm.
Las bandas de la carboxihemoglobina presentan los siguientes límites: banda : 580-560 nm, banda ß: 546-526 nm.
En los espectroscopios de bajo poder resolutivo esa diferencia es poco neta por lo que es necesario fijar la diferencia. Ello se hace volatilizando NaCl utilizando un mechero colocado
frente a la abertura del colimador entre ésta y la solución sanguínea testigo. Al agregar ditionito de sodio (S2O4 =) la HbO2 es reducida, desapareciendo las bandas y ß y se forma una
banda ancha (Banda de Stokes) entre los 590 nm 540 nm más débil, mientras que la carboxihemoglobina no se modifica frente al tratamiento con el reductor.

FeHbO2 + S2O4= HbFe + 2 SO3=

Para la identificación de HBCO se fija la raya D del espectro de emisión de Na con un punto arbitrario de la escala. Luego, se prepara una solución al 1% de sangre oxigenada y se
observa el espectro. Luego, se prepara una solución al 1% de sangre con HbCO y se observa el espectro. Se realizan mezclas de HbO2 y HbCO y se determina la mínima [COHb]. Se
reduce la HbO2 con S2O4= y se observa el espectro. A continuación se coloca igual dilución de la sangre en estudio. Si se observan las mismas posiciones relativas de las bandas en los
espectros, la sangre en examen no contiene carboxihemoglobina o su presencia está por debajo del índice de detección. En cambio, de contener carboxihemoglobina se observará un
desplazamiento de ambas bandas hacia la región violeta del espectro. Al agregar el ditionito de sodio, la sangre normal presenta la banda de Stockes que cubre el espectro. La sangre
carboxigenada no modifica las bandas originales. En los casos de elevado contenido de carboxihemoglobina como ocurre en los casos mortales, la diferenciación con el pigmento normal
mediante el tratamiento reductor no ofrece inconveniente alguno, pero en los casos en que el sujeto intoxicado ha sido retirado del ambiente contaminado y sometido a tratamiento con
oxígeno, la sangre puede acusar un menor tenor en carboxihemoglobina.
Al tratar la dilución sanguínea con el ditionito, la oxihemoglobina prevalece, se reduce y la banda de Stokes cubre el espacio libre existente entre las dos bandas de la carboxihemoglobina
que no resulta alterada por adición del reductor. La Fig. 1 presenta los espectros de absorción oxihemoglobina, hemoglobina reducida y carboxihemoglobina. La carboxihemoglobina
deberá identificarse por otros procedimientos (microdifusión, extracción etc.).
En general se considera la sensibilidad de este método equivale a 3.2 ml de monóxido de carbono por 100 ml de sangre total. Entre las causas de error se encuentra la sangre alterada
que pueda contener hematina alcalina la que al reducirse se transforma en hemocromógeno y su espectro puede confundirse con el de la carboxihemoglobina.

Fig. 1: Espectros de absorción de a) oxihemoglobina, b) hemoglobina reducida y c) carboxihemoglobina

Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina
Método espectrofotométrico

Algunos métodos espectrofotométricos emplean el sistema oxihemoglobina- carboxihemoglobina. El siguiente método se basa en el hecho que la sangre normal contiene varias formas de
hemoglobina (la forma reducida, la forma oxidada, y pequeña cantidades de metahemoglobina), y si un agente reductor como el ditionito de sodio es agregado a la sangre, la forma
oxigenada y la metahemoglobina son cuantitativamente convertidas a la forma reducida la cual presenta un espectro como se presenta en la Fig. 2.
El monóxido de carbono presenta mayor afinidad por la hemoglobina que el oxígeno mientras que la carboxihemoglobina no es reducida por el ditionito de sodio. Así, la
carboxihemoglobina permanece sin modificarse como se muestra en la curva A del espectro en la Fig. aún cuando se ha realizado un tratamiento con ditionito de sodio.
En la Fig. 2 se observa que la máxima diferencia de absorbancia para los espectros de carboxihemoglobina (A) y hemoglobina reducida (B) se presenta a 540 nm, mientras que 579 nm
presenta la misma absorbancia (punto isosbéstico). El porcentaje de saturación de monóxido de carbono en una muestra de sangre puede calcularse de la medida de la absorbancia a
esa longitud de onda de la muestra saturada con monóxido de carbono (A), la muestra libre de monóxido de carbono (B) y la muestra sin tratar (C) luego de la reducción con ditionito de
sodio.

Fig. 2: Espectros de absorción de (A) carboxihemoglobina, (B) hemoglobina reducida y (C) y muestra de sangre de paciente intoxicado con monóxido de carbono.

El método de Amenta (1963) y luego modificado por Heilmeyer trata la sangre con amoníaco diluido y determina la absorbancia a 575 nm, 560 nm y 498 nm. La relación obtenida es
comparada con las soluciones patrones de oxihemoglobina y de carboxihemoglobina calculándose así el porcentaje de carboxihemoglobina

R= (A 575 - A 560) A 496

A 498 nm es el punto isosbéstico, los pequeños errores en el ajuste de la longitud de onda no afecta mayoritariamente las lecturas de absorbancia. Las longitudes de onda de 560 y 575
representan aproximadamente los puntos mínimos y máximos de la gráfica del espectro de absorción de la oxihemoglobina los que pueden ajustarse en las escalas de la mayoría de los
espectrofotómetros.

El método propuesto por Curry, mide la absorción de diluciones similares de muestra a 514 nm (máximo para HbO 2)), 560 nm (mínimo para HbO2) y 576 nm (máximo para HbO2). El
porcentaje de saturación de la muestra se obtiene a partir de los coeficientes A 576/A 560 y A 541/A 580 .

El método de Commins se separa la muestra en dos alícuotas, un de las cuales es tratada con un exceso de oxígeno para obtener un 100% de HbO2. Luego se mide la absorbancia a 420
nm para ambas muestras que corresponde a un punto de máxima diferencia entre los espectros de HbO 2 y HbCO y se compara luego con una curva patrón preparada con
concentraciones conocidas de HbCO.

El método de Sanderson se basa en la existencia de un punto isosbéstico para los espectros de la mHb y la HbCO en los 579nm. De esta manera, luego de diluir la sangre y tratarla con
un adecuado reductor, se calcula la pendiente del espectro de la muestra problema alrededor de este punto por medidas a 575nm y 585nm.

El método propuesto por Panell (1981) corresponde a una modificación de Commins y no presenta el inconveniente de tener que trabajar con sangre fresca, pudiendo utilizarse entonces
para muestras forenses existe un alto nivel de mHb y otros derivados modificados de la Hb que interfieren en los métodos anteriores. Utiliza como agente reductor el ditionito de sodio. En
este método se realizan medidas respecto a la sangre oxigenada a 435nm, 421nm, 570nm y 620nm aplicándose la siguiente relación para la obtención del porcentaje de saturación de
HbCO:

(A 435 + A 421)
%HbCO=100-F
(A 570 - A 620)

El valor de F se determina experimentalmente por mediciones realizadas sobre sangre saturada con oxígeno, es decir, con 0% de HbCO.

Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina mediante separación física de la carboxihemoglobina de otras hemoglobinas

El método se basa en la alta resistencia relativa de HbCO al calor mientras que las otras formas de hemoglobina sufren coagulación. Esta técnica es simple de realizar y permite ser
aplicada con resultados reproducibles si se mantienen estrictamente las condiciones indicadas: calentamiento a 55 ± 0.5ºC durante 5 minutos y pH 5.05 ± 0.05.

Reactivos

1. Buffer acetato. Mezclar 1 volumen de solución 1 (300 g de ácido acético glacial en 1 litro de agua destilada) mas 3 volúmenes de solución 2 (408 g de acetato de sodio
CH3COONa.3H2O disuelto en 1 litro de agua). El pH no debe variar de 5.05 ± 0.05.
2. Antiespumante. Mezclar el antiespumante con agua al 1% y se agita vigorosamente con algunas perlas de vidrio.

Equipos
Baño termostático de agua a 55 ± 0.05ºC
Centrífuga a 5000 rpm. Capacidad 4 o más tubos de 10-15 ml.
Especrofotómetro UV visible

Procedimiento

5 ml de sangre a analizar previamente homogenizada cuidadosamente se mezclan con 15 de agua destilada y 1 ml de antiespumante por inversión. La mitad de esta solución es separada
en un tubo, rotulada y guardada en oscuridad. La otra mitad es saturada con CO durante 30 minutos asegurándose que el volumen de la solución sanguínea no cambie. Para cada una de
las soluciones (la sin tratar y la tratada con CO) dos alícuotas de 1.0 ml son ubicadas en 4 tubos de centrífuga conteniendo 4.0 ml de buffer acetato. Después de mezclar por inmersión
dos veces cada tubo, los tubos se ubican en un baño termostático de agua a 55.0 ± 0.5ºC exactamente por 5 minutos. Luego los tubos se enfrían en agua fría durante otros 5 minutos y
centrifugados a 5000 rpm durante 5 minutos. Dos ml de cada uno de los cuatro sobrenadantes se diluyen con 10.0 ml de agua destilada y se mezclan 2 o 3 veces por inmersión en el
tubo.Para la lectura se requieren tres cubetas: cubeta 1 (blanco) es llenada con agua destilada, cubeta 2 es llenada con la solución de sangre sin tratar y cubeta 3 con solución de sangre
saturada con CO. La absorbancia de las dos soluciones se leen contra agua a 570 mn y 630 nm. Luego de la lectura, la cubeta 2 es vaciada y llenada con el duplicado de la solución de
sangre sin tratar. La cubeta 3 también luego de la lectura es vaciada y llenada con el duplicado de la solución de sangre saturada con CO. De esta manera no se requiere enjuague. Se
repite la lectura a 570 y 630 nm.

Los cálculos se realizan mediante la siguiente relación

(A 570 / A 630)A solucion sin tratar

%COHb= 100
(A 570 - A 630) solucion con CO

Los valores duplicados no deben variar mas de 2 a 3 % de saturación de COHb. Con valores de saturación de COHb menores a 20% dos tipos de dificultades pueden presentarse:
primero, la lectura en el espectrofotómetro de muestra sin tratar es baja e incierta. Segundo, la coprecipitación de COHb con el precipitado de los derivados de hemoglobina puede ser un
factor importante que tiende a disminuir la cantidad residual de COHb en el sobrenadante. El método arroja resultados reproducibles cuando la saturación de COHb es superior al 20%.
Asimismo, el método es moderadamente sensible a los cambios que ocurren en la sangre luego del proceso postmortem.

CROMATOGRAFÍA GASEOSA

La cromatografía gaseosa se considera una metodología universal para la determinación de compuestos con una presión de vapor lo suficientemente alta, por lo que en general se
consideraría adecuada para tóxicos volátiles y gaseosos. Aún esto, la determinación de mon6xído de carbono por CG presenta diversos inconvenientes que es necesario tomar en cuenta
en el momento de optar o no por la utilización de esta metodología.
Por un lado la elevada presión de vapor del monóxido de carbono requiere de columnas y/o de programas que sean capaces de separar al analíto de los gases utilizados como carrier,
helio o nitrógeno generalmente y de otros gases que pudiesen coexistir con el CO como el C02. Este inconveniente se subsana utilizando columnas capilares y programas de corrida
cromatográfica que trabajan comenzando a temperaturas subambiente, típicamente a -20"C. Los equipos requeridos para estas condiciones cromatográficas son muy poco frecuentes en
laboratorios de toxicología.
Por otro lado, la detección de la señal de monóxido de carbono a la salida de la columna CG se realiza mediante dos metodologías posibles. Una forma es la utilización de una post
columna con un catalizador y condiciones de hidrogenación adecuadas para transformar al monóxido de carbono cuantitativamente en metano, luego de los cual este es medido por un
detector común iónico de llama (FID). La otra forma es la utilización de un detector de conductividad térmica. Ni el detector de conductividad térmica, ni el catalizador post columna son
elementos comunes en un laboratorio dedicado a la toxicología.
Finalmente, se ha reportado que la cromatografía gaseosa de monóxido de carbono tiene una adecuada respuesta señal / concentración sólo para niveles de monóxido por encima del
20% en sangre, de manera que no respondería bien para medidas en individuos con intoxicaciones subclínicas o para comparar individuos con niveles normales de CO en sangre.

Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina por el método de Espectrofotometría infrarroja

En la determinación de monóxido de carbono en sangre y aire espirado, la espectrofotometría infrarroja confiere adecuada especificidad, condición que no presentan otros recursos
analíticos depurados tales como cromatografía gaseosa. El procedimiento comienza con una extracción de los gases totales físicamente disueltos o combinados con la hemoglobina.
El monóxido de carbono presenta al infrarrojo dos picos de absorción a 2120 y 2170 cm-1 (4.6-4.7 m) y no presenta otra absorción en el ámbito comprendido entre 700-4000 cm-1. Los
gases que absorben en esta región del espectro y que por lo tanto interfieren, son el diazometano, cloruro de nitrosilo y propano que muy difícilmente pueden hallarse en muestras de
sangre. El dióxido de carbono puede mostrar interferencias cuantitativas por su elevada concentración relativa aún si su absorción máxima difiere de la del monóxido de carbono. Estas
interferencias quedan excluidas con la adopción de sistemas de compensación o filtros adecuados.
Los equipos permiten determinar monóxido de carbono en un rango de 0 a 1000 ppm. En el análisis de sangre, la espectrofotometría infrarroja utiliza un volumen total determinado de 1 a
5 ml. El mismo se trata con ferrricianuro ácido y los gases liberados se analizan en el espectrofotómetro infrarojo.
Para establecer el porcentaje de saturación o el coeficiente intoxicación debe saturarse otra fracción de la muestra con monóxido de carbono y analizarse en la misma forma, efectuando
la pertinente corrección por el monóxido de carbono físicamente disuelto. Con adecuadas modificaciones, la espectrofotometría infrarroja posibilita el registro continuo de monóxido de
carbono en aire (detectores o registradores continuos).
Por otra parte, los ensayos en aire espirado permitieron revelar su presencia en forma inmediata así como después de 30 minutos de haber fumado un cigarrillo.

Determinación de monoxido de carbono en sangre por métodos químicos

Los métodos químicos emplean la cualidad del monóxido de carbono de reducir diversas sales metálicas oxidantes. Uno de los elementos metálicos de mayor aceptación lo constituye el
paladio II. La propiedad reductora del monóxido de carbono se traduce en la siguiente forma:

Pd+2 + CO + H2O Pdº + CO2 + 2H+

Este principio se emplea de diversas formas, una de ellas es el método de Gettler y Freimuth y otra variante es el de microdifusión

Método de Gettler y Freimuth

El monóxido de carbono liberado de la carboxihemoglobina por el ferrocianuro de potasio es arrastrado por aireación y pasado a través de un disco de papel sensibilizado con ClPd2. El
CO produce una mancha oscura sobre el papel de filtro debido a la reacción de del paladio que se reduce a Pdº. Por comparación de la intensidad de la mancha con muestras patrones,
se puede obtener una concentración aproximada a la cantidad de CO presente en la muestra.

Técnica

Reactivos
Solución de cloruro de paladio (0.5g de cloruro de paladio, 0.5 ml de clorhídrico concentrado se llevan a 50 ml con agua destilada.
Solución ferricianuro de potasio-saponina: Ferricianuro de potasio 32 g, saponina 0.8 g agua bidestilada 100 ml.
Solución de ácido láctico (D:1.20) y llevar a 100 ml
Solución de acetato de plomo al 10%
Alcohol caprílico
Solución de cloruro cuproso amoniacal
Equipos

Fig. 3: Dispositivo empleado en la determinación de monóxido de carbono en sangre

Tres tubos de vidrio grueso con borde de 13 a 15 cm de largo y 2 cm diámetro.

Flange (dos discos de vidrio enfrentados para retención de papel de filtro)
Frasco de Mariotte
Pinzas de Hoffman
Perlas de vidrio

Procedimiento

El dispositivo se presenta en la Figura 3. El tubo A contiene 5 ml de solución de cloruro cuproso amoniacal para retener monóxido de carbono del aire e interferencias del medio del
laboratorio. El tubo B contiene 2.0 ml de sangre y se añaden 4 ml de ferricianuro-saponina y 2 ml de solución de ácido láctico junto con 2 gotas de alcohol caprílico. El tubo C contiene
perlas de vidrio en cantidad que alcancen 4 cm de altura y 5 ml de acetato de plomo. Entre los discos del flange se coloca un disco de papel de filtro Whatman Nº 3 cortado en forma
circular humectado con la solución de cloruro de paladio y sujetado en forma segura mediante dos gomitas para lograr el cierre hermético. Se hace burbujear aire a través del dispositivo
aflojando la llave del frasco de Mariotte. La velocidad de escurrimiento debe ser de 26 ml/minuto. Después de 15 minutos, se detiene el burbujeo y se retira el papel reactivo, se lava con
agua destilada para eliminar el exceso de solución de cloruro de paladio y la mancha obtenida. Finalmente se compara con la escala tipo obteniéndose el grado de saturación de la sangre
con respecto al monóxido de carbono.
La preparación de la escala se realiza saturando 10 ml de sangre oxalatada con un contenido de hemoglobina de 80%-90% con monóxido de carbono puro, el cual se obtiene por
descomposición del formiato de sodio por acción del ácido sulfúrico concentrado. Se hace burbujear el gas en la muestra de sangre durante 15 minutos. Mezclando volúmenes iguales de
la muestra saturada con sangre normal, se obtiene un grado de saturación equivalente al 50%, el cual se utiliza para la preparación de la escala mezclando diferentes volúmenes de
sangre normal y sangre saturada con monóxido de carbono (Tabla 1). Cada muestra diluida en la forma expresada se somete al procedimiento señalado a fin de obtener las manchas
testigo. La preparación de manchas para grados de saturación mayores al 50% no es necesaria en la práctica debido a que nunca se alcanzan valores superiores al 50% de saturación.
Dado que la capacidad de saturación de la sangre para el monóxido de carbono reside en el contenido de hemoglobina debe aplicarse el factor de corrección correspondiente para cada
caso.

Tabla 1: Preparación de la escala de saturación de monóxido de carbono

Volumen de sangre
Volumen de sangre normal (ml) Porcentaje de saturacion obtenido
con 50% saturacion CO (ml)
4 1 40%
3 2 30%
2 3 20%
1 4 10%
1 5 5%

CUESTIONARIO

1) Cual es el mecanismo de acción del monóxido de carbono

2) Describa la etiología de las intoxicaciones

3) Como procede para la toma de muestra y como realiza la determinación analítica correspondiente.

4) Que tipo de interferencias presentan los métodos descriptos.

6 - ACIDO CIANHIDRICO Y CIANUROS ALCALINOS

Identificacion y dosaje de acido cianhidrico en medios biologicos

El ácido cianhídrico (HCN) es un líquido volátil, incoloro de olor característico a almendras amargas que presenta gran difusibilidad debido su elevada tensión de vapor. Las sales de
cianuro (sodio o potasio) son de interés toxicológico. El cianuro de sodio es más tóxico que el de potasio porque desprende mas HCN por gramo de compuesto.
El mecanismo de acción tóxica lo ejerce inhibiendo la citocromooxidasa bloqueando de este modo la respiración celular generando hipoxia o anoxia citotóxica. También inhibe proteínas
que posean hierro en su máximo estado de oxidación (+3) como es la metahemoglobina.
La sintomatología puede ser de tipo superaguda con pérdida inmediata del conocimiento, convulsiones, rigidez muscular, la muerte ocurre en pocos minutos. La intoxicación aguda
presenta tres períodos. En el primero se presenta ardor y anestesia en la boca estómago, luego vértigos y zumbidos. En el segundo período se manifiesta pérdida del conocimiento con
convulsiones, contractura espasmódica de maxilares, pulso irregular, cianosis. En el tercer período se presenta relajación muscular y muerte por parálisis del centro respiratorio bulbar y
paro cardíaco.
. La etiología de la intoxicación con ácido cianhídrico (HCN) descripta es muy variada. Las principales fuentes de compuestos cianurados son ciertas industrias en las cuales el HCN
presenta aplicaciones comerciales como son la galvanoplastia, extracción de metales preciosos (oro y plata), producción de gomas sintéticas como resinas acrílicas, poliuretano,
manufactura de plásticos, así como el empleo de HCN para desinfección como insecticida y raticida.
Otra fuente de compuestos cianurados son los alimentos, como algunos productos vegetales que contienen glucósidos cianogenéti cos que por hidrólisis (ácida, alcalina o enzimática) dan
origen al HCN. Entre estos se encuentran especies de porotos, semillas de lino, sorgo, almendras amargas, mandioca, habas, así como en semillas de manzanas y peras y en bebidas
fermentadas como el “Kirsh”, aguardiente de cerezas fermentadas.
También se ha descripto otra fuente de compuestos cianurados en el uso farmacológico como los antitusígenos como agua de laurel cerezo de uso en el pasado.
Se lo ha empleado en ejecuciones en la llamadas cámara de gas y se han registrado muchos casos de intoxicaciones voluntarias y homicidas.

1. Consideraciones generales de la analítica toxicológica

La investigación de ácido cianhídrico puede realizarse con diferentes tipos de muestra: vísceras (que necesitarán de una previa disgregación), líquidos biológicos, sangre u orina,
alimentos (productos vegetales o animales) y medicamentos.
La sangre venosa presenta un color rojo vivo característico. En cadáveres frescos se observa color rojo cereza así como manchas de color rojo mas o menos intenso. Junto al olor típico a
almendras amargas que desprenden los órganos se observan numerosas hemorragias pequeñas en las serosas.
El recipiente que contiene la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y cerrado herméticamente para evitar pérdidas. Si el material es visceral, no debe conservarse en formol
porque reacciona con el ácido cianhídrico formando cianhidrinas de las que no se puede liberar CNH. Las muestras deben conservarse en frío para evitar la acción enzimática y
bacteriana sin agregado de conservantes.
Existen tres tipos de determinaciones del ácido cianhídrico: los ensayos inmediatos o preliminares, los ensayos mediatos y los ensayos cuantitativos.

2. ENSAYOS CUALITATIVOS O INMEDIATOS

La identificación directa del HCN en el recipiente que contiene el material es posible gracias a su elevada presión de vapor a temperatura ambiente y procesos hidrolíticos que ocurren con
cierta rapidez por las condiciones del medio, pH, temperatura, etc.
En la atmósfera del recipiente se libera CNH que puede deberse a dos tipos de procesos: hidrolíticos y putrefactivos
Hidrolíticos

CN- + H2O CNH + OH-

El equilibrio se desplaza hacia la derecha.

En vísceras en estado putrefactivo se libera CNH de acuerdo con

CN- + CO2 + H2O CNH + CO3H-

Los ensayos inmediatos son técnicas que se realizan en la atmósfera del recipiente que contiene la muestra mediante el empleo de los llamados papeles sensibles. Se utilizan papeles
impregnados en diferentes reactivos:

2. 1. Utilización de papel de guayaco:

El ensayo se fundamenta en el aumento del potencial de oxidación de las sales cúpricas al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas. El ensayo es identificativo dado que al
sistema Cu(II)-cianuro se acopla un compuesto reductor (resina de guayaco) que por oxidación origina un derivado coloreado (de color castaño vira al azul).

Tecnica

Reactivos

Solución acuosa de sulfato de cobre al 0.2%

Solución alcohólica de resina de guayaco al 10% recién preparada.

Procedimiento

En el momento de su uso, se embebe una franja de papel de filtro en una solución de SO 4Cu al 0.2 % dejando escurrir el exceso. Luego se embebe en una solución alcohólica de resina
de guayaco al 10% de reciente preparación. El reactivo del papel de guayaco puesto en la boca del recipiente que contiene el material a analizar y el O2 producido en la reacción forman
un compuesto de color azul en forma inmediata.

8HCN + 8 SO4Cu + 4 H2O 2 (CN Cu)2(CN Cu)2 + 8 SO4H2 + 2 O2

Un ensayo negativo permite descartar la presencia de HCN dada su sensibilidad. Un ensayo positivo no entrega mayores datos y requiere confirmación con ensayos específicos. El
ensayo presenta interferencias de tipo oxidantes directos de la resina de guayaco y reductores que actúan de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre.
Es un ensayo clásico, sensible pero inespecífico. Algunos autores indican que puede reconcerse hasta 0.25 µg de ácido cianhídrico.

2.2. Ensayo con O-toluidina:

Presenta igual fundamento que la reacción anterior pero la visualización se realiza con O-toluidina. También se puede usar bencidina, fenoftaleína o cualquier sustancia que al oxidarse
forme un complejo coloreado. Esta reacción es altamente sensible pero inespecífica.

Técnica

Reactivos

Solución acuosa de sulfato de cobre al 0.2%

Solución alcohólica de O-toluidina al 1%.

Procedimiento
El ensayo es similar al anterior. En presencia de ácido cianhídrico se observa en forma inmediata color azul verdoso que rápidamente vira al azul neto. Presenta mayor sensibilidad que el
ensayo guayaco-cúprico.

2.3. Ensayo de Grignard:

El ensayo se fundamenta en que el ácido pícrico en presencia del HCN, liberado de la muestra ácida, forma isopurpurato alcalino, de color rojo al rojo naranja en el transcurso de cinco
minutos.

Técnica

Reactivos

Solución acuosa de ácido pícrico 1% caliente que antes del enfriamiento se agregan 10 gr de CO 3Na2.

Procedimiento

Embeber tiras de papel filtro con solución acuosa de ácido pícrico y escurrir el exceso. Si el papel se prepara en el momento, el ensayo presenta su máxima sensibilidad. El reactivo dura
indefinidamente. El papel es puesto en la boca del recipiente que contiene la muestra a analizar. Un color rojo naranja indica resultado positivo.

2. 4. Ensayo de Magnin:

Se basa en la formación de azul de Prusia.

HCN + OH- CN- + H2O

Luego

6CN- + Fe+2 [Fe(CN)6] -4

Fe+2 + 2OH- Fe(OH)2 precipitado verde

2Fe(OH)2 + 1/2O2 + H2O 2Fe(OH)3

en medio HCL

Fe(OH)3 + [Fe(CN)6] -4 + 3H + + Na+ Fe(CN)6FeNa + 3H2O

azul de prusia

Técnica

Reactivos

Solución acuosa de hidróxido de sodio al 2%

Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% recientemente preparada.

Procedimiento

Se impregna una tira de papel con hidróxido de sodio al 2% y se expone en el interior del recipiente unos minutos. Se retira y se extiende sobre una cápsula de porcelana. Se distribuyen
sobre la superficie expuesta 4 gotas de solución de sulfato ferroso 2%. Se observa un precipitado verdoso que luego pasa a castaño (hidróxido férrico). Finalmente por agregado de unas
gotas de ácido clorhídrico concentrado se observa color azul por formación azul de Prusia. Es una reacción poco sensible pero muy específica
Siempre se efectúan por lo menos dos reacciones: una muy sensible y otra muy específica. Si las dos reacciones arrojan resultados positivos se realiza el aislamiento.

3. ENSAYOS MEDIATOS

3.1. Aislamiento e identificación del ácido cianhídrico de cianuros alcalinos.

Aislamiento

Cuando se sospecha la presencia de ácido cianhídrico mediante los ensayos antes especificados, se procede al aislamiento y posterior identificación. Para la realización de los ensayos
mediatos, se requiere de una separación previa del CNH de la muestra. Son adecuadas una destilación simple o una microdifusión.
En la destilación simple se agrega al material ácido tartárico. El destilado se recoge en hidróxido de sodio para evitar pérdidas del ácido cianhídrico liberado. En el caso de muestras en
estado de putrefacción se debe agregar al material a destilar acetato básico de plomo para retener el ácido sulfhídrico.

Técnica

Reactivos
Acido tartárico al 10%
Hidróxido de sodio al 10%

Equipos

Aparato de destilación

Procedimiento

Colocar 10 g. del material biológico en un matraz de destilación y cubrir con agua (aproximadamente 60 ml). Agregar 10 ml de ácido tartárico al 10% y destilar recogiendo sobre 5ml de
NaOH 10%. Se calienta al principio suavemente para evitar la formación de espuma y una vez alcanzado el punto de ebullición se eleva lentamente la temperatura. Es importante que la
extremidad del tubo de desprendimiento conectado al extremo del refrigerante tome contacto con la solución alcalina. Suspender la destilación cuando hayan pasado alrededor de 1/3 del
volumen inicial. Medir el volumen destilado.

3.2. Técnica del azul de Prusia modificada o técnica de Chellen-Klassen

El ensayo se fundamenta en la formación de un precipitado azul por formación de azul de Prusia (ferricianuro férrico) a partir del destilado, efectuando un ajuste previo del pH a un valor
de 8 para favorecer la precipitación.

Técnica

Reactivos

Solución alcohólica de fenoftaleína al 1%

Acido sulfúrico 0.1N
Solución acuosa de carbonato de calcio al 10%
Solución de sulfato ferroso al 1% recientemente preparada.
Acido clorhídrico concentrado
Solución acuosa de hidróxido de bario al 10%

Procedimiento

A 1ml de destilado se le agrega 2 gotas de solución de fenolftaleína (medio básico rosada), y luego lentamente solución diluida de ácido sulfúrico hasta vivar el indicador a incolora . Luego
se lleva a pH alcalino con solución de carbonato de calcio al 20% gota a gota hasta viraje al rojo. Agregar 3 gotas de solución de sulfato ferroso al 2% y dejar reposar 3 minutos. Acidificar
con clorhídrico concentrado. Color azul indica HCN. Si aparece color verde suave agregar gotas de ácido fosfórico. Si aún no se observa color azul, se puede aumentar la sensibilidad de
la reacción y agregar gotas de solución de cloruro de bario al 10% y dejar reposar unas horas. Si se observan puntos azules sobre fondo blanco, indica presencia de HCN.
Las reacciones correspondientes son las siguientes:

2 CNK + Fe(OH)2 Fe(CN)2 + KOH

Fe(CN)2 + CNK [Fe(CN)6K]4

Se agrega HCl y se agita:

[Fe(CN)6]K4 + Fe(OH)3 [Fe(CN)6]FeK + H2O

[Fe(CN)6]FeK + FeCl3 [Fe(CN6]3Fe4 (Azul de Prusia ) + KCl

Se intensifica con H3PO4 o Cl2Ba, pues forman sales insolubles de SO4Ba que sedimentan arrastrando el Azul de Prusia al fondo del tubo, donde se observará un botón blanco azulado.
La sensibilidad de la reacción es de hasta 10 µg de ión cianuro. Con el agregado de cloruro de bario se puede revelar hasta 5 µg de ión cianuro.

3.3. Reacción sulfociánica o de Von Liebig.

El método consiste en el agregado de un exceso de polisulfuro al destilado y posterior calentamiento para formar sulfocianuro. Luego se acidifica la solución formándose ácido
sulfocianhídrico que con cloruro férrico aparece color rojo.

Técnica

Reactivos

Solución de sulfuro de amonio amarillo (polisulfuro)

Acido clorhídrico concentrado
Solución rojo Congo
Solución acuosa de cloruro férrico al 0.5%
Eter etílico

Procedimiento

Unos 5 ml de destilado se colocan en una cápsula de porcelana y se agregan unas gotas de polisulfuro de amonio (amarillo). Se procede calentando suavemente durante 5 minutos sobre
tela metálica, agitando el líquido con varilla y agregando sulfurente a medida que la solución se decolora. Cuando el contenido se haya concentrado (1 ml) y se observe persistencia de
color amarillo se considera prácticamente realizada la transferencia en sulfocianuro. Se deja enfriar y se acidifica con solución concentrada de HCl hasta reacción ácida frente al rojo
congo. El compuesto puede aislarse por tratamiento con éter etílico realizando tres extracciones con 20, 10 y 10 ml de éter cada una. Los extractos etéreos se evaporan en cápsula de
porcelana y dejar evaporar el eter a temperatura ambiente. Luego se trata el residuo con 2 o 3 gotas de cloruro férrico al 0.5% y aparece color rojo intenso de intensidad variable (50 µg de
HCN transformado en SCN- el color aparece rápidamente)

CN - + (S)m-2 SCN - + (S)n-1-2

2SCN- + Fe+3 [Fe(SCN)2]+ (complejo color rojo)

El ensayo es altamente sensible y específico. Algunos autores estiman que es posible revelar ión cianuro en la proporción de 100 µg/L.

4. ENSAYOS CUANTITATIVOS

Los ensayos cuantitativos permiten valorar la cantidad del tóxico

4.1. Método de Denigés

Constituye una valoración en donde se forma una sal estable de AgCN y el exceso de Ag+ en el punto final forma un compuesto de color amarillo con el ión ioduro de acuerdo con las
siguientes reacciones

CN- + AgNO3 AgCN +NO3 -

AgCN + CN- [Ag(CN)2]- (Complejo Soluble)

[Ag(CN)2]- + Ag+ Ag(CN)2Ag (se forma antes del pto. final)

Se corrige con NH3

Ag(CN)2- + NH3 Ag(NH3)2+ + 2 Ag(CN-)2

Ag+(exceso) + I- AgI amarillo

Técnica

Reactivos

Amoníaco concentrado
Ioduro de potasio al 10%
Solución de nitrato de plata 0.01N

Procedimiento

Tomar 10 ml de destilado y agregar 10 ml de amoníaco concentrado y 1 ml de KI al 10%. Titular con solución de nitrato de plata 0.01N hasta aparición de turbiedad permanente.

Cálculos = 1 ml de NO3Ag (0.01 N) = 5.4 10-4 gr HCN = 0.54 mgr de HCN.

4.2. Determinación de cianuro en alimentos, sangre e hígado.

Método de formación de manchas de azul de prusia

El método se fundamenta en que el cianuro de la muestra es liberado por acción del ácido sulfúrico o ácido tricloroacético y aspirado a través de un disco de papel impregnado en sulfato
ferroso y se forma ion férrico visualizado como manchas de ferrocianuroferrico (azul de Prusia). El disco es luego sumergido en ácido clorhídrico hasta que toda la porción sin reaccionar
sea eliminada. La intensidad de la mancha es proporcional a la cantidad de cianuro presente en la muestra.

Reactivos

1) ß- glucosidasa
2) Agente antiespumante
3) Solución acuosa al 11% de cloruro férrico: pesar 11g de cloruro férrico y llevar a 100 ml con agua destilada.
4) Solución acuosa de sulfato ferroso amónico al 19%: pesar 19 g de (NH 4)2Fe(SO4)2) y llevar a 100 ml con agua destilada.
5) Solución acuosa al 10% de hidróxido de sodio: pesar 10 g de NaOH y llevar a 100 ml con agua destilada.
6) Solución acuosa de 1N de hidróxido de sodio: pesar 40 g de NaOH y llevar a 1000 ml con agua destilada.
7) Solución stock de cianhídrico (1000 µg/ml): pesar 0.2503 g de cianuro de potasio y transferir en un matraz de 100 ml agregar 10 ml de NaOH 1N y diluir al volumen con agua destilada.
8) Solución standard intermedia de cianhídrico (100µg/ml): diluir 1 ml de la solución stock de cianhídrico en 10 ml de agua destilada. Preparar diariamente.
9) Solución de trabajo de cianhídrico (10 µg/ml): diluir 5 ml de la solución intermedia standard de cianhídrico en 50 ml de agua destilada. Preparar diariamente.
10) Solución acuosa al 20% de ácido sulfúrico: agregar 50 ml de agua a un frasco graduado de 100 ml. Agregar 20 ml de ácido sulfúrico concentrado y llevar al volumen con agua
destilada.
11) Solución de ácido clorhídrico 25%: agregar 50 ml de agua en una probeta de 100 ml, agregar 25 ml de HCl concentrado y llevar a volumen con agua destilada.
12) Papel de filtro Watman Nº 40 cortado en forma de discos 16 mm diámetro.

Aparatos y equipos

1) Aparato para cianhídrico (Fig. 3 )

2) Baño de agua a 75ºC.
3) Bomba de aire
4) Baño de vapor o evaporador.
Procedimiento - Pretratamiento de alimentos

1. Pesar cerca de 10 g de alimento y transferir a un homogeneizador

2. Agregar 200 ml de agua y 0.02g de ß glucosidasa
3. Homogenizar durante 4 minutos.
4. Dejar decantar 1 hora.
5. Proceder al paso 10 del análisis.

Pretratamiento en muestras de sangre

1. Agregar 300 ml de agua, 5 ml de sangre y 2 ml de antiespumante a un probeta de 500 ml.

2. Reemplace el tapón de goma en el aparato de cianhídrico con el tapón ajustado en la probeta de 500 ml.
4. Prepare suficiente cantidad de agua caliente (paso 5 del análisis) que pueda contener la probeta de 500 ml.

Pretratamiento para muestras de hígado.

1. Agregue 1 gota de agente antiespumante a la muestra de hígado

Procedimiento

1) Agregar aproximadamente 20 ml de agua al tubo muestra. Pipetear 0.5 ml de solución standard de trabajo en el tubo.
2) Agregar 20 µl de cada uno de los siguientes reactivos FeCl 3 11%, (NH4 )2 Fe(SO4 )2 ) 19%, y NaOH 10% en el centro del papel de filtro de 16 mm de diámetro.
3) Ubicar el papel de filtro en el aparato de cianhídrico mientras esté húmedo y ensamble el aparato.
4) Agregar 1.0 ml de ácido sulfúrico/g de standard con una jeringa a través de la entrada del tubo de aire al tubo muestra.
5) Ubicar el tubo en baño de agua a 75º.
6) Aplicar succión durante 4 minutos. Menor tiempo de succión puede dar incompleta recuperación y mayor tiempo puede condensar agua arriba del disco.
7) Revelar el papel con HCl al 25% caliente (en baño de vapor o en plancha calefactora) hasta que el papel es vea blanco con manchas azul.
8) Enjuagar el disco con agua destilada y secar. Alinear las manchas standard en línea sobre un fondo blanco. Si las manchas son de color oscuro excesivo, puede deberse a sulfuros que
tienden a desaparecer al ubicar el papel en HCl.
9) Repetir los pasos 2-8 con standard de 10 µg, 20 µg y 50 µg standard.
10) Colocar una porción de la muestra homogeneizada (1-5g) estimando que contiene un total de 5-20 µg de cianuro en el tubo muestra. Agregue 20 ml de agua al tubo de la muestra.
11) Agregue 1ml de ácido sulfúrico por gramo de muestra. Como mínimo de 1 ml, pudiendo agregarse más volumen si la muestra es básica.
12) Repetir los paso 5-8.
13) Repetir el análisis de la muestra con un sobreagregado de 5 µg.
14) Puede usarse una comparación visual o cuantificar en un densitómetro.
15) Construir la curva de calibración usando los standard de cianuro y determinar los niveles en la muestra por comparación de absorbancia. Informar en ppm.
Consideraciones generales: Medir el pH del contenido estomacal. Si el pH es ácido, el ión cianuro es probable que se haya perdido.

4.3. Método de microdifusión de Feldstein-Klendshoj.

Fundamento: en la cápsula de Conway el ácido cianhídrico difunde del compartimiento externo al interno siendo fijado como cianuro en la solución alcalina. Se toma una alícuota del
compartimiento interno y se agrega cloramina T, formándose cloruro de cianógeno. Luego por el agregado de piridina se forma cloruro de cianopiridina.
La acción hidrolítica determina la apertura del anillo piridínico, para dar lugar a la formación del ácido glutacónico. Si este derivado se hace reaccionar con ácido barbitúrico se forma un
complejo rojo que se lee a 580 nm.

Muestra: sangre entera con heparina, orina u homogenato de vísceras.

Reactivos

1) Hidróxido de sodio 0.1N

2) Acido sulfúrico 10% en volumen
3) Lubricante: a base de siliconas o mezclar 2 partes de vaselina sólida y 1 parte de parafina.
4) Fosfato monosódico 1M.
5) Cloramina T al 0.25%. Se guarda en heladera hasta el momento de usar.
6) Reactivo piridina-barbitúrico: en un matraz aforado de 50 ml colocar 3 g. de ácido barbitúrico, 15 ml de piridina purísima y 3 ml de ácido clorhídrico concentrado. Mezclar hasta
disolución total, llevar a volumen con agua destilada y filtrar.

Instrumental

1) Espectrofotómetro
2) Cubetas de sección cuadrada de 1 cm de paso de luz.
3) Cámaras de Conway
Procedimiento

Colocar en el compartimiento interno de la unidad de microdifusión de Conway 3.3 ml de hidróxido de sodio 0.1N y en el compartimiento externo 2 a 4 ml de sangre total u orina, o 5 ml de
homogenato de tejido (equivalente a 1 g. de tejido). Como reactivo liberante se agregan 2 a 3 gotas de ácido sulfúrico al 10% en el compartimiento externo. Tapar inmediatamente y
homogenizar por rotación. El tiempo de difusión es de 3 a 4 horas a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo indicado se toma 1 ml de la solución alcalina del compartimiento interno
y se coloca en un tubo de ensayo. Se prepara un blanco colocando en otro tubo 1 ml de hidróxido de sodio 0.1N. A cada tubo agregar 2 ml de fosato monosódico 1M y 1 ml de cloramina
T al 0.25%. Mezclar y dejar en reposo 2 a 3 minutos, agregar por último 3 ml de reactivo piridina-barbitúrico, mezclar y dejar en reposo 10 minutos. En presencia de ión cianuro aparece
color rosado cuya absorbancia se mide a 580nm.
Se compara la absorbancia con testigos de cianuro en concentraciones comprendidas entre 0.1 a 2.0 g/ml de solución de hidróxico de sodio 0.1N.

5. Valores normales de cianuro en individuo adulto

El cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeñas cantidades. Hasta 15 µg/100 ml sangre es considerado como valor normal.

6. Interpretación de los resultados

En una intoxicación por inhalación de ácido cianhídrico valores mayores de 100 ?g/100 ml suelen ser fatales pero puede variar de un individuo a otro.
La ingestión de 150- 200 mg de NaCN puede provocar la muerte en un individuo adulto de 70 Kg pudiendo llegar la concentración sanguínea a valores 1 –2 mg/100 ml o superiores.
En muestras de sangre cadavérica, el cianuro desaparece rápidamente por acción enzimática y bacteriana. Hasta 15 µg/100 ml de sangre en cianuro aparece como producto del
catabolismo normal en pequeñas cantidades.
En sangre, niveles de cianuro mayores de 1 mg/L es asociado con casos fatales.

Dosis tóxica: una concentración de 1 mg/Kg de peso corporal es mortal.

7. CUESTIONARIO

1) Describa el mecanismo de acción del ácido cianhídrico

2) Sobre que tipo de muestras se puede realizar las determinaciones de ácido cianhídrico. Indique la forma correcta de toma de muestra y conservación en cada caso. Que ocurre con
muestras en estado de putrefacción.

3) Como procede para la identificación y cuantificación de ácido cianhídrico en medios biológicos

4) De los métodos descriptos, describa las ventajas y desventajas de cada uno así como las posibles interferencias.

7 - TÓXICOS METALICOS

a - INTRODUCCION

Los metales difieren de otras sustancias tóxicas en que no son creados ni destruidos por el hombre. Sin embargo, la utilización humana influye en la potencialización de los efectos tóxicos
mediante dos formas: el transporte ambiental (aire, agua, suelo y alimentos) y la alteración de la forma bioquímica del elemento.

Rutas para el transporte de elementos traza en el ambiente

Los únicos metales emitidos en fase gaseosa, en concentraciones medibles son el mercurio y el selenio. La presencia de metales en las aguas refleja la erosión de fuentes naturales en
adición con la actividad industrial. Además los metales presentes en el suelo y el agua pueden entrar en la cadena alimentaria.

El siguiente cuadro resume las rutas mas importantes de transporte de los metales a través de los distintos cuerpos terrestres.

Bioconcentración

Los tóxicos metálicos se concentran en los seres vivos a través de mecanismos biológicos. Por ejemplo, los mariscos filtran agua y retienen Arsénico (lo concentran).
Existe un factor de bioconcentración dado por:

Concentración de metal en tejido

=103 -106
Concentración de metal en agua

Biomagnificación

Las especies superiores de la cadena alimentaria tienen mayor concentración de metales que las primarias (plancton , por ejemplo).

Variables toxicológicas

 Edad: los niños son más susceptibles a la toxicidad por exposición a ciertos niveles de metales que los adultos. Los ancianos tienen sus mecanismos de detoxificación
deteriorados.
 Dieta: los factores dietéticos influyen en el nivel de absorción en el tracto gastrointestinal. Por ejemplo, existe una relación inversa entre el contenido proteico de la dieta y la
toxicidad de Cadmio y Plomo probablemente porque aumenta la absorción de Hierro.
 Hábitos: el tabaquismo y el alcoholismo influyen indirectamente en la toxicidad. El humo del cigarrillo contiene algunos tóxicos metálicos como Cadmio que interviene en el
daño pulmonar. El alcohol reduce, al alterar los hábitos alimenticios, el ingreso de minerales esenciales como el Calcio, cuyo déficit lleva a una mayor toxicidad metálica por
aumento de la absorción de Cadmio y Plomo.
 Estado inmune del individuo: cobra importancia en el caso de metales que producen reacciones de hipersensibilidad como Mercurio, Oro, Platino, Berilio, Cromo y Níquel.
 Forma química del metal: es un factor muy importante, no sólo para la absorción pulmonar y gastrointestinal, sino también en términos de distribución corporal y efectos
tóxicos. Por ejemplo, los alquil-compuestos son liposolubles y atraviesan las membranas biológicas. Sólo algunos son desalquilados y transformados en sales inorgánicas.
Los metales afines por tejido óseo como el Plomo, permanecen retenidos largo tiempo y tienden a acumularse con la edad. Otros metales son retenidos en los tejidos a
causa se la afinidad por proteínas intracelulares, como el Cadmio unido a metalotioneínas.

MECANISMOS DE ACCIÓN

La mayoría de los metales afectan múltiples órganos y el blanco de acción son enzimas específicas y/o membranas de células y organelas. El Plomo y el Cadmio ejercen algunos de sus
efectos sobre el SNC; el Plomo, Hierro y Zinc influyen en el metabolismo del HEMO. Las células involucradas en el transporte de metales, como las del tracto gastrointestinal, hígado o
túbulo renal, son particularmente susceptibles a la toxicidad.

MECANISMOS DE DETOXIFICACIÓN

Algunas células poseen mecanismos de protección, tales como formación de complejos proteicos que permiten la acumulación intracelular de metales potencialmente tóxicos sin causar
injuria celular. Estos complejos metal-proteína se presentan por exposición a Plomo, Bismuto y mezclas de Mercurio / Selenio. Las metalotioneínas forman complejos con Cadmio, Zinc,
Cobre u otros metales y la ferritina y hemosiderina son complejos de Hierro-proteína intracelular.

TIPOS DE MUESTRAS

Para establecer una relación dosis-respuesta es necesario conocer tanto la concentración del metal como el tiempo de exposición. La definición más precisa de dosis es la cantidad de
metal dentro de las células del órgano que manifiesta efectos tóxicos. Sin embargo la cuantificación de metales dentro de los órganos no es posible. Se pueden hacer estimaciones
indirectas a partir de modelos metabólicos derivados de las autopsias.

Sangre, orina y pelos son los tejidos más accesibles para realizar las medidas. Los resultados de dichas determinaciones reflejan exposición reciente, pasada ó larga exposición,
dependiendo del tiempo de retención y el tejido en particular.
Sangre y orina reflejan exposiciones recientes y se correlacionan muy bien con efectos agudos. Una excepción es el cadmio en orina: su presencia en alta cantidad en orina implica un
daño renal relacionado con la acumulación de Cd en el riñón.
Los pelos pueden usarse en asociación a variaciones en la exposición a los metales durante largo tiempo. Los análisis pueden realizarse sobre distintos segmentos del cabello de modo
tal que el contenido del metal del nuevo crecimiento puede compararse con exposiciones pasadas. Se debe tener la precaución de lavar el pelo previamente al análisis para remover el
depósito de metal por la contaminación externa.
Otro tipo importante de muestras es el agua. Las aguas de bebidas, libres de materia en suspensión, pueden ser analizadas directamente mientras que, las que presentan materia
orgánica requieren un procedimiento para solubilizar el material suspendido. Los barros, sedimentos y otros tipos de muestras sólidas pueden ser analizadas después de un tratamiento
adecuado.

TRATAMIENTO PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS

Los metales pesados se encuentran frecuentemente en el material a analizar formando complejos con moléculas orgánicas y deben ser liberados de los mismos previamente a su
cuantificación. El tratamiento a efectuar depende de varios factores:

1- Material biológico ( orina, suero, sangre, vísceras)

2- Metal en cuestión (volatilidad y uniones que forma el metal en el organismo)
3- Procedimiento utilizado para la determinación final (colorimétrico, absorción atómica, activación neutrónica).

Entre los métodos más frecuentemente empleados para el tratamiento preliminar de las muestras, pueden mencionarse :

a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleando ácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, ác. nítrico- ác. sulfúrico, ác. nítrico- ác. sulfúrico- ác.
perclórico, o bien permanganato de potasio- ác. clorhídrico.

b) Destrucción de materia orgánica por vía seca.

c) Formación de complejos y extracción con solventes.

d) Precipitación de las proteínas y determinación de los metales en el sobrenadante.

e) Técnicas de volatilización (arsénico como AsH3 , antimonio como SbH3 y mercurio como vapor del elemento).

A veces pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, de manera de obtener una muestra apropiada para las posteriores determinaciones.

El método de destrucción de materia orgánica (DMO) por acción de la mezcla ác. sulfo- ác. nitro- ác. perclórico (SNP), puede ser aplicado para la determinación de As, Tl, y Pb en medios
biológicos. Para la determinación de mercurio (Hg) se utiliza un dispositivo especial que incluye un refrigerante a reflujo “con dedo frío” para evitar pérdidas del elemento por volatilización
del mismo.
Otros metales tales como el antimonio, arsénico, oro, iridio, mercurio, osmio, paladio, platino, rhodio, ruthenio, selenio, plata, talio, estaño y titanio requieren modificaciones en el proceso
de digestión.

El método más empleado y sensible para la determinación de metales es la espectrometría de absorción atómica. Dicho método se fundamenta en la atomización de una solución de la
muestra a altas temperaturas para luego pasar a través del camino de la luz emitida por una lámpara de cátodo hueco es del metal a investigar. Los átomos del metal presentes en la
muestra, que se encuentran en su estado fundamental, absorben la luz y son detectados por un espectrofotómetro.

A continuación se detalla el fundamento del método de DMO por Vía Húmeda Sulfo-Nitro -Perclórica (SNP).

DMO por vía húmeda SNP.

Se basa en la acción de una mezcla fuertemente oxidante sobre la muestra en cuestión, a fin de romper la unión entre los metales y la materia orgánica llevándolos a su máximo estado
de oxidación.

El HNO3 es un agente oxidante (punto de ebullición: 56ºC).

2HNO3 ____________________H2O + NO + 3 O*__ en frío.
2HNO3 ___________________ H2O + 2 NO2 +1O* en caliente.

Luego O* + H (de la materia orgánica)___________H 2O

El H2SO4 permite trabajar a mayor temperatura (270ºC). Es un indicador de la destrucción de la materia orgánica: cuando se acaba el ácido nítrico que brinda el poder oxidante comienza
a actuar el ácido sulfúrico que ataca la materia orgánica dando Carbono de color negro. En ese momento es necesario detener el calentamiento porque falta medio oxidante, entonces se
agregará ácido nítrico y se continúa el calentamiento. (El C es reductor y podrá reducir el As a AsH 3 perdiéndose por volatilización).
Además el H2SO4 rompe cadenas de glúcidos, proteínas y grasas, dando moléculas más pequeñas que serán fácilmente atacadas por el ácido nítrico.
El ácido sulfúrico es también un deshidratante fuerte.
Es indicador de que la materia orgánica ha sido totalmente destruida, cuando no aparece color negro y se observan humos blancos de SO 3

El HClO4 posee un poder oxidante muy fuerte. Explota en presencia de materia orgánica, por eso nunca se lo usa sólo sino como mezcla ácido nítrico-ácido perclórico. Además de ser
oxidante produce el clivaje de cadenas.

4 HClO4 2 H2O + 2 Cl2 + 7 O2 (4 HClO4 :14 O*)

4 HClO4 HClO4 4 ClO2 + 3 O2 +2 H2O

4 ClO2 + C (de la materia orgánica) 4 CO2 + Cl2

La principal desventaja de la mezcla SNP es que resulta ser peligrosa por los ácidos oxidantes empleados, asimismo se generan vapores tóxicos e irritantes así como pueden producirse
explosiones. Entre las ventajas se menciona la rapidez y utilidad si se trabaja con cuidado. La presencia de materia grasa en la muestra permite romper cadenas carbonadas mientras que
la calcinación por vía seca no resulta suficiente.

Muestras

Sangre: se emplean 5 a 10 ml de sangre entera.

Orina: se usan 50 ml
Vísceras se emplean 1 g. de material desmenuzado

Reactivos

Acido nítrico (p.a.)

Acido sulfúrico concentrado exento de As, Tl y Pb.
Mezcla en la proporción 1: 2 de ácido perclórico y nítrico
Oxalato de amonio, solución saturada a temperatura ambiente.

Equipos

Balón de Kjeldahl de 100ml

Procedimiento
Si se trata de vísceras, se colocan 2 g de vísceras desmenuzadas en un balón Kjeldahl de 100 ml de vidrio Pyrex tratando de no ensuciar las paredes. Se agregan 10 ml de ácido nítrico
concentrado y se calienta sobre tela metálica hasta disgregar todo el material. Se continúa calentando directamente sobre llama pequeña, hasta disolver el material Se retira y se deja
enfriar.

Si se trata de orina, se colocan 50 ml de orina en un vaso de precipitados y se calienta sobre tela metálica hasta reducir el volumen a un quinto del original. El líquido remanente se pasa
a un balón Kjeldhal de 100 ml y se incorporan 10 ml de ácido nítrico concentrado.

De allí en adelante se procede de la misma manera en ambos casos.

Se agrega al contenido del Kjeldhal 2 ml de ácido sulfúrico concentrado. Se calienta el contenido para mineralizar hasta llegar a carbonizarse la materia orgánica. En ese momento debe
suspenderse el calentamiento dado que se genera un ambiente reductor y se corre el riesgo de perder metales como el arsénico o el antimonio por volatilización. Se deja enfriar y se
agrega lentamente por el cuello del balón 2 ml de ácido nítrico y se vuelve a calentar. Si se observa nuevamente oscurecimiento se agrega 2ml de la mezcla nítrico-perclórico. Se continúa
calentando hasta la aparición humos densos y pesados de trióxido de azufre. Llegado este punto, se retira el balón del fuego quedando un líquido incoloro o con un ligero precipitado
blanco o amarillento de sulfato de calcio o de hierro respectivamente. Se deja enfriar y se agrega 1 ó 2ml de agua destilada y se calienta para desprender vapores de agua. Se repite el
agregado de agua y se calienta humos blancos de trióxido de azufre. Se continúa calentando hasta obtener un líquido residual de 2ml, se deja enfriar y se trata el líquido y el residuo
sólido si lo hubiera con agua destilada transvasándolo a un matraz de 25ml. En estos 25 ml de investigará los metales de interés toxicológico como son el Tl, As y Pb.

7 - TÓXICOS METALICOS

b - DETERMINACION DE TALIO

El talio es un tóxico de acción diferida y lenta excreción. El órgano principal de eliminación es el riñón por ello el líquido de elección para la determinación de Tl es la orina, aunque puede
utilizarse también sangre.

Las sales de talio son empleadas en la manufactura de semiconductores y pigmentos. No hace mucho tiempo la investigación de Tl era frecuente debido al uso difundido de sales de Tl en
la formulación de cremas depilatorias, en las que éste tipo de compuestos se encontraba en concentraciones muy cercanas a las tóxicas. También ciertos compuestos de Tl eran
ampliamente usados como rodenticidas (Pasta Zelio) que fueron reemplazados posteriormente por compuestos cumarínicos, de menor toxicidad.
Una intoxicación aguda con sales de Tl puede producir daños gastrointestinales con efectos retardados o intermedios en el sistema nervioso central y periférico, sistema cardiovascular,
ojos y piel. La pérdida de cabello es el síntoma típico de la intoxicación. La dosis letal de talio en adultos es de 0.2 a 1 g.

La investigación toxicológica del Tl se realiza en tres etapas:

1) DMO con mezcla sulfo-nitro-perclórica (SNP).

2) Extracción etérea del metal mineralizado como tricloruro de talio.
3) Formación del ditizonato de Tl (rosado) en medio alcalino eliminando las interferencias de otros metales.
A continuación se describe el procedimiento de DMO para cantidades pequeñas de muestras de orina.

Técnica:

Colocar en cápsula de porcelana 5 ml de orina y agregar 4 gotas de ácido sulfúrico concentrado y 10 gotas de ácido nítrico concentrado. Calentar en baño de arena hasta que se observe
oscurecimiento debido a la carbonización de la materia orgánica. Retirar del fuego y agregar 10 gotas de una mezcla constituída por dos volúmenes de ácido nítrico concentrado y un
volumen de ác.perclórico 70% .
Nunca se debe agregar el ácido perclórico directamente sobre la Materia Orgánica (MO) por la formación de mezclas explosivas. Luego se continúa calentando para concentrar y
carbonizar la materia orgánica. Si nuevamente se observa que la muestra se oscurece será necesario agregar la mezcla citada en la misma cantidad. Si esto no ocurre, se continuará
calentando hasta humos densos y pesados de trióxido de azufre. Si ha quedado ácido perclórico, se eliminará éste antes, también como humos blancos pero no tan densos y
característicos como los del trióxido de azufre. El calentamiento continúa hasta residuo siruposo. Si se observa ligeramente coloreado de amarillo, esto puede deberse a la presencia de
hierro. Se deja enfriar, se agregan 2 ml de agua destilada y se calienta para descomponer combinaciones nitradas y eliminar restos de sustancias oxidantes, hasta humos blancos de
trióxido de azufre. Enfriar y agregar nuevamente 2 ml de agua destilada , disolver el residuo con ayuda de una varilla de vidrio y trasvasarlo luego a un tubo de hemólisis, agregar 2 gotas
de ác. nítrico 7M y 6 gotas de ác. clorhídrico 6M (agua regia). Calentar con mucha precaución directamente a la llama, hasta ebullición.

HNO3 +HCl_____________________Cl2

Cl2 + Tl+ _____________________TlCl 4-

Enfriar y extraer dos veces con el doble de su volúmen de éter sulfúrico. Agitar, separar la fase etérea y concentrar a pequeño volumen en baño María. Apagar los mecheros y enfriar. Al
extracto concentrado agregar una pizca de sulfito de sodio (para eliminar el cloro proveniente del agua regia que podría oxidar el ioduro a iodo y constituir una interferencia y 2 gotas de
ioduro de potasio 0.5M y agitar enérgicamente. Un color amarillo en fase etérea y eventualmente, un precipitado en la interfase, indica reacción positiva.

IK + Tl Cl4- ____________I3Tl (amarillo)

Agregar luego gota a gota y agitando una solución de hidróxido de sodio 4M hasta viraje de la ditizona. Luego agregar 4 gotas de solución de cianuro de potasio 2M. Agitar enégicamente
y dejar separar las dos fases. Un color rosado en la fase etérea indica reacción positiva (ditionato de talio).

Otro método empleado en forma cuantitativa aplicable a orina se describe a continuación

Reactivos:

1. Reactivo cianuro: Disolver 1.6 g de hidróxido de sodio, 1.2 g de tartrato de sodio y 1.36 g de cianuro de potasio en 10 ml de agua. Tener cuidado al usar el reactivo de cianuro.
2. Solución de ditizona (250 mg/l) en cloroformo preparado recientemente.

Standards

Blanco de orina al cual se le agrega una solución de acetato de talio en agua destilada (1.0 g/L) para obtener una concentración de 0.1, 1.0, 5.0 y 10 mg/l

Técnica

1. Agregar 1 ml de reactivo cianuro a 5 ml de muestra o de standard en 10 ml y agitar durante 10 segundos.

2. Agregar 2 ml de solución de ditizona, mezclar durante 1 minuto y centrifugar durante 5 minutos.
3. Descartar la fase inferior, la fase acuosa y filtrar el extracto cloroformo a través de papel de filtro.
4. Medir la absorbancia del extracto y leer contra un blanco de orina a 480 mm.

Un color rosado en la fase inferior cloroformo indica presencia de talio a una concentración de 1 mg/l. Realizar una curva de calibración. Este método presenta un número de metales que
pueden interferir. Para realizar la medida en forma definitiva, debe realizarse la determinación del extracto clorofórmico mediante espectrofotometría de absorción atómica.
Sensibilidad del método: 0.1 mg/l.

Interpretación de los resultados:el Tl no se detecta normalmente en fluidos biológicos procedentes de individuos no expuestos.

7 - TÓXICOS METALICOS
c - INVESTIGACION Y DOSAJE DE ARSENICO
El Arsénico puede encontrarse en las aguas subterráneas utilizadas como aguas de consumo. Por eso, puede registrar su presencia en los vegetales que lo absorben en la raíz o son
tratados con dichas aguas. Por otra parte, ciertas especies marinas tales como los mariscos y ciertos crustáceos filtran grandes cantidades de agua y concentran el As. Antiguamente,
formaba parte de algunos medicamentos orgánicos e inorgánicos frecuentemente utilizados. El arseniato de sodio y cobre se emplearon como colorantes en vidrios, papel y pinturas. En
pirotecnia se usan compuestos de As para la generación de fuegos de artificio de color verde. Además, se han registrado casos con etiología criminal.

Sintomatología

Aguda:

1. Vasodilatación de los capilares sanguíneos con alteración de la permeabilidad de los mismos.

2. Vómitos, diarrea ( pérdida de agua y sales), irritación de garganta, dolores faríngeos.
3. Edemas subcutáneos. Hipertensión.
4. Colapso, shock, coma, muerte.

Crónica:

El As se une a albúminas, se absorbe fácilmente a las mucosas y se deposita en hígado, riñón, huesos, pelos y uñas. Se elimina por orina y heces, pero se reabsorbe en el túbulo
contorneado proximal. Por lo tanto, debido a que la absorción es mayor que la eliminación, se acumula. Los síntomas más característicos son:

- caída del cabello.

- mano en forma de garra y pie colgante
- en piel:
* erupciones
* hiperqueratosis (engrosamiento de la piel de la palma de las manos y pies)
* hiperpigmentación (manchas oscuras)
-degeneración grasa del hígado que puede dar cirrosis.
-temblores por alteración del SNC con desequilibrio de Na y K
-fase final: cáncer de piel.

DETERMINACION DE ARSENICO EN MATERIALES BIOLOGICOS.

En todos los casos es necesario destruir previamente la materia orgánica. El método empleado depende del material biológico de que se trate.

a)- Orina: se colocan 10 ml de orina en una cápsula de porcelana, agregando 10 gotas de H 2SO4 concentrado y 20 gotas de HNO3 concentrado. Se calienta la cápsula en baño de arena
hasta observar carbonización (ennegrecimiento). Se agrega luego gota a gota la mezcla constituida por dos volúmenes de HNO3 concentrado y un volumen de HClO4 concentrado (70%)
hasta que el líquido de la cápsula no se oscurezca más. Por calentamiento se lleva a residuo siruposo. Cuando el residuo se enfría se toma con 2 o 3 ml de agua destilada.

b)- Pelos y uñas: se colocan 1 a 2 g de material en una cápsula de porcelana. Si se trata de pelos es conveniente humedecerlos con unas gotas de agua destilada. Agregar 1 ml de
H2SO4 concentrado y 5 ml de HNO3 concentrado. Si es posible dejar en contacto varias horas.
Calentar progresivamente sobre tela metálica y luego en baño de arena. Cuando aparecen humos blancos, retirar del baño de arena y agregar 2 ml de la mezcla constituida por dos partes
de HNO3 concentrado y una parte de HClO4 concentrado (70%). Desde este punto en adelante, cuando se produzca oscurecimiento del líquido por carbonización debe suspenderse el
calentamiento del mismo pues en dicho medio reductor se perderá As por volatilización.
Calentar hasta humos blancos y repetir este tratamiento hasta que el residuo sea incoloro o blanquecino. Retirar del baño y agregar 10 ml de agua destilada. Calentar nuevamente hasta
residuo siruposo. Enfriar y tomar con 10 ml de agua destilada.

c)- Alimentos: nos referiremos en particular al caso de alimentos en base a hidratos de carbono. En este caso es adecuada una DMO por vía seca, útil para la destrucción de
carbohidratos pero no para las grandes moléculas de lípidos o proteínas. Se realiza la DMO por calcinación de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y óxido de magnesio
que transforma el As cuantitativamente en piroarseniato de magnesio. En estas condiciones el As no es volátil.
Colocar 10 g de muestra en cápsula de porcelana y agregar 3.5 ml de solución de nitrato de magnesio al 20% y 0.1 g. de óxido de magnesio. Mezclar bien formando una papilla y calentar
primero a baño maría hasta sequedad, luego en baño de arena y por último en triángulo de pipas hasta cenizas blancas. Enfriar y tomar el residuo con 10 ml de ác. sulfúrico al 10%. Filtrar
si es necesario a fin de obtener una muestra de aspecto límpido.

MgO + 2 Mg(NO3)2 +As2O3 Mg3(AsO4)2 + 4 NO2

Mg3(AsO) As2O7Mg2 (piroarseniato) +MgO

calor

As2O7Mg2 + H2SO4 AsO4H3 (ác. arsénico) + MgSO4

d)- Polvo insecticida: se solubiliza el As con hidróxido de sodio que lo transforma en arsenito soluble. Los insecticidas no tienen materia orgánica, sólo una base de arseniatos de calcio o
plomo.
Pesar 5 g de muestra y agregar 20 ml de hidróxido de sodio al 10%. Calentar a baño maría durante 5 minutos para solubilizar al As. Enfriar , filtrar y llevar a 30 ml con agua destilada.

2 AsO4Na3 + Ca(OH)2 (AsO4)2Ca3

Calentamiento en Baño María

Esta metodología se utiliza sólo para muestras con grandes cantidades de Arsénico.
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE ARSENICO

Se realizan luego de la destrucción de la materia orgánica (DMO). Las mismas se basan en las propiedades reductoras de la AsH 3 o de ciertos reactivos.

Reaccción de Bougault

Reactivo de Bougalt: 10 g de hiposulfito de sodio (H3PO2Na) más 10 ml de agua se llevan a 100 ml con HCl puro. Se deja reposar y se filtra con algodón.
En un tubo de ensayo colocar un volumen de líquido a ensayar con un volumen de reactivo. Calentar a baño maría 10 minutos. En presencia de compuestos arsenicales aparece un color
pardo oscuro a marrón cuya intensidad varía con la concentración.

2 AsO4-3 (o 2 AsO3-3) + 3 H3PO2 3 H3PO4 + 2 As O(marrón)

La reacción tiene una sensibilidad de 100 ppm aumentada a 10 ppm si se agrega I 2. El selenito actúa como interferencia pues da la misma reacción. Se requiere ausencia absoluta de
materia orgánica.

Reacción de Bettendorf
Reactivo de Bettendorf: 10 g SnCl2 se llevan a 100 ml con HCl puro. Preparar en el momento de usar.
En un tubo de ensayo poner un volumen de líquido más un volumen de reactivo . Calentar a ebullición y dejar reposar. Si hay As aparece coloración parda oscura o marrón. Es poco
específica.

AsO3 -3 + 3 HCl As Cl3

2 Cl3As + 3 SnCl2 2 AsO (marrón) + 3 SnCl 4

Reacción de Gutzeit cualitativa

En un tubo de hemólisis colocar 1 ml de ác. sulfúrico al 25% Agregar 1 ml del líquido problema y una granalla de Zn activado.

En la parte media del tubo colocar un trozo de algodón embebido en solución de acetato de plomo al 1% y en la boca del tubo un papel de filtro sobre al que se coloca una pequeña gota
de una solución de nitrato de plata cuya concentración no sea menor del 50% Colocar el tubo en baño de agua fría.

En presencia de As se obtiene una coloración amarilla característica.

AsO4-3 + Zn + 11 H+ <========> AsH3 + Zn+2 + 4 H2O

AsH3 + 6 NO3Ag <=========> As.Ag3.3 NO3Ag (amarillo) + 3 HNO3

As.Ag3.3 NO3Ag + 3 H2O <=========> AsO3-3 + 6 AgO ¯(negro) + 3 NO3- + 6 H+

La reacción tiene una sensibilidad de 10 ppm.

CUANTIFICACION DE ARSÉNICO: Método de Gutzeit cuantitativo

Se basa en la formación de arsina por acción del hidrógeno naciente sobre compuestos arsenicales. La arsina reacciona con un papel embebido en Cl 2Hg formando complejos
coloreados. La longitud e intensidad de la mancha es proporcional a la concentración de As, la cual se compara con manchas standard.

El aparato consiste en un frasco cuyo volumen varía según la cantidad de As a dosar. Para cantidades de As entre 50 y 300 ppm se utiliza un frasco cuyo volumen de 250 ml. Para
cantidades de As entre 0.1 y 20 ppm el volumen del frasco es de 60 ml.

Lleva un tapón de goma con un orificio al que se ajusta un tubo de vidrio con un estrechamiento; a éste se adosa otro tubo similar pero de menor diámetro en cuya parte superior se
coloca una banda de papel embebida con una solución de Cl 2Hg y luego secado.

Técnica

Colocar en la parte inferior del tubo de desprendimiento un papel de filtro plegado y embebido en solución de acetato de plomo seco. Por el estrechamiento de este tubo introducir lana de
vidrio embebida en acetato de plomo. Finalmente, en la parte superior del tubo colocar una tira embebida en Cl 2Hg seco. El Ac2Pb retiene el SH2 (como SPb) que interfiere con el color.

Ensayo macro: en el frasco colocar 20 ml de mezcla ácida, 2 ml de solución de alumbre férrico, 0,5 ml de SnCl 2. Agregar la capacidad de un crisol de 30 ml de granallas de Zn activado y
llevar a volumen de 200 ml con agua destilada. Colocar por último una cantidad exactamente medida de solución a ensayar.

Ensayo micro: en el frasco colocar 4,8 ml de mezcla ácida, 0,48 ml de solución de alumbre férrico, 0,12 ml de SnCl 2. Agregar la capacidad de un crisol de 7,2 ml de granallas de Zn
activado y llevar a volumen de 60 ml con agua destilada. Colocar por último una cantidad exactamente medida de solución a ensayar.

La mezcla ácida consiste en: 20 ml H2SO4 más 10 g NaCl que se llevan a 100 ml con agua destilada. El agregado de NaCl y H2O a la mezcla ácida produce un desprendimiento regular
de Arsina (AsH3).
El alumbre férrico compleja el Sb que pudiera estar presente. El SnCl 2 disminuye el sobrepotencial del H permitiendo la reducción.
Tapar perfectamente y colocar en baño de agua fría durante 45 minutos. Sacar la banda de papel reactivo y sumergirla en una solución de KI al 10%. El color se estabiliza sumergiendo el
papel en una solución de ClK 10%. Secar entre papel de filtro y comparar con bandas standard obtenidas operando de la misma manera. En el caso de utilizar el frasco de 60 ml, las
cantidades de reactivos varían.

AsO4-3 + 4 Zn0 + H+ AsH3 (arsina) + 4 Zn+2 + 4 H2O

2 AsH3 + 3 HgCl2 As2Hg3 (amarillo pardo) + HCl

As2Hg3 + I-1 (I4Hg)3As3

Expresión de resultados: se miden mg del complejo (I4Hg)3As3 pero lo habitual es expresar el resultado en mg de As /Kg de muestra pesada. Por ello hay que transformar el resultado
en As. La sensibilidad del método es de 50 ppm a 300 ppm

Aparatos empleados:

Método de Fleury

Se utiliza para cantidades de arsénico mayores. Se basa en la oxidación de los arsenitos a arseniatos por acción del iodo a pH adecuado. Se trabajará con el solubilizado del polvo
insecticida.

Sobre una alícuota del líquido a ensayar (1 a 3 ml de acuerdo a la intensidad de las reacciones de indentificación) se agrega 25 ml de una dilución ácida preparada con 8 ml HCl
concentrado y 24 ml de agua destilada.
Llevar a baño maría hirviente durante 5 minutos. Agregar 2,5 g de KI , agitar y dejar 10 minutos en reposo. Desde una bureta titular lentamente y agitando con solución de tiosulfato de
sodio 0.1N hasta decoloración, usando engrudo de almidón como indicador.
Agregar bicarbonato de sodio hasta reacción alcalina al tornasol y titular con solución de iodo 0.1N. Cada ml de solución de iodo 0.1N equivale a 0.004946 g de As2O3.

AsO4-3 + I- + H+ AsO3-3 + I2

S2O3= + I2 2 I- + S4O6=

AsO3-3 + I2 AsO4= + 2 I- + 2 H2O

Interpretación de los resultados

Arsénico en sangre (pseudonormal) < 0.07 mg/l

Arsénico en orina (pseudonormal) < 0.05 mg/l
Arsénico en pelo (pseudonormal) < 30 µg/ 100 g pelo
Arsénico en uña (pseudonormal) < 400 µg/ 100 g uña
Arsénico en agua de bebida (pseudonormal) < 0.12 mg/ l

7 - TÓXICOS METALICOS

d - INVESTIGACION DE PLOMO

Los compuestos de plomo son muy utilizados en metalurgia, tuberías, fabricación de baterías, soldaduras, barnices, pinturas para barcos y automóviles, revestimientos de cables,
anticorrosivos, imprentas, etc.
Puede haber plomo en el aire debido al humo de las fábricas, a los combustibles de los autos y el humo del cigarrillo.
El agua potable puede contaminarse con los desechos industriales, el polvo atmosférico o porque el metal se solubiliza en medio ácido en las cañerías de plomo.
De este modo el origen de la intoxicación con Pb puede ser: profesional, ambiental o accidental (principalmente en el caso de los niños).

METABOLISMO

La intoxicación por Pb puede producirse por vía oral, pero la vía inhalatoria es la más importante para su absorción a través del polvo o sus vapores. Las partículas o vapores de plomo
penetran a través del epitelio pulmonar, llegan a la circulación y viajan en plasma como fosfato de plomo
Se deposita en hígado, pulmones, encéfalo, huesos y riñones. Se elimina por orina y en menor cantidad por materia fecal. Atraviesa la placenta pudiendo provocar abortos o
anormalidades fetales.
MECANISMO DE ACCION

El plomo actúa mediante diversos mecanismos:

a)- disminuye la producción de glóbulos rojos y su vida media al alterar su membrana y provocar su ruptura.
b)- disminuye la síntesis del grupo HEM en los eritroblastos de médula ósea, al inhibir tres enzimas de la ruta biosintética de este grupo. Dichas enzimas se denominan:
aminolevulínico dehidratasa, Coproporfirinógeno oxidasa y Ferroquelatasa
c)- actúa selectivamente sobre el músculo liso aumentando su contractilidad.
d)- produce lesiones neuronales difusas, vasodilatación y extravasación de líquidos en el encéfalo.
e)- a nivel del SNP hay desmielinización del asta anterior de la médula y más tarde puede aparecer atrofia y degeneración axonal de las fibras nerviosas.
f)- puede alterar las células del túbulo proximal renal. En casos graves puede aparecer esclerosis y fibrosis renal con nefritis crónica.
g)- se deposita en los huesos y puede permanecer en ellos con una vida media de 25 a 30 años.

DIAGNOSTICO

Es imprescindible efectuar una búsqueda exhaustiva de la fuente de intoxicación. Debe preguntarse sobre fábricas cercanas al domicilio, trabajos realizados en el hogar, fundiciones,
desarmado de baterías y todo aquello que implique alguna posibilidad de contacto con el metal.

PERFIL PLUMBICO

Consta de la medida de la plumbemia (concentración de plomo en sangre) y actividad de la -aminolevulínico dehidratasa en sangre por un lado y ácido -aminolevulínico y
coproporfirinas en orina de 24 hs por otro.

En el paciente intoxicado encontraremos probablemente:

• plumbemia aumentada
Valor Normal: niños no expuestos: 17 ± 8 µg%
Adultos no expuestos: 19 ± 7 µg%
Adultos expuestos: 57 ± 21 µg%
• -aminolevulínico dehidratasa
Valor Normal: mayor de 20Unidades / litro de G. Rojo
• ácido -aminolevulínico aumentado
Valor Normal:0,35 – 4 mg / litro de orina
• coproporfirinas aumentadas
Valor Normal: hasta 160 µg / 24 hs

Por otro lado se buscará también el punteado basófilo característico en frotis de sangre periférica.
Los valores de porfobilinógeno (PBG) en plasma y orina se encontrarán normales o disminuidos.

DETERMINACIÓN DE PLOMO EN SANGRE (PLUMBEMIA)

El método clásico para la determinación de Plomo en sangre es el método de Jacobs modificado, que se basa en la formación del ditizonato de Pb, una vez eliminados por complejación y
extracción los metales interferentes, y su lectura espectrofotométrica a 510 nm.

Las técnicas de absorción atómica son más rápidas y precisas. Tienen además muy alta especificidad de manera que las interferencias son pocas. Por esto los pretratamientos
utilizados en las técnicas colorimétricas se simplifican enormemente.
Los límites de detección para las técnicas de atomización en llama se encuentran en el orden de los µg/ml y los volúmenes de muestra requeridos son de alrededor de 2 ml. Los
coeficientes de variación son de 2 a 0.1%.
En técnicas en donde se realiza una atomización en horno de grafito se requieren volúmenes de muestra de alrededor de 50 µl, con límites de detección 10 a 100 veces menores que
en la atomización en llama. Los coeficientes de variación son de 10 a 1%.

La muestra de sangre (10ml) se toma por punción venosa una vez desinfectada la zona con alcohol, mediante jeringa descartable de plástico, previamente heparinizada. Se necesita del
paciente un ayuno de por lo menos 10 horas.
Todo el material a usar debe ser tratado previamente con ácido nítrico 1:1 durante 24 horas. Se enjuaga luego tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces
con agua bidestilada.
Se describe a continuación un método para determinar la concentración de plomo en sangre basado en la formación de un complejo metálico (entre plomo y APDC) y la posterior
extracción en fase orgánica (MIBK) del mismo. El nivel de Pb seobtiene finalmente mediante la lectura en un espectrómetro de absorción atómica, atomización en llama.

Reactivos

- Amonio pirrolidín di tio carbamato (APDC) 4%: Se pesan 4 gr de APDC y se llevan a 100 ml con agua bidestilada caliente. Luego se filtra en papel Whatman Nº4. Se guarda en heladera.

- Tritón X-100 10%: Tomar 10 ml de Tritón X-100 y llevar a 100 ml con agua bidestilada tibia.

- APDC 2%-Tritón 5%: Se mezclan volúmenes iguales de las soluciones anteriores. Preparar en el momento de usar.

- Metil isobutil cetona (MIBK): Por lo menos 24 horas antes, saturar en agua destilada MIBK, dejando en contacto permanente ambos líquidos.

- Solución madre de Pb: Se pesan 1,5985 gr de (NO 3 )2Pb p.a. llevando a un litro con ácido nítrico 1/1000. Se tendrá una solución de 1 mg/ml.

- Solución testigo: 12,5 ml de la solución madre se llevan a 100 ml con ácido nítrico 1/1000. Se tendrá una solución de 125 µg / ml (125 ppm).

Técnica

Realizar una curva de calibración con sangre de la siguiente manera: colocar 2,5 ml de sangre entera en cada uno de 5 tubos, provistos de tapa y ci erre esmerilado y agregar 0, 5, 10 y 15
y 20µl de la solución testigo de 125 ppm respectivamente. Homogenizar perfectamente. Se obtiene:
Tubo 1: 0 µl -------------------------------- X = concentración de Pb
Tubo 2: 5 µl -------------------------------- X + 25 µg Pb /100 ml sangre
Tubo 3: 10 µl ------------------------------ X + 50 µg Pb /100 ml sangre
Tubo 4: 15 µl ------------------------------ X + 75 µg Pb /100 ml sangre
Tubo 5: 20 µl ------------------------------ X + 100 µg Pb /100 ml sangre

Colocar 2,5 ml de sangre entera de la muestra problema en un tubo provisto de tapa y cierre esmerilado.
Paralelamente se preparan un blanco con 2,5 ml de agua bidestilada

A cada uno de los tubos que contienen sangre se les adicionan 1 ml de la solución APDC-Tritón. Se agitan los tubos en Vórtex, hasta hemólisis completa, durante aproximadamente 15
segundos. Al tubo blanco se les agregará 1 ml de la solución APDC 4%, pues la solución APDC-Tritón con el agua forma emulsiones muy difíciles de separar.

Se agrega luego a cada uno de los tubos 2,5 ml de MIBK, agitando en Vórtex durante aproximadamente 30 segundos. Se debe verificar que la mezcla sea adecuada. Se centrifugarán
luego durante 10 minutos a 3000 rpm. Finalmente se separarán las fases superiores de MIBK. La fase orgánica debe tomar un leve color amarillo y de no ser así se debe sospechar una
agitación insuficiente y se recomienda repetir la operación.

Los extractos de MIBK se nebulizan en el atomizador de llama y se leen contra MIBK, controlando el cero del aparato después de cada medida.
Para graficar la curva de calibración (absorbancia vs concentración de testigo) debe restarse a cada testigo la absorbancia del testigo 1. Luego por interpolación del valor de absorbancia
de la muestra problema se obtendrá la concentración de plomo en sangre expresada en µg Pb /100 ml de sangre.

Valores de referencia para la población de Capital Federal y alrededores

Niños no expuestos: 17 ± 8 µg %
Adultos no expuestos: 19 ± 7 µg %
Adultos expuestos: 57 ± 21 µg%

TEST DE PORFOBIRINOGENO (PBG) EN ORINA

Ensayo de Watson - Schwartz.

Se utiliza como muestra la orina recolectada en las condiciones correspondientes a la determinación de coproporfirinas totales (pH = 7.8) ya que el PBG se polimeriza en medio ácido
dando uroporfirina.
En un tubo pequeño se agregan a 2 ml del reactivo de Erlich (2 g de p-dimetil aminobenzaldehído en 50 ml de HCl y 50 ml de agua destilada) 1 - 2 gotas de orina. Al cabo de 2 segundos
un desarrollo de color rosado a rojo al tope de la solución indica un test positivo para PBG.
El color amarillo que se observa a veces, se debe a compuestos tales como urea y urobilinógeno que no desarrollan color en esas condiciones hasta una concentración de 200 mg/g.

En una intoxicación con Pb se encontrarán valores de PBG normales o disminuídos. Si se hallaran valores aumentados, sería indicio que la porfiria manifestada es de otra naturaleza, por
ejemplo de tipo congénito.

DETERMINACION DE ACIDO ALA EN ORINA.

Método de Berkó- Durkó modificado, Clinical Chem. Lab., 1973.

La reacción del -ALA con el reactivo de Erlich es muy sensible aunque no específica pues también la dan las aminocetonas y las glucosaminas. Desde el punto de vista de la
determinación del perfil plúmbico, estas interferencias no tienen relevancia en los rangos de concentración de -ALA halladas en el saturnismo.

Muestra: orina correspondiente a 24 horas recolectada en frasco oscuro conteniendo solución saturada de ácido tartárico aproximadamente 1 ml/ 100 ml de orina.

Reactivos

- Reactivo de Erlich modificado = 1 gr de p-dimetilaminobenzaldehído se disuelve en 35 ml de ácido acético glacial, se agregan 8 ml de ácido perclórico 70% y se lleva a 50 ml con ácido
acético glacial. Preparar en el momento de usar.
- Solución Acetato de sodio 0,5 M: 41 gr de AcNa se disuelven en 1 litro de agua destilada.
- Solución ácido acético 0,5 M: 28.7 ml HAc glacial se llevan a 1000 ml con agua destilada.
- Buffer acetato: 93,2 ml HAc 0,5 M más 6,8 ml AcNa 0,5 M (pH=3,5).
- Standard de -ALA 400 µg/ml: se disolverán 4 mg de -ALA p.a. en buffer acetato, llevando a 10 ml totales.

Técnica

Transferir 1 ml de orina a un tubo de centrífuga y agregar 9 ml de solución diluyente. Mezclar durante unos minutos y centrifugar. Filtrar por papel de filtro y transferir 2 alícuotas de 2 ml
c/u del filtrado a sendos tubos de ensayo B y D (Blanco y Desconocido, respectivamente). Al tubo D se le agrega 0.1 ml de acetilacetona y ambos tubos se llevan a baño Maria hirviente
durante 20 minutos. Mediante este procedimiento se conjuga la delta-ALA y la acetilacetona dando un compuesto pirrolico positivo a Erhlich. Se enfrían entonces los tubos en baño de
agua y se les agrega 2 ml de Reactivo de Erlich a cada una. Luego de 15 minutos se lee la absorbancia del tubo D a 553 nm contra el tubo blanco.
La cantidad de delta ALA se obtiene a partir de una curva de calibración expresada en µg/ml. Se tomarán soluciones de 50, 30, 10, 5 y 1 µg/ml, diluyendo la solución standard original de
400µg/ml y se realiza la reacción de Erlich en forma análoga a la realizada sobre las muestras.

Valores normales

0.1 a 0.5 mg% para menores de 15 años

0.1 a 0.6 mg% para adultos
excreción urinaria 1.3 a 7 mg/24 hs.
TEST PARA PORFIRINAS EN ORINA

Se trata de un test rápido cuyo resultado es positivo desde valores de concentración de 70 µg% (1µmol/l).

En un tubo de ensayo se colocan 2 ml de una mezcla de igual volumen (1:1:1) de ácido acético, alcohol amílico y éter dejando caer sobre ella 15 ml de orina. Luego de 2 minutos el
reactivo habrá extraído la mayor parte de las porfirinas presentes por lo que se separara una capa superior en el tubo. Si esta capa superior muestra fluorescencia roja el test es positivo.

El ensayo se puede hacer más sensible transfiriendo la fase orgánica superior con una pipeta Pasteur a otro tubo conteniendo 1 - 2 gotas de HCl. Se agita fuertemente (10 - 20 seg) y se
observa la capa clorhídrica inferior a la luz UV.

También puede hacerse una prueba mediante 10 ml de orina, 0.5 ml de AcH glacial y talco, agitando vigorosamente, para observar la fluorescencia en el talco.

DETERMINACION DE COPROPORFIRINAS TOTALES EN ORINA

A.A.Fernández; R.J. Henry, H.Goldenberg Clin. Chem. 12, 463 - 474, (1966).

Muestra

Orina correspondiente a 24 horas recolectada en un frasco oscuro conteniendo CO 3Na2 como conservador en cantidad suficiente para una concentración final de 0.1 - 0.5%.

El CO3Na2 tiene como finalidad de evitar las pérdidas de coproporfirinas conservando el pH: 5 - 9.5. En estas condiciones, la mayor parte de los coproporfirinógenos pasarán a
coproporfirinas.

Reactivos

- Acetato de sodio 1%: 10 g de sal anhidra o 16.6 g de acetato de sodio trihidratado se disuelven en agua y se llevan a 1000 ml. La solución es estable varias semanas a temperatura
ambiente.
- Buffer acetato de sodio(pH = 4.8) : se mezclan 1 volumen de acético glacial con 4 volúmenes de solución. saturada de acetato de sodio y 3 volúmenes de agua.
- Solución saturada de acetato de sodio: la saturación se facilita mucho disolviendo el acetato de sodio a 70 - 80ºC. Si el acetato de sodio no cristaliza al enfriarse el agua, se calienta de
nuevo la solución y se añade más sal. Se puede usar sal anhidra o trihidratada.
- Solución alcohólica de yodo al 1%(de reserva): se disuelve 1 g de I 2 en alcohol y se diluye hasta 100 ml. Conservar en heladera en frasco oscuro con tapón de vidrio.
- Solución de yodo al 0,005%: se diluyen 0.1 ml de la solución de reserva en agua destilada hasta 20 ml. Se debe preparar en el momento de usar.
- HCl 1,5N: se añaden 12,5 ml de HCl a 50 ml de agua destilada aproximadamente y se diluye hasta 100 ml.

Técnica

Se debe controlar el pH de la orina con papel indicador de manera que se encuentre en el rango de 5 a 9.5; no se debe trabajar con muestras cuyo pH sea inferior a 5.
Posteriormente, se debe examinar la muestra de orina a la luz UV y si tuviera fluorescencia roja se debe diluir la misma con agua en una relación 1:10.

A 20 ml de orina se le agregan 10 ml de buffer acetato (pH = 4.8) y se transfiere a una ampolla de decantación. Se le agregan 30 ml de acetato de etilo y se agita suavemente durante 3 a
5 minutos. Se deja reposar y se descarta la fase acuosa.
La fase orgánica se lava 3 veces con 5 ml de acetato de sodio 1% cada vez. Se colectan los extractos orgánicos, descartándose la fase acuosa y se agregan 2 ml de solución de iodo al
0.005% preparada en el momento, no dejando más de 5 minutos en contacto ya que el tiempo es crítico. Como la extracción es de coproporfirinas, con el agregado de I2 se asegura la
oxidación del coproporfirinógeno remanente
Se desecha la solución de iodo y finalmente se efectúan tres extracciones o hasta que la capa orgánica no presente fluorescencia, con 2,5 ml de HCl 1,5 N cada vez. Se recoge el extracto
clorhídrico en un tubo graduado midiendo este volumen.

En forma alternativa puede realizarse una separación mediante el sembrado de 1 ml de orina en una columna de intercambio aniónico Dowex 1X8, dejando eluir con 3 ml de agua
destilada. Se eluyen luego las porfirinas con HCl 3 N hasta fluorescencia negativa.

A continuación, se lee la absorbancia del extracto clorhídrico a tres diferentes: 380 nm, máximo entre 400 y 410 nm (generalmente 402) y 430 nm.

Expresión de resultados

2 A max - (A 380 + A 430 )

A corregida =
1.835

A corregida. Vc .V t. D
Coproporfirinas (µg/24 hs) =

. V alícuota orina

donde:

A 380 y A 430430 : indican absorbancia a 380 y 420 nm, respectivamente

A 380 : indica la absorbancia máxima en el rango 400 - 410 nm
Vc : volumen total de los extractos clorhídricos
Vt : volumen total de orina recolectada en 24 hs.
D: factor de dilución, si se diluyó la orina
: coeficiente de extinción (ml / µg) de coproporfirinas en HCl 1,5 N = 0.673

Valores normales = 0 - 160 µg / 24 hs.

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LA ENZIMA -ALA DEHIDRATASA.

Berlin, A; Schaller, H.M.. Klim. Chim. Klim. Biochem., 12, 389-390 (1974).

Como muestra se utiliza sangre entera que debe ser recogida con jeringa descartable de plástico usando heparina como anticoagulante, en un volumen mínimo de 1 ml. El NaF y el EDTA
inhiben la actividad enzimática. La misma muestra puede usarse para la determinación del hematocrito y Pb.
La muestra se mantendrá en heladera a 4ºC hasta su procesamiento. Se recomienda efectuar la determinación en el día de recolección, pues la actividad enzimática desciende en un
12% a 15% luego de 24 horas.
El material de vidrio deberá ser preferentemente de borosilicato. Para ser utilizado es necesario tratarlo previamente con HNO 3 1:1 durante 24 horas. Posteriormente enjuagarlo tres veces
con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces con agua bidestilada, para evitar cualquier contaminación.
El material de plástico será preferentemente de polipropileno.

Reactivos:

- Buffer Fosfato: 29 ml de fosfato disódico 0,1 M con 71 ml de fosfato monosódico 0,1 M. Ajustar el pH a 6,4 con la solución correspondiente. Mantener en heladera a 4ºC.
- Buffer Sustrato: disolver 0,01676 gr de -ALA p.a. en 5 ml de fosfato monosódico 0,1 M, llevar a pH 6,4 con fosfato disódico 0,1 M. Completar a 10 ml con buffer fosfato de pH 6,4. Se
conservará en freezer a -18ºC.
- Reactivo de Erlich: disolver 0,24 gr de p-DMAB en 7,2 ml de ácido acético glacial, posteriormente agregar 1,92 ml de ácido perclórico, completando a un volumen de 12 ml con ácido
acético glacial. Se prepara en el momento de usar.
- Acido tricloro acético (TCA) 10%: Pesar 10 gr de TCA y disolver en 100 ml de agua destilada.

Técnica:

A un volumen de 0,2 ml de sangre agregar 1,3 ml de agua bidestilada y 1 ml de buffer sustrato. Se produce la hemólisis total de la muestra de sangre.
Paralelamente se procesa un blanco con 0,2 ml de sangre a la que se le agrega 1,3 ml de agua bidestilada, 1 ml de TCA 10% y 1 ml de buffer sustrato.
Incubar los tubos de blanco y muestra durante 60 minutos a 38ºC; el tiempo de incubación se empieza a contar desde el agregado de buffer sustrato a las muestras. Cumplido el tiempo
de incubación, se le agrega al tubo de muestra 1 ml TCA 10%. Se centrifugan luego todos los tubos durante 10 minutos a 2000 rpm.

Reacción de color: A un volumen de 1,5 ml del centrifugado agregar 1.5 ml de reactivo de Erhlich. Mezclar en Vórtex y leer luego de 10 minutos las absorbancias respectivas contra
reactivo de Erhlich a 555 nm.

Expresión de resultados:

Abs x 100 x f x D Abs x 1881,72

Act =
-ALA DEHIDRATASA =

Hto x t x Hto
m

donde:

m: coeficiente de extinción molar en l / µmol. cm = 0.062

Act -ALA DEHIDRATASA : en U/ lt de hematíes

f: factor de conversión de -ALA a PBG = 2
D: factor de dilución = 35
t: tiempo de incubación.

Valor de referencia para la actividad enzimática en sujetos sanos no expuestos al plomo: mayor a 20 U / L hematíes o 20 µmol / min L hematíes.

Determinación en aguas

Antes de la recolección de la muestra, debe tenerse en cuenta qué tipo de metales se quieren investigar: metales disueltos, suspendidos, totales o recuperables totales. Los metales
disueltos son aquellos que atraviesan una membrana filtrante de 0.45µ. Los metales suspendidos son los que quedan retenidos por la membrana de 0.45µ. Los metales totales
corresponden a la concentración determinada sobre una muestra sin filtrar seguida por una vigorosa digestión y los metales recuperables totales corresponden a la concentración de
metales en una muestra sin filtrar seguida de un tratamiento con ácido mineral diluido caliente.
El recipiente para la recolección de muestras de agua debe ser de vidrio al borosilicato, de polietileno lineal, polipropileno o teflón. Los mismos deben lavarse intensamente con detergente
y agua corriente, enjuagados con ácido nítrico 1:1, agua corriente, ácido clorhídrico 1:1 y finalmente con agua destilada deionizada.

Procedimiento

Para la determinación de metales disueltos, las muestras deben estar libres de turbiedad o filtradas a través de membrana filtrante de 0.45µ (previamente lavada con ácido nítrico diluido).
La muestra debe ser filtrada en el momento de la recolección y luego acidificada con 2ml de nítrico concentrado por litro de muestra.
Para la determinación de metales suspendidos la muestra se filtra a través de una membrana filtrante de 0.45µ (previamente lavada con ácido nítrico diluido) y el análisis se realiza sobre
la porción de muestra retenida en la membrana. Se transfiere la membrana a un vaso de precipitado de 250ml y se agrega 3ml de nítrico concentrado. Cubrir el vaso con un vidrio reloj y
calentar. Cuando se ha disuelto la membrana incrementar el calentamiento y evaporar a sequedad. Enfriar y agregar 3ml de ácido nítrico continuar calentando hasta que se complete la
digestión dado por un residuo de color claro. Agregar residuo seco 2ml de ácido clorhídrico (1+1) y calentar muy bien hasta disolver el material. Lavar las paredes de vaso de precipitados
con agua deionizada y filtrar si es necesario para eliminar los silicatos u otros materiales insolubles que pueden obturar el atomizados. Llevar al volumen original de la muestra con agua
deionizada.
La concentración de metales totales resulta ser la suma de las concentraciones de las fracciones disueltas y suspendidas.
La determinación de metales extraíbles se realiza después del agregado de ácido mineral (2ml/l) y del agitado vigoroso permitiendo que repose durante una noche. En muchos casos,
esto representa el contenido metálico total si han sido disueltos todos los sedimentos; por lo que la muestra estaría lista para el análisis.
Equipos

Espectrofotómetro de absorción atómica: debe poseer uno o dos canales haz de luz simple o doble monocromador a red de difracción, detector fotomultiplicador, ranuras ajustables, rango
variable de 190 a 800 nm e interconección a un registrador.
Lámparas de cátodo hueco pueden utilizarse las del elemento simple o las multicátodo.
Reguladores de presión

Reactivos

Agua destilada deionizada

Acido nítrico concentrado grado espectroscópico.
Acido nítrico (1:1)
Acido clorhídrico (1:1)
Combustible y oxidante se usa generalmente acetileno comercial y aire proveniente de un cilindro con aire comprimido.
Soluciones stock standard del metal

Preparación de los standards y calibración

Se preparan a partir de metales de alta pureza, sales de calidad analítica no higroscópicas usando agua destilada y ácido nítrico. Las soluciones stock se preparan en concentraciones de
1000 mg de metal por litro. Los standards de calibración se preparan por dilución de la solución stock del metal en el momento del análisis y se descartan luego del uso. Se deberá
preparar un blanco y como mínimo cuatro standards de calibración en intervalos de acuerdo al rango total tomado. Se preparan empleando el mismo ti po y concentración de ácido usado
en la preparación de las muestras (ácido nítrico 1:1). Aspirar el blanco y las soluciones registrando las lecturas. La curva de calibración debe cubrir un rango apropiado de concentración
que produce una absorción de 0 a 80 %.
1 - INTOXICACIONES ALIMENTARIAS:

MICOTOXINAS

Dentro del amplio tema de intoxicaciones debido al consumo de alimentos el mayor interés se concentra en las levaduras, los mohos y las setas comestibles y venenosas.

Este diverso conjunto de organismos, se caracteriza por poseer una estructura eucariótica, un metabolismo heterótrofo y una pared externa. Así a diferencia de las plantas, los hongos
requieren de fuentes de carbono orgánicas de diferente grado de complejidad. La presencia de la pared determina su forma de alimentarse, a través de la absorción de nutrientes
solubles.

Los hongos filamentosos, comúnmente llamados mohos, son activos agentes del biodeterioro. Si bien no causan el tipo de degradación putrefactiva asociada a algunas bacterias, alteran
las características organolépticas haciendo que los alimentos enmohecidos no sean aptos para el consumo humano. Debemos hacer la salvedad que algunas modificaciones inducidas
por ciertos hongos en los alimentos son deseables, tal como ocurre con algunos quesos, embutidos, etc.

La actitud del hombre frente a la contaminación fúngica de los alimentos, se ha ido modificando, debido a un descubrimiento reciente, relacionado con la capacidad que tienen muchos
hongos contaminantes de producir una gran variedad de metabolitos secundarios denominados MICOTOXINAS.

Estas sustancias presentan estructuras químicas diversas y han sido involucradas tanto en brotes de enfermedades que afectan a diversas especies animales como en una amplia
variedad de enfermedades humanas, desde la gastroenteritis hasta el cáncer.

Las enfermedades producidas por la ingestión de micotoxinas se denominan MICOTOXICOSIS.

El reconocimiento del problema de las micotoxinas data de comienzos de los años sesenta, cuando se produjo en Inglaterra la muerte a un gran número de aves de corral. En esa
oportunidad se pudo comprobar que la causa de la enfermedad había sido la presencia de metabolitos tóxicos producidos por el hongo Aspergillus fl avus, contaminante del maní
empleado para la preparación de las raciones alimentarias de las aves. A esas sustancias desconocidas hasta entonces, se las llamó AFLATOXINAS.

Además de los problemas asociados con la salud, han causado un gran impacto económico en el comercio internacional. Principalmente, en los países productores y exportadores de
alimentos como el nuestro.

HONGOS PRODUCTORES DE MICOTOXINAS:

Los hongos productores de micotoxinas están ampliamente difundidos en el medio ambiente y son contaminantes frecuentes de los alimentos, especialmente los de origen vegetal.

Las especies toxicogénicas de mayor importancia pertenecen a tres géneros:Aspergillus, Penicillium y Fusarium.

También producen micotoxinas ciertas especies de Alternaria, Claviceps, Stachybotrys, Pythomyces, Thrichotecium, Byssochlamys y Rhizopus, entre otros.

Estos organismos son capaces de crecer sobre una gran variedad de sustratos bajo diversas condiciones ambientales. La mayoría de los productos agrícolas son susceptibles de la
invasión por mohos durante alguna de las etapas de producción, procesado, transporte y almacenamiento. La presencia de mohos en un alimento no implica necesariamente la presencia
de micotoxinas, sino que indica un riesgo potencial de contaminación. Por otra parte, la ausencia de hongos toxicogénicos no garantiza que un alimento esté libre de micotoxinas, pues
éstas persisten aún cuando el hongo ha perdido su viabilidad.

Las toxinas de los hongos se diferencian de las de origen bacteriano, asociadas a intoxicaciones alimentarias, dado que éstas últimas, en su mayoría son macromoléculas tales como,
proteínas, polisacáridos, etc. las micotoxinas son compuestos de peso molecular bajo. Por otra parte su química puede ser compleja y presentan una estabilidad frente a agentes físicos y
químicos que las hacen muy difíciles de eliminar una vez que han sido producidas en los alimentos.

GENERO ASPERGILLUS y SUS TOXINAS:

Los mohos de éste género causan deterioro en muchos productos alimenticios. Sus productos metabólicos son altamente tóxicos tanto para los animales como para el hombre. Algunas
especies son de interés industrial, mientras que otras se emplean en la fermentación de alimentos en algunas regiones.

El factor principal de la ubicuidad de los aspergilos es su capacidad para crecer a diferentes temperaturas sobre sustratos con contenido de humedad variables. El rango de temperatura
de crecimiento de los mismos oscila entre 0º a 55º C para la mayoría de las especies.

El color es la principal característica macroscópica para la identificación de los grupos de aspergilos. Poseen distintos tonos de verdes, pardo, amarillo, blanco, gris y negro.

Son varios los metabolitos secundarios de los aspergilos, algunos de los cuales también pueden ser producidos por Penicillium. Es común que las condiciones óptimas para el crecimiento
de las especies toxicogénicas no coincidan con las que facilitan la producción de micotoxinas. El aumento de los metabolitos secundarios es una respuesta al “stress”.

Dentro de las micotoxinas producidas por éste género se puede citar entre otras: ácidos aspergílicos (neurotoxina), ácido ciclopiazónico (neurotoxina-necrótica), aflatoxinas B1,B2,G1,G2,
(hepatotóxica, cancerígena) ,citrinina (nefrotóxica), esterigmatocistina (hepatotóxica, cancerígena), ocratoxina A (hepatotóxica, nefrotóxica, teratogénica, inmunosupresora), patulina
(hepatotóxica, nefrotóxica).

Se representan algunas de las estructuras químicas de algunas toxinas y sus metabolitos :

GENERO FUSARIUM y SUS TOXINAS:

Las especies de Fusarium son “mohos de campo”, ya que se encuentran sobre los vegetales antes de la cosecha, persistiendo sobre los productos almacenados. Los fusarios no
compiten bien con los “mohos de almacenaje”. (Aspergillus, Penicillium), salvo el F. culmorum. Alguno de los fusarios son patógenos para los cereales y pudiendo formar micotoxinas aún
antes de la cosecha. Pueden crecer durante el almacenamiento refrigerado y contribuir a la podredumbre de frutas y hortalizas almacenadas.

Las micotoxinas principales producidas por los fusarios comunes son: DAS (diacetoxiscirpenol), NIV (nivalenol), ZEA (zearalenona), MON (moniliformina), FUM (fumonisinas), T2 (toxina
T2), DON (deoxinivalenol), entre otras.

A continuación se muestran alguna de sus estructuras químicas:

Tricotecenos: Son tóxicos potentes de las células eucarióticas, causan lesiones dérmicas y alteraciones en la respuesta inmunológica. Tienen acción letal a altas dosis.
Zearalenona:Son estrogénicas, actúan sobre el aparato reproductor , en el cerdo producen vulvovaginitis, abortos y atrofia de genitales.
Moniliformina: Produce la leucoencefalomalacia equina, dan temblores y produce la licuación de cerebro.
Fumonisinas: Interfiere en el metabolismo de los esfingolípidos. Se aislaron la B1, B2 y B3, la principal es la B1, estan muy relacionadas con la leucoencefalomalacia equina.

GENERO PENICILLIUM y SUS TOXINAS:

Los penicilios crecen sobre los alimentos preparados o sus materias primas, ya sean de origen vegetal o animal.

Sus micotoxinas consumidas regularmente, aún en cantidades mínimas, causan lesiones irreversibles en riñon, hígado, cerebro y tienen actividad teratogénica.

Producen una gran variedad de micotoxinas, siendo algunas de ellas: ácido ciclopiazónico, ácido penicílico, citreoviridina, citrinina, ocratoxina A, patulina, penitrem A, rubratoxina A,
rubratoxina B, toxina PR, veruculógeno y roquefortina.
A continuación se muestran alguna de sus estructuras químicas:

Ocratoxina A: Producida por P. verrucosum, se encuentra sobre cereales, embutidos y quesos. Produce degeneración grasa del hígado y necrosis del tejido renal en aves de corral. Se
acumula en tejido graso de animales y de ésta forma pasa al ser humano.

Citrinina: Es un metabolito de P. citrinum. Incorporada en la dieta de animales puede causarles la muerte por degeneración renal.

Patulina: Producida por el P. griseofulvum, común en cereales y nueces, P.expansum, frecuente en manzanas y P. roquefortii es ubicuo. Es una micotoxina hepatotóxica, nefrotóxica y
mutagénica.

TECNICAS DE ERRADICACION DE MICOTOXINAS:

Como ya se citó, el problema de la presencia de micotoxinas data de muchos años atrás y representa un grave trastorno para la industria y la agricultura, cuyos objetivos son minimizar la
presencia de éstas sustancias.

Técnicas de decontaminación:
Los procedimientos de decontaminación pueden clasificarse en:

a)Métodos de eliminación:
1.- Químicos
2.- Físicos
3.- Biológicos
b)Métodos por inactivación:
1.- Químicos
2.- Físicos

Un tratamiento efectivo debe inactivar, destruir o eliminar la toxina y no dejar residuos tóxicos en el alimento.

La eliminación física por separación manual o electrónica es usada para reducir los niveles de micotoxinas, principalmente aflatoxinas en maní. Sin embargo, no es un método útil para
semillas de algodón, maíz o sus derivados.

Los métodos químicos son los que han sido más efectivos en el objetivo de minimizar la producción de hongos y sus micotoxinas, por ejemplo la amoniación, donde se usa hidróxido de
amonio o amoníaco gaseoso. Otro gas empleado es el cloro, en distintas concentraciones.

Otros procedimientos han empleado sustancias que son aditivos alimentarios, como por ejemplo, ácido sórbico, ácido fítico, acetato de sodio, ácido propiónico.

Niveles máximos de tolerancia para aflatoxinas:

máximo
País Producto
(µg/kg ó /lt)
Maíz, maní y sus productos 5 (B1) ó 20
Alimentos para bebés 0 (B1)
Argentina
Harina de soja 30 (B1)
Leche fluída y en polvo 0.5 (M1)
Australia Todos los alimentos 5
Austria Todos los alimentos 50
Brasil Alimentos para humanos 30
Canadá Nueces y sus productos 15
 Alimentos para humanos y aves 20
Oleaginosas 10
Colombia
Cereales 30
Alimentos para bovinos 50
Alimentos completos para animales en general 50 (B1)
Alimentos completos para ganado no lechero 50 (B1)
Comunidad
Alimentos completos para aves y cerdos 20 (B1)
Europea
Alimento complementario para ganado lechero 20 (B1)
Otros alimentos completos 10 (B1)
Alimentos para humanos y piensos o materias primas para alimentos de animales,
Cuba 5
cereales y maní
Alimentos animales 5 (B1) ó 20
Chile
Ingredientes de alimentos para animales 20 (B1) ó 50
Japón Todos los alimentos 10 (B1)
USA Todos los alimentos 20

Cuando no se indica otra cosa, las concentraciones están dadas para (B 1+ B2 + G1 + G2) .

INVESTIGACION:

El análisis de micotoxinas se plantea según un esquema que consta de varias etapas básicas.

Este esquema sufre modificaciones en función de la naturaleza de la muestra y del propósito del análisis.

Las metodologías que implican el uso de enzimoinmunoensayos puede aplicarse directamente luego de la etapa de extracción. Estas técnicas presentan una alta sensibilidad y
especificidad para distintas micotoxinas y arrojan resultados cuantitativos de mucha precisión.

ETAPA DESCRIPCION OBJETIVO

con equipos automáticos
MUESTREO obtención de muestras representativas
de muestreo
PREPARACION molienda, mezclado y Submuestra muestra representativa
DE LA MUESTRA
EXTRACCION en shaker separación de las toxinas

CLEAN-UP
en ampolla o columna Cromatográfica separación de toxinas
O LIMPIEZA
SEPARACION FINAL TLC, GLC, HPLC separación y purificación de toxinas
DETECCIÓN Y
fluorescencia (TLC), detector de llama (CG) detección visual y densitometría (TLC)
CUANTIFICACION
ensayos biológicos
CONFIRMACION espectrometría de masas
derivatización (TLC)

CUESTIONARIO:

1. Qué entiende por micotoxinas? A qué se debe su producción por parte del hongo?

2. En una muestra de cereal, donde no se observa desarrollo fúngico,podemos asegurar que no existen micotoxinas en esa muestra?

3. Cuál es la importancia de detectar la presencia de micotoxinas en alimentos? Ejemplifique.

4. Qué métodos de decontaminación se aplican? Cuáles son los más efectivos, por qué?

5. Cuál es el objetivo de la etapa denominada “clean- up”?

6. En qué se basa para afirmar la presencia de aflatoxinas en una muestra?

2 - PLAGUICIDAS

DEFINICIÓN:

Según la OMS, un pesticida o plaguicida es cualquier sustancia o mezclas de sustancias, de carácter orgánico o inorgánico, que está destinada a combatir insectos, ácaros, roedores y
otras especies indeseables de plantas y animales que son perjudiciales para el hombre o que interfieren de cualquier otra forma en la producción, elaboración, almacenamiento, transporte
o comercialización de alimentos, producción de alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, también aquellos que pueden administrarse a
los animales para combatir insectos arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos.

CLASIFICACION: Según la especie a combatir

Compuestos arsenicales
Compuestos fluorados
INSECTICIDAS MINERALES
Azufre
MINERALES Derivados del selenio
ORGANICOS DE SINTESIS Organofosforados
 Organoclorados
Carbamatos
Aceites antracénicos
A BASE DE ACEITES MINERALES
Aceites de petróleo
Nicotina
DE ORIGEN VEGETAL Piretrina
Rotenona
Sales de NH4+, Ca++, Cu++, Fe+++, Mg++, K+, Na+, en forma de
MINERALES
sulfatos, nitratos, cloruros, cloratos.
Fitohormonas
Derivados de la urea
Triazinas y Diazinas
ORGANICOS
HERBICIDAS Derivados de los fenil sustituidos y las quinoxalinas
Derivados de la oxiquinoleína
Derivados de las tiadizinas y tiadiazoles
Parquat
OTROS Diquat
Piclorame
Sales de cobre
MINERALES Compuestos arsenicales
Aceites minerales
ORGANOMETALICOS Derivados órganomercuriales
FUNGUICIDAS
Carbamatos y ditiocarbamatos
Derivados del benceno
ORGANICOS
Amicidas
Benzonitrilos
Derivados cumarínicos Warfarinas
RODENTICIDAS
Inorgánicos Sales de talio

El término plaguicida incluye también los siguientes tipos de sustancias: reguladores del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes, agentes para reducir la densidad de la fruta,
agentes para evitar la caída prematura de la fruta y sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha, para proteger el producto contra el deterioro, durante el
almacenamiento y transporte.

Desde el punto de vista de la toxicología, es importante señalar que las formulaciones de plaguicidas además del principio activo incluyen sustancias transportadoras, diluyentes como
agua o solventes orgánicos, aditivos e impurezas, que pueden tener potencial tóxico por si mismas.

El análisis de plaguicidas puede clasificarse en diversas áreas:

-Forense
-Diagnóstico de urgencia
-Control de poblaciones expuestas y no expuestas.
-Contaminación ambiental.

Si el plaguicida fue causa de muerte, estará en alta concentración, al igual que en una intoxicación aguda grave. En las dos últimas áreas se trabaja con muestras con niveles muy bajos
de plaguicidas (menores de 0,1 ppm), se habla de “residuos” de plaguicidas. De todos ellos estudiaremos los insecticidas organoclorados, organofosforados y carbamatos, por ser los más
utilizados actualmente y producir efectos tóxicos muy característicos.

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

Estas propiedades son las determinantes de su cinética ambiental. El aire, el agua, el suelo y los alimentos retienen gran parte de los pesticidas y éstos llegarán a los seres vivos.
Constituye un problema actual su persistencia en el medio ambiente, su concentración y transformación en organismos vivos.

ORGANOFOSFORADO ORGANOCLORADO
Estabilidad Muy baja elevada
Persistencia baja alta
Efectos bioacumulativo no posee muy grande
Toxicidad aguda alta baja
Solubilidad en agua alta baja
Hidrofobicidad bajo alto
Costo alto bajo
Selectividad alta baja

ETIOLOGIA

Las intoxicaciones accidentales son generalmente de origen profesional, afectando al los obreros que trabajan en la preparación de los insecticidas o a los peones rurales durante o
inmediatamente después de la aplicación en cultivos.

Las intoxicaciones alimentarias se deben al consumo de alimentos tratados impropiamente con pesticidas. Las intoxicaciones casuales se deben generalmente a confusiones, manejo
imprudente y falta de vigilancia de los niños.

Las intoxicaciones suicidas y criminales se han hecho más frecuentes debido a su alta toxicidad y fácil adquisición.
PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS

Desde el punto de vista estructural, constituyen un grupo de sustancias, muy heterogéneo, teniendo en común la presencia de estructuras monocíclicas o policíclicas con distinto número
de sustituyentes cloro.

Incluyen varios grupos:

a) Grupo de los Ciclodienos:Aldrín y su epóxido, el Dieldrín, Mirex
b) Grupo del DDT (dicloro-difenil-tricloroetano): p-p´-DDT, o-p´-DDT, p-p´-Metoxiclor.
c) Grupo del Hexaclorociclohexano (HCH) y Hexaclorobenceno(HCB): HCH, -HCH, HCB.
d) Grupo de los indenos clorados: hepatacloro, a-Clordano.
e) Grupo de los terpenos clorados: Toxafeno.

Absorción

Por vía digestiva principalmente; a través de la piel cuando están en solventes lipídicos y a través de la vía respiratoria por su aplicación en forma de pulverizaciones.

Mecanismo de acción

Poseen acción neurotropa, aunque no se conoce bien el mecanismo sobre el sistema nervioso. A largo plazo, inducen las enzimas microsomales hepáticas. Son inductores en cantidades
residuales, del orden de las que pueden estar acumuladas en el tejido adiposo.

En el hombre, al igual que en el medio ambiente, se degradan lentamente y se pudo determinar que tienen una gran afinidad por los tejidos grasos. Estas cantidades acumuladas en
grasas preocupan, pues por ejemplo, en el caso de adelgazamiento brusco pasan a la circulación general y producen síntomas de intoxicación.
Preocupa también, porque pasan en cantidades considerables a la grasa de la leche. Los recién nacidos se pueden ir contaminando, debido a los residuos de pesticida presentes en su
alimento natural.

Muestras

La sangre es la muestra más adecuada para la búsqueda de plaguicidas organoclorados ya que por su gran liposolubilidad rara vez aparecen en orina. Se colectan 8-10 ml de sangre en
tubo de centrífuga heparinizado.

Jugo gástrico: evitar el agregado de carbón vegetal . Conservar en la heladera.

Distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos cárneos y aguas. Los alimentos son considerados como la principal vía de acceso de los pesticidas
organoclorados al organismo (80-90% del ingreso diario de plaguicidas según Kaphalia, 1985).

PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS

Son sustancias biodegradables en la naturaleza, sin tendencia a acumularse en las grasas del organismo, pero con gran actividad neurotóxica que va a producir intoxicaciones agudas de
gravedad. Son los insecticidas, junto con los carbamatos y piretroides, más ampliamente utilizados en la actualidad.

Sus estructuras químicas derivan de la sustitución por restos orgánicos en el fósforo pentavalente. Pueden clasificarse como:

a) Derivados de la molécula del ácido fosfórico. Si los dos primeros oxhidrilos se esterifican con radicales alquílicos se obtienen los alquil-fosfatos o alquil-pirofosfatos (ejemplo: dichlorvos)
. Si dichos oxhidrilos se sustituyen por amidas se obtienen las fosforamidas (ejemplos: metamidofós, acefato).
b) Derivados de la molécula del ácido fosforotiónico: De este ácido derivarán a su vez numerosos ésteres tiofosfóricos (ejemplo: paratión).

c) Derivados del ácido fosforotiolotiónico. (ejemplo: malatión).

d) Derivados del ácido fosforotiólico (ejemplos: malaoxón, demeton-S-metil.).

Mecanismo de acción

Los insecticidas organofosforados actúan combinándose con gran afinidad con cierto tipo de esterasas, con la consecuencia de su inactivación. Esta reacción, en el contexto de la
fisiología de sus funciones, es irrevesible. Los oxofosforados (enlces P=O) son fuertemente inhibidores, mientras que los tiofosforados (P=S) no son fuertemente inhibidores y necesitarán
de una biotransformación a la forma oxo para actuar como inhibidores.

En particular, la inhibición de las colinesterasas es la que va a derivar en los síntomas y signos de la intoxicación aguda. El papel fisiológico de la colinesterasa consiste en la hidrólisis de
la acetilcolina, mediador químico en la transmisión del impulso nervioso. Se acumulan así grandes cantidades de acetilcolina en las sinapsis.

Existen dos tipos de colinesterasas: la colinesterasa verdadera, presente en eritrocitos y tejido nervioso y la pseudocolinesterasa presente en suero o plasma.

Ambas enzimas son inhibidas por los compuestos organofosforados, pero la eritrocitaria es la que mejor refleja el estado de inhibición de la colinesterasa del sistema nervioso, por lo que
se utiliza para evaluar el estado de intoxicación aguda de un paciente. Por otro lado, la colinesterasa plasmática o pseudocolinesterasa es la que más tarda en regenerarse, por lo que se
utiliza en la evaluación de la exposición crónica a organofosforados.

Absorción:

Los ésteres fosforados se absorben fácilmente a través de la piel y más rápidamente por vía digestiva. La absorción respiratoria es casi instantánea.

Muestras

La muestra mas utilizada para la determinación de organofosforados y sus metabolitos es orina de 24 hs, colectada en envase de vidrio y conservada en heladera.
También, como índice de la intoxicación, puede determinarse la actividad de las colinesterasas sanguíneas: plamática o eritrocitaria.
La determinación de residuos se realiza, por un lado, en distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos cárneos y aguas de bebida, y por otro lado en muestras
ambientales como aguas superficiales y suelos.

CARBAMATOS

Forman parte de una gran familia de plaguicidas entre los que se hallan herbicidas, fungicidas e insecticidas. Todos ellos derivan del ácido carbámico:

Se los divide en tres grupos:

1-N-metil carbamatos: uno de los hidrógenos del grupo amino es reemplazado por un grupo metilo (ejemplos: Aldicarb, Carbaryl, Carbofuran).

2-N,N, dimetil Carbamato: ambos hidrógenos del grupo amino son reemplazados por grupos metilos (ejemplos: Isolan, Pirolan).
3-N-fenil Carbamatos: un grupo fenilo sustituye a uno de los hidrógenos del grupo amino.

Mecanismo de acción

Es equivalente al mecanismo de acción de los organofosforados, uniéndose a las colinesterasas e inactivándolas. Pero ésta unión es reversible espontáneamente en menos de una hora,
de manera que en el curso de una intoxicación aguda por carbamatos se manifiestan los mismos signos y síntomas de la intoxicación por organofosforados pero con un curso más rápido
hacia la recuperación.

Muestras

Se los encuentra en orina de 24 hs. También se los halla en distintos tipos de alimentos contaminados, principalmente de origen vegetal.

INVESTIGACION DE PLAGUICIDAS
CONSIDERACIONES GENERALES

Los plaguicidas deben aislarse de los materiales en los que se encuentran para su investigación. Los extractos deben someterse a una purificación antes de investigarlos y/o
determinarlos cuantitativamente. La identificación se realiza por CGL o TLC. La CGL permite alcanzar más bajos límites de detección , sobre todo con detectores específicos para cada
clase de pesticida (OC, OP ).

Se distinguen tres pasos fundamentales en su determinación:

1- EXTRACCION del plaguicida de la matriz originaria y traspaso a una fase separable. La mayoría de los plaguicidas se extraen de las muestras con solventes como el éter de petróleo,
acetonitrilo o acetona; o bien cloroformo o éter etílico en medio neutro o ácido dependiendo del plaguicida y del tipo de muestra.
MUESTRAS que pueden llegar al laboratorio:
-Biológica: lavado gástrico, sangre, orina , vísceras.
-No biológica: preparados (polvos, emulsiones, etc.), alimentos, agua, aire, suelo.

2- PURIFICACION del plaguicida (eliminación de otras sustancias interferentes).Los métodos de purificación no son generales para los distintos plaguicidas y algunos no lo son, siquiera
para todos los plaguicidas de una misma familia. En general, los extractos pueden purificarse por partición con solventes y/ o por cromatografía en columna de florisil, celite, sílica gel,
alúmina o carbón activado.

3- DETERMINACION Cualitativa y/o Cuantitativa (TLC y CGL). La identidad de un plaguicida debe confirmarse por un segundo método. Por ejemplo, si el plaguicida se ha reconocido por
CGL podrá efectuarse un TLC; una CGL empleando un detector selectivo para otro elemento presente en el plaguicida; o bien una CGL con columnas recubiertas con fase(s) de polaridad
diferente a las usadas en el primer análisis; o una CGL combinada con un espectrómetro de masas.

Para el dosaje de plaguicidas se requieren métodos que los separen y detecten cuantitativamente, siendo el más adecuado la CGL.

A- Investigación de plaguicidas en frutas y verduras

1- EXTRACCIÓN: tomar 50 gramos del vegetal elegido y se colocan en un homogeneizador (licuadora) junto con 100 ml de acetonitrilo y 5 gramos de celite, homogeneizar durante 2
minutos a gran velocidad. Filtrar por succión con papel de filtro poro medio y medir el volumen obtenido: V1

Transferir la mitad de V1 a una ampolla de decantación de 500 ml, agregar 20 ml de éter de petróleo (EP); agitar durante 1 o 2 minutos, luego agregar 10 ml de sol. concentrada de ClNa y
100 ml de agua destilada.

Agitar vigorosamente durante 30-45 segundos. Retirar la fase acuosa. Lavar la fase EP con 20 ml de agua destilada dos veces. Filtrar la fase EP por papel de poro medio que contenga
sulfato de sodio anhidro y medir el volumen obtenido: V2.

Concentrar en plancha calefactora o en Baño de María (con mucho cuidado hasta 2 o 3 ml finales).En el residuo se identifican OC y OP por TLC y/ o CG (en el residuo purificado).

2-PURIFICACIÓN: (Fase Estacionaria por Vía Húmeda): tomar entre 3 y 5 gramos de florisil activado a 650ºC, 5 Hs. y luego mantenido a 130ºC . Suspender en éter de petróleo. Agregar
esa suspensión a la columna cromatográfica poco a poco, de manera que se forme una lluvia fina de Florisil, homogeneizando con golpes cuidadosos, hasta obtener una altura de 10 cm.
Sobre el Florisil y operando de manera similar, añadir sulfato de sodio anhidro llegando a una altura total de 12 cm.

Dejar eluir el EP hasta que sólo sobrepase la fase estacionaria Florisil-sulfato de sodio en 2-3 mm. y sembrar la muestra. Dejar eluir hasta unos pocos mm por encima del sulfato de sodio
y comenzar con el agregado del eluyente elegido (al principio, el agregado se efectúa con pipeta , para no romper la fase estacionaria y luego se llena el reservorio). Se eluye a una
velocidad de flujo de 5mm/ min o menor, con tres fracciones de solvente de elución de 100 ml cada una.

El primer solvente de elución es éter etílico al 6% en éter de petróleo, el segundo es éter etílico al 15% en éter de petróleo, y el tercero es éter etílico al 50% en éter de petróleo.

Los plaguicidas se van eluyendo de acuerdo a la relación de polaridades de estos dos solventes:

Fracción del 6%:

Clorados: Aldrin, DDE, DDT, Heptacloro
Fosforados: Ethión
Fracción del 15%:
Clorados: Dieldrin, Endrin
Fosforados: Metilparatión, Diazinón, Paratión
Fracción del 50%:
Fosforados: Malatión

Concentrar cada fracción hasta no más de 2-3 ml. Este será utilizado para sembrar en TLC o inyectar en un cromatógrafo gaseoso.
B-Investigación de plaguicidas en orina, sangre y lavado gastrico
1-EXTRACCION:

Se utilizan las columnas tipo EXTRELUT , rellenas con tierra silícea como soporte inerte.

Si la muestra a sembrar consiste en ORINA, se acidificarán 19 ml de la misma con 1 ml de solución saturada de ACIDO TARTARICO (pH: 5-6).

Si la muestra es PLASMA o SUERO se realiza una dilución con agua destilada (4 ml de suero o plasma se llevan a 19,5 ml con agua destilada) y se acidifica con 0,5 ml de solución
saturada de ácido tartárico.

Si la muestra es LAVADO GASTRICO, se toman 9,5 del mismo y se llevan a 19 ml con agua destilada (si no se practica la dilución , el líquido taponaría la columna por su alta densidad) y
se acidifica con 1 ml de solución saturada de ácido tartárico.

Se realiza una primera elución con éter de petróleo (E1). Se cambia el recipiente de recolección y se eluye ahora con éter etílico obteniéndose un segundo extracto (E2). Ambos extractos
se concentran por evaporación a Baño María.

En el primer extracto (E1), se aislarán los plaguicidas ORGANOCLORADOS. Para sembrarlo en TLC es necesario resuspender con Hexano.

En el segundo extracto (E2) se hallarán los ORGANOFOSFORADOS y CARBAMATOS. Para sembrarlo en TLC, es necesario resuspender en una mezcla Tolueno: Propanol (1: 1).

C- Investigación de plaguicidas en aguas

Se colocan 750 ml de agua (muestra) en una ampolla de decantación de 1 litro. Se agrega 25 ml de n-hexano. Se agita vigorosamente durante 1 minuto. Se separan las fases y se recoge
la capa de n-hexano. Se efectúan 2 extracciones más con n-hexano y se reúnen los extractos. Secar la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro. Filtrar y concentrar a baja temperatura.

Generalmente se hallan trazas de plaguicidas en agua, por eso se parte de un gran volumen de muestra.

D- Investigación de plaguicidas en visceras. Método de Fassi adaptado.

1-EXTRACCION:

En un vaso de precipitados se colocan 50 gr. de papilla de vísceras, bien trituradas, se le agrega ácido tartárico sólido (como desproteinizante) hasta pH ácido y luego sulfato de sodio
anhidro mezclando hasta consistencia pastosa. La mezcla se seca bajo una corriente de aire caliente (secador de cabello).

El contenido del vaso se transvasa a un erlenmeyer con tapa esmerilada. El material se extrae con éter de petróleo (punto de ebullición 40-60ºC ) agregándolo hasta cubrir la papilla.
Agitar enérgicamente durante 60 segundos, repitiéndose el proceso dos veces más. Dejar en reposo hasta una neta separación de las fases. Reservar la fracción etérea para la
investigación de plaguicidas.

2-PURIFICACION:

El extracto de éter de petróleo se trata con acetonitrilo saturado en éter de petróleo; se dispersa en agua (200 ml de agua destilada con 10 ml de solución saturada de ClNa); se extrae con
50 ml de éter de petróleo.
Si el extracto está impuro se toma con Celite 545 , mezclando cuidadosamente y eliminando el solvente en corriente de aire, hasta que no queden partículas aglomeradas.

Se prepara una columna (de 0,8 x 16 cm) taponándola con algodón y colocando en ella la muestra absorbida en el Celite a través de un embudo y compactando el polvo tanto como sea
posible con una varilla.

Se prepara una segunda columna (de 1,4 x 16 cm) con llave, llenándola con éter de petróleo, empujando con una varilla de vidrio un tapón de algodón hasta el fondo. Posteriormente se
agregan 5 g de alúmina y luego 5 g de Florisil , cubriendo finalmente con una capa de arena de 2 a 2,5 cm de espesor, drenándose el solvente , hasta que el nivel del mismo alcance la
parte inferior de la capa de arena.
Se inserta el extremo inferior de la columna de 0,8 cm en el extremo superior de la columna de 1,4 cm. La columna pequeña que contiene los plaguicidas se eluye con 3-4 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) aplicando presión positiva.
Abriendo la llave de la columna grande se permite la entrada del DMSO en el Florisil, retirándose luego la columna superior y comenzando la elución con 100 ml de éter de petróleo.
Recoger el eluído en un vaso de precipitado y evaporar suavemente.

DETERMINACION cuali / cuantitativa de OC, OP y CARBAMATOS.

a)-IDENTIFICACIÓN DE ORGANOCLORADOS POR TLC

Se usa esta metodología cuando se sospecha una alta concentración de plaguicida en la muestra. Sembrar la muestra (el extracto etéreo purificado) y patrones en una placa de sílica G (9
gramos de sílica G: 18 ml de agua).

Fase Fija: sílica gel G activada a 120ºC durante 2 Hs.

Fase Móvil: n Hexano:Acetona (9:1)
Testigos: DDT, Gamexane

Desarrollar hasta llegar el frente de solvente a 10 cm.

Revelado: Difenilamina al 0.2% en etanol absoluto.
Rociar y exponer a UV entre 20 -60 minutos. Determinar los Rf característicos de las muestras y patrones. Se detectan concentraciones del orden de los microgramos.

b)-IDENTIFICACIÓN DE ORGANOFOSFORADOS POR TLC

Fase fija: sílica gel G activada a 120ºC durante 2 Hs.

Fase Móvil: n Hexano:Acetona (8:2)
Testigos: Paratión, Malatión

Revelado 1: Cloruro de paladio al 0.5% en HCl al 10%

Rociar y calentar a 80º C durante 20 minutos. Aparecen manchas pardas para fosforados. Determinar los Rf y caracterizar las manchas halladas en función de los patrones.

Revelado 2: Inhibidor de la Colinesterasa. Una vez corrida la placa , se la expone a vapores de bromo dentro de una cuba. El bromo oxidará el azufre de la molécula de OP a oxígeno.

En hígado también ocurre una oxidación del plaguicida por oxidasas microsomales hepáticas, aumentando su potencial tóxico.

Luego de exponer la placa al aire para evaporar el exceso de bromo que interfiere en el resto de la reacción , se hace una aspersión con la enzima Colinesterasa y se lleva a estufa a
37ºC durante 30 minutos. La enzima se obtiene a partir de un homogenato de hígado (lugar donde se sintetiza) o bien puede utilizarse suero o plasma fresco.

Luego de hacer la aspersión , la enzima será inhibida en los sitios donde se encuentra el plaguicida. Para evidenciarlo se pulveriza con acetato de alfa naftilo/ Fast Blue. El acetato de alfa
naftilo es sustrato de la enzima y liberará naftol. Luego el naftol se copula con el Fast Blue dando color lila donde la enzima es activa.

Donde la enzima es inhibida por el plaguicida no se produce la reacción , quedando blanco. La placa se verá lila con manchas blancas.
Sensibilidad: 0,1 a 1 ng.

Interferencias: fenotiazinas, cocaína dan positiva la reacción. Cuando da negativa se puede descartar la presencia de OP; si da positiva debe confirmarse con otros revelados.

c)-IDENTIFICACION SIMULTANEA DE OP, OC Y CARBAMATOS POT TLC

Fase fija: sílica gel G activada.

Fase Móvil: Ciclohexano:Hexano:Cloroformo:Acetona (4:4:1:1).

Testigos:
OCl: Heptacloro y Lindane
OF : Parathion y Malathion
Carbamatos: Furadan y Carbaryl.

Revelado: se lleva a cabo un revelado secuencial que consiste en:

1-Difenilamina alcohólica. Rociar y colocar la placa al sol durante 30 minutos. Los pesticidas organoclorados aprecerán de color gris verdoso.

2-KOH al 10% en agua. Calentar suavemente.

3-Tetrafluorborato de nitrobencenodiazonio en etanol con gotas de etilenglicol o propilenglicol. Los carbamatos aparecen azules o rosas.

4-Cloruro de Paladio 0,5% en HCl al 10%. Los organofosforados aparecen de color naranja.

REACTIVOS REVELADORES
Difenilamina al 0,2% en Etanol: 0,2 gr de Difenilamina en 100 ml de Etanol. PREPARAR EN EL
 MOMENTO.

Cloruro de Paladio al 0,5% en ClH al 0,5 gr de Cloruro de paladio se disuelven en 100 ml de ClH al 10 %.
10%:
Hidróxido de Potasio al 10%: 10 gr de K(OH) en 100 ml de agua.
Tetrafluoroborato de 4- se disuelven 25 mg de este reactivo en etanol:etilenglicol (9:1). Se
nitrobencenodiazonio: conoce comercialmente como Fast red.

d)-IDENTIFICACIÓN de OC y OP en CGL

En la cromatografía gas- líquida la muestra se distribuye entre dos fases: una fija y una móvil. A través de la fase fija (líquida), adsorbida sobre un soporte inerte, circula la fase móvil (gas)
transportando la muestra vaporizada.

Las moléculas de la muestra tardarán cierto tiempo en recorrer la columna según su polaridad con respecto a la fase fija.

Cuando circula el gas portador, se registrará una línea de base. Cuando se inyecta la muestra y se detecta, aparecerá un pico.

Del cromatograma se obtendrá la siguiente información:

-Tiempo de retención: es el tiempo que tarda en aparecer el pico, desde la inyección hasta la altura máxima del mismo.

-Área del pico: es proporcional a la concentración de la muestra.

Para identificar una sustancia se debe pasar la muestra por distintas columnas, de diferente polaridad. Si en todas coincide el tiempo de retención de la muestra con el testigo, decimos
que se trata de esa sustancia.

Se utilizan tres tipos de columnas:

OV17 Fenil silicona
QF1 -DC2000 Trifloruro propil Metil silicona
DC2000 Metil silicona

El flujo a través de la columna debe ser constante y es necesario regularlo de modo que permita el intercambio y se reproduzca el tiempo de retención.

La cámara inyectora se encuentra a elevada temperatura, en ella se siembra la muestra, la cual es vaporizada y arrastrada por el gas carrier.

Ventajas: alta resolución y gran sensibilidad. Detecta trazas.

Desventajas: es necesario la purificación previa de la muestra, para poder inyectarla. Además la muestra debe ser de bajo punto de ebullición para que se volatilice.

Conviene usar detectores que respondan a un número limitado de elementos o estructuras de modo de separar más eficazmente el plaguicida contaminante de las interferencias
presentes en la muestra.

Para determinar OC se utiliza detector de captura de electrones. A medida que el gas portador (Nitrógeno) fluye a través del detector, una lámina de Ni radiactivo ioniza las moléculas
del gas y genera electrones. Estos se desplazan hacia el ánodo lo cual produce una corriente de fondo que se visualiza como la línea de base en el cromatograma. Si se inyecta una
muestra con moléculas que tengan átomos electronegativos , disminuye la señal eléctrica y en el cromatograma se ve un pico. Se detectan microgramos y hasta nanogramos de OC.

Generalmente se utiliza una columna capilar de polaridad intermedia con polifenil metil siloxano como relleno. Temperatura del detector: 300ºC. Gas portador: Nitrógeno (caudal: 10 ml/
min.). Programa de temperatura: Temperatura inicial de 190ºC durante 1 minuto. Temperatura final de 250ºC durante 6 minutos. La variación de temperatura es de 1º/ min. entre ambas.
Para los OP se utiliza un detector fotométrico de llama. Este detector consiste en una pequeña llama de hidrógeno quemándose en un exceso de aire y rodeada por un campo
electrostático. El efluente de la columna (con Nitrógeno como gas portador) entra a la base del mechero y se mezcla con el Hidrógeno.
Los compuestos orgánicos al salir de la columna se ionizan y los electrones libres son colectados en un electrodo cargado positivamente aumentando de esta manera la corriente que
circula por él, la cual es amplificada y registrada. Este detector responde sólo a átomos de Carbono que sean oxidables. Posee una sensibilidad del orden de los nanogramos. Para la
determinación se inyecta entre 0.5-2 microlitros de muestra.

INHIBICION de COLINESTERASA - (Como recurso de identificación de la intoxicación con plaguicidas organofosforados y carbamatos ).

Debido a que resulta difícil encontrar algún plaguicida organofosforado en suero u orina o sus metabolitos, se recurre a determinaciones en suero, plasma o sangre entera que son muy
rápidas y pueden dar indicio de la gravedad de la intoxicación.
Para la identificación rápida de colinesterasa, existen técnicas de ejecución simple, basadas algunas de ellas, en el empleo de papeles reactivos. El denominado Merckotest, se
recomienda para determinar la actividad de la enzima en suero o plasma, no sólo es útil en casos de exposición o de intoxicación con inhibidores de colinesterasa, sino tambien en
diversos estados patológicos (lesiones hepáticas) o para evaluar la acción de ciertos medicamentos sobre el sistema enzimático.

Método pHmétrico de Michel (para acetilcolinesterasa eritrocitaria).

FUNDAMENTO: La acetilcolinesterasa provoca la hidrólisis de la acetilcolina en colina y ácido acético. Este método estima la actividad de la enzima, midiendo el cambio de pH a través
del empleo de un electrodo de vidrio.
Otros métodos como el de W. Caraway, registra el cambio de pH usando un indicador colorimétrico.

MUESTRA: Se trabaja con sangre heparinizada, aproximadamente 8 ml de sangre, obtenida por venopunción (evitar la hemólisis), transferirla a un tubo heparinizado (con una gota de
heparina), tapar y agitar cuidadosamente por inversión.
Es conveniente separar el plasma de las células lo más pronto posible, cuando esto no se pueda llevar a cabo, se debe refrigerar la muestra a 4ºC durante 2-3 horas (no es conveniente
por más tiempo).

Procedimiento para la determinación de acetilcolinesterasa eritrocitaria

REACTIVOS
Solucion tampon para globulos rojos: Barbital sodico 0,2 N (4,1236 gr), fosfato de potasio diacido, 0,004 N
(0,5444 gr) y cloruro de potasio 0,6 N (44,736 gr). Disolver los reactivos en 950 ml de agua. Ajustar el pH:
8,10 exactamente a 25º C, con ClH 0,1 N ( se requieren alrededor de 28 ml). Agregar gotas de tolueno y
guardar en refrigerador. Debera comprobarse el pH y la capacidad de la solucion tampon cada vez que se va
a usar ya que estos valores tienden a variar con el tiempo.
NOTA: dietilbarbiturato de sodio= Barbital sodico= Veronal sodico.
Ioduro de acetilcolina: Disolver 3,004 gr de Ioduro de acetilcolina en agua y llevar a 100 ml. Agregar gotas
de tolueno y guardar en heladera.
Si la muestra fue refrigerada esperar a que alcance la temperatura ambiente.
Saponina al 0,01%: Disolver 10 mg de saponina en agua y llevar a 100 ml.
Heparina: 10000 U/ml.

Transferir 0.04 ml exactos de glóbulos rojos sedimentados a un matraz de 5 ml conteniendo 2 ml de saponina al 0.01 %, enjuagando la pipeta con la mezcla de saponina y glóbulos rojos,
hasta que todas las células se desprendan de la pipeta.

Mezclar mediante vortex. Una vez preparadas las muestras, añadir a cada tubo 2 ml de solución tampón (para eritrocitos), esperar l0 min.

Determinar el pH de la solución hasta 0.01 de unidad y anotarlo como pH1, (si la lectura es< de 7.97 desechar la prueba y comenzar otro ensayo con una solución tampón recién
preparada).

Añadir 0.4 ml de sol. 0.1 M de yoduro de acetil colina para eritrocitos, mezclar con vortex y anotar como T1 el momento en que se añadió el yoduro , dejar reaccionar durante 1 hora a
temperatura ambiente, cumplido este tiempo determinar el pH de la mezcla, se tomará como pH2 y el momento que se mide como T2

CALCULO: El pH/hora se determina siguiendo el siguiente esquema:

(pH1 - pH2 -b) x ƒ

pH/hora=
t reccion

b: corrección para la hidrólisis no enzimática (ver tabla)

ƒ: corrección para la variación de pH/hora con el pH.
t reccion : T2-T1, expresado en horas.
Los factores de corrección para la hidrólisis no enzimática, no son lineales con respecto al tiempo.

Valor de referencia: La cifra promedio de la actividad de la colinesterasa en un grupo de individuos normales de acuerdo a Michel, es de Delta de pH/hora: 0.75 para GR.

Factores de corrección que se emplean en el cálculo:

pH b f

7.90 0.03 0.94

7.20 0.00 1.00
7.10 0.00 1.00
7.00 0.00 1.00
6.90 0.00 0.99
6.80 0.00 0.98
6.70 0.00 0.97
6.60 0.00 0.97
pH b f

6.50 0.00 0.97

7.30 0.00 1.00
7.80 0.02 0.95
7.70 0.01 0.96
7.60 0.00 0.97
7.50 0.00 0.98
7.40 0.00 0.99

Procedimiento para la determinación de colinesterasa plasmática

La Colinesterasa sérica o plasmática (Pseudocolinesterasa o Butirilcolina esterasa) cataliza la reacción de hidrólisis de los ésteres de la colina, tal como la S-butirilcolina, con máxima
actividad a pH 7,7. La tiocolina liberada reacciona con el ácido 5,5’-ditiobis-2- nitrobenzoico (DTNB) produciendo un compuesto amarillo de acuerdo al siguiente esquema de reacción.

Butirilcolina + agua Tiocolina + Butirato

Colinesterasa
Tiocolina + DNTB 2-nitro-5-mercaptobenzoato.

La velocidad de aparición de color es directamente proporcional a la actividad enzimática y se mide a 405 nm.

Criterios para determinación del grado y tipo de intoxicación.

Colinesterasa Sérica Colinesterasa Eritrocitaria Indica

-No intoxicación.
Normal o poco descendida >o.75 pH/h normal o poco -Leve intox.
descendida (0.75-0.60) -Intoxicación a carbamatos.
discretamente descendida (0.60- -Intoxicación moderada o a dosis
0.50) repetidas
Muy descendida muy descendida (0.50-0.25) -Intoxicación grave (aguda).
CUESTIONARIO GUIA

1. Qué es un Plaguicida ?. Qué plaguicidas producen intoxicaciones en forma frecuente ?

2. Cuáles son las diferencias más importantes entre pesticidas Organoclorados y Organofosforados en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas ?

3. Respecto a los plaguicidas ORGANOCLORADOS indique su etiología, metabolismo y mecanismo de acción.

4. ¿Qué características clínicas orientan a la sospecha de intoxicación por un organoclorado?. ¿Cómo lo confirma en el laboratorio ?

5. Respecto a los plaguicidas OC indique su etiología, metabolismo, mecanismo de acción.

6. Respecto a los plaguicidas OP indique su etiología, metabolismo, mecanismo de acción. Idem para CARBAMATOS

7. ¿Qué características clínicas orientan a la sospecha de intoxicación por un organofosforado? Cómo lo confirma en el laboratorio ?

8. ¿Qué tipo de pesticida esperaría encontrar en una muestra de sangre de un paciente presuntamente intoxicado con pesticidas ? y en una muestra de orina ?

9. Respecto a los trabajos entregados, detalle claramente objetivos, metodología, resultado y conclusiones de los mismos.

10. ¿Cuáles son los pasos fundamentales en la investigación de plaguicidas?

11. ¿Qué metodología emplea en la búsqueda de pesticidas en frutas y verduras?

12. ¿Qué metodología emplea en la búsqueda de pesticidas en líquidos biológicos?

13. ¿Qué metodología emplea en la búsqueda de pesticidas en vísceras?

14. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de utilizar TLC y CG para OC y OP ?

15. La medida de la actividad enzimática de las Colinesterasas sérica y eritrocitaria es importante en el diagnóstico y tratamiento de la intoxicación por OP: ¿qué muestra utiliza en cada
caso ? ¿Cuál de las dos determinaciones es la más importante y por qué?

16. ¿Cuál es el fundamento del método de Michael para la determinación de la actividad enzimática de la Acetilcolinesterasa?

17. ¿Cuál es el fundamento del método para la determinación de colinesterasa sérica?

3 - TOXICOLOGIA DE URGENCIA:

PSICOFARMACOS

GENERALIDADES:

En esta sección de la Toxicología, se estudiarán aquellos tóxicos que solamente pueden separarse de las mezclas complejas que los contienen mediante la acción de disolventes. Su
investigación es frecuentemente requerida ya sea, porque se debe comprobar un abuso de un fármaco, ingesta voluntaria, sobredosis de un medicamento, ingestión accidental o
simplemente el origen de una reacción adversa.
Estas pruebas son solicitadas en una variedad de pacientes vivos que se presentan en la sala de guardia del hospital con cuadros clínicos de hiperactividad, con alucinaciones,
convulsiones o en coma, en sus diversos grados. En caso de víctimas fatales, su pedido es para situaciones legales.
La mayoría de las intoxicaciones de la actualidad son el resultado de accidentes o intentos de suicidio, más que de homicidios. El mayor porcentaje de las intoxicaciones fatales se deben
a un agente o a una combinación de cuatro agentes: barbitúricos, monóxido de carbono, alcohol etílico y salicilatos, (Loomis, l968).

MUESTRA:

Para las aplicaciones clínicas, las muestras preferidas son: sangre total, suero, plasma y orina. En algunas circunstancias pueden ser útiles los análisis del aspirado gástrico.

La peligrosidad o seguridad de un compuesto químico se relaciona principalmente con su cantidad existente en el cuerpo, por ésta razón, se prefiere la sangre o sus fracciones para el
análisis cuantitativo.

En el cuadro siguiente se tratan de resumir los tipos de muestras recomendadas para este tipo de análisis:

IDENTIFICACION Y
MUESTRA CANTIDAD
CUANTIFICACION
Casi todos los fármacos: sedantes
SANGRE Vivo: 10 ml hipnóticos, ataráxicos, glucósidos
cardiacos, anticonvulsivos
Cadáver: todo lo disponible Casi
ORINA Vivo: 50ml. todos los medicamentos y tóxicos,
tranquilizantes, ataraxicos,
 estimulantes, narcóticos
Todas las sustancias ingeridas
Vivo: aspirado completo y los
CONTENIDO entre las 0 y 6 horas tras la in-
primeros 50 cm de lavado.
GASTRICO gesta. Es útil para identificar al
Cadáver: lo disponible.
toxico.
CEREBRO 1000 gr Hipnóticos, narcóticos, fenotiazinas.
RIÑON 1 riñón Sulfamidas
PULMON 500 gr Narcóticos (cocaína, heroína)
Para la mayoría de los tóxicos es
útil cuando los órganos internos
MUSCULO 500 gr
están en descomposición
avanzada.

CLASIFICACION:

La clasificación de los medicamentos es muy compleja y variada ya que se los puede clasificar desde distintos puntos de vista: en función de su estructura química, o de acuerdo a su
acción farmacológica. La clasificación que se dará a continuación es sólo a los fines de facilitar el estudio de éstos tóxicos.

NOMBRE GENERICO NOMBRE DEL GRUPO CLASES PRINCIPALES

Bromuros,
Hipnóticos Barbitúricos
Derivados del opio

Lépticos Fenotiazinas
Neurolépticos Butiferonas
Reserpinoides
Benzodiacepinas
Tranquilizantes
Carbamatos
Sales de Li
Anfetaminas
Psicoestimulantes
Xantinas
Analépticos Antidepresivos tricíclicos
Timolépticos (no IMAO)
IMAO

Dislépticos:Son aquellos que perturban la actividad mental desviándola, siendo la mayoría son alucinógenos. Por ejemplo: LSD, mescalina, marihuana, heroína.

BENZODIACEPINAS:

ESTRUCTURA QUIMICA:

R3 R(N1)
R
Diacepan -H -H -CH3
Oxacepan -H -OH -H
Loracepan -Cl -OH -H

METABOLISMO:

Son sustancias liposolubles de buena absorción oral. Aparecen en sangre a los pocos minutos de la ingesta, registrándose la máxima concentración en plasma alrededor de las tres horas
para descender y desaparecer a los tres días.

Se los clasifica según su vida media y ésta depende de la velocidad de transformación plasmática.
a) Acción larga: dan metabolitos activos que pueden tener vida media mayor que el fármaco original. Ejemplos: Bromacepan, Cloracepato, Diacepan, Medacepan, Clordiacepóxido.
b) Acción intermedia: el tiempo medio es cercano a 30 horas. Ejemplos: Clonacepan, Flunitracepan, Nitracepan.
c) Acción corta: el tiempo medio es de 10 horas. Ejemplos: Loracepan, Oxacepan, Alprazolan.
d) Acción ultracorta: el tiempo medio es inferior a 5 horas. Ejemplos: Triazolan, Midazolan.

La biotransformación ocurre principalmente a nivel de los microsomas hepáticos e incluye: oxidación, demetilación, hidroxilación, desalquilación, conjugación con el ácido glucurónico.

SINTOMAS CLÍNICOS:
Son depresores selectivos del SNC. Actúan potenciando la neurotransmisión GABAérgica, intensificando la eficiencia de la inhi bición sináptica. Existen sitios receptores de gran afinidad
para las benzodiacepinas en SNC: médula espinal, tallo encefálico, sustancia límbica, corteza cerebral y cerebelosa.

Producen cuatro efectos principales: disminución de la ansiedad, sedación e hipnosis, aumento del umbral convulsivo y relajantes musculares centrales.

MUESTRAS: Suero o plasma, orina

EXTRACCION:

Tomar 10 ml de orina filtrada, se le agrega NaOH 20%, hasta pH: 10, no debiendo superar éste valor dado a que se salifica la droga y no se logra su extracción.

Extraer dos veces con 3 ml de éter etílico, cada vez. Lavar los extractos con agua destilada, filtrar y secar los mismos con sulfato de sodio anhidro. Proceder a realizar los diferentes
ensayos.

ENSAYOS CROMATICOS:

Diazocopulación: Tomar 2-3 ml del extracto etéreo, agregar 0,5 ml de ClH concentrado. Calentar en baño de agua a ebullición durante 5 minutos y enfriar.

Agregar 1 ml de NaNO2 0,1%, sobre baño de hielo y agitar. Dejar reposar 5 minutos. Finalmente agregar 1 ml de sulfamato de amonio 0,5%, agitar y nuevamente dejar en reposo 5
minutos. Agregar 1 ml de clorhidrato de naftiletilendiamina al 0,5%. Agitar. Color rojo o púrpura indica la presencia de benzodiacepinas.

FENOTIAZINAS:

ESTRUCTURA QUIMICA:

CLASIFICACION:

1) Derivados de la Fenotiacina: Cloropromacina, Proclorperacina, Trifluorperacina, Tioridazina.

2) Derivados del Tiosanteno: Tiotixeno, Clotiapina.
3) Butirofenonas: Haloperidol, Droperidol.
4) Estructuras diversas: Pimozida, Loxapina, Sulpirida, Metoclopramida.

METABOLISMO:

Se administra por vía oral y parenteral. La absorción ocurre entre 30 a 60 minutos después de la ingestión. La misma es incompleta y sólo se aprovecha el 30% de lo administrado. El pico
plasmático máximo aparece transcurridas 2 a 4 horas. Son sustancias con elevada liposolubilidad que atraviesan la placenta, pudiendo presentar el feto efectos adversos y teratogénicos.

La metabolización es compleja y se han identificado gran número de metabolitos. Se efectúa en el hígado, donde los procesos oxidativos son realizados por parte de las enzimas
microsomales.

Se excreta en su mayor parte por riñón y en una pequeña proporción por bilis.

MANIFESTACIONES CLINICAS:

Dependen de la interacción con la neurotransmisión dopaminérgica en primer lugar y en menor medida adrenérgica, histaminérgica y colinérgica, lo predominante es el bloqueo de los
receptores dopaminérgicos. Producen efecto antipsicótico, son antieméticos.

El bloqueo ejercido a nivel la de hipófisis anterior produce con el uso crónico hiperprolactinemia, trastornos extrapiramidales, somnolencia.

MUESTRA: Se dosa en sangre y orina.

EXTRACCION:

10 ml de orina filtrada, se alcalinizan hasta lograr un pH:10-11. Se realizan dos extracciones con 3 ml de éter etílico cada vez. Filtrar, lavar el filtrado y secarlo con Na2SO4 anhidro. Con el
extracto proceder a realizar los ensayos cualitativos.

ENSAYOS CROMATICOS:

A) Ensayo directo: Evaporar en un tubo de ensayo 0,5 ml del extracto etéreo a baño de María, agregar 0,5 ml de ClH concentrado. Observar el color.
A modo de ejemplo:
Trifluorperacina (Stelazine): rosa
Cloropromacina (Ampliactil): rosa
Proclorperacina (Stematil): amarillo-pardo
B) Reacción de Denigés: Al tubo anterior agregarle una granalla de Zn, calentar a baño de María durante 5 minutos hasta decoloración, separar la gran alla, enfriar y agregar 2 gotas de
NO2Na al 1% formando dos capas. En la interfase aparecerá un color similar al que dio el ensayo de salificación con ClH. Por agitación desaparece el color, excepto con la
proclorperacina.

C) Reacción con Reactivo. FPN (Férrico-Perclórico-Nítrico): a 0,5 ml del extracto etéreo se agregan unas gotas del reactivo FPN. Observar el color
Trifluorperacina: naranja
Cloropromacina: rojo
Trifluorperacina: amarillo.
Todos son inestables por agitación.

ANTIDEPRESIVOS:

ESTRUCTURA QUIMICA:

CLASIFICACION:

1) Tricíclicos: Imipramina, Trimipramina, Amitriptilina, Desipramina.

2) De segunda generción: Amoxapina, Maprotilina, Mianserina
3) IMAO no hidrazínico: Tranilcipromina
4) IMAO hidrazínico: Isocarboxacida

METABOLISMO:

Se absorben por vía oral o parenteral, siendo fármacos liposolubles. Poseen una vida media prolongada llegando a todos los tejidos y pasan a la leche materna. El 90 % del total se une a
proteínas.

Se metabolizan a nivel hepático dando metabolitos activos. Los procesos fundamentales son: metilación, hidroxilación y conjugación con glucurónico. Los metabolitos se eliminan por vía
renal, alrededor del 1 % lo hace sin modificar.

MANIFESTACIONES CLINICAS:

Los antidepresivos tricíclicos actúan prolongando la presencia del neurotrasmisor en el sitio receptor. Hay un bloqueo de la recaptación de nor-adrenalina, serotonina y dopamina. Son
bloqueantes de la neurotrasmisión colinérgica.

Los signos clínicos por sobredosis son:

a) Alteraciones psíquicas: excitación, insomnio, alucinaciones, sedación, somnolencia.
b) Alteraciones Neurológicas: Temblor, cefalea, extrapiramidalismo, lipotermia, depresión respiratoria, coma.
c) Alteraciones Anticolinérgicas: Midriasis, visión borrosa, retención urinaria, taquicardia, rubicundez.
d) Alteraciones cardiovasculares: Hiperactividad cardíaca, arritmias, taquicardia sinusal, ventricular, extrasístoles y fibrilación ventricular.

MUESTRA: Sangre y sus derivados y orina

EXTRACCION:

10 ml de orina filtrada, se alcalinizan con NaOH al 10% y se procede a realizar dos extracciones con 10 ml de éter etílico cada vez. Filtrar y secar los extractos con SO4Na2 anhidro.

REACCIONES CROMATICAS:

Reacción con reactivo de Forrest: A unos ml del extracto etéreo se colocan en un tubo de Kahn, se evapora el éter y al residuo seco se le agregan 2 ml del Rvo. de Forrest
La reacción positiva se traduce con la aparición de color verde-azul.
Tiene buena sensibilidad pero las fenotiazinas pueden interferir.

BARBITURICOS:

ESTRUCTURA QUIMICA:
CLASIFICACION:

a) Acción ultracorta: Tiobarbital

b) Acción corta: Secobarbital, Pentobarbital
c) Acción intermedia: Amobarbital
d) Acción prolongada: Fenobarbital, Fenobarbital sódico.

METABOLISMO:

Son fácilmente absorbidos por todas las vías, existe combinación con proteínas plasmáticas, especialmente con albúmina.

Su distribución es general, atraviesan la barrera placentaria pudiendo producir depresión respiratoria en el feto. También llegan a la leche materna.

La aparición de los efectos varía en un lapso de 10 a 60 minutos, dependiendo del agente y del preparado.

La metabolización se realiza en el hígado aunque por ejemplo pequeñas cantidades de tiobarbital se transforman en riñón y cerebro. Los de acción corta y ultracorta se biotransforman en
un 100%.

MANIFESTACIONES CLINICAS:

Son depresores generales del SNC. El mecanismo de acción no está totalmente dilucidado. Ejercen efectos sobre la trasmisión sináptica, inhibitoria y excitatoria. Interaccionan con la
neurotrasmisión GABAérgica, actuando sobre los sitios de unión para el canal del cloro. A diferencia de las benzodiacepinas cuya acción se manifiesta aumentando la frecuencia de las
aperturas de los canales del cloro, estos compuestos prolongan los períodos durante los cuales ocurren las aperturas.

Las acciones clínicas que producen son: sedación, hipnosis, anestesia general. Son anticonvulsivantes. Los barbitúricos son fármacos adictivos.

MUESTRAS:

Sangre y sus fracciones, orina o contenido gástrico en cantidad de 5 ml.

EXTRACCION:

10 ml de orina filtrada, se colocan en una ampolla de decantación en la cual se agrega 1 ml de ácido tartárico al 10% y se realizan dos extracciones con 10 ml de éter sulfúrico cada vez.
Agitar el extracto etéreo con 0,5-1 gr de carbón activado, filtrar con papel de filtro que contiene 1 gr de Sulfato de Sodio anhidro.Recibir en cápsula de porcelana, evaporar el solvente a
baño de María hasta sequedad y tomar el residuo con 2 ml de Metanol.

ENSAYOS CROMATICOS:

A) Reacción de Parry-Koppanyi: Se toma 1 ml de la solución del residuo metanólico, se coloca en una placa de toque o en un vidrio de reloj y se le agrega 3-4 gotas de solución
alcohólica de nitrato de cobalto al 1%. Mezclar con varilla e incorporar 1-2 gotas de solución alcohólica de isopropilamina al 5%. Aparición de color violeta o azul-violeta nos indica la
presencia de compuestos que presentan la siguiente agrupación: -CO-NH-CO-, entre ellos los principales ejemplos son: barbitúricos, hidantoínas, xantinas, creatinina, narcóticos
derivados de la piperidina.

La sensibilidad de la reacción es de 1 mgr.

B) Reacción de Zwicker: A 0,5 ml de la solución metanólica, se le agregan 0,5 ml de SO4Cu al 5%. Mezclar suavemente e incorporar 0,5 ml de solución clorofórmica de piridina al 5%.
Se agita enérgicamente y se deja separar la capa clorofórmica (inferior).

La aparición de color púrpura nos indica la presencia de un derivado barbitúrico, los tiobarbitúricos dan coloración verde, las hidantoínas, color azul, los derivados de las xantinas, color
verde.

Este ensayo es más sensible que la reacción anterior, permitiendo detectar del orden de 100µl. Además no requiere solubilización previa y tiene menos interferencias.

GLUTETIMIDA:

Se la usa como sustituto de los barbitúricos. Su absorción es irregular y muy variable, es poco soluble en agua, tras su absorción, la glutetimida es tomada rápidamente por el tejido
adiposo, desde donde gradualmente se libera a la sangre.

MUESTRA:

Sangre, grasa corporal e hígado, son los tipos de muestras elegidas

METABOLIZACION:

Se produce en hígado dando metabolitos inactivos, los que son excretados por orina y bilis. Tiene un índice de mortalidad alto a diferencia de los barbitúricos. La depresión cardiovascular
es mayor que la depresión respiratoria que precede a la muerte con dosis tóxicas.

ANALITICA:

Se emplea el método de TLC para identificar y semicuantificar, pero se prefieren los métodos de CG, para identificación más rápida y cuantificación.

ANTICONVULSIVANTES:

Están dentro del grupo de los depresores del SNC.

Los más empleados son: difenilhidantoína, carbamazepina y ácido valpróico, (el diacepan y fenobarbital ya fueron tratados).

ESTRUCTURA QUIMICA:

METABOLISMO:

DIFENILHIDANTOINA:
Se absorbe en el tracto digestivo a nivel del intestino delgado. Se combina con las proteínas plasmáticas y atraviesa al líquido cefalorraquídeo, la barrera placentaria y llega a la leche
materna. Se deposita en tejido adiposo.
Su metabolización se produce a nivel hepático, por hidroxilación y conjugación con ácido glucurónico. Se excreta por riñón.

CARBAMACEPINA:

Tiene buena absorción por vía oral y parenteral, pero en forma lenta. Atraviesa la barrera hematoencefálica y se distribuye en el líquido extracelular e intracelular.

Se metaboliza en hígado, transformándose en un epóxido que posee actividad. Se excreta por bilis y heces, pero la mayoría de la droga lo hace por riñón.

ACIDO VALPROICO:

Tiene buena absorción por vía oral y parenteral. Se distribuye principalmente en líquido extracelular, atravesando la placenta y pasando también a la leche materna.

Se metaboliza en el hígado y se conjuga con el ácido glucurónico. Se excreta principalmente por riñón.

MUESTRA: Se prefiere sangre y orina.

ACIDO ACETILSALICILICO:

El ácido acetilsalicílico o simplemente aspirina es una de las drogas más utilizadas desde hace muchos años hasta la actualidad. Posee un alto poder antiinflamatorio, antipirético y
analgésico, sumándosele en forma más reciente la de antiagregante plaquetario.

Es una de las causas más comunes de intoxicaciones en pediatría, dado que la ingesta accidental se produce en niños de 1 a 5 años de edad. Los niños pueden ingerir comprimidos para
adultos o pediátricos, pero estos últimos, constituyen la mayoría de los casos debido a su color rosado y su sabor agradable. La dosis terapéutica es de 50 mg/ kg/ día en pediatría, en
algunas patologías pueden darse hasta 100 mg/kg/día.

ESTRUCTURA QUIMICA:

METABOLISMO:
Se absorben por el tracto gastrointestinal encontrándose en plasma a los 30 minutos. Adquieren sus niveles máximos a las 2 horas exhibiendo una vida media de 15 minutos.

Se distribuye en todos los tejidos, sufriendo en el hígado los procesos de biotransformación. Sus metabolitos se conjugan con el ácido glucurónico, ácido sulfúrico y glicina eliminándose
por riñón como glucoconjugados, sulfoconjugados y ácido salicilúrico.

MANIFESTACIONES CLINICAS:
Intoxicación aguda:

Los primeros síntomas producidos son: irritación gástrica que consiste en náuseas, vómitos y dolor abdominal. Produce un aumento de la presión laberíntica que se manifiesta en zumbido
de oídos, cefalea. La respiración se estimula por acción directa e indirecta. La droga pasa la barrera hematoencefálica y a nivel del bulbo estimula directamente al centro respiratorio con
aparición de hiperventilación.

Con dosis muy altas produce desde estupor hasta coma profundo, con convulsiones tónico-clónicas generalizadas. Además produce desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, como
consecuencia de ello hay mayor consumo de oxígeno y producción de dióxido de carbono, generando un alcalosis respiratoria. Al mismo tiempo inhibe enzimas del ciclo de Krebs,
aumentando el ácido láctico y el ácido pirúvico, que conjuntamente con el aumento de la pérdida de bicarbonato dan origen a una acidosis metabólica compensatoria. El catabolismo de la
glucosa aumenta, lo que lleva a un incremento de las cetonas. El desacople de la fosforilación oxidativa referido anteriormente hace que toda la energía se pierda en forma de calor, lo
que lleva a la hipertermia que existe en la intoxicación.

La función renal se va deteriorando. En dosis muy altas puede haber necrosis hepática, con hepatomegalia, ictericia y aumento de las transaminasas.

Intoxicación crónica:

El paciente llega a la consulta con los siguientes signos: hiperpnea, hipertermia, alteraciones del sensorio y acidosis metabólica. El cuadro también puede acompañarse con hemorragias y
convulsiones. Puede dar reacciones de hipersensibilidad a nivel de piel, como también aumentar los cuadros de bronquitis obstructivas.

MUESTRA:

Se emplea suero o plasma, no interfieren los anticoagulantes comunes. En el caso de usar orina, debe ser previamente calentadas para eliminar interferencias volátiles, especialmente
cetonas.

REACCIONES CROMATICAS:

Reacción con nitrato férrico: En un tubo de ensayo se colocan 5 ml de orina filtrada y se llevan a una placa calefactora a 100 ºC o en baño de agua a ebulllición durante 15 minutos. Esta
muestra es la que se utilizará para la reacción con nitrato férrico.

A continuación rotular tres tubos de ensayo : blanco, testigo y desconocido. En el tubo (blanco) colocar 2 ml de ácido nítrico diluido, al tubo (testigo): 2 ml de reactivo color que consiste en
una solución de nitrato férrico diluido con ácido nítrico más 200µl de estándar (solución de ácido salicílico de concentración 25 mg/dl). En el tubo desconocido se colocan 2 ml de reactivo
color más 200 µl de muestra. Agitar y dejar en reposo durante 5 minutos a temperatura ambiente. Reacción positiva: aparición de color violeta. Para cuantificar leer la absorbancia a 540
nm.

GENERALIDADES SOBRE TECNICAS DE EXTRACCION:

Como se dijo anteriormente, los tóxicos que se estudian en este capítulo se separan de mezclas complejas mediante la acción de distintos solventes.
Las distintas técnicas usadas dependen del tipo de muestra.

a) MUESTRA: orina o líquido de lavado gástrico

a.1) Extracción en ampolla de decantación: En un ampolla de decantación se colocan de 25 a 50 ml de orina o líquido de lavado gástrico. Se satura con NaCl droga sólida y se acidifíca
con ácido sulfúrico 10% v/v. Se extrae con éter etílico, se deja decantar y se recoge la fase etérea repitiendo el procedimiento.

Se lavan los extractos etéreos con 2-3 ml de solución saturada de NaCl. La fase etérea se seca con sulfato de sodio anhidro, se filtra, se reúnen los extractos etéreos y se procede a
evaporar en corriente de aire caliente o a temperatura ambiente. La fase etérea puede contener compuestos de carácter ácido, neutro o alcalino.

La muestra luego de ser agotada en medio ácido es tratada con amoníaco concentrado, hasta reacción alcalina o con NaOH al 30% hasta pH:10-11,efectuando doble extracción como se
realizó anteriormente, repitiendo las etapas de lavado, filtrado y evaporación. Debe tenerse cuidado de que si se sospecha la existencia de compuestos volátiles como anfetamina o
efedrina, las que deben evaporase a temperatura ambiente.

En ocasiones puede usarse la mezcla de solventes: cloroformo:isopropanol (3:1) o cloroformo solamente, para la extracción de ciertas drogas básicas como morfina, estricnina, sulpirida,
entre otras.

a.2) Extracción en columnas: El procedimiento descrito en el punto (a.1) puede simplificarse usando columnas de tierras silíceas. El fundamento de la extracción es similar, la partición
líquido-líquido.

La columna se encuentra rellena de una tierra silícea de poro ancho, de estructura granular y de gran volumen de poro. Sobre el material de soporte se aplican 20 ml de solución acuosa
que se reparte como fase estacionaria sobre la matriz soporte, químicamente inerte. A continuación se eluye con disolventes orgánicos insolubles en agua. La fase acuosa se mantiene
fija sobre el soporte y todas las sustancias lipofílicas son extraídas de la fase acuosa a la orgánica.

El pH de la solución sometida a la extracción puede variar entre: pH 1 a 13.

Como material de ensayo en un principio todas la soluciones acuosas son directamente extraíbles, orina, sangre entera, plasma, suero, LCR, líquido amniótico, extractos de heces,
extractos tisulares de animales y plantas.

Las ventajas que presenta éste método con respecto a la extracción en ampolla de decantación son las siguientes: no forman emulsiones, economía de disolventes, material y tiempo, se
obtienen altos porcentajes de recuperación, sensibilidad analítica y eluatos de mayor pureza.

b) MUESTRA: Papilla de vísceras (fracciones de cerebro, hígado, riñón, estómago y su contenido, intestino y su contenido).

Los procedimientos extractivos que describiremos son dos:

1.b) Método de extracción continua de Fassi
2.b) Método de digestión enzimática
1.b) Método de extracción continua de Fassi:
Este método está basado en los métodos de Khon-Abrest y en el Griffon-Le Breton, los cuales permiten realizar un agotamiento cuantitativo y reducir el tiempo requerido por las técnicas
clásicas.

Procedimiento: Se toma una cantidad de papilla homogénea, aproximadamente 50 gramos de vísceras y se coloca en una cápsula de porcelana de capacidad suficiente. Se agrega de 1
a 2 gramos de ácido tartárico en polvo y se mezcla bien con ayuda de una espátula. Es necesario controlar la acidez con papel tornasol en distintos puntos de la papilla. Agregar luego
pequeñas porciones de sulfato de sodio anhidro y agitar hasta obtener una masa homogénea, la cual se irá desecando en un ambiente cálido y seco.

Remover cada 2-3 horas para evitar que se endurezca. Al cabo de 2-3 días estará suficientemente seca, si no fuera así, se deberá recurrir a la ayuda de una corriente de aire caliente,
cuidando de no superar los 50ºC, para evitar alteraciones en el caso de drogas termolábiles. La clave del método es llevar a polvo seco, el cual no debe quedar adherido al recipiente ni
formar gránulos.

Con el material desecado se obtiene un polvo fino, el cual se traslada cuantitativamente al extractor continuo (Soxhlet).

Funcionamiento:

Sobre la torunda de algodón prensado se coloca, sulfato de sodio anhidro, una capa de carbón activado en polvo y sobre ella la columna de material desecado, cuyo nivel no debe superar
el orificio lateral. Colocar en el erlenmeyer inferior un volumen éter de petróleo, adaptar las distintas partes del equipo y volcar a través del refrigerante cierta cantidad de solvente con el fin
de humectar el material.

Calentar mediante manta calefactora, procurando no superar los 55ºC, al principio el éter escurre rápidamente, pero a medida que disminuye la altura de la columna por reducción del
espacio muerto, se condensará en la parte superior, formando una capa líquida, cuyo volumen se regulará con el calentamiento.

El agotamiento previo se da por finalizado cuando el éter de petróleo pase incoloro. Se suspende el calentamiento, se deja enfriar, de esta manera se obtiene un extracto etéreo llamado
“ETER DE PETROLEO”, que se reserva para futuras investigaciones.

Reemplazar el erlenmeyer y agotar con éter etílico, de acuerdo a la forma expresada anteriormente, con lo cual obtendremos una solución extractiva llamada “ETER-ACIDO”.

Alcalinizar el material de la columna agregando a través del refrigerante 2 a 3 ml de NH3. Comprobar la alcalinidad de la papilla con dos trozos de papel de tornasol colocados uno sobre
la superficie del material y otro en el erlenmeyer. Agotar con éter etílico como se procedió anteriormente, con lo cual obtenemos el extracto llamado “ETER ALCALINO”.

Una vez agotado el material con éter en medio amoniacal, el cuerpo medio del extractor se retira y se lo coloca en un lugar ventilado y seco, con el fin de eliminar el éter.

Volver a armar el aparato y agotar con cloroformo en la forma indicada en los pasos anteriores, obtenemos el llamado “CLOROFORMO ALCALINO”.

Consideraciones:

Para la investigación de los tóxicos aislados se procede a concentrar los extractos por calentamiento suave, hasta un volumen de 20 ml. Se reserva una fracción para realizar reacciones
de confrontación, el líquido restante se lo emplea en reacciones cromáticas y de identificación.

Si los residuos son puros se procede a la investigación de las posibles drogas, si no es así, se deberá realizar una etapa de purificación.

En las distintas fracciones encontraremos:

ETER DE PETROLEO: Generalmente se presenta coloreado y conviene purificarlo.

Encontramos principalmente: grasas y alguno tóxicos como salicíllico, benzóico, alcanfor y algunos barbitúricos.

ETER ACIDO: Generalmente se presenta poco coloreado y se va a destinar a la investigación de glucósidos cardioactivos, barbitúricos, cantaridina, insecticidas, salicílico, sulfodrogas,
hidantoinatos,meprobamatos, eventualmente benzodiacepinas y un sólo alcaloide: colchicina.

ETER ALCALINO: Se encuentran la totalidad de los alcaloides, benzodiacepinas, fenotiazinas, anoréxicos, butiferonas, antidepresivos.

CLOROFORMO ALCALINO: Se investiga: morfina y estricnina.

2.b) Método de digestión enzimática:

Se basa en el tratamiento del material a investigar con una enzima proteolítica no específica, la Subtilisina A. Esta proteasa se obtiene del proceso fermentativo del Bacillus licheniformes.
Es una cadena simple de 274 aminoácidos, cuyas condiciones óptimas de trabajo son: 55ºC, pH:10,5, período de incubación de 1 a 4 horas.

La hidrólisis por proteasas constituye un método suave para asegurar la recuperación de sustancias termolábiles o ácido-lábiles, como algunas benzodiacepinas. Por el momento no se
cita en la bibliografía la aplicabilidad de éste método para la extracción de drogas de carácter ácido, como por ejemplo, barbitúricos.

Procedimiento:

Se homogeiniza las vísceras o sangre por agitación mecánica en buffer Tris 0,1 M pH: 10,5. Esta suspensión se incuba con la enzima Subtilisina A cristalina a 55ºC, (1 mg de enzima por
cada gr de tejido o líquido corporal), alrededor una hora como mínimo.

Se obtiene un líquido pardo oscuro que se filtra por lana de vidrio. Para extraer los fármacos, el filtrado se lleva a pH 12 con NH3 2M y se lo trata con éter etílico (100 ml cada vez), se
repite esta operación dos veces. Se lavan los extractos etéreos con NH 4OH 0,2 M, con el fin de eliminar interferencias. La fase etérea se reextrae con HCl 1% (10 ml), se repite el
procedimiento tres veces, esta solución es la que se emplea en los diferentes métodos analíticos.

c) MUESTRA:

Tabletas y Cápsulas: Muchas de las tabletas y cápsulas son mezclas complejas que contienen una pequeña cantidad de una o más drogas simultáneamente, con una gran variedad de
excipientes. Como ejemplos de éstos últimos tenemos los que actúan como:

1) Adhesivos-fijadores: gelatina, glucosa líquida, metilcelulosa

2) Diluyentes: fosfato de calcio, glucosa, caolín
3) Desintegrantes y agentes humidificantes: agar, bentonita
4) Lubricantes: ácido bórico, sílica coloidal
5) Saborizantes:cacao, glucosa, citrato de sodio.

La mayoría de las drogas son solubles en metanol, mientras que los excipientes no lo son, por lo tanto un simple extracto metanólico será suficiente.

De dicho extracto, una parte se empleará para hacer una TLC o CG, otra alícuota se diluirá con agua controlando su pH y se someterá a un barrido espectrofotométrico en la zona de U.V.

Para realizar una espectrofotometría infrarroja, se extrae una pequeña cantidad de la tableta o cápsula con cloroformo, a una porción se le agrega bromuro de potasio sólido, se prepara
una pastilla sólida y se examina al IR.

Caracterización e identificación de tabletas y cápsulas:

El análisis de este tipo de muestra consiste en una combinación de examen visual, microscópico, ensayos cromáticos, cromatográficos y de espectrofotometría UV e IR.

El primer paso es anotar cuidadosamente los detalles del recipiente y de su contenido. Con respecto al recipiente ver si es de papel, vidrio, una caja o botella. Observar los sellos y
etiquetas. Con respecto al contenido anotar: número de tabletas o cápsulas, forma de las mismas, cómo son las cubiertas, marcas, color, peso, diámetro y espesor de las mismas.

a) Reconocimiento visual:
Es importante como guía, dado que cada laboratorio tiene una colección de referencia de cápsulas y tabletas auténticas, las cuales pueden usarse de referencia. Hay que tener especial
cuidado con las cápsulas ya que su contenido puede ser cambiado, por ejemplo por arsénico, LSD, cianuro etc.

b) Análisis microscópico:
Una pequeña cantidad de la tableta aplastada o del contenido de la cápsula, se coloca en un portaobjeto con una gota de agua y se cubre con el cubreobjeto. Se observa a bajo aumento
si hay efervescencia, si es cristalino y su solubilidad en agua. Se determina el pH, si es alcalino nos puede indicar que se trata de una sal de droga ácida. Posteriormente se agrega una
gota de Nitrato de Plata al 1%; si hay formación de precipitado nos indica la presencia de un cloruro de una droga básica.

También se observa la presencia de material vegetal, granos de almidón, que puede confirmarse por reacción con ioduro y luz polarizada. La presencia de otro tipo de material vegetal
nos puede indicar que la tableta sea un remedio herbario.

c) Olor:
Algunas drogas tienen olor característico, por ejemplo, olor a hígado o carne nos da idea de una preparación inocua de vitaminas; los antibióticos como los del grupo de las penicilinas
tienen olor a sulfuro. Todo esto es orientativo.

d) Tamaño:
Debe ser medido con calibradores, existiendo una relación entre el diámetro y el contenido probable de la droga, dicha información se la encuentra en The Pharmaceuti cal Codex.

e) Ensayos Cromáticos:
Tambien son orientativos y su desventaja es que son destructivos. Incluyen:
1) Calentamiento en cápsula: La presencia de material no carbonizado nos indica que se trataría de sales inorgánicas.
2) Reacción de Marquis: Muchas drogas no la dan, es bueno para opiáceos, estimulantes, fenotiazinas, antihistamínicos.
3) Reacción de Koppanyi-Zwicker: Para barbitúricos y sulfonamidas
4) Reacción con Cloruro férrico: para fenoles
5) Reacción de Forrest y FPN: para fenotiazinas
6) Reacción con Iodoplatinato: Para antidepresivos, narcóticos,antihistamínicos

f) Cromatografía en capa fina.

g) Barrido de espectro en UV.
h) Espectrofotometría en IR.

CUESTIONARIO:

1. Qué entiende por psicofármacos? En qué casos se solicita su investigación?

2. Qué método extractivo elegiría si la muestra que en que debe investigar un determinado psicofármaco es cerebro? Por qué?

3. En qué extracto de aislamiento investiga barbitúricos, por qué?. Cómo los caracteriza e identifica?

4. Solamente con el comportamiento frente a los distintos reactivos reveladores y el Rf de una TLC puede usted identificar un psicofármaco determinado?

4 - ALCALOIDES

Los alcaloides son compuestos nitrogenados, que se comportan como bases frente a los ácidos, formando sales.

En su gran mayoría son de origen natural, sobre todo del reino vegetal, aunque se encuentren algunos semisintéticos y otros exclusivamente sintéticos.

Presentan notables propiedades fisiológicas y toxicológicas, que se ejercen fundamentalmente sobre el sistema nervioso central, con predominio en alguno de sus niveles.

Por estas razones pueden ser usados como fármacos. El uso prolongado de alguno de estos de estos compuestos produce en el hombre acostumbramiento, que constituyen verdaderas
toxicomanías, con dependencia física y psíquica y un aumento de la tolerancia.

Propiedades fisicoquímicas

Son sustancias que presentan en su constitución N, generalmente formando parte de heterociclos.

De acuerdo a su estructura pueden agruparse en distintos grupos químicos.

Bases acíclicas colina, muscarina

Aminas aromáticas efedrina, mescalina
Aminoalcoholes Veratrina, solanina
Bases pirrólicas nicotina, higrina
Bases pirídicas coniina, lobelina
Derivados de glioxalina pilocarpina
Derivados del grupo tropano cocaína, atropina, hiosciamina
Derivados indólicos eserina, estricnina,toxiferinas
Bases quinoleicas Quinina
Bases isoquinoleicas papaverina,narcotina, hidrastina
alcaloides fenantrenicos morfina, tebaína, codeína
derivados del ácido lisérgico ergotamina, ergobasina
derivados de la tropolona colchicina
derivados de la aconina aconitina
Derivados de purina cafeína, teobromina

La presencia de oxígeno en la estructura determina que la sustancia sea un sólido blanco, de sabor amargo y cristalizables. La ausencia de oxígeno en la estructura del alcaloide hace
que éste sea aceitoso, volátil u odorante.

La mayoría de los alcaloides son insolubles o muy poco solubles en agua, pero se disuelven bién en alcohol, éter, cloroformo u otros solventes orgánicos.

Se combinan con ácidos para dar sales, comportándose entonces como bases. Las sales son bastante solubles en agua e insolubles en solventes orgánicos.

En la diferencia de solubilidades de la base alcaloidea y de sus sales en agua y en solventes orgánicos se basa el método general de extracción.

Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada. Presentan una fluorescencia característica bajo al luz UV o IR, dando lugar a espectros característicos.

Aislamiento y caracterización.

Para la investigación de tóxicos alcaloidicos en materiales biológicos se requiere de extracción desde una determinada muestra, una posterior purificación y la aplicación de metodologías
de identificación.

Dentro de estas últimas se consideran reacciones generales para alcaloides, reacciones de caracterización de alcaloides y técnicas de identificación y cuantificación mediante CG y HPLC.

Extracción.

El objetivo de la extracción es el aislamiento de los tóxicos de la muestra problema. que puede ser sangre, vísceras, orina, lavado gástrico, vómitos o, eventualmente, restos de alimentos
y bebidas, preparados farmacéuticos.

Si la muestra constituye un material sólido se procederá con el método de extracción continua. En caso de ser una muestra líquida se tiene el método clásico de extracción en ampolla.

Método de extracción continua.

Es aplicable a material sólido o semisólido. Permite efectuar una extracción cuantitativa y reduce el tiempo de operación requerido por las técnicas clásicas.

Unos 25 gramos del material se desmenuza y se procura obtener una papilla homogénea, agregando 1 a 2 gramos de ácido tartárico. La papilla obtenida se mezcla en una proporción 1:2
con sulfato de sodio anhidro obteniendo una masa homogénea que se deja secar al aire en un lugar templado y a una temperatura menor a 50oC.

El material obtenido se disgrega y se deposita en un cartucho de papel de filtro para depositar en extractor Soxhlet.

El extracto se recoge en balón o erlenmeyer esmerilado con éter a reflujo. Se agregan unos 5 mililitros de amoníaco para producir la hidrólisis y liberar así los tóxicos extraíbles en medio
alcalino.

Eliminación de proteínas.

En los métodos de extracción directa, por ejemplo a trabajar con sangre, la presencia de proteínas facilita la formación de emulsiones entre el agua y los solventes de extracción, que
dificultan la separación de los alcaloides.

Por esta razón se procede a obtener filtrados libres de proteínas, para lo cual hay varios métodos. El más simple y directo consiste en el tratamiento con ácido clorhídrico concentrado y el
calentamiento a bañomaría durante una hora a 90OC. Todas las sustancias unidas a proteínas son liberadas pero el tratamiento es muy enérgico y no es adecuado para sustancias
termolábiles como cocaína, aconitina, atropina. Si se sospecha presencia de ellas, se intentará con ácido clorhídrico 1N y calentamiento hasta 40OC que no lo resisten. También se
dispone de otras técnicas menos enérgicas.

Según el método de Stas-Otto, se procede a formar tartratos y oxalatos de alcaloides solubles en agua. La técnica es laboriosa pero da buenos resultados.

El método del ácido túngstico aprovecha la formación de precipitados insolubles entre éste y las proteínas.

La precipitación con sulfato de amonio es un muy buen método para drogas muy metabolizadas y extrae bién estricnina y morfina.

Se han probado métodos que involucran el tratamiento con proteasas, como papaína, tripsina y subtilisina-A, que muestran ventajas sobre los métodos tradicionales, por ser menos
enérgicos y presentar altos porcentajes de recuperación.

Técnica de Stas Otto.

Una porción de papilla de la muestra se trata con dos volúmenes de etanol acidificando con ácido tartárico, dejando en maceración una noche.

Si se sospecha que no están presentes alcaloides lábiles en la muestra, se mantiene la mezcla a 60/70ºC durante al maceración.

A continuación se filtra y se procede a la evaporación del etanol, obteniéndose un residuo siruposo. Se trata nuevamente con un volumen de etanol absoluto tibio, se filtra y se evapora,
obteniéndose un residuo granular seco. Finalmente se trata con una porción de ácido sulfúrico al 5%, obteniéndose un filtrado acuoso libre de proteínas.

Técnica del ácido túngstico.

Una porción de la papilla obtenida de la muestra, se trata con una parte de tungstato de sodio al 25%, dos partes de agua y una parte de sulfato ácido de sodio al 50%, calentando la
mezcla a 60/70ºC.

Luego de obtener una preparación homogénea, se filtra por buchner, obteniéndose un extracto libre de proteínas.

Precipitación por sulfato de amonio.

Una porción de la papilla se trata con una parte de ácido clorhídrico diluido, y una parte de solución saturada de sulfato de amonio. La mezcla ase calienta y luego de enfriar ser procede a
la filtración.

Extracción en ampolla.

Es aplicable a material líquido o en general, toda sustancia líquida o posible de ser solubilizada fácilmente.

Se agrega bicarbonato de sodio hasta reacción alcalina al papel tornasol. Se procede a la extracción con ampolla de decantación con tres porciones de 15 mililitros de éter etílico. Se
obtienen dos fases, una acuosa y otra orgánica.

La fase acuosa se alcaliniza con hidróxido de amonio y se procede a la extracción con tres porciones de cloroformo. La fase orgánica obtenida luego de reunir los tres extractos , se filtra
sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora hasta sequedad. Se resuspende con unos mililitros de etanol, constituyendo éste el extracto cloroformo alcalino.

La fase orgánica original, la de la primera extracción, se filtra sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora hasta casi sequedad, constituyendo éste el extracto éter alcalino.

En el extracto éter alcalino se encontrarán la mayoría de los alcaloides, mientras que en el extracto cloroformo alcalino se encontrarán a la morfina, estricnina, brucina y atropina.

Purificación.

Consiste en los procedimientos que tienen como finalidad la eliminación de impurezas que puedan enmascarar resultados.

Los extractos cloroformo alcalino y éter alcalino se evaporan a sequedad y ser tratan con una porción de ácido sulfúrico diluido a 1/5 v/v, se lava luego con tres porciones de 10 mililitros
cada una de solvente, se trata luego con una porción de hidróxido de amonio hasta reacción alcalina, realizándose nuevamente una extracción con tres porciones de 10 mililitros de
solvente. El extracto se evapora a sequedad. Las extracciones del extracto éter alcalino se realizan con éter etílico y las del extracto cloroformo alcalino se harán con cloroformo.

El residuo obtenido se redisuelve en etanol absoluto, obteniéndose una muestra adecuada para los análisis de identificación.

Identificación.

Los alcaloides, junto a otras drogas básicas de interés toxicológico, tienen un comportamiento análogo frente a un grupo de reactivos de precipitación que permiten sospechar su
presencia. en una pericia toxicológica se hace uso de estas reacciones como primer paso de identificación, y a que una reacción positiva excluye la presencia de estos tóxicos, aunque
una reacción positiva no asegura su presencia.

La reacción con el Reactivo de Mayer (tetraiodo mercuriato de potasio) da lugar a la formación de un precipitado amarillento amorfo o cristalino.

El Reactivo de Draggendorf (yodo bismutato de potasio) forma precipitados de dolor rojo anaranjado y en general amorfos.

El Reactivo de Bouchardat (triioduro) genera precipitados de color rojo pardo.

El procedimiento para estos reactivos generales comienza con la evaporación de 2 a 3 gotas del extracto etanólico en vidrio de reloj. Se agregan luego 2 a 3 gotas de ácido clorhídrico 5%
hasta solubilizar los residuos. A esta solución se agrega una gota del reactivo correspondiente.

Caracterización.
La caracterización del alcaloide presente en la muestra problema permite descartar a un conjunto de sustancias alcaloideas y aproximarnos con relativa precisión a la identidad del
alcaloide en cuestión. Dependiendo del objetivo del análisis que se efectúa, en función de los resultados de las pruebas de caracterización, se procederá a la aplicación de una técnica de
confirmación.

La caracterización puede llevarse a cabo por diversas técnicas cromatográficas (en columna, en papel, en placa delgada, en fase gaseosa), espectrofotométricas (U.V., I.R.), por ensayos
biológicos o por reacciones químicas.

Marcha sistemática de Banford.

Constituye una técnica tradicional para la identificación de alcaloides. Las reacciones químicas que la componen tienen valor relativo y sus resultados no deben tomarse como
concluyentes.
Además la presencia de impurezas puede inhibir o alterar los resultados.

Marcha de Bandford

Rojo sangre a
Grupo I Tebaina
anaranjado
H2SO4 (c) Narcotina Amarillo limon
Morfeolicos (morfina, violeta de tonalidad
Grupo II
apomorfina, codeina) variable
Sinteticos (diluadid, dionina, violeta de tonalidad
Reactivo de Marquis
heroina) variable
Reaccion de Oliver Morfina, heroina rojo brillante
Fe3Cl 1% Morfina azul
Heroina no desarrolla color
Grupo III
HNO3 fumante Brucina rojo intenso
Eserina rojo anaranjado
Atropina, hiosciamina,
Ensayo de Vitali violeta azulado
escopolamina
Grupo IV
azul violaceo a rojo
H2SO4 + Cr2O7K2 Estricnina
violaceo
estrias azules , violetas
Yohimbina
y verdes
Curare rojo a violeta
Reactivo de Fröhde Estricnina no da color
Yohimbina azul
Curare marron
Reactivo de Mecke Estricnina no da color
Yohimbina azul verdoso
Curare marrón
Reactivo de Mandelin Estricnina azul violáceo
Yohimbina azul brillante
Curare violeta
Grupo V
Reactivo alcohól-ácido
Novocaína amarillo (en frío)
rosado violáceo (en
Nicotina, mezcalina
caliente)
Grupo VI
rojo, con vapores NH3
Cl2 y vapores de NH3 Cafeína
púrpura
amarillo, con vapores
Quinina
NH3 verde.
Grupo VII Cocaína, aconitina

El procedimiento para las reacciones de la marcha de Bandford, es el mismo que el utilizado en las reacciones generales, en vidrio reloj, agregando directamente el reactivo
correspondiente sobre el residuo seco. Cuando hay una variación se indica lo contrario. Para cada grupo se describe un reactivo de grupo, para el cual aparece una reacción cromática
característica. En algunos grupos existen reactivos de diferenciación que permiten discriminar, con alguna certeza, cual de los alcaloides del grupo se encontró.

En la realización de la reacción general para el Grupo I pueden detectarse interferencias debidas a falta de purificación (color pardo), por carbonización de la materia orgánica.
La quinina presenta, en medio ácido, fuerte fluorescencia azulada al U.V., lo que permite identificarla con cierta seguridad.

Los alcaloides del Grupo VII se caracterizan por no dar reacciones cromáticas netas. Por ello es necesario proceder a identificarlos por otras técnicas.

La reacción de Oliver consiste en agregar al extracto seco del alcaloide una gota de solución de SO 4Cu al 1% y una gota de agua oxigenada 10 vol., alcalinizando con amoníaco.

El ensayo de Vitali consiste en la evaporación a sequedad el baño maría una pequeña fracción del extracto del alcaloide con una gota de ácido nítrico fumante. El residuo pardusco
obtenido se trata, una vez frío, con una o dos gotas de potasa alcohólica.

Reacciones de confirmación.

Una vez que se efectuó la marcha de Bandford, puede ser necesario confirmar la presencia de alguno de los alcaloides encontrados. Para ello se dispone de las llamadas reacciones
confirmatorias.
Reacción del picrato para cocaína.

Colocar una gota de la solución a ensayar sobre un portaobjetos y llevar a sequedad. Adicionar una gota de ClH al 1% y evaporar nuevamente. Finalmente agregar una gota de ácido
pícrico saturado y observar al microscopio la formación de microcristales característicos con forma de plumeritos.

Reacción de Da Silva.

Usada para la confirmación de cocaína. Sobre el extracto del éter alcalino evaporado en vidrio reloj, se agregan 2-3 gotas de potasa alcohólica, se calienta a baño maría y se observará la
aparición de un característico olor a benzoato de etilo.

Reacción de Kieffer.

Se evaporan unas gotas del extracto clorofórmico, dejando enfriar. Se agrega luego una solución al 1% de (Fe(CN) 6)K3. La aparición de un color azul intenso por formación de azul de
prusia (Fe(CN)6)3Fe4 , da cuenta del poder reductor de la morfina por la presencia de una función fenólica.

Reacción de la tetrahidroestricnina

Se colocan en un tubo dos o tres gotas del extracto de cloroformo alcalino y se seca en baño de agua . Se agregan entonces dos granallas de zinc y 0.5 mililitros de la solución de cloruro
mercúrico. Calentar en baño durante cinco minutos En una cápsula de porcelana colocar un pequeño cristal de nitrito de sodio, volcando a continuación el producto de la reducción.
Calentar en baño y observar la aparición del color rosado en caso de presencia en la muestra original de estricnina.

Reacción para nicotina.

La reacción con el p-dimetilamino-benzaldehido que caracteriza a la nicotina como parte del Grupo V en la marcha de Bandford, no siempre se verifica adecuadamente. Por ello se
procede a confirmar con la siguiente técnica. Se coloca en un tubo de ensayo un mililitro del reactivo vainillina clorhídrico., agregando luego, cuidadosamente por las paredes del tubo dos
a tres gotas de la solución acuosa de nicotina. Aparecerá en la interfase un color rosado que se irá intensificando con el tiempo.

Reacción de la talioquinina.

Se evaporan en un tubo de ensayo, dos o tres gotas del extracto, disolviendo con 0.5 mililitros de ácido acético al 2% y 0.5% de agua destilada. Se agregan entonces dos o tres gotas de
agua de bromo al 50%, cuidando de no agregar en exceso. Luego, alcalinizar con amoníaco al 20% observándose la aparición de un color verde característico.

Cromatografía en capa fina.

La técnica es similar a la utilizada para las drogas psicotrópicas de naturaleza alcalina. En ocasiones se aísla un alcaloide desde la marcha de rutina para identificación de un psicotrópico
en general, y se identifica recién en la cromatografía por comparación con testigos.

La fase fija a utilizar es sílica gel G y el solvente de corrida habitual es la mezcla metanol:amoníaco (99/1)El revelado de la placa se realiza con yodoplatinato de potasio, determinando
entonces los Rf.

Reactivos.

Potasa alcohólica: Se disuelven 5 gramos de KOH en 100 mililitros de etanol absoluto.

Reactivo alcohol-ácido: Se disuelve 1 gramo de p-dimetilaminobenzaldehído en 100 mililitros de etanol absoluto, con 20 gotas de ácido sulfúrico concentrado.
Reactivo de Frödhe: Disolver 1 gramo de molibdato de amonio en 100 mililitros de ácido sulfúrico concentrado. El reactivo se prepara en el momento de usar.
Reactivo de Mandelin: Disolver 1 gramo de vanadato de sodio en 100 mililitros de ácido sulfúrico concentrado. Se prepara en el momento de usar.
Reactivo de Mecke: 1 gramo de ácido selenioso se disuelve en 200 mililitros de ácido sulfúrico concentrado. El reactivo se prepara en el momento se usar.
Yodoplatinato de potasio: Se disuelven 45 mililitros de yoduro de potasio al 10% y 5 mililitros de ácido cloroplatínico al 5% en 100 mililitros de agua destilada.
Reactivo de vainillina:Se disuelven 0.04 gramos de vainillina en 100 mililitros de ClH concentrado.
Cloro naciente: Agregar unos cristales de clorato de potasio a una solución concentrada de ClH.
Reactivo de Marquis: Formol concentrado.

CUESTIONARIO:

1- Indique situaciones en las que sea procedente investigar alcaloides en una muestra de origen biológico.

2.- Por que razón se necesita de la eliminación de las proteínas en la determinación de alcaloides y en que situaciones estima que este procedimiento no sería necesario.

3.- Cuál es el fundamento de la marcha sistemática de Bandford. ¿Por que técnicas se ve reemplazada actualmente?

Psicofármacos:

 Allinger, “Química Orgánica”.

 Apuntes sobre cromatografía zonal y revelado secuenciado. Laboratorio toxicológico. Asesoria Pericial. Corte Suprema del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.
 Bowman & Rand. “Farmacología”
 Clarke’s. “Isolation and identification of drugs”. Segunda Edición 1986.
 Drugs Enforcement Administration. U.S. Departament of Justice. “Drogas de las que se abusa”.
 Fabre-Truhaut “Toxicología”.
 García Fernandez, Patiño, Guatelli, Villamil, “Ensayos con un nuevo procedimiento de simplificación de materia orgánica en el análisis toxicológico forense”. Laboratorio de
Toxicología y Química Legal. Cuerpo Médico Forense de la Justicia de La Nación.
 Goodman and Gilman. “Las Bases farmacológicas de la terapeutica”.
 Guatelli M, “Manual práctico de química toxicológica”.
 Guía de Trabajos Prácticos de Toxicología y Química Legal. Facultad de Farmacia y Bioquímica. UBA.
  Noller, “Química de los compuestos orgánicos”.
 Pesce-Kaplan, “Química Clínica, métodos”.
 ShankarV., DamodaranC., and Ghandra Sekharan P., ”Isolation of alkaloids and glycosides from tissue following enzymatic digestion.” Forensic Science International 37:243-
248(1988).
 Talamoni M, “Intoxicaciones más frecuentes en pediatría”.
 Todd-Sanford, “Química Clínica”.

1- SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

El trabajo en un laboratorio, máxime en un laboratorio de Toxicología, debe realizarse respetando las normas e indicaciones que garanticen la integridad y seguridad de las personas y los
bienes involucrados en la tarea. La gran cantidad de compuestos químicos de elevada peligrosidad, el uso de equipamiento eléctrico y la combustión de gases con diferentes fines
corresponden a algunas de las fuentes que pueden generar accidentes. Para evitarlos, existen reglas, indicaciones y normas, que si se aplican y respetan adecuadamente minimizan los
riesgos y garantizan un trabajo seguro.

Gran parte de la Analítica Toxicológica utiliza muestras biológicas de origen humano para investigar diversas sustancias, tales como plaguicidas, solventes y especialmente, drogas de uso
ilícito o abuso indebido de fármacos. La posibilidad que estas muestras sean portadoras de agentes infecciosos y en particular del virus de inmunodeficiencia adquirida y de la hepatitis,
obliga a la implementación de normas o criterios que permitan el adecuado manejo de dichas muestras, desde su obtención hasta su desecho final.

Se han relacionado únicamente a la sangre, el semen y las secreciones vaginales y /o cérvico - uterinas con la transmisión del HIV, sin embargo existen muchos otros humores orgánicos,
tales como líquido cefalorraquídeo, exudado pleural, pus, etc., que pueden contener hematíes o leucocitos y ser por lo tanto, portadores del virus.

Precauciones generales

1. No fumar, comer, beber, mascar chicle, ni almacenar alimentos o bebidas en el laboratorio.

2. Cuidar que todos los recipientes que contienen muestras biológicas sean de materiales resistentes, posean cierre hermético, no presenten pérdidas o salpicaduras y se
almacenen en lugares seguros.
3. Utilizar guantes descartables (látex o vinílicos) para manejar las muestras y lavarse las manos con abundante agua y jabón finalizada la tarea.
4. Utilizar anteojos de seguridad y máscara protectora de nariz y boca para el manejo de muestras que puedan producir salpicaduras, proyecciones o liberar gases que
arrastren el material sólido.
5. Utilizar únicamente pipetas automáticas, de preferencia desechables para cargar las muestras.
6. Tener siempre a mano un bidón con solución de hipoclorito de sodio (1:10).
7. Siempre que sea posible, instalar una cabina para manejar las muestras biológicas.
8. Limpiar de inmediato cualquier derrame o salpicadura utilizando papel absorbente el cual se desechará en un recipiente debidamente rotulado para tal efecto, lavando el
área afectada con hipoclorito de sodio.
9. Trabajar bajo campana de extracción cuando se manipulen solventes volátiles.
10. Evaporar solventes inflamables, como éter o alcoholes, solo con plancha o camisa calefactora y bajo campana.

Contacto directo o salpicaduras con sangre

a) Contaminación con piel intacta:
- lavar con abundante agua y jabón
- lavar con solución diluida de hipoclorito de sodio.

b) Contaminación de piel no intacta, membranas mucosas, punción con aguja o cortes en general:
- lavar con abundante agua y jabón,
- lavar con solución de agua oxigenada al 3%,
- lavar con solución diluida de hipoclorito de sodio,
- si el ingreso es a través de los ojos, lavar con abundante solución fisiológica. Retirar lentes de contacto si los hubiese.
- poner de inmediato en contacto con el centro médico especializado más cercano y notificar el accidente a fin de recibir el tratamiento correspondiente.

Derrames o roturas de envases

1. Absorber el material derramado mediante el uso de papel adecuado, usando guantes.

2. Lavar toda el área y los elementos utilizados con hipoclorito de sodio (1:10),
3. Desechar todos los materiales utilizados en una bolsa o recipiente debidamente identificado.

Compuestos que liberan cloro

La cantidad de cloro libre en la solución, necesaria para desinfectar correctamente, es de 5 g por litro y se obtiene con las soluciones acuosas los siguientes compuestos en las
concentraciones indicadas a continuación:

 Hipoclorito de sodio (5% cloro disponible) 10%

 Hipoclorito de calcio (70% cloro disponible) 0,7%
 Dicloroisocianato sódico (60% cloro disponible) 0,9%
 Cloramina (25% cloro disponible) 2,0%

Esterilización

A continuación se transcriben las condiciones de esterilización que garantizan la inactivación (muerte) de todos los virus, bacterias y esporas:
  Esterilización por vapor a presión durante 20 minutos, a 1 atm, 121º C
 Esterilización por calor seco durante 2 horas a 170º C

Es fundamental que todo el personal del laboratorio conozca, recuerde, utilice y haga cumplir estas reglas como una forma eficaz de desarrollar una tarea segura para el operador y su
entorno.
Todos los elementos (envase, materiales descartables, algodones, papeles absorbentes, etc.) que de alguna manera estuvieron en contacto con muestras biológicas, deben ser
almacenadas en lugares seguros, debidamente identificados y se debe garantizar que su disposición final no representa ningún riesgo para la comunidad.

2- PAUTAS PARA LA ELABORACIÓN DE INFORMES DE LABORATORIO

La elaboración de un informe de laboratorio, tarea que realizamos permanentemente para asentar y comunicar los resultados de nuestro trabajo, necesita de ciertas características para
que cumpla con sus objetivos tales como legibilidad, coherencia y un marco de referencia bibliográfica.
Los informes de laboratorio tendrán además diferentes esquemas de acuerdo a la diversas temáticas, adecuándose a cada caso. Podemos describir un informe genérico integrado por las
siguientes partes:

Generalidades:

Título del informe.

Objetivos del informe.
Autor (es).
Antecedentes.
Descripción de la(s) muestra(s).
Referencias bibliográficas.
Procedimientos:
Metodología.
Técnicas utilizadas.
Aparatos utilizados.
Productos del informe:
Resultados.
Conclusiones (o discusión de los resultados).
Recomendaciones y observaciones (cuando sea procedente).

Título del Informe: en cierta forma, el título de un informe es un resumen de sus objetivos. Debe quedar claro lo que se pretende comunicar en el informe. Se anotará la fecha de
elaboración del informe.

Objetivos del Informe: Están íntimamente relacionados con los resultados y las conclusiones. Podemos pensar que en los objetivos estamos planteando una pregunta que luego será
contestada, a partir de los resultados, en las conclusiones.

Autor(es): Corresponde a la(s) persona(s) que mediante su(s) firma(s) se hace(n) responsable(s) de las conclusiones del informe y, por lo tanto, de sus consecuencias. Desde el punto de
vista legal, es importante la habilitación que le otorga su titulo al profesional, respecto a la posibilidad de expedir una opinión experta sobre determinadas áreas específicas y no sobre
otras.

Antecedentes:

Muestras: Se debe asentar su naturaleza, el origen, características, cantidad de muestra recibida y cualquier observación que esa relevante para los resultados, como por ejemplo, la
forma y la fecha en que se hizo la toma de muestra, si se conservó la cadena de frío desde la toma hasta el procesamiento de la muestra y todos los datos posibles.

Bibliografía: A partir de ella se fundamentan los procedimientos y por lo tanto, las respectivas conclusiones. Se anotarán todas aquellas referencias que después podrán ser consultadas
para profundizar la metodología y conclusiones del informe. Se indicará autor. fuente y fecha. Generalmente, se ubica al final del informe. Cuando se trate de procedimientos standards,
se indicará el número de código y el organismo o institución oficial que lo publica.

Procedimientos: Debe realizarse una descripción esquemática que incluya las etapas más importantes que han permitido la obtención de los resultados. No se requiere la
transcripción literal de la guía de Trabajos Prácticos., Aunque sí resulta conveniente hacer constar el principio físico o químico en que se basan las diferentes metodologías con su
respectiva referencia, por ejemplo: *Se realiza la determinación de metanol por espectrofotometría (Castro, 1987). . ." Si hay algún pretratamiento de la muestra, debe asentarse también
con los mismos criterios.

Productos del informe:

Resultados: Corresponden a los valores numéricos, con sus respectivas unidades, o resultados cualitativos obtenidos. Deberá anotarse la respectiva sensibilidad y especificidad, lo
cual podrá ser obtenido a partir de la bibliografía así como la precisión y exactitud de los mismos, lo cual está vinculado a cada metodología, cuando corresponda. Es importante
considerar entonces, los rangos de seguridad de los datos entregados y las cifras significativas con que se informan. También, se anotarán las posibles interferencias y/o
inconvenientes que podrían haber modificado los resultados.

Conclusiones: Un informe debe constar necesariamente de los resultados obtenidos y la correspondiente interpretación y discusión que permitan la elaboración de las respectivas
conclusiones. También es importante que se expresen las consecuencias inmediatas que pueden derivar de las mismas. Si los resultados no son satisfactorios puede indicarse, por
ejemplo, una repetición de la toma de muestra y/o de alguna de las determinaciones vinculadas con la temática en estudio. Se presentarán además los valores normales de los
parámetros determinados, su referencia y se efectuará la comparación con los valores obtenidos experimentalmente.

3 - ETANOL

Objetivo

Determinación de la concentración de alcohol en sangre (alcoholemia) por el método de microdifusión

Reactivos

- Solución de Cr207K2 0.106 N en H2SO4 22.08 N ( Pesar 5.2 gr de Cr207K2 en 400 ml de H20 (d) y llevar a 1 l con H2SO4 (c)
-Solución saturada de C03K2

Muestras
- sangre anticoagulada en recipiente con cierre hermético

Curva de calibración

En tubos eppendorf conteniendo 1.0 ml de sangre entera anticoagulada , se preparan los siguientes standards: 0.25 g/l, 0.50 g/l, 1.25 g/l, 2.50 g/l, 5.00 g/l, a partir de alcohol etílico ( =
0.79 g/ml).

Procedimiento

Se colocan en el compartimento interno de la cámara de Conway (tamaño pequeño),

0.5 ml de la solución ácida de Cr207K2. En un extremo del compartimento externo, se agregan 0.2 ml de sangre y en el otro extremo del mismo 0.2 ml de la solución saturada de C0 3K2,
Tapar la cámara y hacerla girar cuidadosamente (en forma horizontal) sobre la mesa de trabajo, para poner en contacto los reactivos colocados en el compartimento externo.
En el caso de utilizar cámaras de Conway (tamaño grande) los volúmenes de los reactivos a utilizar serían los siguientes: 3 ml de la solución ácida de Cr207K2, 1 ml de sangre y 1 ml de la
solución saturada de C03K2.
Dejar difundir 1 hora a temperatura ambiente. Luego, destapar la cámara y recoger la solución del compartimento interno.

Proceder a la lectura espectrofotométrica a 620 nm.

Resultados

Valores de alcoholemia a partir de 0.5 g/l, tienen importancia médico legal.

CUESTIONARIO

1) Qué métodos conoce para determinar etanol? Indique los principios en que se basa cada uno de ellos y sobre qué tipo de muestras se aplica cada uno. Cómo se realiza la expresión a
interpretación de los resultados en cada caso? Qué es el diagnóstico químico de ebriedad? Justifique en cada caso su respuesta.

2) Cuál es el criterio de selección de muestras para la determinación de etanol que permite determinar en forma retrospectiva la alcoholemia? Ventajas y desventajas en cada caso.

3) Respecto a la técnica espacio - cabeza: a) Cuáles son las ventajas que presenta la determinación de etanol por esta técnica?. b) Qué precauciones deben tomarse para procesar las
muestras destinadas a tal fin?

4 - MONÓXIDO DE CARBONO

Determinación de monóxido de carbono en sangre por métodos químicos

Los métodos químicos emplean la propiedad del monóxido de carbono de reducir diversas sales metálicas oxidantes. Uno de los elementos metálicos más usados es el paladio II (Pd+2 ),
lo cual puede verse en la siguiente reacción:

Pd+2 + CO + H2O Pdº + CO2 + 2H+

Este principio constituye la base de diversas metodologías tales como el método de Gettler y Freimuth y el de microdifusión.

Método de Microdifusión

Se basa en el poder reductor del monóxido de carbono, el cual al ponerse en contacto con una solución de PdCl2 , reacciona produciendo Pdº. La reacción se realiza en cámaras de
Conway que poseen en el compartimento externo la muestra de sangre y el agente liberador (ácido sulfúrico) y en el interno el agente atrapante (PdCl 2). En este caso, se produce la
captación y oxidación del monóxido de carbono, forzándose la remoción completa del mismo al cabo de un tiempo y temperatura determinados. El exceso de PdCl 2 es valorado
posteriormente con IK en presencia de goma arábiga.

TECNICA
Reactivos:

Solución de cloruro de paladio: disolver 0.222 g de cloruro de paladio en 25 ml. de ácido clorhídrico 0.01N y completar a 250 ml con ácido clorhídrico. Se prepara en el momento. Acido
sulfúrico 10% (P/V)
Goma arábiga al 0.1%
Solución de ioduro de potasio al 15% (P/V)

EQUIPOS
Centrífuga a 5000 rpm.
Especrofotómetro UV visible
Camara de Conway

Procedimiento:
En el compartimento interno de la cámara de Conway se colocan 0.5 ml de PdCl 2 0.01N y en el externo en sectores separados, 0.25 ml de H 2SO4 y 0.25 ml de la muestra (sangre entera).
Se cubre con la tapa sellando con grasa siliconada, para evitar posibles pérdidas. A continuación, se mezcla la sangre con el ácido sulfúrico mediante un suave movimiento de rotación.
Se deja difundir 1 hora a temperatura ambiente. La existencia de monóxido de carbono se evidencia en forma indirecta a través de la aparición de una pátina platina de paladio metálico
en el compartimento interno.
Con una pipeta capilar se extrae la totalidad de la solución del compartimento interno (Pd º y exceso de cloruro de paladio). Luego se centrifuga con el objeto de separar el precipitado de
Pdµ y se transfiere 0.1 ml del sobrenadante a un matraz de 10 ml.
En otro matraz de 10 ml, se coloca 0.1 ml de solución de PdCl 2 0.01N (blanco).
A cada matraz se agrega 1 ml de solución de goma arábiga al 0.1% y 1 ml de IK al 15 %, se mezcla bien y se lleva a volumen. Se realiza la determinación de la densidad óptica a 500 nm
llevando a cero con agua destilada. El exceso de (Pd +2 ) con el ion ioduro da lugar a la formación del complejo I 4Pd =2. Luego se lee la absorbancia a 500 nm.

Expresión de resultados
A partir de la lectura de absorbancia de la solución blanco, se calcula la concentración de CO en la muestra inicial.

Abst - AbsD
mgCO%= 0.05335*520
Abst

donde Abst y AbsD representa la densidad óptica del blanco y la muestra desconocida, respectivamente. El resultado se expresa en ml % considerando el factor de conversión
correspondiente, el cual tiene en cuenta el PMCO , el volumen que ocupa un gas en CNPT siendo el mismo 0.8 ml/mg.
A fin de lograr una adecuada interpretación de los resultados, es conveniente expresar los mismos como % de carboxihemoglobina.
Para ello, es necesario conocer el tenor de hemoglobina de la muestra y considerar que 1g de hemoglobina fija 1.34 ml de CO.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

El monóxido de carbono es el producto endógeno del catabolismo del hemo con un valor de saturación de carboxihemoglobina entre 0.4 - 0.7%.
El valor promedio de carboxihemoglobina encontrada en sangre de individuos no fumadores que habitan zonas urbanas es del 1-2%. Dicho valor llega a 5-6% en individuos fumadores.
Los valores encontrados en los casos de envenenamiento fatales registrados representan valores superiores a 50% de saturación. En víctimas de incendios se han registrado niveles de
carboxihemoglobina entre 25 - 85% con un valor medio de 59%. Sin embargo, también se ha informado que la carboxihemoglobina en víctimas de incendio puede no ser
significativamente alta.

CUESTIONARIO
1) Fundamento de las determinaciones de Gettler Freimuth. Función del agregado de cada uno de los reactivos.

2) Fundamento del método de microdifusión. Reacciones involucradas.

3) Fundamento del método de investigación espectroscópica. Cuáles son las principales interferencias encontradas?

1 - TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS

Tipos de muestras: Cereales, alimentos balanceados, leche y sus derivados, oleaginosas, especies.

Procedimiento para la determinación de aflatoxinas

Se realizan los siguientes pasos:

1. Molienda del material a tamaño particulado

2. Extracción de las aflatoxinas (AFL.) con mezcla de solventes adecuada
3. Purificación de los extractos
4. Detección mediante TLC.
Procedimiento

Pesar 25 gr de muestra, molerla en molinillo o licuadora y colocarla en un erlenmeyer con tapa esmerilada, en lo posible. Agregarle 50 ml de la mezcla metanol:agua (60:40), 1 gr de NaCl
y 20 ml de hexano, luego colocarlo en un agitador mecánico, durante 30 minutos. Decantar y filtrar por papel Whatman Nº 4, tomar 25 ml de la capa inferior (metanol:agua), mediante el
empleo de pipeta y colocar en ampolla de decantación.

Agregar en la ampolla 25 ml de tolueno o cloroformo, agitar 1 min con cuidado y dejar decantar para que se separen las fases. Tomar la porción superior (en el caso de haber usado
tolueno), o inferior (si empleó cloroformo), filtrar por papel de filtro con Na2SO4 anhidro.

Realizar otra extracción con tolueno o cloroformo, nuevamente, lavando el papel de filtro con una porción del solvente empleado Reunir los extractos secos y llevara sequedad en
rotavapor (80 ºC).

Emplear el extracto redisuelto para realizar la TLC.

Aislamiento y presuncion de identidad

Método por TLC:

Ficha técnica de la AOAC (Official Methods of Analysis 13 th Ed. Association of Official Analytical Chemists), 26031, pág. 419 Washington 1980).

Técnica

Disolver el residuo en 100 µl de tolueno:acetonitrilo (98:2), agitar vigorosamente para disolver adecuadamente y con jeringa de 10 µl. Sembrar en placa de sílica gel (como fase
estacionaria):

1. una mancha de 2 µl
2. una mancha de 5 µl
3. dos manchas de 10 µl del extracto problema. En la misma placa se siembra:
4. una mancha de 2 µl de estándar
5. una mancha de 5 µl de estándar
6. una mancha del 10 µl de estándar
7. una mancha de 10µl de estándar sobre una de las manchas c)

El cromatograma se desarrolla utilizando como fase móvil la mezcla cloroformo acetona (9:1) sin equilibrar. El revelado se realiza bajo luz ultravioleta de onda larga.

Intepretación

Deben analizarse las manchas que presenten la muestra problema y comparar sus respectivos valores de Rf con los de los estándares.

Examinar la fluorescencia de las manchas de la muestra, observando si manchas fluorescentes de idéntico valor de Rf ofrecen un aspecto similar al de los patrones.

A partir de los datos obtenidos en la TLC, se debe estimar la dilución más adecuada a efectuar para el análisis cuantitativo, teniendo en cuenta para el cálculo la cantidad de extracto
usada en este caso.

Cuantificación

Técnica

Si de acuerdo a lo observado en el paso anterior fuera necesario diluir el extracto, el mismo debe evaporarse previamente a sequedad en baño de agua y redisolver en el volumen
calculado de tolueno:acetonitrilo (98:2).

En una placa cromatográfica debe sembrarse:

1. una mancha de 3,5 µl del extracto problema

2. una mancha de 5,0 µl del extracto problema
3. dos manchas de 6,5 µl del extracto problema
4. manchas de 3,5 5,0 y 6,5 µl del patrón cuantitativo correspondiente a la aflatoxina sospechosa, según lo observado en la etapa anterior e) 5,0 µl del patrón cuantitativo sobre
una de las manchas problema de c), actúa como patrón interno.

Luego se procede al desarrollo del cromatograma como se indicó anteriormente.

Interpretación

El patrón deberá presentar una resolución adecuada, caso contrario deberá recromatografiarse. Los valores de Rf de las AFL usadas como patrones internos deben diferir muy poco (lo
ideal es que sean idénticos), de los correspondientes a los respectivos patrones cuantitativos.

Como las manchas de extracto problema se comparan directamente con la de los patrones de AFL. carece de importancia la magnitud de los valores de Rf apreciados.

Toda mancha fluorescente que pretenda identificarse como AFL B o AFL G, deberá tener idéntico valor de Rf y un color similar al ofrecido por la mancha patrón correspondiente.

Comparar la intensidad de fluorescencia presentada por la mancha del extracto problema con la intensidad de fluorescencia de la mancha de AFL. B1 del patrón y determinar cuál de las
alícuotas del extracto problema presenta una intensidad de fluorescencia igual a una de las manchas patrón. Si la intensidad de la mancha problema es intermedia entre dos manchas
patrones, se deberá interpolar entre las mismas.

Cálculos

El contenido de AFL. B1 se determina aplicando la fórmula siguiente:

 S.Y.V
µl de AFL. B1/ Kg. de producto =
X.Z

Siendo:
S.................. µl. del patrón de AFL. B1 de intensidad de fluorescencia igual a la muestra problema.
Y.................. concentración de AFL. B1 en el mencionado patrón, en µgr/ml.
V ..................µl del solvente requeridos para diluir el extracto final
X.................. peso en gr. de la muestra original contenido en el extracto final.
Z...................pl. del extracto problema aplicado para obtener una intensidad de fluorescencia igual a S del patrón de AFL. B1

Los cálculos para B2, G1 y G2 son similares

Procedimiento para determinar simultáneamente aflatoxinas, ocratoxina y zearalenona

Drogas y reactivos:

 Hexano, cloroformo, cloruro de metileno, dietiléter, todos de grado p. a.

 Amoníaco.
 Solución metanol/agua (85:15)
 Solución H2SO4 30%
 Solución de Fast Blue Salt RR 0,7 % p/v en agua destilada.
 Solución de NaOH 0.1 N
 Solución de NaCI al 10% p/v,
 Solvente cloroformo/acetona (9:1)
 Solvente tolueno/acetato de etilo/fórmico 85% (6:3:1)

Standards:

 Solución de Aflatoxinas B1 0.33 µg/ml, B2 0.70 µg/ml, G1 0.33 µg/ml, G2 0.70 µg/ml en cloroformo.
 Zearalenona 50 µg/ml en cloroformo.
 Ocratoxina 5 µg/ml en metanol.

Materiales y equipos especiales:

 Cromatofolios de silicagel 60 sin indicador de fluorescencia, 0.2 mm de espesor

 Lámpara UV 365 nm
 Micropipetas 100 µl
 Jeringa Hamilton 10 25 µl
 Columnas SPE de 5 ml de capacidad
 Rociadores de cromatofolios

Extracción:

Mezclar 20 gramos de triturado con 80 ml de una solución metanol/agua (85:15). Agitar manualmente durante 30 minutos o en shaker o licuadora cinco minutos.
Filtrar en papel de filtro de poro grueso y colectar 40 ml de filtrado.
Agregar 40 ml de NaCI 10% a los 40 ml de filtrado.
Desgrasar por extracción de 2 x 25 ml con hexano en ampolla de decantación. Descartar el extracto hexano.
Extractar la solución desgrasada con 2 x 25 ml de cloroformo. Colectar ambos volúmenes de cloroformo y evaporar, descartando la fase acuosa.

Purificación:

Acondicionar la columna con 3 ml de hexano, seguida de 3 mililitros de cloruro de metileno. No permitir que el lecho de la columna se seque.
Disolver el residuo clorofórmico en 3 ml de cloruro de metileno y transferir cuantitativamente a la columna con cloruro de metileno. Aspirar la muestra.
Lavar con 3 mililitros de hexano, seguido de 3 ml de dietiléter, seguido de 3 ml de cloruro de metileno. Descartar los eluatos.
Eluir la muestra desde la columna con 6 ml de cloroformo/acetona (9:1). Evaporar hasta residuo seco.

Cromatografía en placa fina:

El residuo se redisuelve en 200 µl de cloroformo, usando este extracto para la siembra en TLC. El solvente de corrida a usar es tolueno/acetato de etilo/fórmico 85% (6:3:1)

Revelado:

Las aflatoxinas aparecen con fluorescencia azul al UV (365 nm). Rociando con H 2SO4 30% la fluorescencia se toma amarilla. Límite de detección 0,5 ng. Rf afla. ~ 0.20.
La zearalenona aparece luego del rociado de la placa con Fast Blue Salt RR y seguidamente con NaOH 0. 1 N. Se observará la aparición de una mancha púrpura bajo luz blanca. Límite
de detección 5 ng. Rf zea. ~ 0,70.
La ocratoxina aparece con fluorescencia verde bajo luz UV (365 nm), Luego de exponerla placa a vapores de NH3 se observa viraje a fluorescencia azul. Límite de detección 0.5 ng. R f
ocra. ~ 0.40.
Procedimiento para determinar Tricotecenos de los grupos A y B

Drogas y reactivos:

 Acetonitrilo, acetato de etilo, cloroformo, tolueno, ácido fórmico, benceno, acetona, todos de grado p.a.
 Carbon activo para cromatografía o equivalente. Activado cinco minutos a 150 ºC
 Alúmina neutra para cromatografía o equivalente
 Celite para cromatografía o equivalente.
 Solución de cloruro de aluminio. Disolver 15 gr de Cl 3AI.•3H20 en 15 ml de agua más 85 ml de etanol puro o en 100 ml de etanol 96º
 Solución de ácido sulfúrico al 30%.
 Solvente I mezcla acetonitrilo/acetato de etilo/agua (50:41:9).
 Solvente lI: cioroformo/acetonitrilo (4:1).

Standards:

 T 2 100 µg/ml en cloroformo.

 Neosolaniol 100 µg/ml en cloroformo,
 DON 100 µg/ml en metanol

Materiales y equipos especiales:

 Cromatofolios de silicagel 60 sin indicador de fluorescencia, 0.2 mm de espesor.

 Estufa 120 ºC.
 Lámpara UV 365 nm,
 Micropipetas 100 µl
 Jeringa Hamilton 10 25 µl
 Columnas de 1 cm de diámetro interno y 10 cm de longitud de material no atacable por solventes, pudiendo usarse el cilindro de jeringas descartables de 5 ml.
 Rociadores de cromatofolios.

Extracción:

Pesar 10 gr. de triturado y agregar 40 ml de Solvente 1 y 36 ml de hexano.

Agitar manualmente durante 30 minutos o en shaker o licuadora cinco minutos.
Filtrar a través de papel de filtro de poro grueso. Tomar la fase inferior (acuosa) para proceder a la limpieza del extracto.

Limpieza:

Preparar una columna con elementos en el siguiente orden desde abajo hada arriba: papel de filtro de poro grueso igual al diámetro de la misma, 0.1 gr de celite y 1.5 gr de la mezcla
carbón activado/alúmina/celite (0,7:0,5:0,3), compactando hacia el fondo de la columna.
Lavar la columna con 6 ml de Solvente 1, aplicando vacío con una velocidad de elución de 5 ml/min. Descartar el líquido de lavado.
Agregar sucesivamente 20 ml del filtrado y 10 ml del Solvente 1, recuperando el total del eluído.
Trasvasar a un balón y llevar a sequedad a 70 ºC.
Lavar el balón con dos volumenes de acetato de etilo a temperatura de baño maría para asegurar la disolución de todas las toxinas adheridas a las paredes del balón. Llevar nuevamente
a sequedad.

Cromatografía en placa fina

Redisolver el extracto en 100 µl de Solvente II. El solvente de corrida a usar es benceno/acetona (3:2).
La placa se desarrolla y se seca en la oscuridad.

Revelado:

El DON aparece con una fluorescencia azul a la luz UV de 360 nm, luego de embeber la placa en una solución al 15% en clooruro de aluminio en etanol 96º y calentar a 120 ºC durante
cinco minutos. Rf DON ~ 0.30. T2 y neosolaniol aparecen con una fluorescencia gris verdosa a la luz UV de 360 nm, luego de nebulizar con una solución de ácido sulfúrico al 30% y
calentar a 120 ºC durante cinco minutos. Rf T2 ~ O.7; Rf neos. ~ 0.45

2 - LABORATORIO: TOXICOLOGIA DE URGENCIA

GENERALIDADES:

Se incluye un grupo de sustancias que comúnmente producen intoxicaciones que pueden ser de evolución mortal, lo cual muchas veces puede evitarse por la celeridad del tratamiento
aconsejado en cada caso.

De ahí la importancia de este capítulo de la toxicología, en la cual se usarán para la identificación de dichas sustancias, reacciones relativamente simples, rápidas y en algunos casos
específicas.

Se va a investigar en una muestra de orina tanto drogas de carácter ácido como básico, por lo tanto se procederá a realizar una extracción en medio ácido, obteniendo la fracción "éter
ácido" y de la fase acuosa que resultó de esta extracción, se procederá a alcalinizar y realizándose otra extracción para obtener la fracción "éter alcalino".

Con otra fracción de la muestra de orina se procederá a realizar la hidrólisis ácida, a partir de la cual se investigará metabolitos de ciertos psicofármacos.
MUESTRA: ORINA

PROCEDIMIENTO:

Acidificar un volumen de orina (aproximadamente 20 ml) con ClH o S0 4H2 10%, hasta lograr un pH=2. Colocar en ampolla de decantación y extraer con 10 ml de éter etílico , agitar
suavemente tratando de evitar la formación de emulsiones, dejar reposar para que se separen las fases. Recoger la fase orgáni ca en vaso de ppdo. y realizar otra extracción con otros 10
ml de éter etílico, agitar y dejar separar las fases, juntar esta fase orgánica con la anterior en el vaso de ppdo, (guardar la fase acuosa para realizar la extracción en medio alcalino).

Lavar los extractos con solución saturada de NaCI, separar las fases y secar la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro, filtrar, recoger los extractos en vaso de ppdo. para
posteriormente concentrados.

A partir de la fase acuosa se alcalinizar con aproximadamente 5 ml de NH3 , controlar el pH que no supere valores de 8 ó 9, realizar dos extracciones con 10 ml de éter etílico cada una y
se procede igual que en la extracción ácida.

La concentración de los extractos se lleva a cabo sobre plancha calefactora ADVERTENCIA: CONTROLAR TEMPERATURA o en baño de María hirviente, PREVIAMENTE APAGADO
EL MECHERO

Hidrólisis ácida: Se toman 10 ml de orina y se le agregan 4 ml de ClH concentrado, se calienta a ebullición durante 30 minutos, previa adaptación de un refrigerante a reflujo. Dejar
enfriar, alcalinizar con NH3 concentrado, no superando pH= 10. Realizar dos extracciones con 10 ml de éter etílico, secar los extractos etéreos con sulfato de sodio anhidro, filtrar y
evaporar en plancha calefactora hasta sequedad, teniendo los cuidados anteriormente citados. Tomar el residuo con 5 ml de CIH 6 N.

Se procederá luego a realizar con los extractos alcalino, ácido y el proveniente de la hidrólisis, reacciones de caracterización y dos TLC ( ácida y alcalina), investigando las drogas
correspondientes en cada caso.