ÍNDICE

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ................................................................... 3

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ........... 6

Niveles de bioseguridad: .......................................................................................................................... 7

Normas de trabajo en el laboratorio: ........................................................................................................ 8

MATERIALES DE LABORATORIO............................................................................. 10

De vidrio ................................................................................................................................................. 10
De metal ................................................................................................................................................. 12
De plástico o goma: ................................................................................................................................ 13

LIMPIEZA Y PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE LABORATORIO PARA SU

ESTERILIZACIÓN ...................................................................................................... 14

Limpieza del material:............................................................................................................................. 14

Preparación del material: ........................................................................................................................ 16

ESTERILIZACIÓN ...................................................................................................... 17

ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO...................................................................... 18

Flameado:............................................................................................................................................... 18
Horno esterilizador: ............................................................................................................................... 18

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO ................................................................ 20

Autoclave: ............................................................................................................................................... 20
Vapor fluente: ......................................................................................................................................... 23
Ebullición: ............................................................................................................................................... 23
Tindalización:.......................................................................................................................................... 23
Pasteurización: ....................................................................................................................................... 24

ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN ........................................................................ 25

ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES .................................................................... 26

Ionizantes: .............................................................................................................................................. 27
No Ionizantes:......................................................................................................................................... 27

TOMA Y ENVÍO DE MUESTRAS ............................................................................... 28

Tipos de Muestras: ................................................................................................................................. 28

Materiales necesarios: ............................................................................................................................ 28
Técnicas generales: ............................................................................................................................... 30

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ................................................................... 32

Extracción de ADN ................................................................................................................................. 32

Digestión enzimática .............................................................................................................................. 32
electroforesis en gel ............................................................................................................................... 33
 PCR: (Reacción en Cadena de la Polimerasa)....................................................................................... 33
Hibridación por SONDAS: ...................................................................................................................... 34
Huellas dactilares: .................................................................................................................................. 35
Microbiología molecular .......................................................................................................................... 36

CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS .......................................................... 38

BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 42
 EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Podrá tener diferentes usos: enseñanza, diagnóstico, investigación, de control de
alimentos, producción de vacunas y antibióticos, o una combinación de algunos ellos.
En relación a esto serán las condiciones edilicias
indispensables que deberán cumplir.

Cuando se diseña un laboratorio, sea cual fuere su

función, se deberán tener en cuenta algunas premisas
comunes:

 Ubicación: antiguamente se preconizaba la

conveniencia de que el laboratorio estuviera aislado de los centros urbanos,
actualmente este concepto se ha modificado por la necesidad de rapidez en los
resultados. Debe ser de fácil acceso para los operarios y la recepción de
muestras. El aislamiento se logra con medidas de Bioseguridad y si es posible
se trata de separarlo de otros edificios por un parque circundante.
 No ocurre así con los laboratorios de Máxima Contención, que son aquellos que
trabajan con microorganismos de grupo de riesgo IV, y que deben tener un
edificio totalmente aislado y con las más estrictas precauciones de seguridad.
 Orientación: debe estar orientado en forma tal, que el sol no incida
directamente sobre los ventanales, o por lo menos que esto ocurra sólo unas
pocas horas al día. Tampoco deben olvidarse los vientos y lluvias propias de
cada zona, evitando que choquen contra las ventanas.
 Iluminación: si se trabaja con luz artificial, ésta deberá estar bien distribuida,
hay que prever una iluminación suficiente, evitando reflejos molestos. La luz que
se utiliza generalmente es la fluorescente, ya que ésta no modifica la percepción
de los colores ni cansa la vista. Habrá al menos una ventana en cada laboratorio
que sea fuente de luz natural, difusa y abundante.
 Ventilación: los laboratorios, por razones de salubridad, tienen que estar bien
ventilados. La ventilación debe poder regularse a voluntad. Deberá existir un
sistema mecánico de ventilación que introduzca aire del exterior y expulse el aire
viciado sin recirculación. La contaminación del medio ambiente se evita
colocando filtros de aire especiales en el laboratorio, o cabinas de siembra, que
retengan las partículas y todos los organismos que pudieran encontrarse en el
aire; utilizándose para ello Filtros HEPA de alta eficiencia que tienen capacidad
para retener partículas de 0,3 µ de diámetro. El aire que circula (ingreso y
egreso), sobre todo este último, pasará a través de los filtros, cuyo
 funcionamiento será periódicamente controlado, para constatar la integridad de
los mismos, y serán removidos con cierta frecuencia.
 Techos, paredes y pisos: deberán ser lisos y fáciles de limpiar; impermeables a
sustancias químicas y productos desinfectantes utilizados de ordinario en el
laboratorio. Los suelos serán antideslizantes, generalmente de granito pulido,
baldosas, o de otro material impermeable.
 Las paredes deberán estar recubiertas por azulejos, hasta una altura
aproximada de 2 metros.
 Mesadas: La superficie de las mesadas deberán ser amplias, para permitir
trabajar cómodamente. Impermeables al agua y resistentes a la acción de los
desinfectantes: ácidos, álcalis, solventes orgánicos y al calor moderado. Pueden
ser de azulejo, acero inoxidable o mármol pulido y de color claro.
 Muebles: Debe quedar espacio entre mesas, sillas armarios y otros muebles, así
como debajo de los mismos, a fin de facilitar la limpieza y circulación. Debe
reservarse espacios de guardado inmediatos, a fin de evitar la acumulación
desordenada de materiales sobre las mesadas de trabajo.
 Aparatos: En el laboratorio también encontramos centrífugas, microscopios y
heladeras (donde se guardan los medios de cultivos y las muestras a procesar),
freezers.

Si hablamos de un laboratorio de enseñanza, donde además se realiza algún tipo de

investigación, es indispensable tener en cuenta que debe haber por lo menos cuatro
áreas bien delimitadas, estas son:

 Cocina: es el lugar de lavado, preparación y esterilización de materiales y

medios de cultivo. Este lugar deberá contar con conexiones de agua potable y
gas. Aquí generalmente se encuentran el horno de esterilización, el autoclave, la
estufa de secado y la balanza de precisión.
 Cabinas de siembra: son módulos o cabinas de trabajo individuales, de paredes
laterales, preferentemente de vidrio, para que el director del laboratorio pueda
supervisar los trabajos que en ellas se llevan a cabo. Aquí encontramos todos
los materiales necesarios para trabajar en siembra, aislamiento e identificación
de los gérmenes, incluyendo estufas de cultivo, reguladas a diferentes
temperaturas (37º C para bacteriología, 25º C para hongos, etc.).
 Sector de oficinas: en esta área se encuentran las oficinas de los directivos, la
biblioteca, secretarías y escritorios. Podrán contar además, con computadoras.
 Salón de clases: que puede ser un aula para clases teóricas solamente o un
laboratorio de trabajos prácticos para los alumnos, en este último caso estarán
provisto de mesadas como las ya descriptas, conexión de agua corriente y gas.

Cabinas de Seguridad:

Están diseñadas para proteger al laboratorista de los aerosoles y partículas aéreas,

pero no protegen al trabajador de las consecuencias de prácticas defectuosas.

Tipos de cabinas: Existen tres tipos de cabinas de seguridad (clase I, II y III).

Cabina Clase I: el operador se encuentra sentado frente a la cabina, puede observar a

través de una ventana de vidrio y trabajar con sus manos dentro. Cualquier aerosol
proveniente del cultivo u otro material infeccioso, es retenido por un filtro que remueve
todos los organismos.

Cabina Clase II: esta es un poco más complicada, alrededor del 70% del aire re-circula
a través del filtro, de manera tal que el aire en el área de trabajo es prácticamente
estéril. Los aerosoles que se producen durante el curso del trabajo son removidos por
el filtro.

Cabina Clase III: este tipo de cabina es totalmente cerrado y ninguna partícula puede
escapar de su interior. El operador trabaja con guantes, que forman parte de la cabina.
El aire entra a través de un filtro y es extraído a través de otros dos.

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. ¿Cómo es la ubicación del laboratorio de microbiología de la Facultad?

2. Describa las pautas de construcción (pisos, paredes, mesadas, ventanas) que
pueda identificar cómo correctas en el salón de clases.
3. Describa brevemente que sectores se pueden identificar en un laboratorio y
qué elementos son esperables encontrar en cada uno, según sus funciones.
 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
En el laboratorio de microbiología todas las personas que trabajan con materiales que
contengan agentes infecciosos deben estar conscientes de los peligros potenciales
asociados a estos agentes, y estar entrenadas en las prácticas y técnicas requeridas
para manejar estos materiales de una manera segura.

Los laboratorios de Microbiología requieren que se establezcan normas para su

organización y funcionamiento óptimos.

Agentes de riesgo:

 Biológicos: microorganismos que pueden penetrar en las membranas

mucosas por inhalación, ingestión o inoculación directa.
 Físicos y mecánicos: temperaturas extremas, contactos eléctricos,
radiaciones, vidrios de recipientes dañados.
 Químicos: corrosivos, tóxicos, carcinogénicos, inflamables, explosivos, etc.

Existen dos términos que debemos conocer antes de avanzar.

Cuando hablamos de normas de Bioseguridad, nos estamos refiriendo a un conjunto

de prácticas utilizadas en el laboratorio, algunas de ellas son generales y se relacionan
con el sentido común, otras en cambio, son específicas y se establecen según el Nivel
de Bioseguridad (niveles: 1, 2, 3, 4) de ese laboratorio. Estos niveles se encuentran en
relación directa con el grupo de riesgo (I, II, III, IV) de los microorganismos que se
manipulan en el lugar.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD: Existen cuatro niveles.

 Nivel de Bioseguridad 1: Destinado principalmente al diagnóstico y a

la enseñanza, con equipos de seguridad y reglamentaciones de carácter
general. Las normas de seguridad están destinadas sobre todo a la protección
de los cultivos y no tanto a la protección del operador, se trabaja con
microorganismos de grupo de riesgo I (escaso riesgo individual y ningún
riesgo comunitario). Son microorganismos no patógenos o con escasas
posibilidades de producir enfermedades en humanos y animales, como ser
bacterias saprófitas de alimentos, mohos, levaduras comunes, etc.

Ejemplo: laboratorio de entrenamiento o enseñanza.

 Nivel de Bioseguridad 2: Estos laboratorios trabajan con gérmenes de

grupo de riesgo II (riesgo individual moderado, riesgo comunitario limitado),
podrían llegar a producir enfermedad en el hombre o animales en forma
accidental, sin embargo son bien controlados con normas rutinarias de
laboratorio, existiendo además medidas preventivas (inmunización) y
tratamientos efectivos (quimioterápicos) ejemplo de ellos son: Staphylococcus,
Streptococcus, algunas enterobacterias, vibrios, etc. Aplicamos las normas
generales de bioseguridad y agregamos las siguientes:
-Práctica cuidadosa para no producir aerosoles infecciosos.
-Acceso reglamentado.
-Todo accidente deberá ser notificado, por mínimo que éste fuera.

Ejemplo: laboratorio de hospital, de salud pública, etc.

 Nivel de Bioseguridad 3: Son laboratorios de investigación o de

diagnóstico que trabajan con agentes de grupo de riesgo III (riesgo
individual elevado, riesgo comunitario escaso), son microorganismos que
pueden provocar enfermedades graves en el laboratorista, pero el riesgo de
propagación es muy limitado, debido a su forma de contagio, ya que no se
transmiten en forma rápida de un individuo a otro, y tienen pocas
posibilidades de escapar del laboratorio, como Brucella, Salmonella,
Francisella, Rickettsia, Chlamydiophila, etc. Además existen vacunas
efectivas y quimioterapia para combatirlos.
 -Personal entrenado en el manejo de estos patógenos
-Acceso controlado y restringido al personal del laboratorio.
-Ventanas cerradas herméticamente.
-Sistemas de ventilación independientes.
-Lavamanos accionados con el pie y toallas desechables.
-Uso de gabinetes de seguridad, guantes y barbijos.

Ejemplo: laboratorio especializado.

 Nivel de bioseguridad 4: Son laboratorios de alta seguridad, se trabaja

con agentes de grupo de riesgo IV (elevado riesgo personal y para la
comunidad), los agentes en este grupo son virus. Requieren medidas
estrictas de seguridad por ser muy patógenos y propagarse rápidamente, o
por ser agentes productores de enfermedades exóticas en la zona. Los
ejemplos más representativos son el virus de la Fiebre Aftosa, y el virus de
la Encefalitis equina.
-Acceso restringido únicamente a personal autorizado.
-Entrada a través de un vestuario con duchas y cambio completo de ropa,
además no se podrán utilizar anillos, pulseras o relojes mientras se trabaja.
-Edificio independiente de otros y aislado de los centros urbanos.
-Ventanas de vidrios irrompibles y puertas a prueba de filtraciones de aire.
-El agua de las duchas y todos los efluentes deberán ser tratados previa
eliminación.
-En caso de accidente, habrá un plan de emergencia, con controles médicos
e investigación continua después de subsanado el inconveniente.

Ejemplo: laboratorio de alta seguridad (Laboratorio de Máxima Contención)

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO:

A continuación se transcriben las reglas más importantes:

1. En la zona del laboratorio no se permitirá comer, beber, fumar, guardar

alimentos ni aplicarse cosméticos.
2. Toda persona destinada a cumplir funciones en el laboratorio deberá
recibir adiestramiento y capacitación permanente para reducir al mínimo los
riesgos de contaminación o infección.
3. Es obligatorio el uso de batas o delantales, y en casos necesarios,
también guantes y barbijos. No se llevará la ropa del laboratorio fuera de
 éste, por el riesgo de dispersión de gérmenes. Los delantales serán
esterilizados en autoclave.
4. Todos los procedimientos se llevarán a cabo con el máximo cuidado de
manera tal de evitar la formación de aerosoles.
5. Las mesadas y superficies de trabajo deberán desinfectarse antes de
comenzar el trabajo y al finalizarlo con una sustancia desinfectante eficaz,
como alcohol al 70 %, formol al 4 %, hipoclorito de sodio en solución 1:10,
etc.
6. Lavarse las manos antes y después de trabajar con material infeccioso,
así como al abandonar el laboratorio.
7. Cualquier accidente se informará inmediatamente al encargado de
laboratorio.
8. Tener siempre en lugares visibles los planes de contingencia y
procedimientos de emergencia.
9. Se mantendrá el laboratorio limpio y libre de cualquier material que no
tenga relación con el trabajo.
10. No se permitirá la entrada al laboratorio de animales que no tengan
relación con el trabajo que se está realizando.
11. Todos los líquidos o sólidos contaminados se neutralizarán antes de
eliminarlos o volverlos a utilizar. Los materiales contaminados que vayan a
ser esterilizados o incinerados fuera del laboratorio se colocarán en
recipientes cerrados.
12. Trabajar siempre en el área estéril que rodea al mechero.
13. Se preferirá la utilización de dispositivos de aspiración mecánica para
las pipetas, evitando todo riesgo de contaminación del operador o del medio.
14. En caso que así corresponda, el personal deberá estar inmunizado.

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. ¿Qué es la bioseguridad, de cuántos niveles consta y qué características

posee cada uno de estos niveles?
2. Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiología y un laboratorio
convencional.
 3. Nombre cuatro ejemplos de riesgos: físicos, químicos y microbiológicos.
4. Averigüe a qué grupo de riesgo pertenecen los siguientes gérmenes:
Micobacteryum tuberculosis, virus del Ébola, Saccharomyces cerevisiae.
5. ¿A qué nivel de bioseguridad considera que pertenece el laboratorio de la
facultad? Justifique.

MATERIALES DE LABORATORIO
El material usado en el laboratorio de microbiología puede clasificarse en: material de
vidrio, porcelana, metal y plástico. Por lo general el material más utilizado es el de
vidrio.

A continuación describiremos sintéticamente los materiales de uso más frecuente.

DE VIDRIO
El material de vidrio debe ser de borosilicato, ya que este material es mucho más
resistente al choque térmico y además es neutro.

 Tubos de ensayo: Son de vidrio, de paredes delgadas, pueden tener

diferentes medidas, según su uso. Deben ser de buena calidad,
transparentes, incoloros, resistentes y neutros. Los tubos más utilizados
miden 16 mm x 160 mm.
Usos: Para fraccionar medios de cultivo, sólidos en pico de flauta, líquidos y
semisólidos.
 Tubos de hemólisis: Muy similares a los tubos de ensayo pero de
menor capacidad. Miden 12 mm x 80 mm.
Usos: Para fraccionar medios de cultivo, sólidos en pico de flauta, líquidos y
semisólidos, en aquellos casos en que se desee menor volumen.
 Tubos de Kahn: También similares a los anteriores. Miden 10mm x 70
mm.
Usos: Los mismos que para el tubo de hemólisis.
 Tubos de centrífuga: De forma cilindro-cónica y de paredes gruesas y
resistentes (deben soportar grandes presiones). Su capacidad varía
entre 5 y 200 cc. Pueden ser graduados, aforados o lisos.
Usos: Para centrifugar vacunas o muestras ej: orina, leche, etc.
 Campana de Durham: Es un pequeño tubo de vidrio que se coloca
invertido, en el interior de un tubo de ensayo con medio de cultivo
líquido.
Usos: Para comprobar la formación de gas que se desprende del medio de
cultivo sembrado y queda retenido en la campana.
 Pipetas: Son tubos cilíndricos largos y angostos, que tienen los dos
extremos abiertos: uno es afilado, y es el que entra en contacto con el
líquido, el otro es redondeado y se contacta con la boca del operador o
con la propipeta. Pueden ser graduadas con una escala numérica que
indica su capacidad (1; 5; 10 ml)
Usos: Para trasvasar líquidos.
 Pipetas Pasteur: Tubo recto cuya punta va disminuyendo
gradualmente de diámetro hasta hacerse un tubo capilar, tiene una
longitud de 30 cm, aproximadamente.
Usos: Para aislamientos de colonias, siembras, repiques, etc.
 Matraces: Son recipientes de forma esférica con cuello largo cilíndrico.
Su capacidad varía de 100, 200, 500 y 1.000 cc. Tiene un fondo plano
que los diferencia de los balones. Pueden estar o no aforados.
Usos: Para preparar medios de cultivo, guardar soluciones, etc.
 Frasco de Erlenmeyer: De forma cónica con vértice superior, cuello
corto y base amplia para su sustentación. Los hay de distintas
capacidades: 100, 250, 500, 1.000 y 3.000 cc.
Usos: Para preparar medios de cultivo, vacunas, o siembras de gran volumen,
etc.
 Frasco de Kitasato: De forma similar al anterior, pero con una
tubuladura lateral. Es de vidrio más grueso y resistente, para poder
resistir las presiones.
Usos: Se utilizan para filtrar líquidos a través de bujías o filtros de membranas,
conectados a una bomba de vacío.
 Frascos lavadores: Son frascos cilíndricos provistos en su parte
superior de un tapón de goma que deja pasar dos tubos de vidrio, uno
penetra hasta el fondo del frasco (tubo de derrame), y el otro queda a
nivel del tapón (tubo de infiltración, deja pasar el aire).
Usos: Destinado al lavado de los portaobjetos durante las coloraciones.
 Frascos goteros: Recipientes cilíndricos de 50 o 100 cc. De
capacidad, provistos de un tapón gotero de vidrio. Según la sustancia
que van a contener podrán ser transparentes o de color caramelo
(sustancias fotosensibles).
Usos: Para conservar soluciones colorantes, decolorantes o reactivos.
  Probetas: Recipientes cilíndricos con base ancha que asegura su
estabilidad, presenta una terminación superior en pico. Pueden ser
graduadas o aforadas y tener diferentes capacidades, 10, 100, 500 ml.
Usos: Para volumetrar líquidos.
 Placas o cápsulas de Petri: Recipientes de forma circular, con base y
tapa, de vidrio transparente o de plástico descartables. Las placas
pueden ser finas (de vidrio soplado) o gruesas (de vidrio prensado) y
además tener diferentes diámetros: chicas de 5 cm y grandes de 10 cm.
Usos: Para siembra de microorganismos en medios de cultivo sólidos y en
superficie.
 Embudos: Recipientes cónicos con un extremo largo y delgado.
Generalmente de vidrio, pueden ser lisos o estriados. Se utilizan
preferentemente los que tienen un diámetro de 5 y de 20 cm.
Usos: Para trasvasar y filtrar líquidos si se usa con papel: colorantes, vacunas,
etc.
 Morteros: Están compuestos de dos partes, un recipiente cóncavo de
paredes gruesas y un pilón. Pueden ser de vidrio, porcelana o
cerámica.
Usos: Se lo utiliza para triturar elementos sólidos.
 Portaobjetos: Láminas de vidrio de forma rectangular.
Usos: Utilizados para realizar preparados para observaciones microscópicas:
extendidos, improntas, frescos, etc.
 Cubreobjetos: Láminas delgadas de vidrio, de forma rectangular o
cuadradas, cuyo espesor varía entre 0,17 y 0,20 mm.
Usos: Para cubrir preparados que van a ser visualizados al microscopio.

DE METAL
 Gradillas: Pueden ser de metal, madera o plástico, vienen de
diferentes tamaños.
Usos: se utilizan para sostener los tubos de Khan, de hemólisis, de ensayo,
eppendorf y de centrífuga.
 Mechero de Bunsen: Son utensilios metálicos que presentan una
base, un tubo, una chimenea, un collarín y un vástago. Con ayuda del
collarín se regula la entrada de aire. Para lograr calentamientos
adecuados hay que regular la flama del mechero a modo tal que ésta se
observe bien oxigenada (flama azul).
 Usos: permiten calentar sustancias y flamaear asas de siembra y boca de tubos
 Ansas de siembra: constituido por una varilla metálica con un mango
aislante de ebonita; en el extremo opuesto se fija un alambre fino de
platino o nicromo, de calentamiento rápido a la llama. De acuerdo a su
terminación se denomina: ansa en anillo (extremo en anillo cerrado),
ansa recta (extremo aguzado) y en L (extremo aplanado).
Usos: para inocular y sembrar muestras o bacterias puras en los medios de
cultivo.
DE PLÁSTICO O GOMA:
 Eppendorf: es un pequeño contenedor cilíndrico de plástico, con un
fondo cónico y una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su
desprendimiento. Usos: Son empleados en biología molecular y
bioquímica para centrifugación, y a menudo como viales contenedores
de sustancias químicas.
 Propipetas: es un instrumento de laboratorio que se utiliza junto con la
pipeta para trasvasar líquidos de un recipiente a otro.
Usos: evita succionar con la boca líquidos nocivos, tóxicos, corrosivos, con
olores muy fuertes o que emitan vapores.
 Crioviales: son tubos de plástico con tapa a rosca que deben estar
estériles.
Usos: se utilizan principalmente para conservar aislamientos bacterianos.
 Tapones: son de goma, caucho, polipropileno, u otro material, pueden
ser de distinto diámetro según la boca del tubo. Deben ser
autoclavables.
Usos: para tapar las bocas de tubos de diferentes diámetros.

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. ¿Qué características del vidrio de borosilicato lo hacen ideal para el

laboratorio?
2. ¿Por qué la madera es un material poco deseable en el laboratorio de
microbiología?
3. ¿Cuáles de éstos materiales de laboratorio reconoce del cursado de
bioquímica y cuáles le resultan nuevos o desconocidos?
 LIMPIEZA Y PREPARACIÓN DEL
MATERIAL DE LABORATORIO PARA SU
ESTERILIZACIÓN
Los materiales utilizados en el laboratorio se contaminan durante las prácticas
microbiológicas de rutina, por lo tanto, es indispensable una adecuada limpieza y
desinfección, para evitar la contaminación del ambiente, que podría acarrear
consecuencias muy peligrosas, y para poder re-utilizarlos nuevamente.

En el laboratorio dividimos al material en:

a) Material nuevo: Es aquel que no se ha utilizado nunca, por haber sido

recientemente adquirido.

b) Material contaminado: También llamado “sucio”, es todo el material que proviene

de las cabinas de siembra.

LIMPIEZA DEL MATERIAL: para la limpieza del material, utilizamos los

siguientes elementos:

 cepillos circulares de distintos tamaños.

 bandejas plásticas o bateas.
 rejillas.
 esponjas.
 contenedor de residuos.
 bandeja con solución sulfocrómica.
 agua corriente y agua destilada.
 jabón en polvo
 cestillos de alambre.

a) Material nuevo:
1. Lavar con jabón en polvo.
2. Enjuagar con agua corriente.
3. Sumergir en agua destilada.
4. Escurrir boca abajo.
5. Secar en estufa de secado.
6. Acondicionar y preparar para esterilizar.

b) Material contaminado o “sucio”: todo material proveniente de la cabina de

siembra deberá tratarse con extremo cuidado. Este material se descarta en ollas o
recipientes con tapa, de tamaño adecuado. Se esteriliza en autoclave a 1 ½ AT
(atmósfera) de presión, lo que equivale a una temperatura de 128º- 130º C, durante 30
minutos. De esta forma el material deja de representar un riesgo, y se puede
manipular con tranquilidad.

Después de esterilizarlos, y una fríos, se desechan los tapones, papeles, gasas, etc.,
en el basurero y los líquidos, en la bacha de la pileta. El material se lava con agua y
jabón en polvo.

Material manchado: Una vez lavado el material se examina detenidamente, para

comprobar si quedaron realmente limpios o están manchados, por colorantes o algún
medio, que no podemos remover con el cepillo. De ser así, colocamos este material en
una batea con solución sulfocrómica, cubriéndolo por dentro y por fuera, dejándola
actuar durante 24- 48 hs.

Para trabajar con la solución

sulfocrómica es necesario protegerse
usando guantes de goma y delantal
plástico.

Transcurrido uno o dos días, se limpia nuevamente con jabón y agua corriente, y si las
manchas han desaparecido, se sumerge todo el material en un recipiente plástico con
agua destilada. Si aún quedara algún elemento manchado, vuelve a la solución
sulfocrómica por otras 24 hs. El material ahora limpio se escurre boca abajo, se seca
en la estufa y se prepara para esterilizar.

Material contaminado:

1. Esterilizar en autoclave.
2. Cepillar con agua
3. Limpiar con jabón en polvo.
4. Enjuagar con agua corriente.
5. Revisar todo el material:
 Manchado
6. Solución sulfocrómica 24- 48 hs.
7. Limpiar con jabón.
8. Enjuagar con agua corriente (continúa paso 9)
 Limpio
9. Sumergir en agua destilada.
 10. Escurrir en posición vertical.
11. Secar en horno de secado.
12. Preparar y acondicionar.
13. Esterilizar.

PREPARACIÓN DEL MATERIAL: Una vez limpio el material de vidrio,

debe prepararse convenientemente, para que ya esterilizado conserve esta condición.
Evitando la contaminación con gérmenes comunes que puedan desvirtuar las
prácticas que en él se realicen. Cada material se prepara de una forma distinta, y el
objetivo final será proteger y mantener la esterilidad.

- Pipetas: éstas llevan un pequeño algodón en la boquilla que actúa como filtro,
impidiendo contaminar el material con los gérmenes del operador, y protegiendo al
laboratorista de la llegada del material a la boca. De todos modos, se recomienda el
uso de pro-pipetas o peras de goma, para evitar cualquier riesgo de accidente. Se
envuelven con tiras de papel (ejm.: rollo de máquina registradora). En el exterior
deberá figurar, escrito con tinta indeleble, la capacidad de la pipeta y la fecha en que
fue esterilizada.

- Tubos y frascos: Se tapan con tapones de algodón o algodón recubierto de gasa,

de un tamaño acorde a la boca del mismo. Se cortan trozos de algodón, que se
doblarán sobre sí mismos, cuidando que el tapón no quede muy suelto, para evitar que
se caiga de la boca del recipiente, o tan ajustado que impida la cómoda maniobra del
operador.

En el caso del Erlenmeyer, Kitasato, matraces y probetas, además llevarán un

capuchón de papel madera.

- Cajas de Petri: se pueden envolver solas, o en grupo de 2; 4 y 6 placas, según las

necesidades. Se utiliza papel de diario o papel madera. Siempre se envuelven
colocando la tapa para abajo, como si fuera un alfajor. Es conveniente utilizar doble
papel y asegurar de este modo la esterilización.

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. ¿Para qué se utiliza la solución sulfocrómica?

2. ¿Por qué el último enjuague debe ser con agua destilada?
3. ¿Qué objetivo tiene preparar los materiales antes de esterilizarlos?
 ESTERILIZACIÓN
En cualquier práctica bacteriológica es
indispensable tener todo el material
experimental, sin presencia de gérmenes
viables, de forma tal que al sembrar un
microorganismo en estudio, en un medio de
cultivo, las manifestaciones de vida que se
pongan en evidencia, correspondan a dicho microorganismo y no a una mezcla de
ellos, como ocurriría si el material no se encontrara libre de bacterias, ya que sabemos
que estas pululan en todos los ambientes, en todos los objetos, superficies y
sustancias.

DEFINICIÓN: Se denomina esterilización al método, técnica o proceso que tiene por

objeto la destrucción completa de los microorganismos existentes en el interior o en la
superficie de cualquier material. El término esterilidad indica ausencia total de
microorganismos. En un material puede haber millones de bacterias muertas
presentes, pero si hay una sola bacteria viable, ya no es estéril.

Los métodos que podemos emplear en la esterilización son muy variados, pueden ser
físicos y químicos. En el laboratorio el agente físico más utilizado es el calor.

APLICACIÓN DE CALOR:

El calor es el método más confiable y universalmente aplicado para esterilización. La

destrucción de una población bacteriana por medio del calor es un proceso gradual y
la cinética de destrucción es exponencial. Lo mismo ocurre con otros
microorganismos, hongos y virus.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

DIRECTO
FLAMEADO:

Se utiliza la llama del Mechero de Bunsen. Es uno de los procedimientos más

sencillos, teniendo la precaución de que el material a esterilizar deberá ser resistente a
la temperatura. Se utiliza en forma rutinaria para esterilizar agujas, ansas, espátulas,
varillas, boca de los tubos de ensayo, etc. Consiste en someter directamente a la llama
del mechero el material que se vaya a esterilizar.

Material a esterilizar:
 Bocas de tubos y frascos
 Asas de Platino
 Pipetas

 Tijera y bisturí

INDIRECTO:
HORNO ESTERILIZADOR:

Se utiliza para esterilizar material de vidrio, porcelana y metal, debidamente preparado

(como se vio en clases anteriores) y sin contener medio de cultivo o líquido alguno. No
se utiliza para material que contenga caucho, telas o medios de cultivos porque se
queman.

Descripción del Aparato: El horno o estufa de esterilización es de forma rectangular,

y consta de una caja metálica de triple pared de cobre, de las cuales la interna y media
están conectadas, a través de orificios, lo que facilita la doble circulación del aire, y la
consiguiente distribución más uniforme del calor en su interior.

En la parte interna, pueden tener de uno a tres estantes perforados o rejillas, donde se
colocará el material a esterilizar, y a través del cual el aire pueda pasar libremente.

Exteriormente está revestida de amianto, o de otro material aislante, que impida o

disminuya la pérdida de calor. La puerta se encuentra en el frente y cierra
herméticamente. En el techo se encuentran dos orificios, uno es regulable, chimenea,
para graduar el paso del aire, y otro es para colocar el termómetro.

Estos aparatos pueden funcionar con una fuente de calor a gas, o más comúnmente
con resistencias eléctricas. Poseen una perilla para poder graduar la temperatura
deseada.

Instrucciones para el uso del horno:

1. Cargar el material a esterilizar debidamente preparado, y teniendo cuidado

de que no toquen las paredes de la estufa. Se puede colocar también una
tira indicadira de temperatura. Son cintas que viran de color cuando
alcanzan determinada temperatura dentro de los aparatos de
esterilización.
2. Cerrar la puerta herméticamente y regular la llave de la temperatura.
3. Encender el sistema de calefacción.
4. Cuando el termómetro llegue a la temperatura deseada, se cierra el sistema
superior de ventilación, a fin de que la temperatura se mantenga constante.
5. A partir de allí se controla el tiempo de esterilización.
6. Transcurrido el tiempo, se apaga el sistema de calefacción, y se deja
enfriar.
7. Recién cuando el horno esté frío se abren las puertas y se retira el material,
para evitar roturas por choques térmicos.

Material a esterilizar:
 Material de vidrio (cajas de Petri, tubos, pipetas)
 Material de metal
 Material de porcelana ( mortero)

Los materiales deben ser sometidos a altas temperaturas por largo tiempo, para que la
esterilización sea efectiva. El tiempo requerido para la esterilización está inversamente
relacionado con la temperatura de exposición.
Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. Investigue ¿Qué parte de la llama del Mechero de Bunsen es la que alcanza la

mayor temperatura?
2. Además del flameado o calor directo, el mechero cumple una función
importante en la bioseguridad ¿Cuál?
3. ¿Qué materiales NO esterilizaría en un Horno? ¿Por qué?
4. ¿Cómo se preparan los materiales para esterilizar en el horno?
5. ¿Qué utilizamos para saber si el horno llegó a la temperatura requerida?

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

A PRESIÓN:

AUTOCLAVE:
Trabaja con vapor saturado a presión. Es una técnica de esterilización sumamente
efectiva, que se basa en tres principios físicos.

Es el método de elección en microbiología, pues la actividad esterilizante de este

procedimiento se basa en el fenómeno de ósmosis, por medio del cual el vapor de
agua penetra a través de las membranas de los gérmenes y también de los esporos y
se difunde en su interior donde coagula el protoplasma.

Uno de los modelos de autoclaves más utilizados en el laboratorio, el de

Chamberland, por ser sencillo y eficaz. A su vez vienen modelos verticales y
horizontales.

Descripción del aparato:

Está constituido por una caldera cilíndrica de cobre batido y estañado interiormente,
sostenido por una camisa metálica. En su parte inferior se encuentra una fuente
calórica, este sistema de calefacción puede ser a gas, eléctrico o combustible.
La parte superior posee una tapa de bronce con los siguientes elementos:

 Termómetro, que generalmente va entre 100 y 120º C.

 Manómetro indicador de presión, expresada en Atmósferas. A veces el
termómetro y el manómetro se encuentran en un solo indicador, teniendo en
cuenta la relación que guardan temperatura y presión.
 Espita, que sirve para eliminar el aire durante el calentamiento, proceso
denominado “purgue” o “purgado”.
 Válvula de seguridad.

La tapa se fija a la caldera por medio de bulones o tuercas mariposa, y entre ambas se
ubica una junta o arandela de amianto grafitado, que garantiza un cierre hermético.
Esta tapa está sostenida por un brazo metálico al cuerpo del autoclave.

En el interior se encuentra una lámina cribada, sobre la cual se apoya el material a

esterilizar, y que lo separa del depósito de agua.

Manejo del Autoclave:

1. Colocar agua dentro del autoclave hasta llegar casi el nivel de la rejilla o
lámina cribada.
2. Sobre la rejilla se acomoda el material a esterilizar. Se debe permitir la libre
circulación del vapor entre los elementos. Los recipientes con líquidos van
en posición vertical para evitar que se vuelquen. El material de vidrio se
apila cuidando de no dañar ninguna envoltura.
3. Cerrar la tapa, ajustando los bulones mariposa, de a pares y en forma
diametral opuesta.
4. Encender el sistema de calefacción. El agua que está contenida en el
interior comenzará a hervir, produciendo vapor, éste desplazará al aire que
se encontraba dentro del autoclave, saliendo por la espita (que
permanecerá abierta durante esta operación). Al principio el vapor saldrá
por la espita en forma discontinua.
5. Cuando el vapor sale por la espita de forma continua, quiere decir que
hemos finalizado el purgado del autoclave, es decir que en el interior del
mismo no hay más aire y está saturado de vapor. En este momento recién
se cierra la espita.
6. Se espera a que el termomanómetro marque la presión y temperatura
requeridos, y a partir de allí se comienza a contar el tiempo de
esterilización.
 7. Una vez cumplido este tiempo, se apaga el sistema de calefacción.
8. Dejamos enfriar hasta que temperatura y presión lleguen a cero. De no ser
así, la descompresión rápida provocaría la ebullición de los medios de
cultivo y probables fisuras en el material de vidrio.
9. Abrimos la espita para dejar entrar aire, abrimos y giramos la tapa.
10. Sacamos todo el material esterilizado y lo depositamos en un lugar
protegido de las corrientes de aire.

El proceso de purgado del autoclave es fundamental, porque una mezcla de aire y

vapor dará una presión menor, y por consiguiente un menor valor de la temperatura.
Recordemos la Ley de Dalton o de las presiones parciales que nos dice “La presión
interior de un recipiente herméticamente cerrado, es igual a la suma de cada una de
las presiones de los gases existentes en él” eso significa que la presión del vapor de
agua es diferente a la presión del vapor combinado con los gases del aire, por lo tanto
el manómetro indicará una presión que no guardará relación con la temperatura. Si
quedan restos de aire son necesarias temperaturas mayores para provocar la misma
presión en el interior y lograr la esterilización.
Material a esterilizar:
 Medios de cultivo
 Frascos con tapas de goma
 Objetos de goma, jeringas, catéteres,etc
 Guardapolvos, guantes
 Material contaminado procedente de cabina

El tiempo y temperatura de esterilización va a estar en relación con lo que deseamos

esterilizar:
SIN PRESIÓN:

VAPOR FLUENTE: Utiliza también el autoclave, pero la diferencia radica en

que se deja la espita abierta, con lo cual la temperatura no se eleva por sobre los 100º
C, ni hay aumento de presión. Se coloca el material y se procede a un calentamiento
por 60 minutos, dejando en todo momento la espita abierta.

Material a esterilizar: Para medios de cultivo que no puedan ser sometidos a un

calentamiento mayor a 100º C sin perder alguna de sus propiedades.
 Caldos gelatinados
 Leche
 Medios con azúcares

EBULLICIÓN: No está reconocida como método eficaz y seguro de

esterilización. El agua alcanza una temperatura de 100º C, la cual destruye en 10
minutos, las formas vegetativas de la mayoría de las bacterias y algunos virus. Sin
embargo las esporas y virus como el de la hepatitis humana no son inactivados. Las
esporas son formas de resistencia bacteriana y son termoresistentes.

El agregado de sales al agua aumenta el punto de ebullición, por ejemplo:

 Carbonato de sodio……..104º C
 Carbonato de potasio……135º C
 Cloruro de calcio………..179º C

Material a esterilizar: Es un método para higienizar en forma rápida y con equipo

sencillo algunos elementos como jeringas o instrumental de cirugía, cuando no se
dispone de otro método de esterilización.

TINDALIZACIÓN: Es un método ideado por Tyndall en 1.881. Se lo utiliza

para esterilizar sustancias que se alteran con el calor, como ser sueros o leche.
Consiste en realizar tres calentamientos sucesivos a no más de 60- 80º C, durante 30’,
separados por dos incubaciones a 37º C durante 24 Hs.

Según Tyndall el primer calentamiento destruía todas las formas vegetativas

termosensibles, quedando los esporos viables. En el primer periodo de incubación la
mayoría de los esporos pasarán a formas vegetativas y serán destruidos por el
segundo calentamiento. Si quedase algún esporo viable, germinará en el segundo
periodo de incubación a 37º C, y serán destruidos por el tercer calentamiento. Este
método se utiliza para medios de cultivo que se desnaturalizan por encima de 100°C.
Material a tindalizar:
 Suero
 Leche

PASTEURIZACIÓN:
La pasteurización es el proceso térmico utilizado generalmente en alimentos con el
objetivo de eliminar la presencia de agentes patógenos que puedan contener. Este
proceso de calentamiento recibe el nombre del investigador que lo aplicó por primera
vez al vino, el científico-químico francés Louis Pasteur. Uno de los objetivos es
eliminar todos los gérmenes patógenos alterando lo menos posible la estructura física,
los componentes químicos y las propiedades organolépticas (color, olor, sabor), del
alimento.

Material a pasteurizar:
 Leche
 Vino
 Cerveza
 Mayonesa

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. ¿Por qué el calor húmedo es más efectivo que el calor seco?

2. ¿Qué es el proceso de purgue o purgado del autoclave?
3. ¿Qué materiales se esterilizan en autoclave con vapor a presión? ¿Qué
tiempos, temperatura y presión utilizaría para cada uno?
4. ¿Qué microorganismos podrían sobrevivir al proceso de ebullición?
5. Defina Tindalización
6. ¿Para qué producto fue concebida originalmente la pasteurización?
 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
Se entiende por filtración al pasaje de un líquido a través de una sustancia porosa que
retiene los microorganismos contenidos en él. Esta sustancia porosa consiste en una
serie de canalículos entrecruzados de diferentes diámetros y de recorrido irregular,
denominados poros. El diámetro mínimo de los poros nos da la medida del filtro. En
realidad, y teniendo en cuenta la definición, no puede considerarse un verdadero
método de esterilización, ya que los microorganismos más pequeños (virus filtrables)
no quedarán retenidos.

Para acelerar el proceso de filtración, es necesario el empleo de vacío o de presión.

Una forma sencilla es utilizando un frasco de Kitasato, unido por una manguera de
goma a una canilla (puede o no haber un frasco intermedio o de Wolf, entre el Kitasato
y la canilla). Se emplea el principio de Venturi que hace que al abrir la canilla y correr
el agua, se produzca vacío.

La función de tamiz o acción mecánica dependerá de:

a) La estructura del filtro.

b) El diámetro de los poros.
c) El diámetro y forma de las partículas a filtrar.

La adsorción es un fenómeno físico- químico que depende en gran medida de la

carga eléctrica del filtro, de los microorganismos y de los líquidos a filtrar. Las
partículas que tiene carga eléctrica opuesta a las del filtro, se adsorben con más
facilidad.

Hay una gran variedad de filtros hechos con distintos materiales y de diferentes
porosidades. Se los divide en filtros de paredes rígidas y filtros de membrana.
Como ejemplos podemos citar:

1) Bujías.
2) Filtros Seitz.
3) Filtros de membrana.
Bujías:
Son filtros en forma de cilindros huecos, abiertos sólo en un extremo, con paredes de
espesor variable, que pueden ser de porcelana, tipo Chamberland, o de tierra de
infusorios o diatomeas (algas marinas), tipo Berkefeld.
Filtros Seitz de Placa:
Constan de una armadura metálica o porta filtro donde se montan las placas filtrantes
de asbesto o amianto prensado, que se desecharán una vez utilizadas, el filtro de
Seitz se conecta a un frasco de vacío por medio de un tapón de goma siliconado.
Filtros de Membrana:
Son los más modernos. Están compuestos por ésteres de celulosa puros y
biológicamente inertes. Se preparan cómo membranas circulares de más de 150 µ de
espesor y contienen millones de poros microscópicos de tamaño uniforme. La
porosidad varía de 0,01 a 10 milimicras. Estos filtros actúan esencialmente como
pantallas bidimensionales, reteniendo todas las partículas que exceden el tamaño de
los poros.
Filtros de Colodión: Están constituidos por nitrocelulosa. Sus poros pueden variar
entre 3 y 10 micras.

Filtros Millipores: Constan de una pequeña placa o membrana de Seitz colocada en

una montura plástica que se adapta a una jeringa. El paso del material a filtrar se
realiza por presión positiva, presionando el émbolo.

Material a esterilizar:
 Líquidos orgánicos
 Medios de cultivos o reactivos que no resisten la temperatura
 Urea

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. Investigue ¿Qué es presión positiva y presión negativa y cómo se utilizan estos

principios en filtración?
2. ¿De qué depende que los microorganismos queden retenidos en los poros del
filtro?

ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES

La energía se transmite a través del espacio de diferentes maneras, una de ellas son
las radiaciones. Dentro de éstas se encuentran las electromagnéticas que comprenden
radiaciones de alta energía o ionizantes y otras de baja energía o no ionizantes.
IONIZANTES: Comprenden rayos alfa (α), beta (β), gamma (γ) y X, los cuales
poseen suficiente energía para empujar los electrones fuera de las moléculas e
ionizarlos, mediante una reacción en cadena. Las radiaciones ionizantes no son
específicas, pues los daños que provoca recaen en una gran variedad de
constituyentes celulares, pero básicamente ionizan el agua intracelular y se forman
compuestos tóxicos.

Se aplican como método de esterilización en el laboratorio denominándose

esterilización fría, ya que no generan calor en el material que se irradia. Así es posible
aplicarlas a sustancias sensibles al calor y emplearlas en la industria farmacéutica y de
la alimentación.

De este grupo las más usadas son las radiaciones gamma y X. Los rayos X
(Roentgen) son letales para los microorganismos y formas de vida superior, pero a
pesar de tener gran poder de penetración, no es práctica su aplicación porque cuesta
mucho producirlos en cantidades suficientes. Otra desventaja es que son peligrosos y
difíciles de manejar, ya que las radiaciones salen en todas direcciones a partir del
punto de origen. Se emplean en microbiología experimental para producir mutaciones.

Las radiaciones gamma son emitidas por ciertos isótopos radioactivos como el Cobalto
60, son útiles para esterilizar objetos sensibles al calor, como jeringas de plástico,
catéteres, material descartable en general. Se debe contar con una fuente de radiación
adecuada, que no afecte al operador ni elimine radioactividad al medio.

NO IONIZANTES: Comprenden radiaciones ultravioletas e infrarrojas.

La luz ultravioleta es absorbida por muchos componentes celulares, pero es en los
ácidos nucleicos donde causa mayor daño. Se forma un dímero entre dos bases
pirimidínicas vecinas que, a menos que sea desdoblado por enzimas especificas
intracelulares, inhibe la replicación del ADN.

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

3. ¿Cuáles son las radiaciones que se utilizan para esterilizar y cuáles no? ¿Por
qué?
4. ¿Qué objetos pueden esterilizarse con las distintas radiaciones?
5. ¿Qué características de un material o sustancia se requieren conocer para
elegir el método adecuado de esterilización?
 TOMA Y ENVÍO DE MUESTRAS
Definición: Se denomina muestra a todo material biológico representativo de una
lesión o estado morboso, que se extrae del animal vivo o muerto, y es remitida al
laboratorio para su procesamiento con fines diagnósticos.

Utilidad: Confirma o rechaza un diagnóstico presuntivo.

Importancia: Si tenemos en cuenta que el hallazgo e identificación del agente

etiológico confirma el diagnóstico presuntivo, lo que permite a su vez, realizar un
correcto tratamiento terapéutico, veremos por qué los análisis complementarios tienen
tanta trascendencia. Resulta de vital importancia que el Médico Veterinario se
familiarice con la toma, conservación y remisión de muestras, evitando cometer
errores que las inutilicen

TIPOS DE MUESTRAS:
Según el estado del animal podemos hablar de muestras de animales vivos (sanos,
enfermos, agónicos) o muertos (necropsia)

MATERIALES NECESARIOS: Es importante que al momento de la toma

de muestras, se disponga de los elementos o instrumental necesario para obtener el
material, o los recipientes para su recolección. Éstos deben estar limpios, estériles
(que no agreguen su propia flora) y ser de cierre hermético. Los materiales utilizados
más frecuentemente son:
 Equipo de necropsia:
 bisturí
 cuchillo
 sierra
 guantes
 vestimenta adecuada (delantal, guantes, botas,etc.)
Elementos para recolectar la muestra:
 hisopos estériles (grandes y pequeños)
 frascos de boca ancha, de vidrio o de plástico descartables, con tapa,
estériles, con y sin conservantes
 tubos de hemólisis estériles, con y sin anticoagulante
 portaobjetos
 agujas y jeringas estériles.
 bolsas de nylon
Accesorios:
 marcadores
 tela adhesiva
 hilo grueso
 bandas elásticas
 papel de diario
 desinfectantes
 saches refrigerantes
 cajas de telgopor

Requisitos generales para la toma de muestras:

 Obtener las muestras antes de administrar antibióticos o agentes

antimicrobianos o después de 5 días de suspendida su administración
 Tomar la muestra del sitio más probable de hallazgo del
microorganismo sospechoso, o en los periodos agudos o febriles de la
enfermedad.
 Inmediatamente después de la muerte, las bacterias intestinales
pueden invadir los tejidos del huésped. El significado de estos
microorganismos, algunos de los cuales son patógenos potenciales, es
con frecuencia difícil de establecer cuando los tejidos se han recogido
mucho tiempo después de la muerte. Se recomienda tomar la muestra
dentro de las 6 h de muerto el animal.
  Enviar cantidad suficiente de material, y si fuera más de una muestra,
cada una por separado.
 Debe llegar cuanto antes al laboratorio y acompañada de los datos
clínicos, de necropsia y datos propios del material remitido (protocolos)

TÉCNICAS GENERALES:
Superficies externas: el primer paso deberá ser siempre la higiene con agua y jabón,
de toda la zona. Luego se desinfectará con alcohol de 70º.

Líquidos: de los líquidos corporales se descartarán los primeros mililitros.

Necropsias: Se debe flamear el material y evitar la contaminación exterior.

Medios de transporte: Evitan que la flora animal se multiplique, disminuya o se

destruya, por una prolongada estancia en el medio ambiente o refrigerador.

Impiden la deshidratación, los cambios de pH y la autodestrucción enzimática de los

gérmenes, al mismo tiempo que frenan el desarrollo de la flora saprofita.

Medio de Stuart: Es un medio no nutritivo, compuesto

por sustancias buffers y reductoras, que se utiliza para
la conservación de los gérmenes durante su
transporte al laboratorio.

Se fracciona en tubos con tapón a rosca, o pueden

adquirirse los comerciales.

BACTERIOLOGÍA:

Si la muestra llega al laboratorio antes de las 7 hs de haber sido recolectada, puede ir

refrigerada (4- 10º C). Si demorara más tiempo, se utilizan medios de transporte, como
el medio de Stuart.

MICOLOGÍA:

 Micosis superficiales: el material se envía sin refrigerar, a temperatura

ambiente.
 Micosis profundas sistémicas y subcutáneas: material en solución
fisiológica estéril y refrigerado.
VIROLOGÍA:

Para aislamiento de virus, el material se remite congelado, con glicerina al 50% a.a. o
como lo indique el laboratorio. Existen medios de transporte específicos para virología.

Acondicionamiento y remisión: Las muestras deben llegar en perfectas condiciones

al laboratorio, para ello se acondicionan los envases primarios (bolsas, tubos, frascos),
en cajas de cartón o telgopor que contengan elementos mullidos, como algodón, papel
o bolitas de polipropileno expandido, para evitar roturas. Es conveniente además, que
tanto los recipientes con muestras, como los refrigerantes se encuentren en bolsas
plásticas, evitando los derrames de líquidos. Se utilizan refrigerantes, para mantener
baja la temperatura. Estos saches o bolsitas refrigerantes se adquieren en el comercio.

Los tubos o frascos con líquidos deben ir fijados a las paredes con cinta adherente, o
en canastillas. Los huesos, se envuelven con papel de diario o arpillera.

En todos los casos, en el envoltorio externo se indicará “frágil”, o la leyenda “Muestra

para análisis microbiológico”, y qué parte debe ir hacia arriba.

Toda muestra debe ir acompañada de un protocolo clínico o de necropsia, con los

siguientes datos:

Especie, raza, sexo, edad, nombre, número de caravana o cualquier otro tipo de
identificación, procedencia, día y hora de la recolección, diagnóstico presuntivo,
propietario, profesional actuante (veterinario), dirección y teléfono.

Para el envío de la muestra se elegirá siempre el medio más rápido y nunca se

remitirá material los fines de semana o días feriados.

Cuando tomamos una muestra, son múltiples los factores que podrían hacer fracasar
el resultado final:

Desconocimiento de los exámenes realizados en nuestro medio: Aun cuando la

muestra sea tomada y remitida correctamente, si se solicita un análisis que el
laboratorio de la región no puede realizar, el muestreo resulta inútil. Por ejemplo,
cuando se remite material para aislamiento de virus a un laboratorio que no lo realiza.

Momento de la obtención de la muestra: Cuando se trata de enfermedades crónicas.

No haber suspendido el tratamiento antibiótico o antimicótico.

Mal procedimiento de recolección: Ya sea por elegir una zona poco representativa de
la lesión, desconocer la técnica de muestreo, no guardar las normas de asepsia y
contaminarlo con flora externa o microbiota del animal.

Deficiente conservación, o inadecuado envío al laboratorio: Cuando no se realiza una

buena refrigeración, los medios de transporte no son los adecuados, o la muestra
llega después de varios días de recolectada.

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. ¿Para qué se envía una muestra al laboratorio?

2. ¿Qué es el protocolo y que datos incluye?
3. ¿Cuáles pueden ser las causas de que no se aísle ningún microorganismo en
una muestra?

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Se denomina así a las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo,
visualizarlo, cortarlo, pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), y amplificarlo.

EXTRACCIÓN DE ADN
La primera técnica de la que dependen las demás es la extracción del ADN, y para ello
es necesario purificarlo desde cualquier tejido o cultivo. Se basa en una serie de
lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del
medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el
ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares. Como las bacterias son
organismos mucho más simples, para extraer el ADN a veces es suficiente con el
método de hervido (técnica rápida con la que se obtiene ADN de pureza mínima).

DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
El primer paso en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue el
descubrimiento, aislamiento y caracterización de las endonucleasas de restricción o
enzimas de restricción. Estas enzimas son capaces de escindir el ADN en lugares
concretos y específicos de su secuencia. Estas enzimas fueron identificadas en
bacterias, donde aparentemente cumplen una función defensiva frente a la entrada de
ADN foráneo (por ej. de un virus), estas degradan el ADN (ADNasas) son
consideradas “tijeras moleculares”. Existen dos clases de estas enzimas: las
exonucleasas, que degradan el ADN desde el extremo 5’ o 3’ de la molécula; y las
endunucleasas, que actúan en el interior de los ácidos nucleicos reduciéndolos a
fragmentos más pequeños.

Las bacterias poseen una gran

variedad de estas enzimas, que
cortan el ADN en más de un
centenar de sitios de
reconocimiento, cada uno de
los cuales consiste en una secuencia específica de entre cuatro y ocho pares de
bases. Las enzimas de restricción se nombran según la especie de la que se aislaron,
seguido por un número romano para distinguir distintas endonucleasas aisladas de un
mismo microorganismo. Dado que las endonucleasas de restricción digieren el ADN
en secuencias específicas, pueden ser utilizadas, in vitro, para cortar una molécula de
ADN en sitios únicos (digestión del ADN).

ELECTROFORESIS EN GEL
La técnica de electroforesis se fundamenta en la capacidad de las macromoléculas
cargadas de desplazarse en un soporte poroso sometido a la acción de un campo
eléctrico. El soporte está constituido por un polímero entrecruzado cuyos poros poseen
un tamaño que depende de la concentración de agarosa que se utilice en su
preparación.

La técnica de electroforesis en gel es utilizada en biología molecular para la

separación de distintos fragmentos de ADN en una misma muestra. Las moléculas de
ADN tienen, a pH alcalino, una carga negativa uniforme que hace que se movilicen
hacia el cátodo (electrodo positivo).

PCR: (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

Definición: Es un método para conseguir un gran número de fragmentos de ADN a
partir de una única copia, por medio de reacciones llevadas a cabo completamente in
vitro.

Principios: La técnica se fundamenta en los principios de desnaturalización,

hibridación y replicación del ADN.
Materiales:
 ADN a amplificar (muestra problema)
 Taq polimerasa
 Nucleótidos: adenina, timina, citocina y guanina
 Cebadores o primers
 Termociclador

Técnica: Consta de varios ciclos (30 aproximadamente) que se llevan a cabo en el

termociclador. Se denomina ciclo de amplificación al conjunto de procesos mediante
los cuales se obtienen dos moléculas de ADN nuevas a partir de una única molécula
original. El ciclo comienza con el calentamiento a altas temperaturas de la molécula de
ADN original, ocasionando la separación de ambas hebras. Una vez obtenidas las
monohebras o cadenas simples se desciende la temperatura permitiendo que los
cebadores se apareen con sus secuencias complementarias en las hebras de ADN. La
ADN polimerasa utiliza los cebadores para sintetizar una nueva cadena
complementaria sobre cada hebra de ADN preexistente.

Los fragmentos de interés aumentan de modo exponencial, duplicándose con cada

ciclo de amplificación. Por ejemplo, una única molécula de ADN sometida a 30 ciclos
de amplificación da lugar a 230 copias del fragmento amplificado.

Cada ciclo consiste en:

 Desnaturalización del ADN a 95ºC

 Hibridación de los primers a 55ºC
 Replicación del ADN o polimerización con la Taq polimerasa a 75ºC

Incluye los siguientes pasos:

HIBRIDACIÓN POR SONDAS:

Definición: Las sondas son cadenas de ADN sintéticas (diseñadas por el hombre),
cuya secuencia de nucleótidos es conocida y complementaria a una zona de ADN del
genoma del organismo que se desea analizar.
Ambas cadenas de la doble hélice del ADN pueden separarse (desnaturalizarse)
mediante el calentamiento por encima de 85°C o la exposición a pHs elevados,
obteniéndose cadenas simples o mono-hebra. Al bajar la temperatura o neutralizar el
pH, las hebras vuelven a aparearse con una cadena homóloga (hibridación) debido a
la gran especificidad de la interacción entre bases complementarias. La hibridación
puede realizarse entre dos cadenas de una misma molécula de ADN o bien entre dos
mono-hebras de distinto origen (híbrido). La estabilidad (mayor duración del
apareamiento entre las hebras) de un híbrido es mayor cuanto más elevada sea la
proporción de bases complementarias y mayor la longitud de las secuencias
apareadas, de este modo si la cadena de ADN resulta complementaria a la sonda
construida, se hibridará con ella.

Principios: Hibridación de ADN

Técnica: Para poder diseñar sintéticamente una sonda es necesario conocer la

secuencia completa, o por lo menos un fragmento relativamente grande del genoma
del organismo en estudio. Para identificar una secuencia en particular mediante el
proceso de hibridación se requieren dos elementos básicos:

 La presencia de una secuencia diana (fragmento de ADN problema).

 Una sonda marcada de modo tal que permita su detección.

El uso de sondas requiere, obligatoriamente, fragmentos de ácidos nucléicos

marcados de modo tal que permita su detección. La molécula o grupo marcador puede
tener diversa naturaleza, siendo los más utilizados isótopos radioactivos, fluorocromos
o enzimas.

Utilidad: La aplicación práctica más utilizada consiste en analizar la presencia de

determinadas secuencias (complementarias a la sonda) en el genoma o elementos
genéticos no cromosómicos. Si la sonda es lo suficientemente larga y específica, es
posible identificar el microorganismo hasta el nivel de género y especie.

HUELLAS DACTILARES:
Definición: técnica de comparación de fragmentos de ADN sometidos a digestión
enzimática.

Técnica: Se trabaja con el ADN de un control y de la o las muestras problema que se

digieren con las mismas enzimas de restricción. Se utiliza para ello una enzima de
restricción de corte específico, con la que se digiere el ADN de dos microorganismos
diferentes y los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis y se comparan el
número y tamaño de éstos fragmentos, cuanto más similares sean los patrones o
huellas de ADN obtenidas más estrechamente relacionados se encuentren ambos
microorganismos (análisis del polimorfismo en los fragmentos de restricción o
restriction fragment long polyimorphism - RFLP).

Principios: Digestión enzimática- Detección de fragmentos de ADN de distinto peso

molecular.

Utilidad: Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para
comprobar si pertenecen al mismo microorganismo o no.

MICROBIOLOGÍA MOLECULAR
Las técnicas que se describieron anteriormente nos permiten aislar, manipular y
secuenciar el ADN, así como controlar la expresión del mismo. Estas técnicas tienen
diferentes usos en microbiología, entre ellos podemos resaltar:

1. Tipificación, Identificación y Clasificación de Microorganismos:

 Composición de bases del ADN: Porcentaje de guanina/citocina. En
teoría una especie en particular contiene una cantidad definida de
bases que la constituyen y esto es una propiedad fija, y por tanto, el
porcentaje de G+C puede revelar el parentesco entre diferentes
especies. Así, dos organismos que tengan relación estrecha (varios
genes idénticos o similares), tendrán cantidades equivalentes de bases
en su ADN. En cambio cuando la diferencia supere un 10 % en el
porcentaje de estas bases, es muy probable que estos
microorganismos no estén relacionados. Aún así, cabe resaltar que dos
microorganismos pueden compartir la misma proporción de GC y no
tener relación filogenética alguna.
 Huellas del ADN (fingerprinting): Mediante esta técnica es posible
comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al
mismo microorganismo o no.
 PCR: Permite genotipificar la especie o especies que provocan un
determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del
genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea características de
tamaño que permitan identificarlo de forma inequívoca.
 Secuenciación: Es un método ideado por Sanger, que permite conocer
la secuencia completa de bases del ADN de cualquier microorganismo.
 La técnica se basa en una PCR interrumpida, se utilizan diferentes
nucleótidos marcados radiactivamente.
 Hibridación de ácidos nucleicos: A través de las sondas marcadas se
puede determinar la similitud entre la secuencia de bases de dos
microorganismos diferentes o un microorganismo y una sonda.
2. Epidemiología:
 Huellas del ADN, o análisis del polimorfismo en el largo de los
fragmentos de restricción: Esta técnica, vista anteriormente, nos
permite identificar las fuentes de infección en el brote de una
enfermedad, y comparar microorganismos aislados de diferentes
localidades, para establecer o no una relación epidemiológica.
3. Determinación de Carga viral:
 Real Time- PCR: Se utiliza esta variante de PCR que permite medir en
tiempo real la cantidad de fluorescencia emitida (la cual es proporcional
a la cantidad de ADN amplificado), ayudando a inferir el estadio de la
enfermedad y la respuesta a la quimioterapia utilizada.
4. Análisis Molecular de Resistencia a Antibióticos:
 Utilizando diferentes técnicas de biología molecular es posible
identificar los genes que codifican la resistencia a diferentes
antibióticos.
5. Estudios Evolutivos
 PCR y Secuenciación: Se amplifican genes de organismos ya
extinguidos, para comparar éstos con genes semejantes de organismos
actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos
6. Microorganismos Transgénicos:
 Se pueden utilizar a microorganismos como biorreactores para la
producción de proteínas humanas: Para ello se clonan los genes de
ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su
fabricación comercial, por ejemplo una serie de hormonas como la
insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, son
producidos hoy a través de estos métodos.
 Obtención de vacunas recombinantes: El sistema tradicional de
obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos,
puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la
hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética. Como la
 mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es
clonar el gen de la proteína correspondiente.

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. ¿Qué son las técnicas de biología molecular?

2. Investigue: ¿cómo han cambiado los estudios moleculares la taxonomía de los
seres vivos?
3. ¿Qué significa PCR? ¿En qué principios se basa?
4. ¿Qué son las enzimas de restricción? ¿Qué tipos hay?

CONSERVACIÓN DE CEPAS
MICROBIANAS
INTRODUCCIÓN: La preservación de microorganismos
asegura la viabilidad e integridad de un cultivo para su
posterior utilización en industria, docencia, investigación,
extensión, etc. Conservar un determinado cultivo implica
mantener su pureza, viabilidad y propiedades genéticas
durante un período de tiempo más prolongado que con los
cultivos convencionales. Con frecuencia la elección de una técnica adecuada para
conservar cultivos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los
criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos,
número y valor de los cultivos; costo, suministro y transporte de cepas, así como la
frecuencia del uso de los cultivos. Además, cada cepa (no género o especie)
reacciona de manera distinta frente a los diferentes procesos de conservación, por lo
que se debe evaluar el más apropiado para cada microorganismo.

OBJETIVOS:

 Mantener y preservar cultivos puros, evitando que se contaminen en el

proceso o durante el almacenamiento.
 Conservar cultivos estables, sin pérdida de ninguna de sus propiedades
bioquímicas.
 Preservar la viabilidad por un tiempo determinado, pudiendo recuperar
un 70- 80 % de los microorganismos presentes antes del proceso de
conservación.
  Facilitar el transporte y manejo de los microorganismos.

MÉTODOS: La mayoría de los métodos de preservación logran reducir el ritmo

metabólico de los organismos por retención de nutrientes, oxígeno o agua; por
disminución de la temperatura de conservación o por una combinación de ambos. El
método va a depender del tipo de microorganismo y el tiempo que se lo desee
preservar. Podemos agruparlos en: métodos de elección, alternativos y restringidos.

1) Métodos de elección: son técnicas de conservación a largo plazo, aplicables a la

mayoría de los microorganismos. Disminuyen la actividad de agua deteniendo el
crecimiento de las células microbianas. Son los métodos más efectivos y usados en la
actualidad.

a. Conservación por Congelación a -70 ºC: las células suspendidas en medio

líquido se congelan y almacenan a temperaturas inferiores a cero grados
centígrados. El agua congelada no se encuentra disponible para las células por
lo que no hay crecimiento. Para la
reactivación de los cultivos solo se
debe subir la temperatura. Existen
cuatro factores que influyen en la
viabilidad y estabilidad de las
células conservadas por este
método: la edad del cultivo
(conviene utilizar células en fase
estacionaria o una vez
esporuladas).
La velocidad de congelación y descongelación (en general es mejor una
disminución lenta de la temperatura y un aumento rápido), la temperatura de
almacenamiento (debe ser lo más baja posible – en nitrógeno líquido entre -
140 y -195ºC o en freezers de -70º C) y la formación de cristales de hielo (la
adición de agentes crioprotectores protege a las células).
Ventaja: es el método más efectivo, con altos porcentajes de recuperación
para la mayoría de los microorganismos. Desventajas: requiere aparatos
especiales, existe una subida no deseada de la temperatura durante el
almacenamiento. Dificultades para el transporte.
b. Conservación por Liofilización: este proceso se basa en el principio de
sublimación (pasaje del estado sólido al gaseoso). La técnica consiste en
congelar el producto, y colocarlo en el liofilizador a baja presión y temperatura,
 para eliminar el agua libre y ligada a las células. Al igual que para la
congelación, el agregado de agentes protectores, soportes o lioprotectores
(sustancias proteicas como sueros y leche descremada y azúcares como
glucosa y sacarosa) mejora la recuperación de las cepas. Para liofilizar no se
debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de evaporación y por ser muy
higroscópico.
Ventajas: es un método muy recomendable por su comodidad para el
almacenamiento y para el envío de las cepas, ya que pueden conservarse a
temperatura ambiente. Las cepas liofilizadas pueden mantenerse viables hasta
un período de 10 años. Desventajas: el liofilizador es un aparato costoso. El
congelamiento a bajas temperaturas requiere aparatos especiales o nitrógeno
líquido.

2) Métodos Alternativos: son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los
métodos de elección por carecer de los equipos necesarios o porque la cepa
microbiana no resiste los métodos.

a. Conservación por transferencia periódica o subcultivos: permite la

supervivencia en cortos períodos de tiempo en el medio de cultivo en el que ha
crecido. Estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo
tubo, porque al seguir activas excretan sustancias tóxicas, producto de su
metabolismo, que se acumulan provocando el envejecimiento y la muerte
celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo
nuevo o fresco. Ventajas: es un método de conservación económico y fácil de
realizar. Desventajas: es el peor método para conseguir la estabilidad
genética, puesto que al estar las células creciendo, hay una alternancia de
generaciones, con el tiempo las células que se están guardando serán
descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven
o hayan perdido algunas de sus características. El intervalo de transferencia
varía con el microorganismo, algunos requieren ser transferidos a nuevos
medios después de días o semanas, y otros después de meses o años. Esta
frecuencia puede reducirse con el almacenamiento del subcultivo a
temperaturas relativamente bajas.
b. Mantenimiento bajo capa de aceite: consiste en cubrir enteramente un
cultivo, luego de su desarrollo en el medio sólido, con una capa de aceite
mineral o vaselina estéril. Se mantienen dos años a temperatura ambiente.
Ventajas: es un método alternativo económico y sencillo. Desventajas: bajo
número de células conservadas, dificultad para el manejo y transporte.La
 estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena, pero no se ha
comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder
fermentativo, etc.
c. Conservación por suspensión en agua destilada estéril: consiste en
suspender en agua estéril células del cultivo que se quiere conservar. La
durabilidad de las cepas es de hasta 5 años. Ventajas: es un método
alternativo económico y sencillo que da altos porcentajes de viabilidad en
algunos microorganismos (hongos y algunas bacterias). Desventajas: bajo
número de células conservadas, dificultad para el manejo y transporte y la
estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena, pero no se ha
comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder
fermentativo, etc.

3) Métodos Restringidos: no se emplean habitualmente pero se recurre a ellos para

conservar grupos de microorganismos determinados que no resisten bien los métodos
de elección o alternativos. Se basan en el detenimiento del crecimiento por eliminación
del agua disponible para las células. La viabilidad de los gérmenes puede ir de 2 a 5
años.

a. Desecación en papel de filtro: se utiliza un papel absorbente que se

impregna con una solución concentrada de células, se deja secar al aire en
condiciones estériles y se almacena en frascos a temperatura ambiente o
refrigerada.
b. Desecación en gel de sílice: se añaden las células a este sustrato que las
protegerá al desecarse. Los microorganismos productores de esporas se
pueden conservar durante bastante tiempo por este método.
c. Desecación en alginato: las células se encuentran en una matriz de alginato
(gel proveniente de algas pardas) y la eliminación del agua se hace por
tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al
aire. Se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y refrigerados

CONSIDERACIONES FINALES: cada microorganismo soportará determinado

proceso mejor que otros, es decir que no existe un método general de conservación.
La mayoría pueden conservarse a largo plazo con los métodos de elección y para
periodos cortos pueden mantenerse vivos por alguno de los métodos alternativos o
restringidos.

EVALUACIÓN DE LA EFICACIA: se tienen en cuenta tres parámetros para evaluar la

eficacia del método de conservación de una cepa: pureza (que no se haya
contaminado), viabilidad a lo largo del tiempo de almacenamiento (sobrevida de al
menos el 70-80% de las células), y caracteres bioquímicos (cultivos genéticamente
estables).

Preguntas de AUTEVALUACIÓN:

1. ¿Qué efectos produce el congelamiento en las células?

2. ¿Cuánto tiempo puede conservarse una cepa en subcultivos: bajo capa de
aceite, congelada y liofilizada?
3. ¿Qué principios físicos utiliza la liofilización?
4. ¿Es suficiente con evaluar la durabilidad de las cepas? ¿Qué otra característica
tendría en cuenta a la hora de elegir un método de conservación de cepas?

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