Manual Abcs 2019-2 PDF

Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

Departamento de Ciencias Biológicas
Sección de Ciencias de la Salud Humana
Manual de Laboratorio
Análisis Bioquímicos Clínicos de Sistemas

Clave de la asignatura: 1849
Autores: 3ª. Revisiòn realizada por:
QFB. Ma. de Lourdes Galván Ruíz Ma. de Lourdes Galván Ruiz

M. en C. Gloria Leticia Arellano Martínez G. Leticia Arellano Martínez
M en C.. Beatriz L. González Maldonado Beatriz L. González Maldonado
QFB. Maricruz Reyes Aguayo Maricruz Reyes Aguayo
QFB. Luis A. Gordillo Reséndiz Luis A. Gordillo Reséndiz
M en C.. Betsabé Rodríguez Pérez Betsabé Rodríguez Pérez
M. en C. Heidi J. Amezcua Hempel Heidi J. Amezcua Hempel
ENERO, 2018
ALUMNO:_____________________________________ GRUPO:_______ SEM:________

Contenido
Presentación I
Reglamento de laboratorio ii
Introducción Iii
Objetivo General de la asignatura Iv
Objetivos del curso experimental Iv
Práctica No. 1 “Hemostasia Primaria” 1
Práctica No. 2 “Hemostasia Secundaria” 13
Práctica No. 3 “Uroanálisis y Función glomerular” 25
Práctica No. 4 “Función tubular” 42
Práctica No. 5 “Introducción a la enzimología clínica” 53
Práctica No. 6 “Enzimas pancreáticas y cardíacas” 58
Práctica No. 7 “Enzimas hepáticas” 72
Práctica No. 8 “Evaluación del Metabolismo y Excreción hepática” 82
Apéndices 95
PRESENTACIÓN
El Laboratorio clínico es un departamento muy importante de ayuda para el diagnóstico y

tratamiento del paciente, donde el requerimiento de una determinada prueba responde a la
petición de un servicio de consulta y el objetivo fundamental es la obtención de un informe
analítico como resultado de la comprensión adecuada una serie de procedimientos que le
permiten al profesional del laboratorio, alcanzar condiciones próximas al nivel óptimo y, en
consecuencia, mejorar la precisión y exactitud.
En la actualidad presenta un crecimiento acelerado, siendo cada vez menor el tiempo que
transcurre entre un descubrimiento y su aplicación; aunado a esto las casas comerciales
elaboran muy pronto los aparatos y reactivos necesarios, por lo que la asignatura de Análisis
Bioquímicos Clínicos de Sistemas, que forma parte del plan de estudios de la carrera de
Licenciado en Bioquímica Diagnóstica, impartida en la Facultad de Estudios Superiores
Cuautitlán, UNAM, tiene como objetivo la formación de profesionales competentes capaces
de comprender los mecanismos y los fundamentos teórico-prácticos en Hemostasia y
Bioquímica Clínica, para la interpretación de los resultados de laboratorio.
La enseñanza experimental correspondiente a esta asignatura le permite al alumno conocer

los métodos; desarrollar las habilidades necesarias para realizar en forma correcta las
pruebas establecidas, así como la utilidad éstas, de tal manera que en su desempeño
profesional pueda aplicar adecuadamente dichos conocimientos hacia el diagnóstico integral
de los pacientes, sin olvidarse de los principios éticos que rigen la profesión del Licenciado
en Bioquímica Diagnóstica.
Los Autores
i
ii
INTRODUCCIÓN
Para apoyar a las actividades del laboratorio se cuenta con el presente Manual de Prácticas,
que cumple adecuadamente con los requisitos que indica el Sistema de Gestión de Calidad
Corporativo de la FESC, debido a que la enseñanza experimental en los laboratorios de la
FESC está certificada bajo la norma ISO-9001-2008.
El presente manual consta de 8 prácticas, 7 de las cuales describen las pruebas básicas y
especiales que se realizan dentro del laboratorio clínico para evaluar integralmente al
sistema correspondiente: Hemostático, Renal, Pancreático, Cardíaco y Hepático; mientras
que en la práctica 5 se estudia la importancia de las enzimas como apoyo al diagnóstico.
Cada una de las prácticas está redactada bajo el siguiente esquema:
1. La introducción, que le describe al alumno parte del contenido teórico y algunas
actividades previas necesarias para una mejor comprensión de la práctica.
2. El objetivo (u objetivos) indica(n) los conocimientos y habilidades que el estudiante
debe adquirir al terminar la práctica.
3. Los materiales, reactivos y aparatos a emplear, divididos en biológicos, por equipo,
por grupo, para que el alumno conozca el material que le será entregado para hacer
la práctica.
4. El procedimiento experimental, donde se describe el fundamento, la técnica de cada
determinación a realizar durante la práctica, fórmula para calcular la concentración
del analito, valores de referencia y el significado clínico.
5. La disposición de residuos, basada en la NOM-087-SEMARNAT-2002.
6. También cuenta con un espacio disponible para realizar cálculos, tablas para registrar
resultados; esto le permite organizar correctamente todos los datos y observaciones
que servirán para elaborar el reporte final con su equipo de trabajo.
Para que los resultados de dicho análisis sean útiles en el diagnóstico, tratamiento y
seguimiento de una enfermedad, éstos deberán realizarse bajo un estricto control de calidad
logrando niveles óptimos de precisión y exactitud, características deseables en cualquier
resultado de diagnóstico.
A continuación aparecen cada una de las prácticas que se realizan en la enseñanza
experimental y la relación con los temas teórica contenidos en el programa de la asignatura.
No. de la Número y Nombre de la Unidad

Práctica de Título de la Práctica Temática en el programa de la
Laboratorio asignatura
1 “Hemostasia Primaria” Unidad 1. Sistema Hemostático
2 “Hemostasia Secundaria” Unidad 1. Sistema Hemostático
3 “Uroanálisis y Función Glomerular” Unidad 2. Sistema Renal
4 “Función Tubular” Unidad 2. Sistema Renal
5 “Introducción a la enzimología clínica” Unidad 4. Enzimología Clínica
6 “Enzimas cardíacas y pancreáticas” Unidad 4. Enzimología Clínica
7 “Enzimas hepáticas” Unidad 3. Sistema Hepático
8 “Evaluación del metabolismo y excreción hepática” Unidad 3. Sistema Hepático
iii
OBJETIVO GENERAL DE LA ASIGNATURA:
Comprender los mecanismos y fundamentos teórico-prácticos en hemostasia y bioquímica
clínica, para la interpretación de los resultados de laboratorio de varios sistemas en
enfermedad, con lo que podrá llevar a cabo un diagnóstico completo (integral) y de calidad.
OBJETIVOS DEL CURSO EXPERIMENTAL
OBJETIVO GENERAL:
Tener disponible una fuente de consulta escrita durante el desarrollo experimental, que le
permita realizar adecuadamente las pruebas descritas, así como entender los mecanismos
fisiológicos y los fundamentos teórico-prácticos en hemostasia y bioquímica clínica, para la
interpretación de los resultados de laboratorio de los sistemas a estudiar, con lo que podrá
llevar a cabo un diagnóstico completo (integral) y de calidad.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Aplicar los cuidados en la fase preanalítica, para obtener muestras biológicas que
aseguren la calidad de éstas en cada sesión práctica del curso de Análisis
Bioquímicos Clínicos de Sistemas.
2. Comprender el fundamento de cada método incluido en las sesiones de laboratorio,
desarrollar la habilidad necesaria para llevar a cabo el procedimiento utilizando los
aparatos y materiales de manera correcta, realizando todos los cálculos necesarios
para asegurar la obtención de resultados confiables.
3. Conocer los valores de referencia de cada prueba, para poder discernir si los
resultados obtenidos son indicativo de alguna patología.
4. Realizar el análisis de resultados a través de la discusión de casos clínicos enfocados
a laboratorio clínico.
5. Aplicar el manejo adecuado de los residuos peligrosos biológico-infecciosos, apegado
a las normas oficiales mexicanas, para garantizar la seguridad en el laboratorio.
6. Adquirir los elementos formativos que le permitan desarrollar una actitud y
pensamientos críticos, y de independencia en el trabajo.
7. Adquirir una formación profesional en Bioquímica Clínica que le permita afrontar los
retos que encontrará en su vida profesional, ante el creciente número de técnicas que
continuamente se están desarrollando para la detección y cuantificación de analitos
de interés en la medicina moderna.
iv
PRÁCTICA No.1
“HEMOSTASIA PRIMARIA”
Maricruz Reyes Aguayo
Ma. de Lourdes Galván Ruiz
1.1 INTRODUCCIÓN
La hemostasia se define como el conjunto de mecanismos que permiten que la sangre se
encuentre como un tejido líquido dentro de los vasos sanguíneos y que al existir una
hemorragia se detendrá por dichos mecanismos (Mateo, J., 2001).
En condiciones normales la sangre circula en fase líquida por todo el organismo. Después de
una lesión vascular la hemostasia se activa para detener la hemorragia sólo en el sitio de
lesión para sellar únicamente el área lesionada, mediante vasoconstricción y actividad
plaquetaria para obstruir el flujo sanguíneo y formar un tapón temporal a este fenómeno se le
denomina hemostasia primaria (Grimaldo, F., 2017, Mateo, J., 2001; Majluf-Cruz A., 1996).
La formación del tapón hemostático primario, depende de la integridad vascular (endotelio y
subendotelio) y funcionalidad plaquetaria (alteraciones cuantitativas o cualitativas).
El endotelio tiene numerosas funciones; en condiciones fisiológicas tiene propiedades
anticoagulantes pero puede presentar propiedades procoagulantes cuando se rompe el
equilibrio y profibrinolíticos; vasodilatadores que inhiben a las plaquetas (prostaciclina y óxido
nítrico); expresa glicosaminoglicanos semejantes a la heparina que activan a la antitrombina
(AT) para inhibir factores hemostáticos activados; expresa trombomodulina (Tm) que se une
a la trombina para hacerla antihemostática (el exceso de trombina intravascular se une a la
Tm y activan a la proteína C (PC), la cual detiene la generación de trombina) (Geng, JG,1990).
Cuando se produce una lesión en un vaso el primer mecanismo para detener la hemorragia
es una vasoconstricción local refleja y a continuación la formación del tapón hemostático
plaquetario, por medio de los siguientes mecanismos:
Adhesión plaquetaria: Las plaquetas se adhieren a las fibrillas de colágeno del
subendotelio vascular mediante receptores de membrana: Glucoproteína Ib/IX (en la
membrana plaquetaria) formando un puente con el factor von Willebrand (FvW).
Activación: depende de la síntesis de Tromboxano A2 y PGI2 por la vía de la
ciclooxigenasa.
Agregación: el complejo glucoproteína IIb/IIIa es un receptor para fibrinógeno, que
aparece cuando la plaqueta se activa. Dando lugar a la formación del tapón
plaquetario.
Secreción: Se realiza gradualmente durante un cierto periodo y antes o mientras
sucede la agregación. En los gránulos densos δ y gránulos α de las plaquetas existen
sustancias que regulan la agregación y la activación de la coagulación: ADP, calcio,
serotonina, PDGF (Factor de crecimiento obtenido de plaquetas), Factor 3 y 4
plaquetario.
Se conocen como trombopatías a las alteraciones funcionales en la adhesión, agregación y
degradación plaquetarias tanto congénitas como adquiridas, mientras que la trobocitopenia
se define como el recuento de plaquetas <150,000/mm3. Esto puede deberse a la
disminución en la producción, secuestro esplénico o la destrucción acelerada de las
plaquetas (Toneguzzo Janina, 2009).
La hemostasia primaria es el cierre inmediato de la lesión vascular por vasoconstricción y
activación plaquetaria, en esta fase no hay formación de fibrina, esta hemostasia es
1
inestable ya que sin la presencia de la red de fibrina, la hemorragia puede reactivarse (Handin,
RI. 2001; Slack SM, 1993).

1.2 OBJETIVOS
- Conocer y seleccionar la muestra biológica útil para realizar las pruebas que evalúan
a la hemostasia primaria, a través de comprender los factores que afectan a la misma
en la fase pre-analítica y analítica con el fin de obtener una muestra biológica de
calidad para evaluar el proceso hemostático del paciente en estudio.
- Comprender el fundamento y las técnicas de cada uno de los métodos a utilizar, a
través de conocer los cuidados necesarios, forma de lectura e interpretación de
resultados, para la obtención de resultados confiables que permitan identificar de
forma precisa la fase de la hemostasia que presenta alteración.
1.3 ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRÁCTICA

A. Explicar con un esquema la participación de los sistemas vascular y plaquetario en la
formación del tapón hemostático primario.
B. Describir el método de Ivy e Ivy modificado, explicar el fundamento y los
componentes de la hemostasia qué evalúa.
C. Explicar: ¿qué es un concentrado plaquetario, cómo se obtiene, cuál es su uso
terapéutico?
D. Realizar un cuadro en donde indique las pruebas que ayuden a diferenciar un
problema vascular de un plaquetario.
E. Realizar un cuadro en donde clasifique las alteraciones plaquetarias (cualitativas y
cuantitativas) y las enfermedades involucradas.
F. Indicar el volumen de citrato de sodio al 3.8% necesario para anticoagular 5 y 10 mL
de sangre.
G. Realizar la justificación de cómo se obtienen los factores por los cuales se multiplican
las plaquetas en el conteo que se realiza en la cámara de Neubauer y en frotis de
sangre periférica.
H. Realizar en el cuaderno de trabajo el diagrama de flujo (ver apéndice A) con todas las
pruebas correspondientes a esta práctica.
1.4 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Material reciclable por equipo
1 Gradilla 1Hemocitómetro
1 Propipeta 50Perlas de vidrio
8 Tubos de ensaye 12x75 mm 1Caja Petri c/algodón (cámara húmeda)
1 Contador de células 1Tapón de hule:12x75 mm
1 Pipeta de plástico de 5 mL 1 Esfigmomanómetro
1 Cronómetro 1Frasco con 10 mL de SSF (0.85 %)
1 Pipeta de vidrio de 2 mL (1/100) 2Pipetas Pasteur
1 Microscopio 1Tubo de plástico 13x100 mL con tapón de
2 Portaobjetos hule
3 Tubos eppendorf cap. 200 µL
Material no reciclable por equipo
1 Lanceta 1 Cuadro de papel filtro (2x5 cm)

4 Tubos capilares 10 Cuadros parafilm para tubo 12x75 mm
5 Torundas c/alcohol al 70 % 1 Jeringa de 10 mL c/aguja 21x32 G
2
4 Gasas 4 Jeringas de 3 mL sin aguja
1 Cuadro de papel seda (5x5 cm) 1 Espiral de alambre de cobre (calibre 16-18)
Material por grupo
1 Centrífuga p/tubos 13x100 mm 3 Micropipetas de 5-40 µL
2 Balanzas c/frascos y jeringa 100 puntas amarillas
3 Baños para incubación con gradilla 2 Pipetas graduadas de 2 mL
2 Termómetros 2 Pipetas graduadas de 1 mL
2 Gradillas 1 Charola para tinción
Reactivos por grupo

10 ml Citrato trisódico al 3.8 % 100 ml Oxalato de amonio al 1 %
75 ml Colorante de Wright 5 ml Solución de EDTA al 5 %
50 ml Buffer de fosfatos 200 ml Etanol al 70 % : para torundas
1.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Obtención y procesamiento de la muestra biológica
- Revisar anexo A (Indicaciones al paciente), anexo B (Extracción de muestra) y anexo
C (Anticoagulantes).
- Rotular tres tubos de ensaye: dos de vidrio 12x75 mm y uno de plástico 13x100 mm.
- Dosificar en un tubo12x75 mm la cantidad necesaria de EDTA al 5 % para 2 mL de
sangre.
- Dosificar en el tubo de plástico 13x100 mm citrato trisódico al 3.8% para 6 mL de
sangre.
- Extraer con jeringa 10 mL de sangre venosa y repartir de la siguiente forma:
o 2 mL en el tubo con EDTA, tapar y mezclar por inversión.
o 6 mL en el tubo de plástico con citrato trisódico, tapar y mezclar por inversión.
Centrifugar para obtener PRP.
o 2 mL en el tubo 12x75 mm sin anticoagulante.
- Obtener Plasma Rico en Plaquetas (PRP): centrifugar sangre citratada a 1,000 rpm
por 10 min. Transferir el sobrenadante a un tubo de plástico.
Prueba de Rumpel–Leede
Fundamento
Al aplicar un torniquete en el brazo (con ayuda de un esfigmomanómetro) por un tiempo
determinado, se origina un incremento en la presión intracapilar y una anoxia, responsables
de la producción de extravasaciones sanguíneas conocidas como petequias cuando existen
anormalidades vasculares o deficiencia de plaquetas.
Técnica
- Revisar la cara anterior del antebrazo del paciente marcando lunares o manchas que
pudieran confundirse con petequias.
- Medir la presión arterial del paciente, y calcular la media entre la presión sistólica y la
diastólica.
- Colocar el brazalete del esfigmomanómetro a 5 cm de la fosa cubital (fosa anterior del
codo) e insuflar hasta ejercer una presión equivalente a la presión arterial media que
previamente se ha medido y mantenerla durante 5 min.
- Retirar el esfingomanómetro, esperar 2 min para revisar la aparición de petequias en
el antebrazo del paciente y contarlas (CDC, 2014)
3
Valores de Referencia
Negativo:< 10 peteq; Dudoso: 11-20 peteq; Positivo: > de 20 peteq.
Significado clínico
Las petequias se aprecian como pequeñas manchas cutáneas de color rojizo y que no
desaparecen cuando se ejerce compresión sobre ellas.
Normalmente, la pared vascular no permite la extravasación de sangre. Sin embargo, en
algunas situaciones anormales, tales como desnutrición, intoxicaciones, trombocitopenias,
desarreglos hormonales, se puede presentar una fragilidad del endotelio capilar o pared
vascular, que permite una salida anormal de la sangre hacia los tejidos circulantes, lo que se
traduce en la aparición de petequias. Por lo tanto, es una medida de la integridad de los
componentes vascular y plaquetario. En general las petequias grandes son el resultado de
trombocitopenia y las pequeñas suelen tener relación con la permeabilidad vascular, se
presenta en: trombocitopenia, púrpura senil, escorbuto, enfermedad de von-Willebrand,
deficiencia de vitamina K, deficiencia grave de F VII, F II ó F I, y sobre todo en las púrpuras
vasculares.
Tiempo de sangrado (Método de Duke)

Fundamento
Al realizar una herida estandarizada (3 mm de profundidad) con una lanceta se valoran 2
componentes de la hemostasia. El primero es el sistema vascular ya que se activa el
mecanismo de vasoconstricción y en segundo lugar las plaquetas las cuales van a migrar a
donde se produjo la lesión realizando los mecanismos de adhesión, cambio de forma,
agregación y reacción de liberación hasta la formación del trombo blanco plaquetario.
Técnica
- Dar masaje al lóbulo de la oreja hasta asegurar la irrigación completa de la zona.
- Limpiar el lóbulo de la oreja con una torunda con alcohol al 70 %. Dejar secar.
- Puncionar el lóbulo con ayuda de una lanceta, dejar que la sangre salga sin ejercer
presión y poner en marcha el cronómetro.
- Recoger con papel filtro, cada 10-15 s, la gota de sangre presente en el lóbulo, sin
tocar la piel, hasta que cese el sangrado.
- Detener el cronómetro y registrar el tiempo
Valores de Referencia
1 - 3 min
El tiempo de sangrado alargado se presenta en: púrpuras vasculares, trombopatías
congénitas, enfermedad de von–Willebrand y en pacientes que consumen ácido
acetilsalicílico.
Conteo plaquetario (con hemocitómetro)

Fundamento
La sangre anticoagulada con EDTA se diluye en oxalato de amonio al 1 % (frío) que lisa los
leucocitos y eritrocitos para permitir el recuento en el hemocitómetro.
Técnica
4
- Mezclar bien por inversión el tubo con la sangre anticoagulada.
- Colocar en un tubo 12x75 mm 1.98 mL de diluyente frío y agregar 20 µL de sangre
mezclada.
- Tapar el tubo con papel parafilm, agitar y refrigerar 15 min.
- Mezclar bien, llenar la cámara de Neubauer con ayuda de un tubo capilar y colocarla
dentro de la cámara húmeda durante 5 min.
- Limpiar la base de la cámara de Neubauer con una gasa.
- Observar al microscopio (10X), buscar la cuadrícula central.
- Cambiar el objetivo a 40X y con baja intensidad de luz contar las plaquetas
observadas en los 25 cuadros que componen la cuadrícula central.
- Las plaquetas se observan en forma ligeramente alargada o circular y presentan
refringencia cuando se mueve el tornillo micrométrico del microscopio.
Cálculo
3
Número de plaquetas contadas x FACTOR = # de plaquetas/ mm
Valores de referencia
150,000-450,000 plaquetas/mm3
Conteo plaquetario (en frotis sanguíneo)

Fundamento
Consiste en determinar el número de plaquetas presentes en sangre anticoagulada con
EDTA, al realizar una extensión sanguínea teñida con colorante de Wright, que además
permite revisar la morfología.
Técnica
- Utilizando 5 µL de sangre anticoagulada con EDTA y mezclada, realizar un frotis
delgado y homogéneo.
- Realizar la tinción de Wright: cubrir frotis con colorante de Wright sin dejar secar
durante 6 min, adicionar sobre el colorante el buffer de fosfatos durante 12 min (los
tiempos pueden variar dependiendo los reactivos empleados). Decantar la mezcla
anterior y enjuagar bien con agua. Dejar secar el frotis.
- Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
- Elegir una zona del frotis donde no están superpuestas las células.
- Contar el número de plaquetas en 10 campos microscópicos y calcular el promedio.
Cálculo
No de plaquetas = Plaquetas contadas por campo X 20 000
Nota: En un frotis bien realizado y de paciente normal se puede observar 1 plaqueta por
cada 10-20 eritrocitos; equivalente a la presencia de 5-25 plaquetas por campo.
150,000-450,000 plaquetas/mm3
Número de plaquetas < 150,000/mm3 indica trombocitopenia.
Número de plaquetas > 450,000/mm3 indica trombocitosis
5
Ante una trombocitopenia debida a que las plaquetas se agregan por la presencia de
aglutininas dependientes del EDTA, observándose agregados trombocitarios en los bordes
del frotis sanguíneo. Para diferenciar este fenómeno de una trombocitopenia verdadera se
debe confirmar la prueba dividiendo la sangre problema en 3 alícuotas; anticoagulando la
primera con EDTA, la segunda con citrato y la tercera con heparina; se realiza frotis con
cada una de las sangres, comparando los resultados obtenidos. Si se observa aglutinación
sólo en muestra con EDTA se trata de una pseudotrombocitopenia.
La trombocitopenia puede ser por aumento en la destrucción, distribución anormal o por
disminución de la producción plaquetaria; debido a aplasia o hipoplasia de médula ósea,
carcinoma, leucemia, infección diseminada, trombopoyesis ineficaz debido a falta de ácido
fólico o vitamina B12, tratamiento con acetanolamida, fenilbutazona, estreptomicina,
sulfonamida, furosemida.
La trombocitosis puede ser secundarias a: reacción inflamatoria, hemorragia, infecciones,
enfermedades malignas, postoperatorios, postesplenectomía, anemia ferropénica. La altitud
y el ejercicio intenso también pueden provocar trombosis.
Tiempo de Retracción del Coágulo

Fundamento
Esta prueba depende del número de plaquetas, su actividad funcional como es la adhesión,
agregación, cambio de forma y reacción de liberación, así como de la cantidad de
fibrinógeno para formar un coágulo estable con la liberación del suero, la actinomiosina o
trombostenina plaquetaria es responsable de la formación de pseudópodos durante el
cambio de forma, participa en la reacción de liberación y regula la contractibilidad de las
plaquetas esta proteína es responsable de la retracción del coágulo.
Técnica
- Introducir un espiral de alambre de cobre (9mm de diámetro y 2.5 cm de espiral + 7.5
de alambre recto) en el tubo (12x75 mm) que contiene 2 mL de sangre sin
anticoagulante. Incubar a 37ºC y cronometrar.
- Transcurrida una hora retirar el coágulo y medir el volumen remanente de suero
- Referir este volumen como porcentaje del volumen inicial.
Cálculo Volumen de suero

% suero liberado = X 100
Volumen de sangre
40-50 % de suero liberado, y el sedimento de hematíes expulsado del coágulo debe ser
escaso (<5 mm de grosor).
La capacidad de retracción del coágulo se considera aumentada si el volumen de suero
liberado es mayor al 60 % del volumen inicial de sangre y el coágulo es pequeño. Esto
sucede en anemias y en hiperfibrinogenemias.
La capacidad de retracción del coágulo se considera disminuida si el volumen de suero
liberado es pequeño, (menor al 40 %) el coágulo grande y se adhiere a las paredes del tubo
6
en casi toda su extensión. Esto sucede en trombocitopenias y en la trombastenia de
Glanzmann.
Adhesividad Plaquetaria (Técnica de Prost)
Fundamento
Las plaquetas son capaces de adherirse a superficies artificiales como el vidrio que
proporciona cargas negativas sobre las cuales se expanden. El número de plaquetas
retenidas es proporcional a su capacidad de adhesión.
Técnica
- Centrifugar el tubo con sangre citratada para obtener PRP, separando el
sobrenadante.
- Realizar un conteo inicial del PRP con una dilución (1:200) utilizando oxalato de
amonio al 1 % como diluyente.
o Mezclar la dilución del PRP, llenar la cámara de Neubauer con ayuda de un
tubo capilar y colocarla dentro de la cámara húmeda durante 5 min.
o Limpiar la base de la cámara de Neubauer con una gasa.
o Observar al microscopio (10X), buscar la cuadrícula central (tornillos macro y
micrométrico).
o Cambiar el objetivo a 40X (afinar imagen sólo con tornillo micrométrico) y con
baja intensidad de luz contar las plaquetas observadas en los 25 cuadros que
componen la cuadrícula central.
- Realizar el cálculo para obtener el factor por el cual se calcula el número de
plaquetas contadas para obtener el No. de plaquetas/mm3 (esta cifra se utiliza como
el 100 % de plaquetas no adheridas).
- Preparar 4 jeringas con capacidad de 5 mL colocando 15 perlas de vidrio en c/u y
tapar con papel parafilm la parte inferior (donde se enrosca la aguja).
- Agregar 2.5 mL de PRP a la jeringa 1, tapar con su embolo y mezclar suavemente
por inversión durante 60 segundos, produciendo un choque suave entre las perlas.
- Realizar el 1er. pase de la muestra a la jeringa 2 que previamente ya contiene las
perlas de vidrio, mezclando 60 segundos por inversión.
- Repetir la operación vaciando el contenido de la jeringa 2 a la jeringa 3 (2° pase).
Separar una alícuota para recuento y verificar la disminución de plaquetas no
adheridas. Hacer conteo plaquetario realizando una dilución (1:100)
- Continuar con la operación hasta la 4ª jeringa, en esta última realizar el conteo
plaquetario final (Hacer dilución 1:50)
Cálculos:
Obtener: Número de plaquetas contadas x FACTOR = # de plaquetas/ mm3
Para: PRP concentrado (conteo inicial) = 100% plaquetas en el PRP

Jeringa 2 (º pase)
Plaquetas no adheridas
Jeringa 4 (4º pase)
Con los datos anteriores calcular ahora el % de plaquetas adheridas a las perlas de vidrio.
#
100 − x 100 = % ! "ℎ $%" !
#
7
Después del 2° pase quedan retenidas aproximadamente el 40 ó 50 % de las plaquetas.
Después del 4° pase la proporción de plaquetas adheridas es del 70 % aproximadamente.
En caso de enfermedad de von Willebrand, la proporción de plaquetas adheridas después
del 9° pase suele ser inferior al 10 %.
Los casos de hiperadhesividad trombocitaria son detectados a partir del 2° pase donde la
proporción de plaquetas adheridas es mayor al 60 %.
1.6 DISPOSICION DE RESIDUOS
- Material como agujas, capilares, palillos, cubreobjetos rotos, navajas, alambre de

cobre, desechar en el contenedor para RPBI punzocortantes. R1
- Material empapado de sangre se deposita en contenedor con bolsa roja para RPBI.
R2
- Material con sangre en menor cantidad, guantes, papel estrasa, puntas de micropipe-
tas, hisopos, cubrebocas, envolturas de las jeringas y papel se depositan en la bolsa
negra del municipio. R3
- Muestras biológicas se entregarán al laboratorista para que disponga de su
eliminación en contenedores con hipoclorito de sodio al 6 %. R4
1.7 RESULTADOS
Cálculos
8
Tabla de Resultados:
Nombre del paciente: _________________________________ Edad: ______ Sexo: _______
Horas de ayuno: ____________ Tratamiento: __________________________________
Diagnóstico presuntivo: _______________________________ Fecha: _______________
Valores de
Determinación Resultado Interpretación Realizado por:
referencia
Prueba Rumpel Leede
Tiempo de sangrado
Conteo plaquetario en
sangre
Conteo plaquetario en
frotis
Conteo Inicial:
_______________
Conteo 2º pase:
Prueba de adhesividad _______________
plaquetaria en PRP %=
Conteo 9º pase:
_______________
%=
Prueba de Retracción del
%=
coágulo
1.8 ORIENTACIÓN PARA LA ELABORACIÓN DEL REPORTE

Cuando le solicitan pruebas de hemostasia usted debe tomar en cuenta lo siguiente:
Información del paciente:

Como responsables en la valoración de enfermedades, es de gran importancia conocer
información del paciente que va a ser de ayuda para la interpretación de resultados como es:
edad, sexo, si padece alguna enfermedad crónica, diagnóstico presuntivo o definitivo,
medicamentos que consume, etc.
¿Para qué le solicitan la prueba?:

La hemostasia es una evaluación que va de lo general a lo particular, si aun no se conoce la
causa por la cual el paciente presenta algún tipo de sangrado, es importante que realice las
pruebas básicas del perfil de hemostasia primaria y secundaria para valorar si el problema es
vascular o plaquetario por deficiencia o funcionalidad. Si existe alguna deficiencia de factores
de la coagulación.
Los estudios de hemostasia primaria los tiene que manejar en conjunto para descartar las
pruebas que están dentro de los valores normales y realizar un diagrama que le ayude a
interpretar en dónde se encuentra el desorden hemostático y completar su análisis con otros
9
estudios más especializados que lo lleven a la causa de la hemorragia. Puede ayudarse de
la tabla de resultados y de los anexos D y E para descartar o aceptar un diagnóstico en base
a las pruebas del laboratorio.
En pacientes que se someterán a procesos quirúrgicos, la valoración de plaquetas en
cantidad y calidad son importantes (Anexo D), en caso de alguna anormalidad se
administran concentrados plaquetarios. (Justifique, su interpretación si es el caso).
Realice y escriba todos los cálculos tomando en cuenta diluciones, factores, etc., que lo
llevaron a la obtención de sus resultados.
Para el reporte de resultados, tome su tiempo, verifique qué va a reportar y si tiene
congruencia con los antecedentes del paciente, recuerde que con el resultado que usted
emita se tomarán decisiones importantes en el tratamiento del paciente.
Es de gran importancia que durante la práctica usted no se quede con dudas de
procedimientos y fundamentos, los cuales debe reafirmar al realizar este reporte, justificando
por qué descarta alguna enfermedad, con base a qué se emite un diagnóstico presuntivo,
por lo tanto para realizar la justificación de las pruebas empleadas contemple también los
fundamentos.
1.9 BIBLIOGRAFIA
- CDC. (2014) Tourniquet Test. Dengue Clinical Case Management (DCCM).

Consultado en
https://www.cdc.gov/dengue/training/cme/ccm/Tourniquet%20Test_F.pdf
- Espitia, P. (2015). Actualidades en coagulación. Revista Mexicana de Anestesiología.
38 (1). pp S143 – S146.
- Geng, JG, et al (1990). “Rapid neutrophil adhesion to activated endothelium mediated
by GMP-140”. Nature. 343:757-760
- Grimaldo, F. (2017). Fisiología de la hemostasia. Revista Mexicana de
Anestesiología. 40 (2). pp S398 – S400.
- Handin, RI., et al (2001). "Disorders of coagulation and thrombosis". En: Braunwald E,
Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, eds. Harrison Principle's of
Internal Medicine. Nueva York: MacGraw Hill, pp. 751-757.
- Majluf-Cruz A., et al (1996). El sistema de contacto: su papel en la hemostasia y su
relación con otros sistemas biológicos. En: Martínez-Murillo C, Quintana-González S.
Manual de hemostasia y trombosis. Ed. Prado.
- Mateo, J. et al (2001). "Fisiología y exploración de la hemostasia". En: Sans Sabrafen
J, Besses Raebel C, Vives Corrons JL, eds. Hematologia Clínica. Madrid: Ed.
Harcourt, pp. 597-618.
- Slack SM, et al. (1993). “The effects of flow on blood coagulation and thrombosis”.
Thromb Haemost; 70:129-134.
- Toneguzzo Janina, et al (2009). “Trastornos plaquetarios” Clinica-UNR.org 1-13.
10
1.10 ANEXOS
A. Indicaciones para el paciente

Presentarse al laboratorio con un tiempo de ayuno de 8 h o no haber ingerido alimentos
grasos dentro de las cuatro horas previas a la extracción, para evitar obtener plasmas
lipémicos. No haber ingerido ningún medicamento por lo menos, dos semanas previas al
análisis. En cualquier caso se debe preguntar y notificar el uso de cualquier medicamento.
Existen muchos otros constituyentes dietarios “normales”, como alcohol, cebollas, ajo,
pimientos y jengibre, que también pueden inhibir la agregación plaquetaria; tener esto en
cuenta al evaluar los resultados.
A continuación se da una lista de fármacos que interfieren en las determinaciones ya que
pueden inducir trombocitopenia.
Heparinas, quinina y quinidina, antiarritmicos, inhibidores de plaquetas, agentes
antirreumáticos, antibióticos, anticonvulsivos, antihistamínicos, diuréticos e
inmunosupresores.
B. Extracción de la muestra sanguínea

Debe realizarse con la menor estasis circulatoria, y causar un daño mínimo a los tejidos
circundantes para no contaminar la sangre con tromboplastina tisular, Es necesario eliminar
los primeros mililitros de sangre extraídos, tomando primero un tubo rojo y después el azul,
es importante el aforo del tubo azul este cuenta con una marca de aforo que puede variar
hasta un 10% para no interferir con los estudios a realizar ya que este contiene el
anticoagulante necesario para tomarlo en su totalidad y cantidades menores interfieren
dando resultados erróneos. No emplear la misma vena donde se infunden soluciones,
medicamentos o sangre. Los tubos siliconizados o de plástico son los recomendados para la
recolección de sangre.
C. Anticoagulantes
Los anticoagulantes que se pueden emplear en las pruebas para evaluar la hemostasia son:
- Citrato trisódico al 3.8 % forma complejo soluble con el Ca2+ y protege a los
procoagulantes lábiles. Dosificación: 1 parte de anticoagulante para 9 partes de
sangre.
- EDTA al 5 %. Útil para realizar conteo plaquetario ya que inhibe el proceso de
agregación. No es útil para pruebas de coagulación ya que inactiva al Factor V.
Dosificación: 0.02-0.04 mL de anticoagulante para 1 mL de sangre.
D. Riesgos de sangrado según niveles plaquetarios

3
Recuento de plaquetas/mm Riesgo
>100,000 No existe riesgo de sangrado
50,000 a 100, 000 Riesgo con trauma mayor. La cirugía no está contraindicada.
20,000 a 50, 000 Riesgo con trauma menor. Existe riesgo en cirugía.
11
< 20,000 Riesgo de sangrado espontáneo
<10,000 Riesgo de sangrado severo
E. Trastornos de la hemostasia primaria
12
PRÁCTICA No.2
“HEMOSTASIA SECUNDARIA”
Ma. de Lourdes Galván Ruiz
2.1 INTRODUCCIÓN
El plasma contiene al menos 16 procoagulantes, denominados también factores de la
coagulación; casi todos son glucoproteínas sintetizadas en el hígado, aunque algunos son
elaborados por los monocitos, las células endoteliales y los megacariocitos. Ocho son
enzimas que circulan en forma inactiva y se denominan zimógenos (proenzimas); otros seis
son cofactores que se unen y estabilizan a sus enzimas respectivamente (Rodak, F.B. 2002).
La hemostasia secundaria se activa como consecuencia de los mecanismos
desencadenados en la hemostasia primaria, siendo necesaria para controlar el sangrado de
heridas grandes debido a cirugías o traumatismos (García,E. B. 2002).
La hemostasia secundaria se produce cuando los factores de coagulación interactúan en una
serie de reacciones enzimáticas en cadena (cascada), en donde los zimógenos se
transforman en enzimas activas mediante un proceso de activación secuencial, pues cada
zimógeno actúa primero como un sustrato y luego como una enzima. La activación de la
cascada se inicia cuando los zimógenos se exponen a las capas subendoteliales de los
vasos sanguíneos.
Entonces al activarse los factores de coagulación se logra la interrelación de las dos vías:
intrínseca y extrínseca hasta convertir a la proteína soluble fibrinógeno en fibrina insoluble,
que por su estructura en forma de red, consolida el agregado plaquetario dando lugar al
coágulo. El tiempo es de 5-10 min desde el inicio de la hemorragia.
Todas las reacciones enzimáticas, excepto la última (la formación de fibrina a partir de
fibrinógeno) requieren un fosfolípido de superficie proporcionado por las membranas de las
plaquetas activadas y por los vasos lesionados; dicha superficie es importante ya que limita
el lugar de las reacciones para la formación de la fibrina en el sitio lesionado.
La actividad proteolítica de los factores activados está limitada por inhibidores naturales, así
como el proceso de formación de la fibrina, el cual está controlado por retroalimentación
negativa, pues cantidades abundantes de trombina destruyen a los cofactores de la cascada
de coagulación (McKenzie,S.B. 2000).
Una vez que el coágulo de fibrina ha cubierto el vaso lesionado y éste comienza a repararse,
el plasminógeno (proteína inerte) se activa por las proteasas de serina de la cascada de
coagulación convirtiéndose en plasmina para llevar a cabo la fibrinólisis, durante la cual
existe una degradación enzimática del coágulo de fibrina por medio de la plasmina. El tiempo
comprendido es: 48-72 h a partir del inicio de la hemorragia (García,E. B.2002).
Las deficiencias en la hemostasia secundaria producen equimosis (moretones grandes) y
hemorragias profundas muy intensas en las articulaciones y cavidades corporales (McKenzie,S.B.
2000).
2.2 OBJETIVOS
- Conocer y seleccionar la muestra biológica útil para realizar las pruebas de
hemostasia secundaria que de acuerdo a los fundamentos conocidos de éstas le
permitan evaluar cada una de las partes de la cascada de coagulación.
13
- Realizar el trabajo de laboratorio de acuerdo a las técnicas descritas, que permitan
desarrollar las habilidades necesarias para el manejo correcto de materiales,
reactivos y equipos.
- Trabajar en equipo, de forma integrada y con responsabilidad, para obtener
resultados confiables que permitan realizar un análisis de los mismos,
relacionándolos con los conocimientos teóricos para identificar de forma precisa la
fase de la hemostasia que presenta alteraciones.
- Conocer las pruebas específicas que ayudan a diagnosticar la enfermedad presente,
así como dar seguimiento a la efectividad del tratamiento y evolución de la
enfermedad.

A. Realizar un cuadro que indique: la nomenclatura internacional de los factores de
coagulación, su naturaleza (lipoproteína, glucoproteína, ión, etc.), lugar de síntesis
(hepática, plaquetaria, etc), y si es vitamina K dependiente.
B. Explicar el contenido de un plasma fresco congelado y un crioprecipitado, modo de
almacenamiento y uso terapéutico.
C. Esquematizar la cascada de la coagulación sanguínea, indicando la vía intrínseca, la
vía extrínseca, la vía común y la fibrinólisis, señalar en éste las pruebas que ayuden a
identificar alteraciones en cada una de sus partes.
D. Describir el procedimiento para preparar 25 mL de citrato trisódico al 3.8 %
E. Explicar que es el INR, como se obtiene y cuál es su utilidad.
F. Calcular la dosificación del anticoagulante anterior para 5 y 10 mL de sangre.
G. Realizar en el cuaderno de trabajo el diagrama de flujo (ver apéndice A) con todas las
H. Investigar las técnicas de cada prueba de acuerdo al fundamento y marca del reactivo
(La información será proporcionada por los profesores del grupo).
25 Tubos de ensaye 12x75 mm 1 Tubo de ensaye 15x100 mm

1 Gradilla 5 Tubos de ensaye 13x100 mm
1 Propipeta 1 Pipeta de vidrio de 1 mL (1/100)
2 Pipetas Pasteur con bulbo 1 Pipeta de plástico de 5 mL (1/10)
1 Cronómetro 1 Tapón de hule para tubo 15x100mm
1 Jeringa de 10 mL con aguja 21x32 G 4 Gasas 10x10 cm

4 Torundas con etanol al 70 % 10 Cuadros de parafilm p/ tubo 15x100 mm
Material por grupo
1 Centrífuga 10 Propipetas
14
2 Balanzas de dos platos 5 Pipetas graduadas de 1 mL
2 Baños para incubación con gradilla 8 Pipetas graduadas de 5 mL
2 Termómetros 5 Pipetas graduadas de 10 mL
8 Gradillas 1 Agitador vortex
20 Puntas azules para micropipeta 2 Tubos de ensaye 15x150mm
100 Puntas amarillas para micropipeta 4 Micropipetas (200–1000 µl)
1 Bolsa roja para RPBI 6 Micropipetas (5–200 µl)
1 Contenedor para punzocortantes RPBI 3 Pisetas con agua destilada (llenas)
Reactivos por grupo
100 mL NaCl 0.85 % (SSF) 10 mL Reactivo para cuantificar fibrinógeno

200 mL Etanol al 70 % (torundas) 10 mL Reactivo p/cuantificación de PDF
100 mL Agua destilada 10 mL Ácido acético al 0.75 %
10 mL Citrato trisódico al 3.8 % 10 mL Etanol al 50 %
20 mL Cloruro de calcio 0.025 M 10 mL Amortiguador de fosfatos pH = 7.2
30 determinaciones para TTPA 10 mL NaOH 0.1 N
30 determinaciones para TP 15 mL Ácido Acético puro
30 determinaciones para TT
3 L hipoclorito de sodio al 6 %
Extracción y procesamiento de la muestra biológica

Revisar anexo A (Indicaciones para el paciente) y B (Extracción de la muestra sanguínea).
- Rotular un tubo 15x100 mm y dosificar citrato trisódico al 3.8 % para 9 mL de sangre.
- Extraer con una jeringa 9 mL de sangre venosa, vaciar en tubo 15x100 mm, tapar y
mezclar bien por inversión.
- Centrifugar a 3,000 rpm/15 min, separar el plasma pobre en plaquetas (PPP) y
depositarlo en otro tubo 12x75 mm.
Tiempo de recalcificación del PPP
Fundamento
Mide el tiempo que tarda en coagularse un plasma pobre en plaquetas cuando se vuelve a
recalcificar. El estudio permite la detección de trastornos relacionados con la vía intrínseca o
con la vía común de la coagulación.
Técnica:
- Encender el baño de incubación, regularlo a 37° C y colocar un tubo 15x150 mm con
7.5 mL de CaCl2 (0.025 M)
- Rotular tres tubos de ensaye 12x75 mm (con numeración ascendente 1, 2 y 3) y
depositar en cada uno 200 µl de PPP. Incubar a 37° C por 2 min.
- Adicionar al tubo No.1: *200 µl de CaCl2 (0.025 M) previamente incubado a 37°C.
- *Mezclar, cronometrar e incubar.
15
- *Aproximadamente a los 60 seg, sacar el tubo del baño, inclinarlo suavemente cerca
de una fuente de luz y observar los primeros filamentos de fibrina, de no ser así,
regresar el tubo al baño de incubación y revisarlo cada 15 seg hasta que aparezcan,
lo que indica el punto final de la prueba.
- *Detener el cronómetro, registrar el tiempo y retirar el tubo del baño.
- Repetir los pasos anteriores (*) con el tubo No.2 y después con el tubo No.3.
- Reportar el promedio de los 3 resultados.
90 - 250 seg
Se encuentra aumentado el tiempo de esta prueba en déficits de factores de la vía intrínseca
como la hemofilia; en situaciones de afibrinogenemia y fibrinolisis excesiva, y en terapias con
heparina.
Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
Fundamento
Lapso de tiempo que tarda en coagular un PPP después de activarlo añadiendo emulsión de
fosfolípidos, además de una sustancia activadora de factores de contacto (caolín, sílice,
ácido elágico o celite) y calcio. Esta prueba valora el funcionamiento de la vía intrínseca, es
decir, a los factores: I, II, V, VIII, IX, X, XI y XII.
Técnica
- Homogenizar los reactivos y el PPP sin agitarlos bruscamente.
- Incubar 7.5 mL de CaCl2 (0.025 M) y reactivos a 37° C de 5 a 15 min.
- Rotular tres tubos (con numeración ascendente 1, 2 y 3) de ensaye 12x75 mm y
depositar en cada uno 100 µL de PPP e incubar por 2 min a 37° C.
- Adicionar al tubo No.1: *100 µL de reactivo de TTPa (previamente incubado a 37° C),
mezclar e incubar 2 min.
- *Agregar 100 µL de CaCl2 (0.025 M) (previamente incubado a 37°C) mezclar,
cronometrar, incubar a 37° C.
- *A los 20 seg, sacar el tubo del baño, inclinarlo suavemente cerca de una fuente de
luz y observar si aparecen los primeros filamentos de fibrina, de no ser así, regresar
el tubo al baño de incubación y revisarlo cada 5 seg hasta que aparezcan, lo que
indica el punto final de la prueba.
- *Detener el cronómetro y registrar el tiempo.
- Repetir los pasos anteriores (*) con el tubo No.2 y después con el tubo No.3
30 - 42 seg
Significado clínico:
16
Tiempos prolongados se encuentran en casos de: deficiencia de factores de la vía intrínseca,
presencia de inhibidores de la coagulación como anticoagulante lúpico o factor reumatoide,
coagulación intravascular diseminada (CID), enfermedad hepática y para el control de los
tratamientos con heparina, warfarina, agentes trombolíticos o combinación de los anteriores.
Tiempo de protrombina (TP) o Tiempo de Quick

Fundamento
Tiempo necesario para formar un coágulo en un PPP después de añadir tromboplastina
hística y calcio. Esta prueba valora la vía extrínseca (Factores I, II, V, VII y X).
Técnica
- Incubar reactivo para TP a 37° C.
- Rotular 3 tubos de ensaye 12x75 mm (con numeración ascendente 1, 2 y 3), colocar
en c/u 100 µL de PPP e incubar 2 min a 37° C.
- Adicionar al tubo No.1: * 200 µL de reactivo de TP, mezclar, cronometrar e incubar.
- *A los 8 seg, sacar el tubo del baño, inclinarlo suavemente cerca de una fuente de luz
y observar si aparecen los primeros filamentos de fibrina, de no ser así, regresar el
tubo al baño de incubación y revisarlo cada 2 seg hasta que aparezcan, lo que indica
el punto final de la prueba. Detener el cronómetro y registrar el tiempo.
11-15 seg
El TP está aumentado en pacientes con déficits de factores de la vía extrínseca, deficiencia
de vitamina K, CID, hepatopatías. Seguimiento de la terapéutica con anticoagulantes orales.
Nota: Si el paciente se maneja con terapia anticoagulante, se hace un seguimiento para

verificar la efectividad del tratamiento, usando las pruebas de TP, TTPa e INR.
Tiempo de Trombina (TT)

Fundamento
Es el tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se le añade una pequeña cantidad de
trombina bovina cálcica o no cálcica. Esta prueba valora solamente la transformación del
fibrinógeno en fibrina.
Técnica
- Poner el baño de incubación a 37°C e incubar reactivo para TT.
- Rotular 3 tubos de ensaye 12x75 mm (con numeración ascendente 1, 2 y 3), colocar
en c/u 100 µL de PPP e incubar 2 min a 37°C.
- Adicionar al tubo No.1: * 50 µL de reactivo de TT (previamente incubado a 37°C),
mezclar, cronometrar e incubar.
- *A los 8 seg, sacar el tubo del baño, inclinarlo suavemente cerca de una fuente de luz
y observar si aparecen los primeros filamentos de fibrina, de no ser así, regresar el
17
tubo al baño de incubación y revisarlo cada 2 seg hasta que aparezcan, lo que indica
el punto final de la prueba.
- Detener el cronómetro y registrar el tiempo.
9-13 seg
El TT está aumentado cuando hay un exceso de inhibidores de la trombina (heparina, PDF);
y por alteraciones del fibrinógeno: hipofibrinogenemia o disfibrinogenemias.
Cuantificación de Fibrinógeno (Método de Clauss)
Fundamento
En presencia de un exceso de trombina, el tiempo de coagulación de un PPP diluido
depende de la cantidad de fibrinógeno presente y es inversamente proporcional a la
concentración de éste en el plasma estudiado.
Técnica
- Preparar 1 mL de PPP diluido 1/10 con SSF
- Colocar en un tubo (12x75 mm) 100 µL del PPP diluido e incubar a 37º C por 2 min.
- Adicionar 50 µL de reactivo de trombina, mezclar, incubar a 37º C y cronometrar.
- Revisar el tubo con regularidad (cada 5 seg aproximadamente) hasta observar la
aparición de un filamento delgado de fibrina.
- Registrar el tiempo y buscarlo en el cuadro correspondiente el resultado en mg/dL.
8-25 seg
Fibrinogenemia: oscila entre 150- 450mg/dL
La concentración plasmática de fibrinógeno puede estar disminuida por trastornos
congénitos (afibrinogenemia) o adquiridos (hepatopatías); y puede aumentar de forma
inespecífica en procesos inflamatorios, estrés, embarazo y en tratamientos con
anovulatorios.
Nota: Las pruebas de TP, TTPa y Fibrinógeno, son necesarias para conocer si el paciente se
puede someter a una cirugía o se le administra plasma fresco congelado o crioprecipitados
en caso necesario.
Tiempo de lisis del coágulo de euglobulinas
Fundamento
18
Las euglobulinas (fibrinógeno, plasminógeno y activadores del plasminógeno) presentes en
el plasma son precipitadas con agua destilada y ácido acético. Después de centrifugar y
decantar el sobrenadante para eliminar a las no euglobulinas. El sedimento resuspendido en
amortiguador de fosfatos es coagulado adicionando trombina e incubando a 37º C hasta que
se disuelve totalmente.
Técnica
- Rotular 2 tubos (12x75 mm): Control y Problema.
- Adicionar a cada tubo los volúmenes correspondientes proceder de acuerdo a la
siguiente tabla:
Control Problema
PPP control normal 150 µL ---
PPP problema --- 150 µL
Agua destilada a 4ºC 2.3 mL 2.3 mL
Ácido acético al 0.75% 50 µL 50 µL
- Mezclar los tubos mediante inversiones sucesivas, refrigerar a 4º C por 15 min.

- Centrifugar a 3,000 rpm/5 min, retirar completamente el sobrenadante.
- Limpiar cuidadosamente la pared interna de los tubos con ayuda de papel
absorbente.
- Redisolver las euglobulinas mediante la adición de:
Fosfato salino (pH 7.2) 150 µL 150 µL
- Agitar enérgicamente hasta la redisolución total del sedimento.

- Adicionar a cada tubo:
Trombina 50 µL 50 µL
- Mezclar e incubar 20 segundos a 37º C.

- Verificar la formación de un coágulo y cronometrar.
- Revisar los tubos en intervalos de 10 min hasta observar la aparición de lisis del
coágulo, lo que indica el fin de la prueba.
- Anotar el tiempo transcurrido hasta ese momento.
Debe ser superior a 2 hrs
Tiempo inferior a 2 hrs: sospecha de existencia de un proceso de hiperfibrinolisis (síndrome
de desfibrinación).
El tiempo está disminuido en las hiperfibrinolisis primarias, y puede estar bajo o ser normal
en la CID.
Detección de monómeros de fibrina y complejos solubles

Fundamento
19
Tanto los monómeros de fibrina como los complejos solubles contenidos en un PPP, se
precipitan cuando se ponen en contacto con una solución de alcohol etílico al 50 %, dando
lugar a la formación de un gel que se percibe a simple vista.
Técnica
- Rotular 2 tubos (12x75 mm): Control y Problema.
- Adicionar a cada tubo 450 µL de PPP del paciente o PPP control y proceder de
acuerdo a la siguiente tabla:
Control Problema
Plasma control normal 450 µL ---
Plasma problema --- 450 µL
NaOH 0.1N 50 µL 50 µL
Agitar los tubos hasta mezclar completamente
Etanol al 50% 150 µL 150 µL
Dejar en reposo los tubos a 4ºC/10 min
Lectura de resultados
La observación de una línea de gel de precipitado, situada entre la mezcla de plasma y el
etanol, implica un resultado positivo.
Resultado negativo
En CID, se produce un acumulo de monómeros de fibrina y sus complejos en el plasma;
debido a ello esta prueba es positiva.
En hiperfibrinolisis primaria, se produce destrucción directa del fibrinógeno, que origina un
ascenso en el plasma, de la presencia de productos de degradación de fibrinógeno, que no
son precipitados por etanol, por lo que la prueba es negativa.
Detección de Dímeros D (método de aglutinación con látex)
Fundamento
En presencia de productos de degradación de la fibrina y, en concreto, de dímeros D, se
produce una aglutinación de partículas de látex que están recubiertas con anticuerpos
monoclonales dirigidos contra ese PDF.
Técnica
- Realizar dilución del PPP:
- Depositar, sucesivamente, en 4 círculos de una tarjeta visualizadora:
o 20 µL de plasma control positivo
o 20 µL de plasma control negativo
o 20 µL de plasma problema no diluido
o 20 µL de plasma problema diluido 1:6 con SSF
- Añadir en cada círculo, 20 µL de la suspensión de látex.
20
- Mezclar bien las dos gotas de cada círculo, usando un palillo diferente para c/u de
ellos.
- Observar la aparición de una aglutinación macroscópica, al cabo de: 3 minutos.
Lectura de resultados
En la aglutinación aparecen unos grumos blancos que flotan en un líquido blanquecino, en
caso contrario, la mezcla presenta un aspecto lechoso.
Siempre debe aparecer aglutinación en el círculo con el plasma control positivo.
La presencia de dímeros D en el plasma problema puede ser semicuantitativa, aplicando el
siguiente criterio de lectura:
Plasma diluido: Plasma no diluido: dímeros D (µg/mL)

- - < 0.5
- + 0.5 – 3
+ + >3
hasta 0.25 µg/mL
Significado clínico:
La concentración plasmática de PDF, y en concreto, de dímero D aumenta en la CID. Al
detectarse un exceso de dímeros D se deduce que se han formado coágulos de fibrina en el
interior de los vasos que posteriormente han sido degradados.
Cuantificación de Plasminógeno (PLG) método colorimétrico
Fundamento
El plasminógeno presente en un PPP se activa con una solución de estreptocinasa la cual
hidroliza al sustrato cromogénico específico marcado con para-nitroanilina (pNA),
originándose la aparición de color, cuya intensidad es directamente proporcional a la
concentración de plasminógeno en la muestra.
Técnica
- Encender el espectrofotómetro 15 minutos antes de su utilización y posteriormente
seleccionar la longitud de onda (405 nm).
- Ajustar a cero de absorbancia con agua destilada.
- Homogenizar los reactivos.
- Rotular 2 tubos de ensaye 12x75 mm (Blanco de reactivos y Muestra), adicionando
los volúmenes indicados en la tabla, a cada tubo por separado:
Blanco Muestra
Plasma pobre en plaquetas -------- 20 µL
Estreptocinasa 500 µL 500µL
Agitar los tubos
Sustrato cromogénico 500 µL 500 µL
- Mezclar, cronometrar y vaciar en la celda
21
- Registrar las absorbancias a los 30 seg, 1´30´´, 2´30´´ 3´30´´.
Cálculos
∆A/min muestra - ∆A/min blanco = ∆A/min PLG
% PLG = ∆A/min PLG X 303
80–120 %
Una baja concentración de plasminógeno aparece en los síndromes de desfibrinación.
2.6 DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

- Material como agujas, capilares, palillos, cubreobjetos rotos, navajas, desechar en el
contenedor para RPBI punzocortantes. R1
- Material empapado de sangre se deposita en contenedor con bolsa roja para RPBI.
R2
- Material con sangre en menor cantidad, guantes, papel estrasa, puntas de
micropipetas, hisopos, cubrebocas, envolturas de las jeringas y papel se deposita en
la bolsa negra del municipio. R3
- Muestras biológicas se entregarán al laboratorista para que disponga de su
eliminación en contenedores con hipoclorito de sodio al 6 %. R4
2.7 RESULTADOS
Cálculos
22
Tabla de Resultados
Valores de
Determinación Resultado Interpretación Realizado por:
referencia
T. Coagulación de PPP
TTPa
T. de Protrombina
INR
T. de Trombina
Cuantif. de Fibrinóg.
Cuantif. del Factor X
Lisis de euglobulinas
Monómero de fibrina
Dímeros D
Cuantificación de
Plasminógeno

Una vez que se concluye el trabajo experimental, cada alumno deberá realizar los cálculos y
el llenado de la tabla correspondiente a la práctica en su manual de laboratorio.
Cada integrante del equipo realizará los cálculos correspondientes y analizará los resultados
que posteriormente serán comentados entre ellos.
Se anotará lo anterior en el cuaderno de trabajo, continuando en la parte de discusión en
donde escribirán todos los comentarios que incluirán la interpretación de los resultados
obtenidos y finalmente obtendrán sus conclusiones teniendo como base los objetivos
planteados e incluyendo el diagnóstico presuntivo.
En equipo revisarán los puntos anteriores y trabajarán en el llenado del cuaderno de trabajo,
integrando los conocimientos adquiridos en la realización de la práctica y vinculando con la
parte teórica de la materia.
2.9 BIBLIOGRAFÍA
- García,E. B.(2002) Hematología 2.España. Ed.Paraninfo.
- McKenzie,S.B- (2000) Hematología Clínica. México. Ed. El Manual Moderno.
- Rodak,F.B. (2002) Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas. México. Ed.
Panamericana.
23
2.10 ANEXO
A. Indicaciones para el paciente
Presentarse en el laboratorio con un tiempo de ayuno de 8 horas o no haber ingerido
alimentos grasos dentro de las cuatro horas previas a la extracción. Si es posible suspender
tratamiento por lo menos, dos semanas previas al análisis, en caso contrario notificar el uso
de cualquier medicamento.
A continuación se da una lista de fármacos que interfieren en las determinaciones ya que
potencian el efecto anticoagulante como son los antiinflamatorios, hormonas: tiroideas,
esteroides, anabolizantes. antihistamínicos, antibióticos, sulfamidas, hidantoínas,
hipolipemiantes, hipoglucemiantes, inhibidores de la mono-amino-oxidasa o reducen el
efecto de los anticoagulantes orales como meprobamato, barbitúricos, anovulatorios y
antitiroideos (García, E.B. 2002).
B. Obtención de la muestra sanguínea

Causar un daño mínimo a los tejidos circundantes ya que se eleva la concentración de los
factores VIII-c y VIII-vW; además para no contaminar la sangre con tromboplastina tisular
que acorta algunos tiempos de las pruebas basadas en formación del coágulo (Rodak, F.B. 2002).
No emplear la misma vena donde se infunden soluciones, medicamentos o sangre.
El calibre de las agujas puede ser del número 20 ó 21 G y para pacientes pediátricos del 22
G. Los tubos siliconizados o de plástico son los recomendados para la recolección de
sangre.
C. Anticoagulación de la muestra
En las pruebas de la hemostasia secundaria se emplea el citrato trisódico al 3.8 % que
forma complejo soluble con el Ca2+ y protege a los procoagulantes lábiles. El anticoagulante
debe estar transparente, ya que si se observa turbio se debe a que está contaminado
y debe descartarse.
La mezcla entre el anticoagulante y la muestra debe realizarse inmediatamente, empleando
movimientos suaves de inversión, para evitar la formación de espuma y lisis de hematíes que
son ricos en tromboplastina tisular.
Si se requiere preparar un plasma pobre en factor V, el anticoagulante de elección es el
oxalato sódico.
24
PRÁCTICA No. 3
“UROANÁLISIS Y FUNCIÓN GLOMERULAR”
Betsabé Rodríguez Pérez
3.1 INTRODUCCIÓN
El riñón es un órgano fundamental para mantener el balance de fluidos y electrolitos,
mediante las siguientes funciones básicas:
1. Excreción de productos de desecho del metabolismo. Por ejemplo, urea, creatinina,
fósforo, etc.
2. Regulación del medio interno imprescindible para la vida. Equilibrio hidroelectrolítico y
acido-básico.
3. Función endócrina. Síntesis de metabolitos activos de la vitamina D, sistema renina-
angiotensina, síntesis de eritropoyetina, cininas y prostaglandinas.
Las unidades funcionales del riñón son las nefronas, en donde se llevan a cabo tres
procesos básicos para la formación de la orina: filtración de la sangre que llega a los
capilares glomerulares, reabsorción tubular de sustancias que no deben ser eliminadas y la
secreción tubular de sustancias que pueden sufrir los dos procesos anteriores.
La enfermedad renal puede presentarse en la clínica con síntomas y signos variados;
muchos pacientes pueden ser asintomáticos (Strasinger, 2010).
El estudio de la orina se denomina uroanálisis y de acuerdo con el CLSI (Clinical and
Laboratory Standars Institute), debe realizarse para detectar enfermedad renal, así como
para el diagnóstico de la enfermedad, la selección de poblaciones asintomáticas para
trastornos no detectados y para seguimiento de la enfermedad y tratamiento (Rabinovitch, 2009).
Este análisis se compone de un análisis macroscópico, un análisis microscópico y un análisis
citodiagnóstico, este último, para pacientes sintomáticos con enfermedades renales, del
tracto urinario inferior, o neoplasias. El uroanálisis es de gran utilidad como prueba de
escrutinio para la detección temprana de diabetes mellitus, alteraciones metabólicas,
neuropatías e infecciones del aparato urinario, entre otras (Strasinger, 2010).
Con frecuencia, para la detección temprana de la enfermedad renal se deben realizar
pruebas orientadas al diagnóstico de patologías glomerulares (filtración glomerular) y
tubulares (reabsorción y concentración y acidificación de la orina) (Castaño, 2009).
Para conocer la tasa de filtración glomerular, se emplea la prueba de depuración; existen
diferentes sustancias endógenas, como son: urea, creatinina y cistatina C que pueden
emplearse para dicho estudio. Para el cálculo de su depuración o aclaramiento, se requiere
conocer los niveles en sangre y orina de la sustancia y el volumen urinario (ml/min) (Treviño,
2010).
3.2 OBJETIVOS
- Comprender la importancia de la correcta recolección, manipulación, transportación y
conservación de una muestra de orina.
- Conocer y desarrollar las pruebas que conforman el estudio del uroanálisis con la
finalidad de obtener resultados confiables que le permitan integrar e interpretar los
resultados para evaluar el estado de salud o enfermedad en el funcionamiento renal
del paciente y otras funciones orgánicas.
- Conocer los fundamentos teórico-prácticos de las diferentes técnicas y procedimientos
3.4 más usuales, para ser capaz de aplicar el criterio para resolver correctamente
cualquier problema referente al diagnóstico por el laboratorio de funcionamiento
glomerular.
25
A. Indicar los factores preanalíticos, analíticos y postanalíticos que afectan la determinación
de las pruebas de funcionamiento glomerular.
B. Investigar las ecuaciones más utilizadas para la estimación del filtrado glomerular.
C. Indicar los principales conservadores de orina, así como las ventajas y desventajas de su
uso.
D. Mencionar las condiciones de almacenaje y conservación de la muestra para estudios de
análisis de función glomerular.
E. Investigar las técnicas de cada prueba de acuerdo al fundamento y marca del reactivo,
esta última será proporcionada por los profesores del grupo.
F. Con la información anterior llenar todas las tablas que aparecen en el manual de
prácticas.
G. Realizar en el cuaderno de trabajo el diagrama de flujo (ver apéndice I) con todas las

1 Gradilla 2 Portaobjetos 1 Cronómetro
10 Tubos de ensaye 12x75 mm 1 Microscopio óptico
5 Tubos de ensaye 13x100 mm 1 Propipeta
1 Tubo de ensaye 15x100 mm 2 Pipetas Pasteur
1 Pipeta graduada de 2 mL (1/100) 1 Bulbo de gotero
5 Cuadros de parafilm (5x5 cm) 5 Cuadros de gasas (5x5 cm)

2 Cuadros de papel seda
Material por grupo
2 Pipetas graduadas de 5 mL con propipeta 1 Baño de incubación con termómetro

2 Probetas de 1000 mL 1 Agitador vórtex
2 Pipetas graduadas de 1 mL (1/10) 3 Racks con puntas amarillas
1 Pipeta graduada de 2 mL 3 Racks con puntas azules
3 Espectrofotómetros UV/visible 12 celdas para espectrofotómetro
4 Vasos de precipitados de 250 mL 2 Vasos de precipitados de 500 mL
4 Micropipetas: 5-40, 40-200 y 200-1000 µL 6 Gradillas
1 Balanza de dos platos 1 Centrifuga con camisas
1 Recipiente para RPBI 1 Recipiente para punzocortantes
Reactivos por grupo

30 Determinaciones para microalbuminuria 30 Determinaciones para creatinina
20 Tiras reactivas para uroanálisis 30 Determinaciones para urea
3 Pisetas con agua destilada 25 mL de colorante Sternheimer Malbin
100 mL de Ácido sulfosalicílico al 3 %
26
Instrucciones para la recolección de la muestra para el uroanálisis
- Realizar aseo de los genitales externos con agua y jabón sin dejar residuos.
- Utilizar un recipiente limpio, nuevo, con tapa de rosca, de plástico transparente e
identificado con los datos del paciente, se depositará el chorro medio de la primera orina
de la mañana, que se obtiene desechando la primera parte de la orina en el inodoro y
recoger 50 mL de orina del chorro medio, terminando de orinar en el inodoro.
Instrucciones para recolectar orina de 24 horas, necesaria en la depuración de creatinina

- Entregar un recipiente limpio, estéril, con tapa hermética para prevenir derrames,
evaporación o contaminación, previamente con los datos de identificación del paciente.
o Un día antes de iniciar la recolección de la orina, suprimir las carnes rojas, té y el
café; la suspensión de medicamentos debe ser consultada con el médico tratante.
o Desechar la primera orina de la mañana del día en el cual se inicia la recolección
y reunir toda la orina producida durante 24 h, incluyendo la primera orina de la
mañana del segundo día.
- Medir el volumen de la muestra de orina de 24 h y reportar en la tabla correspondiente
Obtención de suero o plasma
Indicar al paciente ayuno de 8 horas.
Obtener muestra por venopunción con tubo al vacío tampón rojo o lila. Evitar emplear
muestras hemolizadas o lipémicas.
Uroanálisis o Examen General de Orina

Estabilidad
Para que los resultados sean precisos, es esencial que la orina sea examinada dentro de las
2 h siguientes a su recolección o conservada en refrigeración (2-8°C) o utilizar
conservadores adecuados, siempre y cuando se entiendan claramente sus efectos sobre la
orina y sobre los ensayos a realizar.
Análisis físico
Fundamento
El examen físico de la orina incluye la determinación de color y aspecto, la observación de
estas características proporciona información preliminar acerca de trastornos como
hemorragia glomerular, enfermedad hepática, alteraciones metabólicas congénitas e
infección urinaria. Además de utilizarse para explicar datos de los aspectos químicos y
microscópicos (Strasinger, 2010).
Técnica
- Mezclar bien la orina y observar el color, así como la presencia o ausencia de turbidez
(aspecto).
- Registrar las observaciones en la tabla de resultados.
Color: Incolora hasta amarillo ámbar
Aspecto: Transparente o ligeramente turbio
27
Color. La orina roja es la de mayor importancia clínica. Este color puede ser producido por
hemoglobina urinaria o mioglobina, eritrocitos intactos, eritrocitos hemolizados, o
hemoglobina libre (hemólisis). En la glomerulonefritis aguda el color característico de la orina
es pardo rojizo. Las variaciones pueden deberse a funciones metabólicas normales,
actividad física, sustancias ingeridas, dietas, situaciones patológicas, entre otras.
Aspecto. La presencia de células epiteliales escamosas, moco, bacterias por una
conservación deficiente y cristales precipitados en orinas refrigeradas, pueden dar un
aspecto turbio, pero normal, de la orina
Las causas más frecuentes de turbidez patológica se deben a la presencia de eritrocitos,
leucocitos y bacterias, sea por infección o por un trastorno orgánico sistémico. Otras causas
menos frecuentes son las cantidades anormales de células epiteliales no escamosas,
levaduras, cristales anormales, linfa y lípidos (Strassinger, 2010).
Análisis químico
Fundamento
Son reacciones químicas específicas de tipo semicuantitativo para cada analito mediante
una tira reactiva.
pH. La tira contiene los indicadores azul de bromotimol, rojo de metilo y fenolftaleína que
reaccionan específicamente con los iones H+, produciendo un cambio de color según la
concentración de los mismos.
Glucosa. La prueba se fundamenta en la reacción específica de la glucosa-

oxidasa/peroxidasa (método GOD/POD).
Proteínas. Este reactivo es altamente sensible para albúmina, y menos sensible para
hemoglobina, globulina y mucoproteínas, por lo que un resultado negativo no descarta la
presencia de otras proteínas. Cualquier cambio de color respecto a la escala de colores
(trazas), representa una proteinuria importante.
Sangre (Hemoglobina o mioglobina). Se fundamenta en una actividad que cataliza la

oxidación del indicador tetra-metil-bencidina por la acción del peróxido de hidrógeno.
Cetonas. Se emplea en la reacción nitroprusiato de sodio, que detecta acetona y ácido

acético en medio alcalino para formar un complejo color castaño.
Nitritos. La prueba se basa en el principio del ensayo de Griess, se basa en la reducción de

nitratos a nitritos por la acción enzimática de ciertas bacterias presentes en la orina. En un
pH ácido los nitritos reaccionan con el ácido p-arsanílico formando un compuesto de diazonio
el cual a su vez reacciona con N-(1-naftil) etiléndiamina produciendo un color rojo.
Gravedad específica. Se basa en el cambio de pKa de algunos poli electrólitos, con lo que se
mide la concentración iónica de la orina, lo cual está relacionado con el peso específico.
28
Bilirrubina. La prueba se basa en la unión de la bilirrubina a una sal diazoica. Cualquier
coloración, por leve que sea, indica la presencia del analito.
Urobilinógeno. Reacciona con una sal de diazonio estable dando lugar a la formación de un
colorante azoico rojo.
Leucocitos. La prueba revela la existencia de esterasas de granulocitos, las cuales

segmentan un éster indoxil cuyo indoxil liberado reacciona con una sal de diazonio para
producir un colorante violeta.
Técnica
– Si la muestra se refrigeró, esperar a que alcance la temperatura ambiente para
analizarla.
– Colocar aproximadamente 5 mL de la primera orina de la mañana (previamente
mezclada) en un tubo de ensayo de 13x100 mm.
– Sumergir la parte reactiva de la tira reactiva durante aproximadamente 2 segundos.
– Eliminar el exceso de orina de la tira con papel absorbente.
– Leer los resultados para cada parámetro en el tiempo especificado en la etiqueta de
colores.
– Comparar los colores en la misma escala, reportando los resultados como negativo (-
) y en caso de ser positivo (+), reportar con cruces desde +, ++, +++, o hasta ++++,
según se indique.
Nota. Para las proteínas si se obtiene un resultado de +++ (una cruz “+” equivale
aproximadamente a 1 g/L), realizar la determinación de proteinuria con ácido sulfosalicílico.
pH 4.7 a 7.8
Gravedad específica 1.003 a 1.035 g/mL
Urobilinógeno 3-16 umol/L
Los demás analitos en condiciones normales deben ser negativos.
pH. La orina puede tornarse alcalina como consecuencia de la descomposición bacteriana
de la urea. Se puede modificar por factores como la dieta y es de utilidad en el diagnóstico y
manejo de las infecciones y cálculos del tracto urinario.
Glucosa. La principal causa de glucosuria es un elevado nivel de glucosa en sangre, que

supera los 160-180 mg/dL (umbral renal). Aunque también puede encontrarse incrementada
cuando existen problemas a nivel tubular y no se reabsorbe adecuadamente.
Proteínas. La proteinuria puede ser el resultado tanto de un incremento en la filtración como

de una disminución en la reabsorción (función tubular) considerando las siguientes
posibilidades: proteinuria benigna, proteinuria prerrenal, proteinuria renal y proteinuria
posrrenal.
29
Sangre oculta. Un ensayo positivo indica la presencia de hematuria, hemoglobinuria o
mioglobinuria, en enfermedades renales o lesiones del tracto urinario inferior, siendo
necesario un análisis microscópico para confirmar la presencia de eritrocitos produciendo
orinas de apariencia rosada a roja.
Cetona. La determinación de cetonas es importante en el monitoreo de la diabetes y de la

cetoacidosis y debe realizarse siempre que se determinen azúcares.
Nitritos. El ensayo de nitritos es empleado para detectar bacteriuria, ya que es específica

para organismos gram negativos, sin embargo, se pueden obtener resultados falsos
negativos con microorganismos como enterococos, estreptococos o estafilococos.
Gravedad específica. Valores iguales o superiores a 1.035 indican la presencia de solutos

extraños. Una disminución de la gravedad específica se observan en pacientes quienes
utilizan diuréticos. Valores de 1.040 o superiores están asociados con la presencia de
medios de contraste radiográficos o conservadores.
Bilirrubina. Orinas espumosas, de color amarillo a pardo, u oscuras son sugestivas de la

presencia de bilirrubina conjugada. Los pacientes ictéricos con enfermedad hepatocelular
como hepatitis o enfermedad obstructiva como cirrosis biliar pueden tener bilirrubina
conjugada en la orina. Se pueden encontrar resultados falsos negativos, en orinas no frescas
porque la bilirrubina urinaria puede hidrolizarse u oxidarse por acción de la luz.
Urobilinógeno. Se encuentra disminuido en niños deficientes en bacterias intestinales; en

pacientes después de la administración de antibióticos que reducen la flora intestinal, y en
pacientes con enfermedades obstructivas hepáticas. Se encuentra un aumento en pacientes
con anemias hemolíticas y disfunción hepática.
Leucocitos. La presencia de leucocitos (piuria) es un indicador de inflamación clínicamente

importante. La intensidad de la reacción de color es directamente proporcional a la cantidad
de leucocitos presentes en el espécimen.
Análisis microscópico
Fundamento
El examen microscópico es una parte indispensable del uroanálisis, la identificación de
cilindros, de células, de cristales y de microorganismos ayuda a dirigir el diagnóstico en una
variedad de condiciones. Esta evaluación puede realizarse directo o tiñendo la muestra con
colorante de Sternheimer Malbin, que contiene violeta de metilo y safranina. El colorante se
absorbe bien por los leucocitos, células epiteliales y cilindros, lo que proporciona una
delimitación más clara de la estructura y los colores contrastantes del núcleo y el citoplasma.
Técnica
– Mezclar bien la orina y vaciar aproximadamente 10 mL en tubo de ensaye 15x100
mm
– Centrifugar 2,000 rpm durante 5 min.
30
– Con ayuda de una pipeta Pasteur, retirar el sobrenadante, conservando
aproximadamente 1 mL para resuspender el sedimento.
– Adicionar 2 gotas de colorante para sedimento urinario (Stemheimer-Malbin) y
mezclar.
– Colocar en un portaobjetos 30 µL de sedimento teñido y cubrir con un cubreobjetos
22x22 mm.
– Enfocar con objetivo de 40X y revisar 15 campos. Emplear luz tenue para la
búsqueda de cristales, bacterias, células, eritrocitos, leucocitos, moco, bacterias,
levaduras y artefactos.
– Verificar que la muestra no se seque, de lo contrario, realizar una nueva preparación.
– Reportar todos los conteos, anotar tipo de célula, cilindro o cristal encontrado y la
proporción en la que se encuentra: como escasos, moderados o abundantes.
Es normal encontrar:
Escasas células de descamación del epitelio
1–2 eritrocitos/campo
1–3 leucocitos/campo
Células del epitelio tubular renal. Su presencia indica descamación del epitelio tubular renal.
La presencia de más de dos células por campo indican daño o lesión activa de los túbulos
renales.
Células epiteliales de transición. En la orina normal se pueden encontrar unas pocas células
de transición. Un gran número de células transicionales puede indicar procesos inflamatorios
de la vejiga, cateterización o estados patológicos malignos. Cuando los núcleos de las
células transicionales llegan a agrandarse o a tornarse irregulares, se recomienda emplear
tinciones de Papanicolaou con el fin de detectar enfermedades malignas del sistema urinario.
Células epiteliales escamosas. La presencia de células escamosas en la orina usualmente

indica contaminación (vaginal, en mujeres y uretral en hombres no circuncidados) o
metaplasia escamosa de la vejiga, y representan el tipo menos importante de células
epiteliales encontradas en la orina.
Cuerpos grasos ovales. Los cuerpos grasos ovales son células del epitelio tubular renal que
están llenas de lípidos absorbidos o que han sufrido cambios degenerativos celulares. A
menudo son asociados con proteinuria y lipiduria y son característicos del síndrome nefrótico
y diabetes mellitus.
Eritrocitos. En caso de observar eritrocitos, se procede a diferenciar entre la hematuria

glomerular y la posglomerular, con una tinción de Wright. Se sospecha hematuria glomerular
cuando el 75-80 % de los hematíes tienen un aspecto dismórfico y la observación de más de
un 80 % de hematíes normales indica un origen posglomerular.
31
Leucocitos. Son característicos de procesos inflamatorios de vías urinarias en la nefritis
intersticial de origen medicamentoso, en los casos raros de cistitis y en la prostatitis aguda.
Cilindros. Son estructuras formadas por la mucoproteína de Tamm-Horsfall, producida por

las células del epitelio tubular renal, la cual puede precipitarse por diversos factores (alta
concentración de proteínas, sales, y un pH urinario bajo) en la porción distal de la nefrona y
en los ductos colectores del riñón, donde la orina es más concentrada. Se han clasificado
como fisiológicos o patológicos de acuerdo a la apariencia de su matriz (hialina, granular,
cérea), por los constituyentes celulares (eritrocitos, leucocitos, o células del epitelio tubular
renal) o por el tipo de material particulado embebido en la matriz (gránulos finos, gruesos o
fibrina).
Cristales. Los cristales se forman cuando varios constituyentes químicos llegan a saturarse o
sufren un cambio en su solubilidad, cuando la orina es almacenada a temperaturas más
bajas. La cistina, ácido úrico, leucina, y tirosina son los cristales de mayor importancia
diagnóstica y por tanto deben ser identificados.
Microorganismos. Su presencia es importante desde el punto de vista clínico, se reportan

bacterias, hongos, parásitos, y células infectadas con virus. La detección de bacterias
intracelulares fagocitadas y hongos, Toxoplasma, y cuerpos de inclusión viral, usualmente
requieren procedimientos citológicos. La identificación exacta de los organismos ayuda en el
diagnóstico clínico diferencial de infecciones del sistema urinario.
Urea sérica ó plasmática

Estabilidad en la muestra
5 días en refrigeración (2-8º C).
Fundamento
La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en la muestra, en amoníaco (NH3) y
anhídrido carbónico (CO2). El amoníaco formado se incorpora al α-cetoglutarato por acción
de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidación paralela de NADH a NAD+
ocasionando una disminución en la absorbancia (a 340 nm), que es proporcional a la
cantidad de urea presente en la muestra.
+ Ureasa
Urea + H2O + 2 H 2 NH3 + CO2
GLDH +
2 NH3 + α-cetoglutarato + NADH H2O + NAD + L-Glutamato
Técnica
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda (λ = 340 nm).
- Marcar 2 tubos de ensaye de 12x75 mm adicionando los volúmenes indicados en la
tabla:
-
32
Blanco de reactivo Muestra Patrón
Suero
Patrón
Reactivo para urea
Concentración del Patrón: ________ mg/dL

- Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia con agua destilada y trabajar cada
tubo
- Mezclar, leer la absorbancia de la Muestra y/o Patrón después de 30 s (A1).
- Activar el cronómetro y lea al minuto exacto la absorbancia (A2).
Características del método

Límite de detección: ________________________
Límite de linealidad: ________________________
Cálculos
∆Abs Mta = Abs 1 Mta – Abs 2 Mta
∆Abs Mta
X Conc. Pt Conc.
= Mta
∆Abs Pt = Abs 1 Pt – Abs 2 Pt ∆Abst
15 – 45 mg/dL
La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas; se forma en el hígado a partir
de su destrucción. Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en dietas con exceso
de proteínas, enfermedades renales, insuficiencia cardiaca, hemorragias gástricas,
hipovolemia y obstrucciones renales.
Creatinina en suero y orina

Estabilidad
La creatinina en suero es estable al menos 24 h en refrigeración (2-8º C) y en orina 7 días en
refrigeración.
Fundamento
Ensayo basado en la reacción descrita por Jaffé. La creatinina reacciona con el picrato
alcalino formando un complejo rojizo, la intensidad del color es proporcional a la
concentración de creatinina en la muestra. Hay sustancias en el suero y orina que actúan
como cromógenos inespecíficos, por ello es la adecuación del pH, para obtener la máxima
sensibilidad para la creatinina y la mínima interferencia de cromógenos.
Acido pícrico + NaOH Picrato de Sodio + Creatinina Picrato de creatinina
33
Técnica
- Preparar 2 mL de orina diluida (1:50) con agua destilada. Emplear la muestra de orina de
24 horas.
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda en un rango de 490-510
nm.
- Rotular 4 tubos de ensaye de 12x75 mm adicionando los volúmenes correspondientes.
- Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia con el blanco y trabajar uno por uno
cada tubo:
Blanco Patrón Muestra de Suero Muestra de orina

Suero problema
Orina diluida (1:50)
Patrón
Reactivo para Creatinina

- Mezclar y poner en marcha el cronómetro.
- Leer la absorbancia (A1) al cabo de 30 s y a los 90 s (A2) de la adición de la muestra.
Límite de detección: ________________________
Límite de linealidad: ________________________
Cálculos
[Creatinina en suero (mg/dL)] = ∆ Abs Muestra x [Patrón]
∆ Abs Patrón
[Creatinina en orina (mg/dL)] = ∆ Abs Muestra x [Patrón] x Factor de dilución

∆ Abs Patrón
[Creatinina en orina (g/24 horas)] = [Creatinina en orina (mg/dL)] x Vol. de orina de 24 horas
Suero Hombres: 0.4 -1.7 mg/dL Orina: 0.6 -1.8 g / 24h
Mujeres: 0.6 -1.1 mg/dL
La creatinina es el resultado de la degradación de la creatina, componente de los músculos y
puede ser transformada en ATP, fuente de energía para las células. La producción de
creatinina depende de la modificación de la masa muscular. Varía poco y los niveles suelen
ser muy estables. Se elimina a través del riñón. En una insuficiencia renal progresiva hay
una retención en sangre de urea, creatinina y ácido úrico. Niveles altos de creatinina son
indicativos de patología renal.
34
Depuración de creatinina
Fundamento
La depuración renal de creatinina es una prueba que se emplea para medir la velocidad de
filtración glomerular. Se expresa como el volumen del plasma, libre de creatinina mediante la
actividad renal por unidad de tiempo (min). El cálculo de la depuración se realiza empleando
una fórmula matemática que relaciona la concentración de creatinina en suero y en orina, y
el volumen de orina eliminado en 24 horas.
Técnica
- Medir el volumen de la orina colectada durante 24 h.
- Emplear los resultados obtenidos de la cuantificación de creatinina en suero y orina.
Cálculos
Calcular el valor de depuración empleando la siguiente fórmula:
Dc = U/P x V
Donde:
Dc = Depuración de creatinina
U = Concentración de creatinina en orina (mg/dL)
V = Volumen de la orina de 24 h (mL/min)
P = Concentración de creatinina en suero (mg/dL)
Volumen de Orina en 24 horas: 750- 2000 mL/24 h

Depuración de creatinina: Hombres: 80-125 mL/min
Mujeres: 75 -115 mL/min
Volumen
Oliguria: Volumen < 400 mL/día en adultos, <1 mL/kg/h en lactantes y <0.5 L/kg/h en niños.
Las causas son por deshidratación, vómito, diarrea, sudoración, quemaduras.
Anuria. Volumen < 100 mL/día en adultos. Las causas son daño grave en riñón, disminución
en el flujo de sangre a los riñones.
Poliuria: Volumen > 2.5 L/día adultos y > 2.5-3 mL/kg/día en niños. Las causas son diabetes
mellitus, diabetes insípida, inducida por diuréticos, cafeína, alcohol, inhibidores de la
vasopresina.
Depuración de Creatinina Endógena

La medición de la velocidad con que ocurre la filtración a través del glomérulo, se utiliza para
obtener un índice de función renal, que permite valorar la evolución de un padecimiento y su
respuesta al tratamiento.
La eliminación de creatinina en un intervalo de 24 h es un valor constante, dependiendo
principalmente de la masa muscular del individuo, y que, por otro lado, el cálculo del
aclaramiento de la creatinina será un parámetro directo del funcionalismo renal.
35
A pesar que es el marcador más utilizado, su determinación en plasma puede verse
modificada por otros cromógenos, hay una pequeña secreción tubular de creatinina, que en
situaciones de insuficiencia renal avanzada tiene un importante aclaramiento extrarrenal
sobrestimando por tanto la filtración glomerular real y, finalmente, la dificultad de recogida de
un volumen urinario exacto en un tiempo exacto.
Determinación de proteinuria
Fundamento
La prueba se basa en la desnaturalización de proteínas como: albúmina, globulinas,
glucoproteínas y las proteínas de Bence-Jones contenidas en la orina, la cual se acidifica
con ácido sulfosalicílico, midiendo la turbidez que es proporcional a la concentración de
proteínas presentes.
Técnica
- Centrifugar 6 mL de orina de 24 h a 2000 rpm/15 min.
- Separar el sobrenadante para la cuantificación de proteínas.
- Rotular 2 tubos de ensaye de 12x75 mm y adicionar los volúmenes especificados en la
siguiente tabla:
Blanco Problema
Sobrenadante (orina centrifugada) 500 uL 500 uL
Agua destilada 1.5 mL --------
Ácido sulfosalicílico al 3% -------- 1.5 mL
- Seleccionar la longitud de onda a 420 nm y ajustar el espectrofotómetro a 100 % de

transmitancia con el blanco.
- Mezclar en vortéx, esperar 5 minutos y leer.
- Nota. Si la lectura de la muestra es > 90 % de transmitancia, realizar la dilución
correspondiente.
Cálculo
Interpolar el valor de transmitancia en la tabla del Anexo.
2 – 8 mg/dL
Menos de 150 mg/24horas
La excreción diaria de proteínas es de 100 mg/día, una fracción muy pequeña del contenido
de proteínas plasmáticas. La mayoría de las proteínas presentes en la orina es albúmina que
pasa la membrana glomerular, pero también pueden estar presentes proteínas de peso
molecular pequeño como las globulinas. Una vez filtradas las proteínas son casi
completamente reabsorbidas en el túbulo proximal. La proteinuria, por lo tanto, puede ser el
resultado tanto de un incremento en la filtración como de una disminución en la reabsorción
(función tubular).
36
Determinación de microalbuminuria
Estabilidad
Habitualmente, la albúmina es estable si la orina se conserva entre 2-8º C, durante 7 días. Si
la orina es almacenada durante largo tiempo debe conservarse en congelación a -80º C; si la
conservación es a -20º C la cuantificación de la albúmina puede sufrir modificaciones.
Para la determinación de la microalbuminuria se recomienda ajustar la orina a un pH de 7.0
con NaoH/HCl 1mol/L; ésta es estable 7 días a 2–8o C cuando se le añade azida sódica 1 g/L
para prevenir posibles contaminaciones. Centrifugar la orina antes de realizar el ensayo y
trabajar con él sobrenadante.
Fundamento
La microalbúmina-turbilátex es un ensayo turbidimétrico para la cuantificación de
microalbúmina (µALB) en orina humana. Las partículas de látex recubiertas con anticuerpos
anti-albúmina humana, son aglutinadas por µALB presente en la muestra del paciente. El
proceso de aglutinación provoca un cambio de absorbancia proporcional a la concentración
de µALB de la muestra, y por comparación con un calibrador de µALB de concentración
conocida se puede determinar el contenido de µALB en la muestra ensayada.
Técnica
- Ajustar el pH de la orina a 7.0 con NaOH/HCl concentrado.
- Centrifugar a _____________ rpm.
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda de trabajo:
______________________ y ajustarlo a cero de absorbancia utilizando agua
destilada
- Pipetear en un tubo de ensaye de 12x75 mm:
Patrón Muestra
Reactivo
Patrón
Orina (Sobrenadante)

- Tapar los tubos con papel parafilm y mezclar en vortex o por inversión.
- Leer la absorbancia inicial (A1) frente al blanco.
- A los _____ min realizar una segunda lectura (A2).

Límite de detección: _________________________
Límite de linealidad: _________________________
Cálculos
Calcular: ∆ Abs = A2 – A1 en orina y en patrón
[Albúmina en orina (mg/L)] = ∆ Abs Muestra x [Patrón]
∆ Abs Patrón
37
Hasta 15 mg/L
La microalbuminuria es un marcador del riesgo de la nefropatía diabética, así como de
alteraciones cardiovasculares en pacientes que sufren diabetes mellitus tipo 1 o tipo 2.
Recientemente, se ha observado que la microalbuminuria también está asociada a
enfermedades cardiovasculares en poblaciones no diabéticas y normales, así como en
hipertensión arterial no controlada.

Los residuos deberán de eliminarse de la siguiente manera:
- Agujas sin capuchón, aplicadores de madera, material de vidrio roto se depositan en el
contenedor de punzocortantes. R1
- Torundas empapadas de sangre se depositan en la bolsa roja para RPBI. R2
- Guantes, papel estrasa, papel, torundas que no estén empapadas de sangre, tira reactiva
se depositan en la basura municipal del laboratorio, mientras que el contenedor de orina
se desecha en la basura municipal del baño. R3.
- Material de vidrio utilizado para el procedimiento experimental que haya estado en
contacto con la muestra biológica se depositan en el recipiente con hipoclorito de sodio al
4-7%. R4.
- Muestra de orina se deposita en el inodoro. R5
3.7 RESULTADOS
Cálculos
38
Tablas de resultados
Resultados del Análisis físico
Determinación Resultado Valores de referencia Interpretación Realizado por:
Color
Aspecto
Resultados del Análisis químico
Glucosa
Proteínas
Sangre
Cetonas
Bilirrubinas
Gravedad Esp.
pH
Urobilinógeno
Leucocitos
Nitritos
Resultados del Análisis microscópico

Eritrocitos
Leucocitos
Células
Cristales:
Bacterias
Otros:
39
Resultados de la Función glomerular
Urea sérica
Creatinina sérica
Creatinina en orina
Volumen de orina en
24 horas
Depuración de
creatinina
Proteinuria
Microalbuminuria

Al terminar el trabajo experimental, cada alumno deberá realizar los cálculos y el llenado de
la tabla correspondiente a la práctica en su manual de laboratorio.
Cada integrante del equipo analizará los resultados obtenidos y comentará con sus
compañeros de equipo el trabajo experimental, participando en el llenado del cuaderno de
trabajo.
Finalmente obtendrá sus conclusiones teniendo como base los objetivos planteados y
vinculando con la parte teórica de la materia.
3.9 BIBLIOGRAFÍA
- Castaño-B, I; Slon-R, M; García-F, N. (2009). Estudios de función renal: función

glomerular y tubular. Análisis de la orina. Nefro Plus 2(1):17-30.
- Morán Villatorio, L. (2004). Obtención de muestras sanguíneas de calidad analítica.
México: Ed. Panamericana.
- Rabinovitch, Albert (2009). Urinalysis; Approved Guideline: GP16-A3. Clinical and
Laboratory Standars Institute (CLSI), 29(4), 2-26. Recuperado de
http://www.clsi.org/source/orders/free/gp16-a3.pdf.
- Strasinger, S. K., Di Lorenzo M. (2010). Análisis de orina y de los líquidos corporales.
Buenos Aires: Ed. Panamericana.
- Treviño-B, A; et al. (2010). Medición de la filtración glomerular comparativa por cistatina
C y métodos convencionales basados en la depuración de creatinina. Rev Hosp Jua Mex;
77(1):22-27.
40
3.10 ANEXO
Valores de transmitancia para determinar concentración de proteínas en orina por el método de
precipitación con ácido sulfosalicílico al 3%.
41
PRÁCTICA No. 4
“FUNCIÓN TUBULAR”
Heidi J. Amezcua Hempel
4.1 INTRODUCCION
El ultrafiltrado glomerular u orina primitiva, formado por el proceso de filtración glomerular en

los capilares glomerulares, contiene las mismas concentraciones de solutos y nutrientes que
el plasma (a excepción de las proteínas). Considerando la tasa de filtración glomerular
normal, sin el proceso de reabsorción tubular, se perderían grandes volúmenes de líquidos,
sales y nutrientes que deberían reponerse (a la misma tasa a la que se pierden), para
mantener la homeostasis del organismo. Gracias al proceso de reabsorción tubular el 99%
de los componentes del ultrafiltrado glomerular (agua, sales) se reabsorbe y solo un 1% se
excreta en la orina. La reabsorción tubular es el proceso a través del cual los componentes
del ultrafiltrado glomerular son recuperados desde el líquido tubular hacia los capilares
peritubulares. Este proceso ocurre en los túbulos renales. (Guyton,1998)
En las células tubulares, el transporte de sustancias puede efectuarse por mecanismos
activos o pasivos. En el primer caso el proceso consume energía, en el segundo el
transporte se efectúa gracias a la existencia de un gradiente de potencial químico o
electroquímico. No obstante la creación de este gradiente, puede precisar un transporte
activo previo. Por ejemplo, la reabsorción activa de sodio por las células del túbulo renal,
crea un gradiente osmótico que induce la reabsorción pasiva de agua y también de urea.
En el túbulo proximal se reabsorbe del 65 al 70 % del filtrado glomerular. Esto se produce
gracias a una reabsorción activa de sodio en este segmento, que arrastra de forma pasiva el
agua. Además de sodio y agua, en este segmento se reabsorbe gran parte del bicarbonato,
glucosa y aminoácidos filtrados por el glomérulo (Haya, C. 2012)
El asa delgada de Henle, el tramo descendente es muy permeable al agua y a solutos como
la urea y el sodio. La parte ascendente delgada es mucho menos permeable al agua y
mantiene la relativa permeabilidad a los solutos.
El tránsito a través de los túbulos distal y colector tiene un efecto determinante en el ajuste
de iones y agua que deben ser reabsorbidos, según las necesidades homeostáticas. El
primer tramo continúa la dilución activa, con reabsorción de Na y Cl; el segmento terminal del
túbulo distal y el túbulo colector reabsorben Na y excretan K. En el túbulo colector cortical, en
presencia de ADH, se produce un notable incremento de la permeabilidad al agua, que es
intensamente reabsorbida hasta que se logra la isotonía.(OCW,UNICAN 2011)
Por uno u otro de estos mecanismos, la mayor parte del agua y sustancias disueltas que se
filtran por el glomérulo son reabsorbidas y pasan a los capilares peritubulares y de esta
forma nuevamente al torrente sanguíneo. Así el túbulo renal realiza dos procesos,
reabsorción y secreción de sustancias desde el torrente sanguíneo hasta la luz tubular (Haya, C.
2012).
Mediante estas funciones, reguladas por mecanismos hemodinámicos y hormonales, el riñón
produce orina en un volumen que oscila entre 500 y 2.000 mL, al día, con un pH
habitualmente ácido pero que puede oscilar entre 5 y 8, y con una densidad entre 1.010 y
1.030. Estas variables, así como la concentración de los diversos solutos, difieren en función
de las necesidades del organismo en ese momento (Haya, C., 2012).
42
4.2 OBJETIVO
- Conocer la importancia de la función tubular renal, a través del estudio de pruebas
diagnósticas específicas, con el fin de evaluar la presencia o ausencia o dar seguimiento a
un tratamiento en las diferentes patologías que se presentan en el sistema renal.
- Conocer la importancia de la valoración clínica de las diferentes sustancias producidas

por el metabolismo humano, a través de pruebas diagnósticas específicas para evaluar la
presencia, ausencia o dar seguimiento a un tratamiento en las diferentes patologías que se
presentan en el sistema renal.
A. Indicar la composición de la orina recolectada en 24 h.

B. Esquematizar la reabsorción de agua y solutos en los diferentes segmentos de la
nefrona.
C. Explicar la importancia de los electrolitos (Na, K, Ca, Cl), en la valoración de la
función tubular.
D. Mencionar que pruebas (aparte de las mencionadas en la práctica) se pueden
realizar al paciente para evaluar su función tubular.
E. Explicar ¿cómo prepara 4 mL de orina diluida 1:50?
F. Investigar las técnicas de cada prueba de acuerdo al fundamento y marca del
reactivo, esta última será proporcionada por los profesores del grupo.
G. Con la información anterior llenar todas las tablas que aparecen en el manual de
prácticas.
H. Realizar en una hoja tamaño carta el diagrama de flujo (ver apéndice A) con todas las
4.4 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:

1 Gradilla 1 Pipeta Pasteur
15 Tubos de ensaye 12x75 mm 1 Propipeta
6 Tubos de ensaye 13x100 mm 1 Pipeta graduada de 1 mL
1 Cronómetro 1 Pipeta graduada de 2 mL (1/100)
5 Cuadros parafilm (5x5 cm) 2 Cuadros de papel seda

5 Cuadros de gasas (5x5 cm)
Reactivos por grupo
30 determinaciones para Acido úrico 30 determinaciones para Potasio

30 determinaciones para Calcio 100 mL Agua destilada
30 determinaciones para Cloro 50 mL de Acido nítrico al 50 %
50 mL de NaOH concentrado
50 mL de HCl concentrado
43
Material por grupo
2 Pisetas con agua destilada 12 Celdas

3 Pipetas graduadas de 2 mL 2 Vasos de precipitados de 500 mL
1 Probeta de 1000 mL 2 Pipetas graduadas de 10 mL
2 Pipetas graduadas de 1 mL Micropipetas de: 5-40,40-200 y 200- 1000 µL
1 Baño de incubación a 37° C 5 Gradillas
1 Recipiente para RPBI 1 tela de asbesto
1 Termómetro 1 tripie
1 Agitador Vortex 1 mechero
1 rack con puntas amarillas 1 gradilla con 20 tubos de ensaye de 12x75 mm
1 rack con puntas azules
2 Espectrofotómetros UV/visible
Reactivos por grupo
30 determinaciones para Acido úrico 30 determinaciones para Potasio

30 determinaciones para Calcio 100 mL Agua destilada
30 determinaciones para Cloro 50 mL de Acido nítrico al 50 %
50 mL de NaOH concentrado
50 mL de HCl concentrado
Obtención y procesamiento de la muestra biológica
- La orina debe ser colectada en un recipiente limpio, estéril, con tapa hermética, de
boca ancha y de material transparente.
- Para evaluar la función tubular, se utiliza orina recolectada durante un periodo de
tiempo determinado u orina de 24 h, desechando la orina de la primera micción de la
mañana del día en el cuál se inicia la recolección y reunir toda la orina producida
durante 24 h, incluyendo la primera orina de la mañana del segundo día.
- Las muestras deben estar rotuladas en forma apropiada con nombre y edad del
paciente, fecha y hora de recolección en el recipiente y no en la tapa, y no deben
desprenderse si el recipiente se refrigera y debe ser transportada en una bolsa de
plástico para evitar derrames.
Determinación de ácido úrico en orina
Estabilidad
3 días a temperatura ambiente a pH > 8. No refrigerar.
FundamentoEl ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de hidrógeno

(2H2O2) que en presencia de peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol
Sulfonato (DCPS) forma un compuesto rosáceo:
44
Uricasa
Ácido úrico + 2H2O + O2 Alantoína + CO2 + 2H2O2
POD
2 H2O2 + 4-AF + DCPS Quinonaimina + 4H2O
La intensidad de quinonaimina roja formada es proporcional a la concentración de ácido

úrico presente en la muestra ensayada
Técnica
- Realizar una dilución (1:50) con agua destilada a la muestra de orina de 24 h sin
centrifugar. La muestra diluida se empleará en la cuantificación.
- Si la muestra es turbia, calentarla a 60º C por 10 min para disolver los precipitados de
urato y ácido úrico. No refrigerar.
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda: ______________.
- Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada
Patrón Muestra
Reactivo
Patrón
Orina (dilución 1:50)
Concentración del patrón: ________ mg/dL
- Mezclar los tubos en vórtex o sellando con papel parafilm por inversión.
- Incubarlos a ________° C durante ______ minutos.
- Efectuar las lecturas de las absorbancias del patrón y de la muestra frente al blanco
del reactivo.
Estabilidad de la mezcla reactiva: ______________
Cálculos
[Ácido úrico en orina (mg/24 h)] = Abs Muestra x [Patrón] x Vol. Orina/24 h
Abs Patrón
250 - 750 mg / 24 h de ácido úrico
45
El ácido úrico y sus sales son el producto final del metabolismo de las purinas. En una
insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de urea, creatinina y ácido úrico.
Niveles altos de ácido úrico son indicativos de patología renal y generalmente se asocia con
la gota.
El aumento del ácido úrico en orina se denomina uricosuria. El ácido úrico puede
sobresaturarse en la orina y cristalizar para formar cálculos renales que pueden obstruir el
sistema renal. La excreción urinaria de ácido úrico depende de los niveles en sangre, de la
filtración glomerular y de la secreción tubular. Un aumento de la concentración en orina se
observa en gota, cáncer metastásico, leucemia, mieloma múltiple. La disminución se observa
en enfermedad renal, eclampsia, alcoholismo, acidosis cetósica o láctica.
Determinación de Calcio en orina
Estabilidad
Realizar la recolección de la orina de 24 h en recipientes libre de calcio. El calcio en la
muestra en estable 10 días a 2-8 ºC.
Fundamento
El calcio, en medio neutro, forma un complejo de color azul con arsenazo III (ácido 1,8-
dihidroxi-3,6-disulfo-2,7-naftalenen-bis(azo)-dibenzenarsónico). La intensidad de color es
directamente proporcional a la cantidad de calcio existente en la muestra.
Técnica
- Antes de la recolección de la muestra, adicionar al contenedor 10 mL de ácido nítrico

al 50 % (v/v), registrando el volumen total.
- Diluir la orina (sobrenadante) 1:2 con agua destilada para su análisis.
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda: ______________.
- Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia frente a agua destilada
Patrón Muestra
Reactivo
Patrón
Concentración del patrón: ________ mg/dL

- Mezclar los tubos en vórtex o por inversión (sellar con papel parafilm).
- Incubarlos a ________° C durante ______ minutos.
- Efectuar las lecturas de las absorbancias del patrón y de la muestra frente al blanco
del reactivo.
46
Estabilidad de la mezcla reactiva: _______________

Límite de detección: __________________________
Límite de linealidad: __________________________
Cálculos
[Calcio en orina (mg/24h)] = Abs Muestra x [Patrón] x Vol. Orina/24 h (dL)
Abs Patrón
Adultos: 50 - 300 mg/24 h

Niños: 80 – 160 mg/24 h
El calcio es el mineral más abundante e importante del cuerpo humano, el 99 % se halla en
los huesos. Una calciuria aumentada tiene lugar en procesos que originan hipercalcemia o
alteran la reabsorción renal del calcio como en hiperparatiroidismo primitivo, neoplasias
óseas, atrofias óseas, acidosis renal, dieta láctea excesiva, intoxicación por Vitamina D. Una
calciuria disminuida está presente en todos los síndromes hipocalcémicos, excepto los
debidos a lesión renal.
Determinación de Cloro en orina
Estabilidad
Los iones de cloruro en orina son estables 1 semana a temperatura ambiente (15-25º C) o en
refrigeración (2-8º C) o en congelación (-20º C).
Fundamento
Los iones cloruro de la muestra reaccionan con tiocianato de mercurio desplazando el ión
tiocianato. El tiocianato libre en presencia de iones férricos forma un complejo coloreado
medible colorimétricamente:
- -
2 Cl + Hg (SCN)2 HgCl2 + 2 SCN
- +++ ++
SCN + Fe FeSCN
La intensidad del color es proporcional a la concentración de iones cloruro presente en la

muestra ensayada
Técnica
- Efectuar la recolección de orina de 24 h en recipientes libres de cloruros y diluir la

orina 1:2 con agua destilada para su análisis.
- Si la orina es demasiado turbia, centrifugar y trabajar con el sobrenadante.
47
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda: _______________.
- Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia frente a agua destilada
Patrón Muestra
Patrón
Solución precipitante
Concentración del patrón: _______________
- Mezclar e incubar entre _____________ minutos a ______________º C.

- Leer la absorbancia (A) del blanco, del patrón y de las muestras.

Cálculos
[Iones cloruro en orina (mg/24 h)] = ∆ Abs Muestra x [Patrón] x Vol. Orina/24 h (dL)
∆ Abs Patrón
110 - 250 mmol /24 h
El control de la concentración de iones cloruro tiene gran interés clínico dada su importancia
en el balance ácido-base y la regulación osmótica del fluido extracelular. Valores altos se
relacionan con pérdidas excesivas de agua o alteraciones del flujo renal y fibrosis quística.
Valores bajos nos indican acidosis metabólica, trastornos gastrointestinales o alteración de
los mecanismos renales
Determinación de Potasio en orina

Los iones potasio en orina son estables 48 h a temperatura ambiente (15-25º C), 14 días en
refrigeración (2-8º C) y 2 meses a -10º C.
Fundamento: Los iones potasio en un medio alcalino libre de proteínas reaccionan con el
tetrafenilborato (TCA) de sodio para producir una suspensión turbia finamente dispersa de
tetrafenilborato de potasio. La turbidez producida es proporcional a las concentraciones de
potasio.
48
Técnica
Preparación del sobrenadante libre de proteínas.
- Realizar una dilución de la muestra de orina 1:10 con agua destilada.
- Añadir _______de muestra de orina diluida en un tubo de 12x75 mm.
- Posteriormente añadir ________ de reactivo TCA precipitante gota a gota a cada
tubo, utilizando un vortex.
- Dejar reposar ______minutos y centrifugar a ________rpm.
Procedimiento de la prueba
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda: _________________.

Blanco Patrón Muestra
Reactivo de trabajo
Patrón
Sobrenadante de orina (1:10)
Agua destilada
Concentración del patrón: __________________
- Mezclar e incubar _______ minutos a temperatura ambiente.

- Leer la absorbancia (A) del blanco, del patrón y de las muestras.

Cálculos
[Iones potasio en orina (mg/24 h)] = ∆ Abs Muestra x [Patrón] x Vol. Orina 24 h x
Factor
∆ Abs Patrón
26 – 123 mmol /24 h (varían con la dieta)
Con una función renal adecuada es virtualmente imposible permanecer en un estado de
hiperpotasemia pues el potasio es excretado con suma facilidad por el riñón. Por tanto, un
incremento significativo de potasio se encuentra principalmente en casos de insuficiencia
renal grave con azoemia; también podría haber aumento con una administración desmedida
49
de potasio si hay excreción urinaria inadecuada, con el uso excesivo de diuréticos
antagonistas de la aldosterona.
Se tiene disminución de potasio en estados diarreicos, perdidas abundantes de líquidos
gastrointestinales, diuresis masiva, pacientes postoperatorios con pérdidas múltiples de
potasio, pacientes después de tratamiento de cetoacidosis diabética, respuesta a la tensión,
falta de ingestión adecuada de potasio, síndrome de malabsorción donde el intestino no es
capaz de absorber nutrientes.
- Agujas sin capuchón, aplicadores de madera, cubreobjetos, material de vidrio roto se

depositan en el contenedor de punzocortantes RPBI. R1.
- Torundas empapadas de sangre se depositan en la bolsa roja de RPBI. R2.
- Contenedor se deposita en la basura municipal del baño; guantes, papel estrasa,
papel, torundas que no estén empapadas de sangre, tira reactiva se depositan en la basura
municipal del laboratorio. R3.
- Material de vidrio utilizado para el procedimiento experimental que haya estado en
contacto con la muestra biológica se colocan en el recipiente con hipoclorito de sodio al 4-7
%. R4.
- Muestra de orina se desecha en el inodoro. R5.
4.7 RESULTADOS
Cálculos
50
Tabla de resultados

Determinación Resultado Valores de Realizó
Observaciones
Referencia
Vol de orina de 24 hrs
Ácido Úrico en orina
Calcio en orina
Cloro en orina
Potasio en orina
De forma muy breve se describirán los objetivos de la práctica, enunciar si se cumplieron o

no y si no se cumplieron explicar por qué. Mencionar cuáles son las principales patologías
que se presentan en la función tubular y cuáles son sus causas.
Exponer de manera muy concisa los resultados más importantes obtenidos en la práctica, los
cuales sean objeto de realización de la discusión.
En la discusión se deberá de incluir todas las variables a considerar del porque del resultado
(procedimiento de la técnica); si la técnica fue realizada adecuadamente, entonces la
discusión deberá realizarse en base a tratar de obtener el diagnóstico del paciente; ésta
discusión deberá ser soportada con bibliografía que deberá ser referenciada.
Finalmente el reporte deberá incluir la conclusión final que deberá de ser con base a los
objetivos mencionados al inicio de la práctica.
4.9 BIBLIOGRAFÍA
- Anatomía y Fisiología Renal. Recuperado de

www.carloshaya.net/biblioteca/contenidos/docs/.../pacodiez.PDF
- Bauer J. D. (1986). Análisis clínicos; métodos e interpretación. México: Ed.
Reverté.1302 pp.
- Cameron J. S. (1997). Oxford text book of clinical nephrology. Oxford University
Press.
- Campuzano M. (2007). El Uroanálisis un gran aliado del médico. Urología
Colombiana 67 – 92 pp.
- Gancedo G. (2009). Función Renal. Pediatría Integral; XIII (6): 513-518
- Gradwohl R. B. H. (1970). Gradwohl’s clinical laboratory methods and diagnosis.
USA: Ed. Mosby
51
- Graff S. L. (1987). Análisis de orina. Atlas color. Argentina: Ed. Médica
Panamericana. 226 p. p.
- Henry B. (1993). Diagnóstico y tratamiento clínicos por el laboratorio. España: Ed.
Científica y Técnicas. 1509 p.p.
- Rodriguez, J. (1996). Función renal y su estudio. En: Gordillo Paniagua G. Nefrología
pediátrica. Madrid. 2 – 50 pp
- Tratado de Fisiología médica. A.C. Guyton. Editorial Interamericana. 1998.
- http://ocw.unican.es/ciencias-de-la-salud/fisiologia-humana-2011-g367/material-de-
clase/bloque-tematico-4.-fisiologia-del-rinon-y-liquidos/tema-3.-funciones-
tubulares/funciones_tubulares.pdf
52
PRÁCTICA No. 5
“INTRODUCCIÓN A LA ENZIMOLOGÍA CLÍNICA”

Luis Antonio Gordillo Reséndiz
5.1 INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas catalíticas que disminuyen la energía de activación de las
reacciones bioquímicas, permitiendo que estas sean termodinámicamente favorables,
mostrando una alta especificidad por los sustratos que se requieren para dichas reacciones
(Dufour, 2010; Horton, 2008).
La mayoría de los nombres de las enzimas se forman agregando el sufijo –asa al nombre de
sus sustratos, o a un término descriptivo de la reacción que catalizan. Un comité de la Unión
Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB, por sus siglas en inglés) mantiene
un esquema de clasificación de acuerdo con la clase general de reacción que es catalizada,
dicho comité asigna un número único llamado número de clasificación de la enzima, o
número EC (Enzyme Classification) (Horton, 2008).
Los niveles plasmáticos de las enzimas son generalmente inferiores al 1% de los niveles
celulares. La causa más común del aumento en los niveles plasmáticos de las enzimas es la
muerte de las células que las contienen, sin embargo existen diversos mecanismos que
pueden provocar el aumento del nivel de enzimas en plasma (Sánchez, 2005).
El uso de las enzimas con fines diagnósticos se remonta a los años 50 y ha evolucionado
rápidamente gracias a una generación de bioquímicos dedicados a aislar, identificar y
caracterizar las enzimas tisulares así como al desarrollo simultáneo de métodos y aparatos
para efectuar mediciones de alta calidad a bajo costo. Se han identificado por lo menos 50
enzimas relacionadas con algún estado patológico, sin embargo de forma rutinaria se utilizan
apenas unas 15 enzimas (Uhthtoff-Brito, 1999).
En química clínica las enzimas se miden estableciendo su actividad a través de la
determinación de la velocidad de la reacción catalizada. Para estandarizar la medida de la
actividad enzimática se utiliza la unidad internacional (UI) la cual se define como la cantidad
de enzima que transforma un µmol de sustrato en un minuto a temperatura y pH óptimos de
trabajo (Horton, 2008).
Durante el proceso de determinación de la actividad de una enzima, es importante
considerar los factores que pueden afectar la estructura terciaria o cuaternaria de la proteína,
tales como la temperatura de reacción, la fuerza iónica y el pH, pues pueden afectar la
capacidad catalizadora de la enzima. Al igual que otras variables tales como la hemólisis, la
lipemia, la concentración de sustrato, la longitud de onda en la que se lleve a cabo la
determinación, entre otras, las cuales, pueden afectar el resultado de la determinación (Uhthtoff-
Brito, 1999; Calatayud, et al, 2008).
Dado que las enzimas se encuentran localizadas intracelularmente y distribuidas en
citoplasma y/o en los organelos, la funcionalidad de un órgano involucra la medición de
aquellas enzimas que se encuentran en mayor proporción en sus células, dando lugar a los
llamados perfiles enzimáticos. Existen perfiles enzimáticos hepáticos, cardíacos,
pancreáticos, etc, que permiten apoyar al diagnóstico y pronóstico de muchas
enfermedades.
53
5.2 OBJETIVO
Explicar la importancia de la enzimología clínica a través de conceptos bioquímicos que
ayuden a la comprensión de la actividad enzimática y su utilidad para un diagnóstico clínico;
conociendo las variables analíticas de las determinaciones enzimáticas a través de la
descripción de los factores que afectan su actividad y mediante el cálculo de los resultados
experimentales para reconocer la importancia de los cuidados en el trabajo dentro del
laboratorio.
I. Definir isoenzima, coenzima y cofactor, ejemplificando en reacciones enzimáticas la
participación de cada una.
B. Indicar los diferentes métodos para la determinación de enzimas en muestras
biológicas y su utilidad en la clínica.
C. Definir las siguientes unidades de reporte: Unidad Internacional (UI) y Kat (Katal),
explicando por qué se utiliza la primera.
4. Realizar un cuadro comparativo de los factores que afectan la actividad enzimática,
considerando las fases preanalíticas y analíticas del proceso.
5. Investigar las principales enzimas e isoenzimas utilizadas en el diagnóstico clínico.
5.4 MATERIALES
Cuaderno de trabajo
Calculadora
Manuales de usuario (insertos) de las determinaciones de enzimas disponibles

Cálculo del promedio de incremento o disminución de absorbancia por minuto (∆Abs/min)
Se realizarán diversos ejercicios de cálculo para la obtención de la ∆Abs y su aplicación para
calcular la actividad enzimática, analizando el comportamiento de acuerdo al fundamento de
cada determinación.
Considerar que si la absorbancia de la determinación va aumentando la fórmula para la
obtención del ∆Abs/min es:
(Abs4-Abs3) + (Abs3-Abs2) + (Abs2-Abs1)

∆Abs/min =
3
Mientras que cuando la absorbancia dismuye la fórmula es:

(Abs1-Abs2) + (Abs2-Abs3) + (Abs3-Abs4)
∆Abs/min =
3
Asimismo, es importante recordar que el número de lecturas realizadas y el denominador de
la fórmula dependerán de la técnica.
Cálculo del Factor para determinar la actividad enzimática
Para obtener la actividad enzimática, se utiliza la siguiente ecuación: ∆Abs/min x FACTOR.
54
Dicho factor puede modificarse según la reacción y las condiciones del método, siendo el
más común, la modificación de la temperatura (25ºC, 30ºC, 37ºC) y se calcula utilizando la
siguiente fórmula:
Donde:
VT = volumen total de la reacción en mL (suma del volumen de la muestra biológica más el
volumen del reactivo)
ε = coeficiente de absortividad molar de la sustancia que da la absorbancia a la longitud de
onda utilizada
LP = longitud de paso óptico en cm (normalmente es 1 cm que es el grosor de la celda)
VS = volumen de la muestra biológica en mL
Demostración de factores
Calcular los factores para la obtención de la actividad enzimática, los cuales se utilizarán en
la práctica 6 (revisar en el manual de usuario –inserto- de las determinaciones con que se
cuenta en el laboratorio, para saber cuáles serán estos factores).
Discusión de casos clínicos utilizando enzimas e isoenzimas

Elaborar un ejemplo de algoritmo diagnóstico que apoye a identificar la alteración de un
órgano con los datos proporcionados por los profesores y se realizará la discusión de casos
clínicos que incluyan la determinación de enzimas e isoenzimas de utilidad para el
diagnóstico de alteraciones órgano-específicas.
Se realizará la discusión de casos clínicos que incluyan la determinación de enzimas e
isoenzimas desarrollando un algoritmo diagnóstico para la identificación de alteraciones
órgano-específicas.

Debido a no se utilizan muestras biológicas ni reactivos, no se generarán residuos de
importancia biológica.
5.7 RESULTADOS
Cálculos de ∆Abs/min
55
Cálculos de obtención de factores
Cálculos de actividad enzimática
56
En el reporte de esta práctica se deberá analizar el ∆Abs/min y su relación con el
fundamento de la determinación, la importancia de variables como la longitud de onda, el
volumen de muestra y el volumen de reactivo, entre otras, en la obtención del factor con el
cual se obtiene la actividad enzimática en la prueba realizada. Por último, analizar cuáles son
las directrices a seguir en el uso de enzimas e isoenzimas para confirmación y seguimiento
de diagnósticos.
En las conclusiones considerar si se alcanzó el objetivo planteado y si sus expectativas y
dudas fueron aclaradas durante la práctica.
5.9 BIBLIOGRAFÍA
- Calatayud-F, O; Juliá-S, ML., Rodríguez-B, E., López-G, R., Ochoa-A, E. (2008)

Experiencia de verificación de la estabilidad de enzimas en suero y plasma durante
60 y 120 minutos. Acta Bioquim Clin Latinoam; 42 (4):575-8
- Dufour, D.R., Lott, J.A., Henry, J.B. (2010) Enzimología clínica. En Henry, J.B.
Laboratorio en el diagnóstico clínico. Madrid: Marbán Libros.
- Horton, H.R. (2008) Principios de Bioquímica. México: Ed Pearson.
- Sánchez, M.A. (2005) Enzimología Clínica. Bioquimia, 30 (001): 30 31
- Uhthtoff-Brito, E.C. (1999) La calidad en enzimología clínica; LAB-acta 11(3): 80 -86
57
PRÁCTICA No. 6
“ENZIMAS CARDÍACAS Y PANCREÁTICAS”
Beatriz L. González Maldonado

6.1 INTRODUCCIÓN
Como se comentó en la práctica 5, diferentes enzimas son útiles en el monitoreo y el
reconocimiento de determinados procesos patológicos, no obstante, solamente algunas se
determinan en el laboratorio clínico. En la presente práctica se evaluarán las enzimas que
permiten detectar daño cardiaco o pancreático.
El corazón es un órgano muscular situado en el mediastino, mide alrededor de 12 cm de
largo, 9 cm en su punto más ancho y 6 cm de espesor, con un peso que varía entre 250 y
300 g en personas adultas; su función es bombear sangre rica en oxígeno, proveniente de
los pulmones, al resto del cuerpo (circulación sistémica) y recibir sangre pobre en oxígeno
para bombearla a los pulmones (circulación pulmonar) para reoxigenarla y reiniciar el circuito
(Tortora y Derrickson, 2006).
No existe ningún síntoma que identifique inequívocamente una enfermedad cardiaca, pero
algunos síntomas (dolor, disnea, fatiga, palpitaciones, sensación de mareo y desmayo)
sugieren esta posibilidad y la asociación de varios permite establecer un diagnóstico casi
exacto. Las cardiopatías pueden clasificarse, de forma muy simple, en eléctricas (arritmias),
estructurales (congénitas o desarrolladas que provoquen insuficiencia) y circulatorias
(isquemia, infarto al miocardio –IAM-) (Al-Hadi y Fox, 2009).
Para las dos primeras, el diagnóstico clínico se apoya en pruebas de gabinete; mientras que
la última entidad puede evaluarse con la determinación de enzimas cardiacas, tales como la
CK-total, CK-MB, LDH y AST, además de proteínas como la mioglobina y las troponinas (Al-
Hadi y Fox, 2009).
Por su parte, el páncreas es un órgano retroperitoneal con funciones exocrinas (80 % de las
células son acinares) y endocrinas (2 % son células de los islotes de Langerhans). Tiene un
peso aproximado de 100 g y diariamente produce 500 mL de jugo pancrático. Las tres
funciones principales del páncreas son: neutralizar el ácido gástrico que ingresa al duodeno,
sintetizar y segregar enzimas digestivas y liberar hormonas con funciones metabólicas (Lizarazo,
2008).
El páncreas puede sufrir diversas afecciones entre las que se encuentran: inflamación
(aguda, crónica), cáncer, tumores endocrinos y fibrosis quística, las cuales pueden ocasionar
alteraciones en la digestión y en el metabolismo en general. Habitualmente se sospecha de
daño pancreático cuando el paciente presenta dolor central epigástrico que irradia hacia la
espalda y los costados, acompañado de náuseas y vómitos (Tortora y Derrickson, 2006).
Para evaluar al páncreas pueden utilizarse diversas pruebas clínicas, algunas evalúan la
función endocrina (curvas de insulina y de glucagón, cuantificación de péptido C), mientras
que otras evalúan la función exocrina (pruebas de estimulación de secreción pancreática,
determinación de la actividad de enzimas pancreáticas séricas). La amilasa y lipasa son de
gran utilidad en el diagnóstico de pancreatitis aguda, aunque sus incrementos también
pueden relacionarse con otras patologías, propias o no del páncreas (Dufour, Lott y Henry, 2010; Heisig,
Theattre, Henry, 2010).
58
La sensibilidad y especificidad del uso de enzimas cardiacas y pancreáticas, en el
diagnóstico temprano de IAM y pancreatitis aguda, está influenciado por factores tales como:
tiempo de presentación después del inicio de los síntomas, tamaño del infarto o de la zona
de lesión y algunos factores cinéticos (peso molecular, el organelo donde se encuentre
dentro de la célula, el volumen de distribución, velocidad de clarificación). De manera que es
importante considerar estos factores cuando se considere utilizar la determinación de estas
enzimas (Al-Hadi y Fox, 2009).
6.2 OBJETIVO
Analizar la importancia de la determinación de enzimas pancreáticas y cardiacas realizando
la determinación de la actividad enzimática para relacionar los resultados con patologías
órgano-especificas.

A. Elaborar una tabla donde indique la localización a nivel de órgano y celular de las
siguientes enzimas e isoenzimas: LDH, AST, ALT, CK-MB, CK-MM, CK-BB, Lipasa,
Amilasa.
B. Elaborar un gráfico donde se indique el orden de elevación con respecto al tiempo
después de un infarto de las siguientes enzimas LDH, AST, CK-MB, CK-NAC.
C. Indicar tres precauciones en la toma y manejo de muestra para la determinación de
enzimas pancreáticas.
D. Explicar cómo se relaciona la determinación de lipasa y amilasa con alteraciones de
la función endocrina del páncreas.
E. Investigar cómo apoya la elevación de enzimas cardiacas al diagnóstico diferencial de
un IAM y una isquemia coronaria.
F. Investigar las técnicas de cada prueba de acuerdo al fundamento y marca del reactivo
(ésta última será proporcionada por los profesores del grupo).
G. Con la información anterior llenar todas las tablas que aparecen en el manual de
prácticas.
H. Realizar en el cuaderno de trabajo el diagrama de flujo (ver apéndice A) con todas las
Material reciclable por equipo de trabajo

10 Tubos 12x75 mm 1 Gradilla
1 Cronómetro 1 Pipeta Pasteur
Material no reciclable por equipo de trabajo

1 Aguja doble para extracción de sangre venosa 2 Cuadros de gasa (10x10 cm)
1 Tubo al vacío, tapón rojo 10 Cuadros de papel parafilm
59
Material por grupo
10 Celdas para espectrofotómetro 2 Dispensadores con puntas azules
4 Gradillas 2 Dispensadores con puntas amarillas
2 Espectrofotómetros 1 Baño de agua a 37º C
2 Pisetas con agua destilada 2 Micropipetas 10 a 100 µL
1 Contenedor para RPBI rígido 2 Micropipetas 100 a 1000 µL
1 Bolsa roja para RPBI
Reactivos
Kit para determinación de:
- LDH - AST
- ALT - CK-MB
- Lipasa - CK-NAC
- Amilasa

Obtención y procesamiento de la muestra
- La muestra debe obtenerse por venopunción con un tubo al vacío de tapón rojo, cuya
capacidad sea de 4 a 7 mL, siguiendo las normas para una toma de muestra de calidad
analítica, evitando hemolisis o lipemia.
- El suero debe separarse por centrifugación antes de una hora después de realizada
la toma de muestra.
Lactato deshidrogenasa (LDH)

Nombre sistemático (S)-lactato:NAD+ oxidoreductasa, EC 1.1.1.27, PM 134 KDa
La LDH es una enzima ubicua, encontrada en el citoplasma de casi todas las células donde
participa en un paso muy importante de la glucólisis. Se trata de un tetrámero formada por
las subunidades H y M, lo que genera 5 posibles isoenzimas: LDH1 (corazón), LDH2 (riñón
corazón, pulmones, eritrocitos), LDH3 (riñón, pulmones, bazo, eritrocitos), LDH4 (pulmones,
bazo) LDH5 (hígado, músculo esquelético) (McClatchey, 2002).
Estabilidad
La muestra es estable 2 días de 2 a 4° C. La congelación disminuye la actividad de la LDH4
y 5, en consecuencia, la actividad total se observará disminuida.
Fundamento
La LDH se determina por el método de Wacker (1956) modificado por Buhl y Jackson (1978),
quienes optimizaron las condiciones de reacción; la enzima cataliza la reducción de L-lactato
a piruvato, con la reducción simultánea de NAD+,
+ LDH
Lactato + NAD Piruvato + NADH
Esta reacción es reversible: a pH de 8.8 a 9.8 va de lactato a piruvato, mientras que a pH de
7.4 a 7.8 va de piruvato a lactato; la ventaja de la reacción a pH alcalino es que la velocidad
60
de reacción es más baja y se mantiene constante. La reacción se monitorea midiendo la
absorbancia del NADH a 340 nm.
Técnica
- Ajustar el espectrofotómetro a cero utilizando:______________________.
- Rotular un tubo de ensaye con el número de equipo y las siglas de la enzima.
- Realizar la determinación de acuerdo a las indicaciones del manual de uso del
reactivo (inserto).
LDH
Reactivo de trabajo (mL)
Muestra (µL)
Mezclar. Vaciar el contenido del tubo en la celda. Cronometrar.

Leer A1 exactamente en: ________ minuto.
Repetir lecturas cada min durante ________minutos
Cálculos
Actividad de CK = ∆Abs/min (Factor) = U/L

Temperatura _______________
Factor______________________
Límite de detección ____________________
Límite de linealidad ___________________
25°C 30°C 37°C
120 – 240 U/L 160 – 320 U/L 230 – 460 U/L .
La elevación de la actividad enzimática de la LDH indica daño tisular (debido a anoxia y
pérdida de citoplasma o hasta necrosis). El diagnóstico definitivo de infarto agudo al
miocardio (IAM) se confirma con la medición de su actividad junto con la creatina cinasa (CK)
y la aspartato aminotransferasa (AST). La LDH comienza a elevarse 12 a 24 h después del
inicio del dolor; alcanza un pico máximo 48 a 72 h y se mantiene elevada hasta el séptimo o
décimo día; por lo tanto, es de gran utilidad en apoyo al diagnóstico tardío de IAM. La LDH
también se ha visto aumentada en pacientes con necrosis hepática (por agentes tóxicos o
virales), en necrosis tubular renal y en tumores sanguíneos (leucemias y linfomas).
Creatin cinasa (CK)
61
Nombre sistemático: ATP:creatina N-fosfotransferasa, EC 2.7.3.2, PM 80 KDa
La enzima mitocondrial CK de la célula muscular cataliza la transferencia de un grupo fosfato

de alta energía de ATP a la creatina, para formar creatina fosfato; durante la contracción
muscular, la enzima citoplasmática cataliza la reacción reversible, dando al miocito una
fuente inmediata de ATP. La CK citoplasmática consiste en un dímero integrado por las
subunidades M y B, lo que permite la presencia de tres posibles isoenzimas: MM, MB, BB.
Además, modificaciones postraduccionales pueden producir tres isoformas de MM y dos de
MB. La fracción CK-MM es característica del músculo esquelético, la CK-MB, del músculo
cardiaco y la CK-BB del cerebro (McClatchey, 2002).
Estabilidad
La muestra es estable 7 días de 2 a 4° C protegida de la luz.
Fundamento
La actividad de la CK total se mide de acuerdo al método modificado de Szansz (1976), con
base a las siguientes reacciones:
CK
Fosfocreatina + ADP Creatina +ATP
Hexocinasa
ATP + Glucosa ADP + Glucosa-6-fosfato
+ G-6-PD +
Glucosa-6-fosfato + NADP 6-fosfogluconato + NADPH + H
La reacción es monitoreada por el incremento de NADPH medido a 340 nm. Se requiere una
fase lag de 90 a 120 segundos para que se inicie la reacción lineal, la cual debe llevarse a
cabo a un pH de 7.0. Se requiere la adición de N-acetilcisteína como un activador para
mantener un suministro de grupos sulfhidrilos necesarios para la completa activación de la
CK. La presencia de adenilato cinasa (proveniente de los eritrocitos, del músculo
esquelético, del hígado y del riñón) en el suero produce una interferencia positiva en la
reacción; aunque la mayoría de los kits comerciales incluyen adenosina monofosfato y
diadenosina pentafosfato para inhibirla.
Técnica
- Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia con agua destilada.
reactivo (inserto).
CK
Reactivo de trabajo (ml)
62
Muestra (µl)
Mezclar. Vaciar el contenido del tubo en la celda.

Cronometrar.
Leer A1 exactamente en: ________ minutos.
Cálculos
Actividad de CK = ∆Abs/min (Factor) = U/L

Factor______________________
25°C 30°C 37°C
Hombres: 0 – 80 U/L 0 – 130 U/L 0 – 195 U/L
Mujeres: 0 – 70 U/L 0 – 110 U/L 0 – 170 U/L
El incremento de la CK total puede relacionarse con alteraciones del músculo esquelético y
cardiaco. En el caso del infarto agudo al miocardio, esta enzima comienza a elevarse 2 a 6
horas después del inicio del dolor, alcanzando el máximo 18 a 24 horas después; el pico
alcanzado puede llegar a ser 20 veces el límite superior normal, por lo cual es la prueba más
sensible para el diagnóstico de esta patología.
CK-MB
Se trata de una isoenzima de la CK, ubicada principalmente en el músculo cardíaco, que se
encuentra constituida por las subunidades M y B (McClatchey, 2002).
Estabilidad
La muestra es estable 7 días de 2 a 4° C protegida de la luz.
Fundamento
Para determinar la actividad de CK-MB es necesario utilizar un anticuerpo monoclonal anti-
M, para inhibir las fracciones CK-MM y la subunidad M de la CK-MB. La actividad de la
subunidad B de la CK-MB se mide de acuerdo al método modificado de Szansz (ver
Fundamento de CK)
Técnica
63
reactivo (inserto).
CK-MB
Muestra (µL)

Leer A1 exactamente en: ________ minutos.
Repetir lecturas cada min durante ________minutos.
Cálculos
Actividad de CK-MB = ∆Abs/min (Factor) = U/L

Factor______________________
25°C 30°C 37°C
0 – 10 U/L 0 – 15 U/L 0 – 24 U/L
La CK-MB se incrementa en forma simultánea a la CK después del infarto al miocardio, de
manera que estas dos enzimas pueden indicar este diagnóstico. En algunas ocasiones,
también puede aumentar por traumatismos del músculo esquelético.
Aspartato aminotransferasa (AST)

Nombre sistemático L-aspartato:2-oxoglutarato aminotransferasa, EC 2.6.1.1
La AST es una enzima que se encuentra en el músculo cardiaco y esquelético, además de

estar presente en el hígado y en los eritrocitos. Hay dos isoenzimas (citoplasmática y
mitocondrial) las cuales pueden ser medidas en el plasma (McClatchey, 2002).
Estabilidad
La muestra es estable 7 días de 2 a 4° C. Las muestras de pacientes dializados o con
deficiencia de fosfato de piridoxal pueden dar resultados falsamente disminuidos.
Fundamento
La actividad de la AST se mide mediante las siguientes reacciones:
AST
L-aspartato + oxoglutarato oxalacetato + glutamato
MDH +
Oxalacetato + NADH L-malato + NAD
64
La reacción es monitoreada por la disminución de NADH medida a 340 nm.
Técnica
reactivo (inserto).
AST
Muestra (µL)

Repetir lecturas cada min durante ________minutos.
Cálculos
Actividad de AST = ∆Abs/min (Factor) = U/L

Factor______________________
25°C 30°C 37°C
Hombres: 0 – 19 U/L 0 – 26 U/L 0 – 38 U/L
Mujeres: 0 – 16 U/L 0 – 22 U/L 0 – 31 U/L
Los niveles elevados de esta enzima no son específicos de enfermedad hepática, cardiaca o
muscular. El resultado siempre debe interpretarse considerando otros datos clínicos y la
historia del paciente. En el infarto agudo al miocardio, se observará aumentada 6 a 8 h
después del inicio; alcanza niveles máximos 48 h después y regresa a la normalidad entre el
cuarto y sexto día.
α-Amilasa
Nombre sistemático 4-α-D-glucan glucanohidrolasa; EC 3.2.1.1
La amilasa es una enzima que escinde los enlaces α-1,4 de los polisacáridos; pertenece al
grupo de las enzimas digestivas; puede presentar dos isoenzimas, una salival y otra
pancreática (McClatchey, 2002).
65
Estabilidad
La muestra es estable una semana a temperatura ambiente y un mes en refrigeración. La
amilasa es temperatura dependiente. Debe evitarse el pipeteo con la boca y el contacto de la
piel con el material a utilizar, debido a que la saliva y el sudor contienen amilasa.
Fundamento
El método colorimétrico para la determinación de amilasa se lleva a cabo mediante la
siguiente reacción
Amilasa
10 CNPG3 9CNP + 1CNPG2 + G3 + G
donde CNPG3 es el sustrato con enlaces α-1,4, 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltotriósido; CNP es

2-cloro-4-nitrofenol, el producto colorido cuyo incremento permite monitorear la reacción a
405 nm; CNPG2 es 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltósido; G3 es maltotriosa y G es glucosa.
Técnica
reactivo (inserto).
Amilasa
Muestra (µL)

Leer A1 exactamente en: ________ segundos.
Cálculos
Actividad de amilasa = ∆Abs/min (Factor) = U/L

Factor______________________
0 – 90 U/L a 37° C
La elevación de amilasa está relacionada con diversas alteraciones, sin embargo se realiza
principalmente en apoyo al diagnóstico de pancreatitis aguda, donde aumenta 2 a 4 horas
después del inicio; el pico máximo se presenta en 12 a 24 h, permaneciendo elevada hasta
72 h, regresando a la normalidad entre el tercer y quinto día después de que inició el
66
episodio. Dado que no hay relación del aumento con la severidad de la pancreatitis, es
recomendable establecer el diagnóstico con base a otros datos clínicos y la historia del
paciente.
Lipasa
Nombre sistemático triacilglicerol acilhidrolasa; EC 3.1.1.3
La lipasa cataliza la hidrólisis secuencial de los triglicéridos en β-monoglicéridos y dos ácidos

grasos libres. La principal porción presente en la sangre proviene del páncreas, aunque
puede producirse también en las glándulas salivales, estómago, intestino y pulmones
(McClatchey, 2002).
Estabilidad
La muestra es estable dos días en refrigeración.
Fundamento
El método colorimétrico para la determinación de lipasa se lleva a cabo mediante la siguiente
reacción:
Lipasa
DGGME DG + AGEE AG+ Metilresorufina
Donde DGGME es 1-2-O-dilauril-rac-glicerol-3-glutárico-(6’-metilresorufina)-ester un sustrato

con unión éster; DG es 1-2-O-dilauril-rac-glicerol y AGEE es ácido glutárico-6’-etilresorufina
éster que es un producto inestable, el cual permite la liberación de AG, que es ácido
glutárico, y de la sustancia colorida la Metilresorufina, con la cual se monitorea la reacción a
580 nm.
Debido a que esta reacción también puede medir la actividad de la lipoproteinlipasa, es
necesario agregar colipasa y sales biliares (desoxicolato y taurodesoxicolato) que
incrementan la velocidad de reacción y la sensibilidad analítica de la lipasa pancreática, con
quienes se unen para formar un complejo, que le permite a la enzima enlazar eficientemente
al sustrato. Esto disminuye la actividad de la lipoproteinlipasa.
Técnica
- Rotular 3 tubos de ensaye (Bco, Pt y Mta) con el número de equipo, las siglas de la
enzim.
reactivo (inserto).
67
Lipasa
Blanco Patrón Muestra
Muestra (µL)
Reactivo A (mL)
Reactivo B (µL)

NOTA: Trabajar cada tubo individualmente y anotar las respectivas absorbancias.
- Calcular el ΔA/min y multiplicarlo por el factor correspondiente.

Cálculos
Abs Mta = ∆Abs Mta - ∆Abs Bco
Abs Pt = ∆Abs Pt - ∆Abs Bco
Actividad enzimática de lipasa = Abs Mta x [Pt]

Abs Pt

Factor______________________
0 – 38 U/L 37° C
El aumento de la lipasa pancreática puede estar originado por pancreatitis aguda u
obstrucción pancreática. Comienza a incrementar 4 a 8 h después del inicio de la crisis,
teniendo su pico máximo a las 24 h; regresando a niveles basales 8 a 14 días después. Si se
realiza junto con la amilasa, se incrementa la sensibilidad del diagnóstico de pancreatitis
aguda.
6.6. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

- Agujas de tubo al vacío deben depositarse en el contenedor de punzocortantes de
RPBI se desechan a la basura municipal. R1.
- Material que esté empapado de sangre, depositarlo en la bolsa roja de RPBI. R2.
68
- Torundas, empaques de agujas, guantes, los materiales de asepsia y aquellos que se
utilicen para limpieza del área de trabajo deben desecharse en el bote de la basura
municipal. R3.
- Tubos que contengan mezclas reactivas sangre, muestra biológica y coágulo se
depositan en los contenedores con cloro dispuestos por el laboratorista. R4.
- Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el
contenedor de basura municipal del laboratorio; éstas deberán depositarse en los
botes ubicados fuera del laboratorio.
6.7. RESULTADOS
Cálculos de la actividad enzimática
69
Tabla de resultados para enzimas cardíacas
Diagnóstico presuntivo: _______________________________ Fecha: ______________
Enzima (método) Resultado Valores de referencia Interpretación Realizado por:
Observaciones:
Tabla de resultados para enzimas pancreáticas

Enzima (método) Resultado Valores de referencia Interpretación Realizado por:
Observaciones:
70
6.8. ORIENTACIÓN PARA LA ELABORACIÓN DEL REPORTE
Los resultados de cada perfil enzimático deben relacionarse con el estado de salud del
paciente; en caso de que sean anormales es necesario indicar la patología relacionada.
Además deben indicarse otras pruebas con las que se pueda sustentar que el paciente tiene
la patología en cuestión.
Es importante que se resalte la importancia del uso de las enzimas relacionadas con la
evaluación del funcionamiento del corazón y del páncreas, según corresponda.
6.9. BIBLIOGRAFÍA
- Al-Hadi, H., Fox, K. (2009) Cardiac markers in the early diagnosis and
management of patients with acute coronary syndrome. SQU Medical Journal
9(3):231-246
- Dufour, D.R., Lott, J.A., Henry, J.B. (2010) Enzimología clínica. En Henry, J.B.
Laboratorio en el diagnóstico clínico. Madrid: Marbán Libros.
- Heisig, D.G., Threatte, G.A., Henry, J.B. (2010) Diagnóstico de laboratorio de
las alteraciones gastrointestinales y pancreáticas. En Henry, J.B. Laboratorio en el
diagnóstico clínico. Madrid: Marbán Libros.
- Lizarazo, J. (2008) Fisiopatología de la pancreatitis aguda. Rev Col
Gastroenterol 23(2):187-191.
- McClatchey, K. (2002) Clinical Laboratory Medicine. EUA: Lippincott Williams
and Wilkins.
- Tortora, G.J., Derrickson, B. (2006) El aparato circulatorio: el corazón. En
Principios de anatomía y fisiología. México: Editorial Médica Panamericana.
71
PRACTICA No. 7
“ENZIMAS HEPATICAS”
G. Leticia Arellano Martínez
7.1 INTRODUCCION
El hígado es la glándula más voluminosa del cuerpo, pesa aproximadamente 1.4 Kg en un
adulto promedio, se localiza por debajo del diafragma y se divide en dos lóbulos principales
unidos por el ligamento falciforme. Por debajo del lóbulo derecho se localiza la vesícula biliar.
Los lóbulos del hígado están formados por muchas unidades funcionales llamadas lobulillos,
cada lobulillo tiene forma hexagonal y está constituido por hepatocitos, capilares, células de
Kupffer, canalículos biliares y una vena central. El hígado recibe sangre oxigenada de la
arteria hepática, nutrimentos recién absorbidos así como fármacos a través de la vena porta.
La mayoría de los nutrimentos y sustancias tóxicas para el organismo son captadas por los
hepatocitos en donde sufren modificaciones bioquímicas para su utilización, distribución o
almacenamiento (Tortora y Derrickson, 2013).
Aunque existen numerosas enzimas que participan en la función hepática, son pocas las que
se utilizan para evaluar daño al órgano. Las seis enzimas más utilizadas son: fosfatasa
alcalina, gamma-glutamiltransferasa, aspartato y alanina transaminasas, 5’-nucleotidasa y
lactato deshidrogenasa. En la presente práctica sólo se realizarán 4 de las seis enzimas
antes mencionadas y estas son: fosfatasa alcalina, gamma-glutamiltransferasa, aspartato y
alanina transaminasas. Estas pruebas han sido elegidas con base en los recursos con los
que se cuenta en el laboratorio, la factibilidad de su realización y el valor diagnóstico de los
resultados (Gaw et al, 2014; Marshall et al, 2013).
Las transaminasas: aspartato amino transferasa (AST) y alanina amino transferasa (ALT)
son enzimas ampliamente distribuidas en el organismo, que catalizan la transferencia de un
grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, en una de las más importantes reacciones
del metabolismo proteico. La gamma-glutamiltransferasa (GGT) es una enzima de
membrana ampliamente distribuida en el organismo, se localiza principalmente en riñón,
vesículas seminales, páncreas, hígado, bazo y cerebro, cataliza la transferencia de grupos
gamma glutamil entre una molécula donadora y otra aceptora, participa en el transporte de
aminoácidos en la célula. Finalmente, la fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima ampliamente
distribuida en el organismo, hidroliza ésteres monofosfato en medio alcalino. ALP ha sido
localizada en la mayoría de los tejidos del cuerpo, pero se ha identificado mayor actividad en
hígado, hueso, intestino, riñón y placenta, dando lugar a distintas isoenzimas cuyas
actividades pueden encontrarse elevadas en suero, como respuesta a diversas condiciones
fisiológicas o patológicas (Gaw et al, 2014; Marshall et al, 2013).
7.2 OBJETIVO
Realizar la determinación de enzimas hepáticas en una muestra biológica, aplicando el

conocimiento de los fundamentos y técnicas de forma correcta, para obtener resultados
confiables que permitan diagnosticar una alteración en la función hepática.
72
A. Investigar las funciones metabólicas de cada una de las enzimas, indicando su

localización a nivel celular.
B. Anotar los principales órganos donde se localizan, en orden decreciente de importancia.
C. Elaborar una tabla en donde relacionen diferentes enfermedades hepáticas con
alteraciones en los niveles séricos de las enzimas que se determinarán en la práctica.
D. Investigar las técnicas de cada prueba de acuerdo con el fundamento y marca del
reactivo,esta información será proporcionada por los profesores del grupo.
E. Con la información anterior llenar todas las tablas que aparecen en el manual de
prácticas.
F. Realizar el diagrama de flujo (ver apéndice A) con todas las pruebas correspondientes a
esta práctica.

1 Gradilla 1 Propipeta
5 Tubos 12x75 mm 1 Pipeta graduada de 1 mL (1/100)
1 Pipeta Pasteur con bulbo 3 Punta amarilla para micropipeta
1 Adaptador para tubo al vacío 1 Cronómetro

3 Torundas 1 Tubo al vacío de tapón rojo o dorado
2 Cuadro de gasa de 15x15 cm 1 Aplicador de madera
1 Aguja verde para tubo al vacío 1 Cuadro de papel parafilm 3x3 cm
Material por grupo

2 Espectrofotómetro UV-Visible 1 Baño de agua a 37º C
4 Vaso de precipitado de 250 mL 1 Termómetro
3 Micropipeta de 5 a 40 uL 1 Recipiente para desechos (RPBI)
3 Micropipeta de 40 a 200 uL 1 Contenedor para punzocortantes
3 Micropipeta de 200 a 1000 uL 4 Pipeta graduada de 1 mL
1 Centrífuga 4 Pipeta graduada de 2 mL
4 Piseta con agua destilada 3 Pipeta graduada de 5 mL
Reactivos por grupo
100 mL Etanol al 70 % Kit para determinación de:

100 mL SSF
1200 mL Agua destilada - ALT
200 mL de Hipoclorito de sodio - AST
- GGT
- ALP
73

- El paciente debe tener un ayuno mínimo de 8 h. La muestra debe obtenerse por
venopunción con un tubo al vacío de tapón rojo, cuya capacidad sea de 4 a 7 mL,
siguiendo las normas para una toma de muestra de calidad analítica, evitando hemólisis.
- El suero debe separarse por centrifugación antes de una hora después de realizada la
toma de muestra.
Aspartatoaminotransferasa (AST)
Considerar los datos del procedimiento experimental indicado para esta enzima en la
práctica No. 6 “Enzimas pancreáticas y cardiacas”.
Alaninaaminotransferasa (ALT)
Nombre sistemático: L-alanina-2-oxoglutarato aminotransferasa (EC 2.6.1.2).
Estabilidad
ALT es estable por 7 días cuando se refrigera (2° - 8°C).
Fundamento
La actividad de la enzima es medida de acuerdo con las siguientes reacciones
ALT
L-alanina + oxoglutarato piruvato + glutamato
LDH +
Piruvato + NADH Lactato + NAD
La velocidad de disminución del NADH, determinada espectrofotométricamente a 340 nm, es

proporcional a la actividad de la ALT en la muestra.
Técnica
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda 340 nm.

- Realizar la determinación de acuerdo con las indicaciones del manual de uso del reactivo
(inserto).
ALT
Suero
Reactivo
Mezclar. Vaciar el contenido a la celda. Cronometrar.

Leer A1 exactamente en:________ minuto.
Repetir lecturas cada min durante: _______ minutos
74
Temperatura: _________________
Factor: ______________________
Límite de detección: _____________________
Linealidad: _____________________________
Cálculos
Actividad de ALT = ∆Abs/min (Factor) =U/L
25° C 30° C 37° C
Hombres (hasta, U/L) 22 29 40
Mujeres (hasta, U/L) 18 22 32
Estas enzimas tienen acción intracelular, por lo que la actividad sérica en condiciones
normales es baja o nula. Un aumento de actividad será evidencia de un deterioro de los
tejidos en que se encuentra, resultando particularmente importantes corazón e hígado. Se ha
observado que después de infarto agudo al miocardio (IAM) se incrementa la actividad de la
AST, debido a su liberación hacia torrente sanguíneo y por ser tan abundante en músculo
cardíaco.
En hepatitis virales y otras enfermedades hepáticas que involucren necrosis de tejido, habrá
un incremento de la actividad sérica de las transaminasas incluso antes de la aparición de
ictericia. En este caso la ALT será la enzima predominante por su alta concentración en
tejido hepático. También se puede elevar la actividad de las transaminasas en traumas
accidentales y quirúrgicos y en distrofias musculares y miositis.
Cálculo del índice de De Ritis
La relación de la actividad de AST con respecto a la de ALT fue descrita por Fernando De
Ritis en 1957, como un indicador de la etiología de la hepatitis; basándose en que la
proporción de AST/ALT es de 2.5:1 y que la AST se aclara del suero por los sinusoides
hepáticos dos veces más rápido (t ½ = 18 h) comparado con la ALT (t ½ = 36 h), el resultado
de los niveles séricos de AST y ALT son muy similares en los pacientes sanos. Cuando hay
daño hepatocelular, los niveles séricos de AST comparados con los de ALT tienden a reflejar
las proporciones celulares, indicando la alteración existente.
Técnica
- Una vez obtenida la actividad de cada enzima, debe sustituirse en la siguiente fórmula
( %+%" " " ,-.

í'"%( " ) *% %! =
( %+%" " " ,/.
75
ambas actividades expresadas en U/L, por lo que el resultado es adimensional.
1.0 a 1.5
En la enfermedad hepática aguda, el cociente presenta valores inferiores a 1, y cuanto
menor sea más aguda es la lesión, debido a que la ALT es una enzima indicadora de
necrosis hepatocelular de origen citoplasmático. Algunos investigadores han observado que
en hepatitis viral aguda este índice puede ser mayor a 2, aunque estos casos típicos
representan hepatitis fulminante, donde a menudo hay una pobre prognosis. En casos donde
existe lesión hepática crónica, cuando se llega a observar fibrosis, los valores del índice
pueden ser normales o superiores al rango de referencia, pero sin ser mayores a 2. En
pacientes con cirrosis o hipertensión portal con una relación AST/ALT mayor a 3 sugiere
cirrosis biliar primaria. Cuando los incrementos de AST/ALT se acompañan de proteínas
totales aumentadas y albúmina disminuida, debe considerarse la posibilidad de necrosis
celular activa crónica y posiblemente por una hepatitis crónica autoinmune.
γ-Glutamiltransferasa (GGT)
Nombre sistemático (5-L-glutamil)-péptido:amino-ácido 5-glutamiltransferasa(EC 2.3.2.2).
Estabilidad
La GGT en suero es estable hasta 2 semanas en refrigeración (2-8° C) y hasta 6 meses en

congelación (-4° C) sin agregar conservadores.
Fundamento (método cinético-colorimétrico)
La actividad de la enzima es medida de acuerdo con la siguiente reacción:
GGT
γ-glutamil p-nitroanilida + glicilglicina γ-glutamilglicilglicina + p-nitroanilina
La actividad enzimática está relacionada con la velocidad de aparición de la p-nitroanilina,

que se mide a 405 nm.
Técnica
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda 405 nm.

- Ajustar a cero de absorbancia.
- Realizar la determinación de acuerdo con las indicaciones del manual de uso del
reactivo (inserto).
76
GGT
Suero
Reactivo

Repetir lecturas cada min durante: _______ minutos

Temperatura: _________________
Factor: ______________________
Linealidad: _____________________________
Cálculos
Actividad de GGT = ∆Absorbancia/min (Factor) = U/L
25° C 30° C 37° C
Hombres (U/L) 4 – 18 5 – 25 7 – 32
Mujeres (U/L) 6 – 28 8 – 38 11 – 50
En caso de alteración hepática, la GGT generalmente es indicativo de agresión tóxica. Sin

embargo, la determinación sólo tiene valor clínico cuando sus valores son comparados con
otras enzimas de mayor órgano-especificidad. Un aumento aislado de GGT es una prueba
de tamizaje y monitoreo del alcoholismo, una relación GGT/ALP mayor a 5 apoya la
presencia de hepatopatía de origen alcohólico. El análisis conjunto de la GGT, fosfatasa
alcalina, transaminasas y bilirrubinas, ayuda al diagnóstico diferencial de las enfermedades
hepáticas primarias y secundarias, formando parte del hepatograma.
Fosfatasa Alcalina (ALP)
Nombre sistemático fosfato-monoéster fosfohidrolasa (EC 3.1.3.1).

Estabilidad
ALP en suero es estable solamente 6 h, por lo que, si la determinación no puede llevarse a
cabo dentro de ese tiempo, deberá congelarse máximo un mes, aunque existe pérdida de la
actividad enzimática menor de un 10%.
77
Fundamento
La ALP hidroliza (en medio alcalino) al p-nitrofenil fosfato que es incoloro, liberando fosfato
inorgánico y p-nitrofenol (residuo orgánico) cuya longitud de absorbancia máxima es 405 nm.
ALP
p-nitrofenilfosfato p-nitrofenol + fosfato
La velocidad de la producción del p-nitrofenol está relacionada con la actividad enzimática.
Técnica
− Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda de 405 nm.

− Ajustar a cero de absorbancia.
− Rotular un tubo de ensaye con el número de equipo y las siglas de la enzima.
− Realizar la determinación de acuerdo con las indicaciones del manual de uso del
reactivo (inserto).
ALP
Suero
Reactivo
Repetir lecturas cada min durante: _______
minutos

Temperatura: _________________
Factor: ______________________
Limite de detección: _____________________
Linealidad: _____________________________
Cálculos
Actividad de ALP = ∆Absorbancia/min (Factor) = U/L
25° C 30° C 37° C
Niños (1 a 14 años, hasta, U/L) < 400 < 480 <645
Adultos (U/L) 60 – 170 73 – 207 98 – 279
La ALP ósea, alcanza su mayor actividad en los niños en crecimiento (llegando a triplicar los
niveles del adulto) debido a que esta isoenzima se localiza en los osteoblastos (relacionados
con la calcificación y formación de estructuras óseas). También es fisiológico el aumento que
78
se produce al final del último trimestre del embarazo, a expensas de la isoenzima placentaria
que en este periodo alcanza niveles máximos (aproximadamente el doble de los valores de
referencia).
Las patologías que afectan la actividad sérica de la ALP son: carcinomas metastásicos en
hígado y hueso, colestasis biliar, fenómenos osteoblásticos, trastornos de malabsorción
acompañados de lesiones ulcerosas que por deficiencia de vitamina D se produce
osteomalacia con el consecuente aumento de la ALP ósea, e incluso en lesiones en vías de
reparación tales como IAM, infarto pulmonar o renal.
La 5’-nucleotidasa ayuda a identificar el origen del aumento inespecífico de la fosfatasa
alcalina (hepático, intestinal u óseo), pues a diferencia de la ALP, no está comprometida en
el metabolismo óseo ni en la mucosa intestinal; por lo que, en enfermedades del sistema
hepatobiliar, la actividad de la 5’-nucleotidasa aumenta paralelamente a la ALP y en
procesos óseos solamente aumenta la ALP manteniéndose sin cambio la 5’-nucleotidasa.
La lesión hepatocelular/colestásica mixta se asocia al aumento de ALT y ALP mayor al doble
del límite superior de referencia, y una relación ALT/ALP entre 2 y 5.
− Agujas se depositan en el contenedor para punzocortantes RPBI. R1.

− Algodones empapados en sangre deben depositarse en la bolsa roja. R2.
− Algodones manchados ligeramente de sangre, guantes de látex y las toallas de papel
se depositan en la bolsa de basura municipal. R3.
− Tubos con coágulos de sangre y muestras biológicas deben depositarse en el
recipiente con cloro que dispondrá el laboratorista para tal fin. R4.
7.7 RESULTADOS
Cálculos
79
Tabla de resultados
AST
ALT
Índice de De Ritis
ALP
GGT
7.8 ORIENTACIÓN PARA LA ELABORACION DEL REPORTE
− Al terminar la sesión experimental, cada integrante del equipo deberá tener anotados
los cálculos realizados con su respectivo resultado y llenar la tabla correspondiente.
− Deberán analizar los resultados y escribir su discusión en equipo. Considerar la
función de las enzimas, el valor obtenido, los datos del paciente (si están disponibles)
y correlacionar con el estado de salud. Tener en cuenta también la experiencia en la
sesión experimental, el estado de los reactivos, los tiempos de lectura, la calibración
de los equipos, etc.
− Obtener sus conclusiones considerando los objetivos planteados y emitir
recomendaciones si lo considera pertinente.
7.9 BIBLIOGRAFÍA
- Botros,M., Sikaris, K. (2013) The De Ritis Ratio: the test of time. Clin Biochem Rev
34:117 - 130
- Gaw, A., Murphy, M., Srisvatava., R. (2014) Bioquímica clínica. España. Elsevier.
- Marshall, W., Bangert, S., Lapsley, M. (2013) Bioquímica clínica. Ed 7ª. Elsevier,
España
80
- Pagana, K., Pagana, T. (2015) Laboratorio clínico, indicaciones e interpretación de
resultdos, El Manual Moderno, México.
- Tortora G.J., Derrickson B. (2013). Principios de Anatomía y Fisiología. Ed 13ª
Médica Panamericana. Méxic
81
PRÁCTICA No. 8
“EVALUACIÓN DEL METABOLISMO Y EXCRECIÓN HEPÁTICA”
G. Leticia Arellano Martínez

8.1 INTRODUCCION
La mayoría de las sustancias que se incorporan a nuestro organismo son transportadas al
hígado, donde sufren modificaciones bioquímicas para su utilización, distribución o
almacenamiento; de la misma forma un número importante de sustancias producto del
metabolismo celular, son procesadas en el hígado para su reutilización o eliminación. Se
estima que el hígado lleva a cabo más de 500 actividades diferentes entre las que se
encuentran:
- Metabolismo de hidratos de carbono, lípidos, aminoácidos y proteínas.
- Almacenamiento de glucógeno, lípidos, aminoácidos, proteínas, hierro, cobre y
vitaminas.
- Biotransformación de alcohol, fármacos, bilirrubina y hormonas.
- Formación y excreción de ácidos biliares.
- Producción de factores de coagulación.
- Fagocitosis (células de Kupffer), secreción de IgA y producción de factores del
complemento, además de formar parte del sistema fagocítico mononuclear.(Kaplan 2003,
Henry 2001, Tortora2010)
Dada la complejidad de funciones que lleva a cabo, existen varias determinaciones que
pueden realizarse para evaluar daño hepático, sin embargo son pocas las que se utilizan,
dado su costo, accesibilidad y especificidad diagnóstica. Entre las pruebas que componen
los perfiles hepáticos se encuentran:
- Pruebas basadas en el estudio de las funciones de metabolismo y excreción:
bilirrubinas séricas y ácidos biliares.
- Pruebas basadas en el metabolismo de las proteínas: proteínas séricas totales y
albúmina.
- Pruebas basadas en el metabolismo de grasas: colesterol total y triacilglicéridos.(Kaplan
2003, Henry 2001)
En la presente práctica se realizarán todas las determinaciones antes mencionadas.
Aproximadamente el 80% de la bilirrubina es producida por el catabolismo de la
hemoglobina, el 20% restante proviene de otras fuentes que también contienen grupos heme
como la mioglobina y los citocromos. El rompimiento del grupo heme produce bilirrubina no
conjugada que es transportada por la albúmina hasta el hepatocito, donde la enzima
glucuroniltransferasa la transforma en bilirrubina conjugada que se excreta por las vías
biliares hacia intestino. Las proteínas son compuestos orgánicos ampliamente distribuidos en
el organismo, son esenciales para la vida y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas,
anticuerpos, factores de coagulación etc. La proteína más abundante en plasma es la
albúmina cuya función principal es el transporte de ácidos grasos, hormonas esteroideas,
bilirrubina, catecolaminas, drogas y antibióticos, que en forma libre son insolubles en medio
acuoso. Mantiene también la presión oncótica y sirve de almacén de proteínas estructurales
usadas en el crecimiento.
82
El colesterol es un componente estructural de la membrana celular y las lipoproteínas
plasmáticas, es precursor de glucocorticoides, hormonas sexuales y ácidos biliares. Se
absorbe de los alimentos, es metabolizado y sintetizado en hígado, y secretado por la bilis
junto con los ácidos biliares. La determinación de los ácidos biliares en suero ha sido
considerada como un índice de gran importancia en la evaluación de la función hepatobiliar.
Los triacilglicéridos constituyen la principal forma de almacenamiento de lípidos y
comprenden el 95% del tejido graso. Los triacilglicéridos séricos están dispuestos en varios
agregados o complejos lipídicos, fundamentalmente quilomicrones, cuya función principal es
el transporte celular de los triglicéridos de los alimentos.(Kaplan 2003, Henry 2001)
8.2 OBJETIVO
Conocer y seleccionar la muestra biológica útil para realizar un perfil hepático, aplicando el
conocimiento de los fundamentos y técnicas de forma correcta, para obtener resultados
confiables, cuya interpretación permita diagnosticar una alteración metabólica y/o excretora
en el hígado.
A. Realizar un esquema para describir el mecanismo de formación de las bilirrubinas

directa e indirecta.
B. Describir los tipos de ictericia que existen y señalando las alteraciones que se
presentan en las pruebas de laboratorio que permiten identificarlas.
C. Realizar una lista con los nombres de los ácidos biliares primarios y secundarios,
indicar en donde se forma cada uno, señalar con marcatextos cuáles de ellos se
cuantifican en suero y explicar su utilidad diagnóstica.
D. Investigar las técnicas de cada prueba de acuerdo al fundamento y marca del
reactivo, ésta última será proporcionada por los profesores del grupo.
E. Con la información anterior llenar todas las tablas que aparecen en el manual de
prácticas.
F. Realizar en el cuaderno de trabajo el diagrama de flujo (ver apéndice A) con todas las
1 Gradilla 1 Propipeta
13 Tubo de ensaye 12x75 mm 1 Pipeta graduada de 1 ml (1/100)
1 Pipeta Pasteur con bulbo 3 Puntas amarilla para micropipeta
1 Adaptador para tubo al vacío 1 Cronómetro

3 Torundas 1 Tubo al vacío de tapón rojo o dorado
2 Cuadros de gasa de 10x10 cm 1 Aplicador de madera
1 Aguja para tubo al vacío 21G x 32mm (verde) 20 Cuadros de papel parafilm para tubos 12x75mm
83
Material por grupo
2 Espectrofotómetro UV-Visible 1 Baño de incubación a 37º C
4 Vaso de precipitado de 250 mL 1 Termómetro
3 Micropipetas de 5 a 40 uL 1 Recipiente para desechos (RPBI)
3 Micropipetas de 40 a 200 uL 6 Contenedor para punzocortantes
3 Micropipetas de 200 a 1000 uL 4 Pipeta graduada de 1 mL
1 Centrífuga 4 Pipeta graduada de 2 mL
4 Pisetas con agua destilada 3 Pipeta graduada de 5 mL
Reactivos por grupo
100 mL Etanol al 70 % Kit para determinación de:

100 mL SSF - Bilirrubinas (Total y Directa)
1250 mL Agua destilada - Proteínas totales
Hipoclorito de sodio - Albúmina
- Colesterol
- Triacilglicéridos
- Ácidos biliares

- El paciente debe tener un ayuno mínimo de 10 a 12 hrs. La muestra debe obtenerse
por venopunción con un tubo al vacío de tapón rojo, cuya capacidad sea de 4 a 7 mL,
siguiendo las normas para una toma de muestra de calidad analítica, para evitar
hemólisis.
- El suero debe separarse por centrifugación antes de una hora después de realizada
la toma de muestra y protegerse de la luz. Cubriendo el tubo que contiene el suero
con papel aluminio.
Bilirrubinas (método de Van den Bergh)
Estabilidad
La bilirrubina es estable hasta 48 h en refrigeración cuando se protege de la luz.
Fundamento
El ácido sulfanílico con nitrito de sodio forma ácido sulfanílico diazotado (reactivo diazo). La
bilirrubina conjugada, muy polar, reacciona directamente con el reactivo diazo produciendo
un color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide a 530 nm. Sin embargo, la bilirrubina-
albúmina conocida como no conjugada o indirecta, requiere la presencia de un acelerador
(benzoato de cafeína, metanol o Dimetilsulfóxido = DMSO) para hacer posible la reacción
con el reactivo diazo, determinándose entonces, la bilirrubina total (conjugada y no
conjugada).
Técnica
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar longitud de onda: _______ nm.
- Rotular 3 tubos de ensaye con el número de equipo y las siglas B (Blanco), BD
(bilirrubina Directa), BT (Bilirrubina Total) respectivamente.
84
reactivo (inserto).
REACTIVOS Bco BD BD Bco BT BT
Ácido Sulfanílico
Acelerador: __________________
Diazorreactivo
Suero o Calibrador
- Mezclar en vortex y activar cronómetro. Leer Abs de Bco BD = __________
- A los 5 minutos exactos:
- Leer Abs de BD = _______________ . Después:
- Leer Abs de Bco BT = _____________
- Leer Abs de BT = _______________
Temperatura: _________________
Límite de detección: ___________________________
Límite linealidad: ________________________________
Cálculos
Con calibrador: Abs Muestra – Abs Bco Muestra

X Conc. del calibrador
Abs Calibrador- Abs Bco Calibrador
Con Factor: Conc. del calibrador

Abs Muestra – Abs Bco Muestra X Factor Factor =
Abs Calibrador- Abs Bco Calibrador
Bilirrubina total: Hasta 1.10 mg/dL
Bilirrubina directa: Hasta 0.25 mg/dL
Bilirrubina indirecta: Hasta 0.75 mg/dL
Los trastornos hepáticos se dividen en dos grupos, los que cursan con síndrome ictérico y
los que no lo presentan. Considerando los aspectos anatómicos y etiológicos las ictericias se
dividen en:
Prehepática: el incremento de bilirrubina proviene de un aumento en la destrucción de
eritrocitos (anemias hemolíticas, hemólisis por transfusión, resorción de hematomas
celulares de gran tamaño). La elevación es de la bilirrubina no conjugada o indirecta. Aunado
a esta elevación se produce un incremento en la eliminación de la bilirrubina directa hacia el
intestino y por lo tanto una elevación de los niveles urinarios de urobilinógeno.
Intrahepática: causadas por agentes virales (hepatitis infecciosa, mononucleosis infecciosa),
agentes tóxicos, medicamentos, parasitosis, entre otros. En estos casos la mayor parte es de
bilirrubina conjugada o directa, los niveles alcanzados dependen del grado de obstrucción de
los canalículos biliares que al impedirse su eliminación se desborda hacia circulación, de
donde se elimina por vía renal y por tanto se incrementa el urobilinógeno urinario.
85
Posthepática: la obstrucción se presenta en los canalículos biliares principales, la gravedad
de la ictericia depende del grado de obstrucción. Las causas más frecuentes son cálculos
biliares, tumoraciones en los conductos biliares, compresión externa por tumoraciones de
otros órganos; cualquiera que sea el motivo se produce un incremento de la bilirrubina
directa en suero, provocando el paso de la misma a la circulación y su posterior eliminación
por vía renal. A diferencia de la ictericia intrahepática, existe decremento en la eliminación de
urobilinógeno, ya que al no pasar bilirrubina al intestino su producción y absorción en
intestino grueso es casi nula.
Proteínas totales (Método de Biuret)

Estabilidad
En suero refrigerado son estables por 3 días o una semana en congelación.
Fundamento
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico en medio alcalino, para
dar un complejo violeta con un máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es
proporcional a la concentración de las proteínas totales en la muestra.
Técnica
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar longitud de onda: _______ nm.

- Rotular 3 tubos de ensaye con el número de equipo y las siglas B, P, M
respectivamente.
reactivo (inserto).
Blanco (B) Patrón (Pt) Muestra (M)
Reactivo
Agua destilada
Solución Patrón
Suero
Mezclar e incubar ____________________________
Leer la absorbancia de la muestra y el patrón, contra el blanco.
Temperatura: _________________
Concentración de la solución patrón: ______________________
Límite de linealidad: _____________________________
Cálculos
Abs Muestra
0Proteínas totales: = x 0Patrón: = 0g/dL:
Abs Patrón
86
6.4–8.3 g/dL
En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones prolongadas,
etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en mieloma múltiple, endocarditis
bacteriana y hemoconcentraciones de diversos orígenes, se observan hiperproteinemias.
Albúmina (Método del Verde de Bromocresol)

Estabilidad
En suero refrigerado son estables por 3 días o una semana en congelación.
Fundamento
La albúmina se une específicamente por puentes de hidrógeno con la forma aniónica de la
bromo cresolsulfonftaleína (BCF), en presencia de un exceso de colorante a pH 3.8,
complejos coloridos cuya intensidad es proporcional a la concentración de la albúmina en
este medio.
Técnica
− Encender el espectrofotómetro y seleccionar longitud de onda: _______ nm.
− Ajustar a cero de absorbancia.
− Rotular 3 tubos de ensaye con el número de equipo y las siglas B, P, M
respectivamente.
− Realizar la determinación de acuerdo a las indicaciones del manual de uso del
reactivo (inserto).
Blanco (B) Patrón (P) Muestra (M)

Reactivo
Agua destilada
Solución Patrón
Suero

Temperatura: _________________
Linealidad: _____________________________
Cálculos
Abs Muestra
Albúmina = x 0Patrón: = g/dL
Abs Patrón
87
3.5–5.0 g/dL
Significado Clínico
La hiperalbuminemia tiene poco significado clínico, excepto en los casos de deshidratación
que produce el consecuente aumento en el contenido proteico del plasma. La
hipoalbuminemia, se presenta en casos como síndrome nefrótico, desnutrición, infecciones,
enfermedades graves del hígado, etc.
Relación Albúmina/Globulinas (A/G)

Fundamento
La relación A/G se define como el cociente de la albúmina entre las globulinas. Con las
determinaciones anteriores es posible determinar la cantidad de globulinas, considerando
que la suma de estas con la albúmina es igual a las proteínas totales.
Técnica
- Obtener la concentración de globulinas despejándolas de la siguiente fórmula
Conc Proteínas totales = Conc Albúmina + Conc Globulinas
- Sustituir los valores obtenidos en la siguiente fórmula
Concentración de Albúmina
= Relación A/G
Concentración de Globulinas
1.2 a 2.2
Antes del auge de las técnicas electroforéticas para el estudio de las proteínas, la relación
A/G fue el mejor indicador disponible para apreciar la relación entre los componentes de las
proteínas séricas. En varios estados patológicos hay una relación constante entre el
aumento de las globulinas y la reducción de la concentración de albúmina, por ejemplo,
cirrosis, nefrosis, infecciones agudas, neumonía y fiebre reumática. De manera general, la
relación A/G disminuye en cualquier trastorno que reduzca la fracción de albúmina de las
proteínas totales; por el contrario, aumenta cuando la patología provoca la disminución de
las globulinas.
Colesterol (Método enzimático colorimétrico CHOD-POD)

Estabilidad
El colesterol es estable en suero o plasma con EDTA o heparina, sin hemólisis, por 5 días en
refrigeración (2-8º C).
Fundamento
CHE
Esteres de colesterol + H2O Colesterol + ácidos grasos
CHOD
Colesterol + O2 Colest-4-en-3-ona + H2O2
88
POD
H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol Quinonimina roja + 2H2O
CHE: Colesterol éster hidrolasa CHOD: Colesterol oxidasa POD: Peroxidasa
Técnica
− Ajustar a cero de absorbancia con blanco de reactivos.
respectivamente.
reactivo (inserto).
Blanco (B) Patrón (Pt) Muestra (M)

Reactivo Col CHOD-POD
Agua destilada
Solución Patrón
Suero
Mezclar e incubar: ____________________________
Leer la absorbancia de la muestra y el patrón.

Temperatura: _________________
Linealidad: _____________________________
Cálculos
Abs Muestra
Colesterol = x0Patrón: = mg/dL
Abs Patrón
< 200 mg/dL deseable
200–239 mg/dL limítrofe
> 240 mg/dL alto
La hipercolesterolemia, que es el incremento del colesterol en suero, puede denotar riesgo a
sufrir arteriopatía coronaria, así como hepatitis incipiente, trastorno de lípidos, bloqueo de
conductos biliares, síndrome nefrótico, ictericia obstructiva, pancreatitis e hipotiroidismo.
La hipocolesterolemia suele guardar relación con desnutrición, necrosis celular del hígado e
hipertitoidismo. Los niveles anormales de colesterol a menudo obligan a practicar otras
pruebas para detectar el problema, según el tipo de anormalidad y la presencia de signos
manifiestos.
89
Triacilglicéridos (método enzimático colorimétrico)
Estabilidad
Los triglicéridos son estables en suero o plasma con EDTA o heparina, sin hemólisis, por 3
días en refrigeración (2-8º C).
Fundamento
Lipasa
Triacilglicéridos Glicerol + Ácidos grasos
GK
Glicerol + ATP Glicerol-1-P + ADP
GPO
Glicerol-1-P + O2 Dihidroxiacetona fosfato
POD
H2O2 + 4-aminofenazona + clorofenol Quinonimina roja
GK: Glicerol cinasa GPO: Glicerol fosfato oxidasa POD:

Técnica
− Ajustar a cero de absorbancia utilizando blanco de reactivos.
respectivamente.
reactivo (inserto).

Reactivo TAG CHOD-POD
Agua destilada
Solución Patrón
Suero
Leer la absorbancia de la muestra y el patrón.

Temperatura: _________________
Límite de linealidad: _____________________________
Cálculos
Abs Muestra mg
Triacilglicéridos = x0Patrón: =
Abs Patrón d
90
< 150 mg/dL
150-199 mg/dL moderadamente alto
>200 mg/dL alto
Los niveles elevados de triglicéridos y colesterol se traducen en un alto riesgo de sufrir
arteriopatía coronaria. El incremento mínimo o moderado de triglicéridos en suero indica
obstrucción de vías biliares, diabetes, síndrome nefrótico, endocrinopatías o consumo
excesivo de bebidas alcohólicas.
Los niveles muy altos sin causa primaria identificable, reflejan hiperlipoproteinemia congénita
y obligan a estimar el fenotipo lipoproteínico, para confirmar el diagnóstico. La disminución
de los niveles séricos es rara y se observa en desnutrición o abetalipoproteinemia; en ésta
última el suero prácticamente no tiene beta lipoproteínas y triglicéridos, porque el organismo
carece de la capacidad de transportar triglicéridos preformados de las células epiteliales de
la mucosa intestinal, o del hígado.
Ácidos Biliares Totales en Suero (Método enzimático-colorimétrico)

Estabilidad
Los ácidos biliares son estables en suero, sin hemólisis, por 1 semana en refrigeración (2-8º
C) o 3 m3s3s a -20°C.
Fundamento
La determinación se basa en la siguiente reacción:
3α-HED
Ácido biliar (3α-hidroxi) + NAD Ácido biliar (3−ceto) + NADH
NADH + NBT Formazán
3α-HED: Hidroxiesteroide deshidrogenasa NBT: Nitroazul de tetrazolio
Técnica
- Encender el espectrofotómetro y seleccionar longitud de onda: _______nm.
- Rotular 3 tubos de ensaye con el número de equipo y las siglas B, P, M
respectivamente.
reactivo (inserto).
91
Reactivo
Agua destilada
Solución Patrón
Suero

Temperatura: _________________
Linealidad: _____________________________
Cálculos
Abs Muestra
Ácidos biliares = x0Patrón: = mg/dL
Abs Patrón
Suero en ayunas: 0–10 µmol/L
La prueba es útil para la detección de enfermedad hepatobiliar. Los niveles en ayunas
aumentan en pacientes con hepatitis aguda y crónica, hepatitis alcohólica, esclerosis
hepática, cirrosis, ictericia poshepática y colestasis intrahepática. Niveles anormales en
pacientes en ayunas o después de ingerir una comida, pueden ser indicadores de daño
hepático anictérico, deficiencia de la función hepática, disfunción intestinal y tal vez un
bloqueo de la vesícula biliar. Este análisis puede detectar algunas formas de enfermedad
aún antes que las pruebas normales del hígado, porque los niveles de ácidos biliares
corresponden a la función hepáticae n lugar de al daño hepático.
Se han encontrado niveles de moderados a elevados en personas embarazadas, conocida
como colestasis intrahepática del embarazo (ICP), esta enfermedad no tiene consecuencias
significativas para la madre pero se asocia con distress fetal, parto prematuro y mortalidad
fetal.

- Agujas deben depositarse en el contenedor rojo para punzocortantes. R1.
- Algodones empapados en sangre deben depositarse en la bolsa roja. R2.
- Algodones manchados ligeramente de sangre, guantes de látex y las servitoallas se
depositan en la bolsa de basura municipal. R3.
- Tubos con coágulos de sangre y muestras biológicas deben depositarse en el
recipiente con cloro que dispondrá el laboratorista para tal fin. R4.
92
8.7 RESULTADOS
Cálculos
93
Tabla de resultados
Valores de Interpretación Realizado por:

Determinación Resultado
referencia
Bilirrubina Total
Bilirrubina Directa
Bilirrubina Indirecta
Proteínas totales
Albúmina
Globulinas
Relación A/G
Colesterol
Triglicéridos
Ácidos Biliares
8.8 ORIENTACIÓN PARA LA ELABORACION DEL REPORTE
− Al terminar la sesión experimental, cada integrante del equipo tendrá anotados los
cálculos realizados con su respectivo resultado, llenando la tabla correspondiente en
el Manual de Laboratorio.
− Deberán analizar los resultados y escribir su discusión en equipo. Considerar la
función de las enzimas, el valor obtenido, los datos del paciente (si están disponibles)
y correlacionar con el estado de salud. Tener en cuenta también la experiencia en la
sesión experimental, el estado de los reactivos, los tiempos de lectura, la calibración
de los equipos, etc.
− Obtener sus conclusiones considerando los objetivos planteados y emitir
recomendaciones si lo considera pertinente.
8.9 BIBLIOGRAFÍA
- Henry M.D. (2001). Clinical diagnosis and management by laboratory methods.

Philadelphia, Pennsylvania: W.B. Saunders Co.
- Kaplan L.A., Pesce A.J., KazmierczakS.C. (2003). Clinical Chemistry: theory,
analysis, correlation. St. Louis, Missouri: Mosby.
- Gaw, A., Murphy, M., Srisvatava., R. (2014) Bioquímica clínica. España. Elsevier.
- Marshall, W., Bangert, S., Lapsley, M. (2013) Bioquímica clínica. Ed 7ª. Elsevier,
España
- Pagana, K., Pagana, T. (2015) Laboratorio clínico, indicaciones e interpretación de
resultdos, El Manual Moderno, México.
- Tortora G.J., Derrickson B. (2013). Principios de Anatomía y Fisiología. Ed 13ª
Médica Panamericana. México
94
Apéndices
A. Diagramas de flujo
El diagrama de flujo es la representación gráfica de un proceso. Estos diagramas utilizan
símbolos con significados bien definidos que representan el flujo de ejecución mediante
flechas que conectan los puntos de inicio y de fin de proceso.
Objetivo
Realizar un diagrama de flujo de cada práctica del laboratorio de ABCS, con el fin de que el
estudiante revise las técnicas a realizar y tenga el conocimiento previo a la práctica para la
ejecución, así como encontrar problemas o dudas que pueda resolverla con ayuda de los
asesores.
*Identificar quién lo empleará y cómo.
Este diagrama se intercambiará entre los diferentes equipos durante la práctica por lo que
debe de ser lo más claro y detallado posible para que al alumno que use el diagrama pueda
ejecutar las pruebas sin problema.
Características
Las siguientes son características a considerar para el diseño del diagrama de flujo:
• Identificar las ideas principales a ser incluidas en el diagrama de flujo:
o Obtención de material biológico y procesamiento de muestra (Tipo de tubo a utilizar y
orden de toma, homogenizar, incubar, centrifugar, separar, rotular etc.).
o Procedimiento de pruebas destacando puntos críticos (tiempo de ejecución, tiempo
de incubación, longitud de onda, procesamiento de blanco, tiempo de lectura, valor de
referencia o esperado, mezcla, cantidad y orden de reactivos, objetivo de microscopio,
región de lectura y modo de lectura, concentración de reactivos, diluciones a realizar,
cantidad de materiales).
• Debe indicar claramente dónde inicia y dónde termina el diagrama.
• Cualquier camino del diagrama debe de llevarte siempre a la terminal de fin.
• Organizar los símbolos de tal forma que se siga visualmente el flujo de arriba hacia
abajo y de izquierda a derecha.
• Las líneas deben ser verticales u horizontales, nunca diagonales.
• No cruzar las líneas de flujo empleando los conectores adecuados, sin hacer uso
excesivo de ellos.
• No fraccionar el diagrama con el uso excesivo de conectores.
• Sólo debe llegar una sola línea de flujo a un símbolo, pero pueden llegar muchas
líneas de flujo a otras líneas.
• Las líneas de flujo deben de entrar a un símbolo por la parte superior y/o izquierda y
salir de él por la parte inferior y/o derecha.
• Evitar que el diagrama sobrepase una página; de no ser posible, enumerar y emplear
conectores correspondientes.
• Usar lógica positiva, es decir, realizar procesos cuando es verdadera la condición y
expresar las condiciones de manera clara.
• Comentar al margen únicamente cuando sea necesario.
95
B. Ejemplo de Diagrama de Flujo: Determinación cuantitativa de transaminasas TGO y TGP
Método Colorimétrico (Spinreact)
Inicio
Toma de muestra,
sistema al vacío
R2
¿Muestra No
adecuad
a?
Si
Separar suero
R4
Marcar dos tubos de ensaye uno

para TGO y otro para TGP
Colocar 0,5 ml de sustrato de

TGO o TGP según corresponda e
incubar 5 min a 37ºC
R4
Añadir 100 µl de muestra en cada Añadir 0,5 ml de revelador en

tubo mezclar e incubar 30 min a cada tubo mezclar y reposar 20
37ºC min a Tº ambiente
R4
Añadir 5 ml de NaOH 0,4 N en

cada tubo mezclar y reposar 5
min a Tº ambiente
R4
Leer la absorbancia de Ajustar el espectrofotómetro a

la muestra cero con agua destilada a 505 nm
R4
B. Estilo de la American Psychological Association para redactar la lista de referencias
de un documento
Realizar cálculos y
C. Consideraciones generales Fin
registrar
96
- Orden alfabético por la primera letra de la referencia
- Obras de un mismo autor se ordenan cronológicamente
- En caso de que la publicación cuente con Digital Object Identifier (DOI) debe
indicarse en la cita.
- Considere que si una publicación en la web no tiene autor o una institución que avale
la información, puede tratarse de una fuente poco confiable.
- La dirección electrónica de las publicaciones de la web, o Uniform Resource Locator
(URL) debe indicarse y comprobar que la liga funcione adecuadamente.
- Los autores deben indicarse conforme se citan en la obra consultada.
- Cuando un libro cuente con editores (autores que compilan y editan la versión final)
se indican conforme se citan en la obra consultada y se pone entre paréntesis (Ed).
Ejemplos para redactar la lista de referencias

Publicaciones periódicas
Apellidos, A.A., Apellidos, B.B.& Apellidos, C.C. (Año). Título del artículo. Título de la
publicación. volumen (número), pp xx-xx doi: xx.xxxxxxx
Artículo de la web
Apellidos, A.A., Apellidos, B.B.& Apellidos, C.C. (Año). Título del artículo. Título de la
publicación, volumen (número), pp xx-xx Recuperado de URL
Libros
Apellidos, A.A. (Año). Título. Ciudad: Editorial
Apellidos, A.A. (Año). Título. Recuperado de URL
Capítulo de un libro
Apellidos, A.A. (Año). Título del capítulo. En Apellidos, A.A. (Ed). Título del libro (pp xx-xx).
Ciudad: Editorial
Ejemplos para citar en el texto las referencias consultadas

- Si no se incluye el autor en la oración, se escribe entre paréntesis el apellido y la fecha:
La aminoacidura excesiva puede presentarse por un exceso de aminoácidos en sangre o
porque exista una deficiencia en la resorción tubular (Balcells, 1986).
- Si la oración incluye el apellido del autor, sólo se escribe el año de la publicación entre
paréntesis:
Balcells (1986) indica que la aminoaciduria se presenta cuando existe un exceso de
aminoácidos en sangre o cuando hay deficiencias en la resorción tubular.
Referencia
Viveros, F. (Ed). (2010). Manual de Publicaciones de la American Psychological Association.
México: Manual Moderno
97

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Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

Análisis Bioquímicos Clínicos de Sistemas

Autores: 3ª. Revisiòn realizada por:

QFB. Ma. de Lourdes Galván Ruíz Ma. de Lourdes Galván Ruiz

ALUMNO:_____________________________________ GRUPO:_______ SEM:________

Objetivo General de la asignatura Iv

Objetivos del curso experimental Iv

Práctica No. 1 “Hemostasia Primaria” 1

Práctica No. 2 “Hemostasia Secundaria” 13

Práctica No. 3 “Uroanálisis y Función glomerular” 25

Práctica No. 4 “Función tubular” 42

Práctica No. 5 “Introducción a la enzimología clínica” 53

Práctica No. 6 “Enzimas pancreáticas y cardíacas” 58

Práctica No. 7 “Enzimas hepáticas” 72

Práctica No. 8 “Evaluación del Metabolismo y Excreción hepática” 82

El Laboratorio clínico es un departamento muy importante de ayuda para el diagnóstico y

La enseñanza experimental correspondiente a esta asignatura le permite al alumno conocer

No. de la Número y Nombre de la Unidad

OBJETIVOS DEL CURSO EXPERIMENTAL

RI. 2001; Slack SM, 1993).

1.3 ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRÁCTICA

1.4 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Material no reciclable por equipo

1 Lanceta 1 Cuadro de papel filtro (2x5 cm)

Reactivos por grupo

1.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Tiempo de sangrado (Método de Duke)

Conteo plaquetario (con hemocitómetro)

Conteo plaquetario (en frotis sanguíneo)

Tiempo de Retracción del Coágulo

Cálculo Volumen de suero

Para: PRP concentrado (conteo inicial) = 100% plaquetas en el PRP

1.6 DISPOSICION DE RESIDUOS

- Material como agujas, capilares, palillos, cubreobjetos rotos, navajas, alambre de

Prueba Rumpel Leede

1.8 ORIENTACIÓN PARA LA ELABORACIÓN DEL REPORTE

Información del paciente:

¿Para qué le solicitan la prueba?:

- CDC. (2014) Tourniquet Test. Dengue Clinical Case Management (DCCM).

A. Indicaciones para el paciente

B. Extracción de la muestra sanguínea

D. Riesgos de sangrado según niveles plaquetarios

E. Trastornos de la hemostasia primaria

2.3 ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRÁCTICA

2.4 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Material reciclable por equipo

25 Tubos de ensaye 12x75 mm 1 Tubo de ensaye 15x100 mm

Material no reciclable por equipo

1 Jeringa de 10 mL con aguja 21x32 G 4 Gasas 10x10 cm

Material por grupo

Reactivos por grupo

100 mL NaCl 0.85 % (SSF) 10 mL Reactivo para cuantificar fibrinógeno

2.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Extracción y procesamiento de la muestra biológica

Tiempo de recalcificación del PPP

Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)

Tiempo de protrombina (TP) o Tiempo de Quick

Nota: Si el paciente se maneja con terapia anticoagulante, se hace un seguimiento para

Tiempo de Trombina (TT)

Cuantificación de Fibrinógeno (Método de Clauss)

Tiempo de lisis del coágulo de euglobulinas

ALUMNO:_________________________________ GRUPO:_ SEM:______