Uso de la Pseudomona Aeruginosa Bt-lab-01 en la degradación del tensoactivo

dodecilbenceno sulfonato de sodio presente en el detergente en polvo (Ariel®).

Use of the Pseudomona Aeruginosa Bt-lab-01 in the degradation of the surfactant

dodecylbenzene sulfonate sodium present in the (Ariel®) powder detergent.

1CorreaXimena 2Parias Christian 3Rodriguez Harol

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RESUMEN

La contaminación ambiental en cuerpos de agua ha incrementado exponencialmente en

las últimas décadas, uno de los principales aportes tiene origen en las aguas residuales
domésticas, que son vertidos a los principales canales y ríos de los municipios de
nuestro país, una característica notoria de estas aguas es la alta carga de tenso activos,
los cuales corresponden al ingrediente activo y principal de los detergentes, empleados
comúnmente para las actividades de higiene y aseo doméstico. Mediante la evaluación
del crecimiento del microorganismo P. Aeruginosa BT-LAB-01 aislado en el Laboratorio
de Microbiología de la Sede Porvenir de la Universidad Distrital y la utilización de un
biorreactor, se analizó la capacidad que posee el microorganismo para degradar este
compuesto, contenido en el detergente (Ariel®). La evaluación de la degradación se
realizó mediante pruebas de sustancias activas al azul de metileno (Test de SAAM)
conforme a las indicaciones del standard methods for the examination of water and
wastewater, así mismo se realizó seguimiento al crecimiento del microorganismo por
medio de conteo en cámara de Neubauer. Aunque el microorganismo presentó
inicialmente resultados óptimos de crecimiento en la fase exponencial bajo condiciones
específicas, la fase estacionaria fue relativamente corta, con lo cual no se logró un
porcentaje de degradación del compuesto tenso activo significativa, conllevando a la
aceleración de la fase de decrecimiento de la población microbiana y deteniendo el
proceso de degradación del compuesto.

Palabras clave: Biorreactor, degradación, espectrofotometría, Pseudomona

Aeruginosa, tenso activo.

ABSTRACT

Environmental pollution in bodies of water has increased exponentially in recent decades,

one of the main contributions has its origin in domestic wastewater, which discharges to
the main natural water channels of cities and municipalities of our country, a notorious

1 1estudiante, biotecnología, ingeniería sanitaria, facultad de medio ambiente y recursos naturales, universidad distrital Francisco
José de caldas, Colombia, email ximena.co.co@gmail.com 2estudiante, biotecnología, ingeniería sanitaria, facultad de medio
ambiente y recursos naturales, universidad distrital Francisco José de caldas, Colombia, email
chpariasv@correo.udistrital.edu.co 3estudiante, biotecnología, ingeniería sanitaria, facultad de medio ambiente y recursos
naturales, universidad distrital francisco José de caldas, Colombia, email hadrodriguezv@correo.udistrital.edu.co

1
characteristic of these waters is the high load of surfactants, which correspond to the
active ingredient and principal of the detergents, commonly used for hygiene and
housekeeping activities. By evaluating the growth of the microorganism P. Aeruginosa
BT-LAB-01 isolated in the laboratory, and the use of a bioreactor, the ability of the
microorganism to degrade this compound, contained in Ariel detergent, was analyzed.
The evaluation of the degradation was carried out by means of tests of active substances
to methylene blue (Test of SAAM) according to the indications of the standard methods
for the examination of water and wastewater, likewise the Microorganism's growth was
monitored by counting in Neubauer camera. Although the microorganism initially showed
optimal growth results in the exponential phase under specific conditions, the stationary
phase was relatively Short, which did not achieve a significant degradation percentage of
the surfactant compound, leading to the acceleration of the sample phase of the
population microbial, and stopping the degradation process of the compound.

Key words. Bioreactor, degradation, spectrophotometry, Pseudomonas aeruginosa,

surfactant.

INTRODUCCIÓN

La contaminación antropogénica se incrementa aceleradamente en nuestro planeta;

hidrocarburos, pesticidas, fertilizantes, aerosoles, plásticos, pinturas, solventes, jabones,
detergentes, etc., representan algunas de las fuentes mayoritarias de contaminación del
suelo y de los cuerpos de agua, originando diversos problemas de salud como resultado
de su persistencia, toxicidad o transformación en metabolitos difíciles de degradar.
Los usos y características del microorganismo Pseudomona Aeruginosa, lo ubican como
uno de los más aptos para Biorremediación de aguas contaminadas por medio del uso
de Biorreactores. Su alta adaptabilidad y tolerancia y alto crecimiento en temperaturas
de hasta 42°C lo convierten en atractivo y viable para el desarrollo de alternativas de
control biológico en la contaminación de los cuerpos hídricos. (Guevara, 2013).
Los jabones y detergentes domésticos constituyen una importante fuente de sustancias
orgánicas e inorgánicas descargadas por sistemas de evacuación de aguas residuales
urbanas e industriales, por lo que se produce una amplia dispersión de los mismos en el
entorno acuático. La producción mundial de tensoactivos sobrepasa los 16 millones de
toneladas, de las cuales el 56% son jabones. Después de miles de años de amplio
consumo del jabón, su aceptabilidad medio-ambiental está fuera de duda tanto para
especies de la cadena trófica: microorganismos, algas, peces, etc., como para el hombre.
(Aguirre, 2013).
Los tensoactivos aniónicos se encuentran entre las muchas sustancias naturales y
sintéticas activas al azul de metileno a través de la aplicación del test de SAAM,
(Sustancias activas al azul de metileno) IDEAM (2007) es posible identificar en este caso
sí ocurrió o no degradación del compuesto dodecilbenceno sulfonato de sodio,
componente activo del detergente (Ariel®), el cual fue agregado de manera controlada
al reactor que contenía el microorganismo aislado y estudiado P. Aeruginosa BT-LAB-
01.

2
El método es aplicable para la determinación de tensoactivos aniónicos en aguas
superficiales y en aguas residuales, pero debe tenerse en cuenta la posible presencia de
otro tipo de sustancias activas al azul de metileno. (Cárdenas, 2005).

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento y ensayos de crecimiento Commented [1]: agar selectivo?

Para el desarrollo del proyecto se utilizó como medio de cultivo agar cetrimide selectivo
para el crecimiento de Pseudomona Aeruginosa, que permite aislar el organismo. (Das,
2011).
Para las pruebas de crecimiento se utilizó un medio de sales mínimas variando las
características del cultivo como la concentración de detergente, pH y la temperatura
escogiendo las características óptimas con el fin de obtener una mayor eficiencia en el
proceso de degradado del dodecilbenceno sulfonato de sodio. (Aguirre, 2013)
El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a las
irregularidades en la distribución de la muestra. Además pueden confundirse las células
con otras formas orgánicas e inorgánicas existentes en el medio y no permite distinguir
células vivas de células muertas. (Arnaiz, 2000)

Preparación de pre cultivo y siembra en biorreactores

Para el aislamiento de la Pseudomona Aeruginosa en los biorreactores se empleó un pre
cultivo con el organismo en fase logarítmica en un medio de 50 ml de sales mínimas
(K2HPO4 1%, MgSO4.7H2O 2%, KCl 0.5%, FeSO4.7H2O, y agua destilada) con 375
ppm de detergente ajustando el medio a un pH 7.0. y con una temperatura constante de
35 °C obteniendo concentración de células en 48 horas de 3,2x10 9 para la
homogeneización de mezcla se utilizó el vortex y posteriormente se realizó la siembra en
uno de los biorreactores.
Las especificaciones de los dos biorreactores están dadas en un medio igual al pre
cultivo con agitación circular por medio de giro de aspas a 150 rpm constantes, con
aireación controlada de aire (ducto de ventilación con filtro) y temperatura constante en
el medio externo de 35°C manejando un volumen de 1 L en cada biorreactor y utilizando
uno de ellos como control sin organismo.

Pruebas de crecimiento en detergente utilizando conteo

Para la evaluación del crecimiento de la Pseudomona Aeruginosa, en el biorreactor se
empleó el método de conteo en cámara de Neubauer extrayendo 100 µl de muestra del
biorreactor.

Identificación de dodecilbenceno sulfonato de sodio con test de SAAM.

Se desarrolló la prueba de SAAM (Sustancias Activas al Azul de Metileno) para conocer
la concentración del tensoactivo dodecilbenceno sulfonato de sodio en el cultivo por
medio de espectrofotometría para tal proceso se llevó acabo utilizando un solución patrón
de tetrapropilbencensulfanato (TPBS) de sodio al 5 % p/v y realizando una solución A
con 10 ml de la solución patrón y adicionando 0.5 litros de agua des ionizada, se realizó
una tercera solución utilizando 25 ml de la solución A y adicionado 0.5 litros de agua

3
bidestilada está solución es elaborada para medir la curva de calibración utilizando
valores de 2.0 a 20.0 mg/l de (TPBS).
Se inició con la muestra de 100 ml adicionando NaOH 1N e indicador de fenolftaleína y
se eliminó la coloración con H2SO4 1,0N, acto seguido se adiciono 10 ml de cloroformo
y 25 ml de azul de metileno, mezclando 60s aproximadamente, dejando reposar para
realizar la extracción del cloroformo y se repitió dos veces más esta operación; a
continuación se mezcló y se adiciono 50 ml de solución de lavado, agitando por 30s y
dejando reposar realizando el filtrado con papel filtro; ya teniendo listo esto se tomó una
muestra, se realizó el procedimiento para establecer la curva de referencia acto seguido
se procedió a medir las absorbancias y patrones a 652nm. (Cárdenas, 2005)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Es importante garantizar una fiabilidad en los resultados, ya que esto permitirá realizar
de manera certera predicciones al correlacionar los datos. Uno de los procedimientos
más importantes fue la construcción de la curva de calibración del espectrofotómetro a
través de los patrones mencionados para la prueba de SAAM.
Tras realizar la primera medición en la concentración del tensoactivo, por el ya
mencionado test de SAAM se obtiene que a pesar que la preparación del medio fue
realizada con 375 ppm de detergente, el resultado analizado por medio de los datos
obtenidos en el espectrofotómetro expresan una concentración inicial real de 148 mg/L,
de tensoactivo, esto bien puede darse por la compleja composición del detergente ya
que en este caso el dodecilbenceno sulfonato de sodio no corresponde al 100% de la
composición del detergente.
A continuación, se presenta la tabla No. 1 en la cual se da una identificación a las
muestras tanto del biorreactor que contiene al microorganismo P. Aeruginosa como del
control, el cual contiene el medio de cultivo de sales mínimas y el detergente en su
concentración de 375 ppm.
En esta tabla se entrega información sobre las fechas, horas e identificación asignada a
cada muestra.

Tabla No. 1- Identificación de Muestras

Fuente: Autores.

En el recuadro derecho se encuentra la relación de muestras correspondientes al

biorreactor con el cultivo activo de P. Aeruginosa BT-LAB-01.
Cada una de estas muestras fue sometida al Test de SAAM, donde a partir de la curva
de calibración 𝛌, es posible calcular la concentración para cada una de las muestras,
partiendo de la lectura de la absorbancia reportada por el espectrofotómetro.
En la gráfica No.1 se presentan los resultados obtenido al realizar la curva de calibración.
Generada bajo las concentraciones de 0, 2, 5, 10, 15, 20 y 60 mg/L de tensoactivo.

4
Grafica No. 1 Curva de Calibración del Espectrofotómetro.

Fuente: Autores.

El resultado obtenido como valor para el coeficiente de determinación R 2 es de 0,97,

cercano a 1, sin embargo, el valor esperado debe encontrarse al margen del 0,99, con
lo cual los datos de linealidad en la curva de calibración no son perfectos, lo que puede
afectar directamente la estimación de las concentraciones a interpolar conforme a las
lecturas para cada muestra.
Es importante mencionar que para la valoración en el crecimiento del microorganismo el
método empleado fue el conteo por medio de cámara de Neubauer, en la tabla No. 2, y
Gráfico No. 2 se presenta la curva de crecimiento y decrecimiento para el
microorganismo empleado en la determinación de la degradación del tensoactivo.

Tabla No. 2 Crecimiento celular en relación al Tiempo.

Fuente: Autores.

Gráfica No. 2 Crecimiento celular expresado en células/ml en relación al tiempo

Fuente: Autores.
La curva de crecimiento se realizó con el fin de conocer el momento en el cual los
microorganismos alcanzan su fase máxima de multiplicación (Meyer et al. 1985)
Se puede observar que el organismo entró en una fase logarítmica en el primer día en
contacto con el medio aumentado la concentración de células en el biorreactor esto
indica que la P. Aeruginosa utiliza procesos metabólicos para la degradación del
tensoactivo sin embargo esta fase solo se mantiene 24 horas y el organismo entra en
una fase estacionaria aproximadamente por dos días indicando que el medio puede

5
presentar un agotamiento de nutrientes o una acumulación de productos tóxicos
evidenciando el comportamiento de un cultivo discontinuo de lote o Batch donde el
sustrato es el limitante. Cabe mencionar que las condiciones en el biorreactor en cuanto
a temperatura fueron controladas, sin embargo, el pH no se controló, sin embargo, se
realizó un monitoreo donde el valor oscila entre 7 y 7.5, sin embargo, en el biorreactor
no se adiciona ninguna fuente de carbono alternativa, razón por la cual se pudo presentar
el decrecimiento del celular. (Fortunato, 1998).
No se presentaron variaciones significativas de pH y temperatura durante los mismos
días
evaluados, aunque se observó que a medida que pasaba el tiempo el medio se alcaliniza,
indicando la actividad de las bacterias al utilizar el sustrato graso y degradarlo a ácidos
grasos, liberando C02 y agua. El C02 alcaliniza el medio, por lo cual el pH aumenta
(Barrera 1994).
La concentración de células en el tercer día empieza a descender evidenciando que el
organismo entra en una fase de decadencia e indicando que el organismo agotó el
sustrato o que el ambiente es demasiado agresivo para mantener la eficiencia en la
degradación del dodecilbenceno sulfonato de sodio.

Gráfica No. 3 Concentración de tensoactivo Vs. Crecimiento del Microorganismo.

Fuente: Autores.

Teniendo en cuenta la relación entre la gráfica de crecimiento y la concentración de

dodecilbenceno sulfonato de sodio se evidencia la efectividad y eficiencia del organismo
en la degradación del sustrato en el primer día reduciendo la concentración del
tensoactivo presente en el medio a un 40.02% al presentar el sustrato como limitante el
organismo entra a la fase estacionaria por la reducción de nutrientes a causa del
crecimiento poblacional del organismo ya que en este periodo de tiempo la P. Aeruginosa
aumentó un 84.37% la presencia en el medio.

Cinética de Crecimiento del Microorganismo.

Basados en la ecuación de Crecimiento Exponencial, y teniendo en cuenta que el
bioreactor diseñado es tipo batch, se presentan como resultados los valores del, numero
de generaciones (n), crecimiento microbiano 2n, tiempo de generación (T), y la velocidad
especifica de crecimiento (µ) y el valor de la biomasa o Numero de celular al final de esta
fase (X). Este análisis se realiza únicamente para la fase de crecimiento exponencial o
Fase log, la cual se da entre el día 1 y 2.

6
 Variable Valor
n 0,887613716
T 27,03878903
µ 0,025635289
X 592036293,9

Teniendo en cuenta el comportamiento poblacional de la P. Aeruginosa se puede

evidenciar que este organismo presenta una lenta velocidad de crecimiento ya que le
toma un día entero obtener una generación nueva de microrganismos y doblar la
población inicial, además de esto cuando el organismo duplica su población llega al límite
de sustrato que suministra el biorreactor generando un problema de muerte celular, lo
que implica una nueva siembra de organismos en un nuevo medio, se descartó que la
muerte se presentara por condiciones ambientales debido a que se controlaban estos
factores. Para impedir que esto suceda se pude cambiar el tipo de biorreactor por uno
de tipo continuo o quimiostato que solucionaría el limitante del sustrato y la muerte de
todos los organismos.
Por otra parte, se analiza en este caso teniendo en cuenta la totalidad del tiempo
transcurrido en el ensayo el rendimiento del sustrato. Esto teniendo en cuenta
únicamente el sustrato inicial y el sustrato Final.

Variable Valor
Y x/s 3064098,231

Debido a que el rendimiento se define como la relación entre el producto obtenido y el

sustrato consumido podemos relacionar esto con los datos arrojados por el tes de SAM,
donde observamos que la reducción del tenso activo aumenta la producción de biomasa
e indicando que el sustrato que controla en la velocidad de producción de biomasa es el
dodecilbenceno sulfonato de sodio

Tabla No. 3. Resultados Absorbancia

Fuente: Autores.

Dentro de los resultados más notorios se presenta el porcentaje de degradación del

componente activo del detergente empleado en el medio de cultivo y en el biorreactor.
Estas apreciaciones se ven correlacionadas desde el inicio del estudio, donde al realizar
los análisis de crecimiento y adaptabilidad a diferentes concentraciones de se identificó
que la concentración que presentó mejor comportamiento en crecimiento celular fue a
375 mg/l y a 35°C, en donde al alterar estas condiciones por detrimento del sustrato en

7
 este caso la fuente de carbono empleada por P.Aeruginosa, su crecimiento y desarrollo
se afecta directamente.

CONCLUSIONES

● Se concluyó que a pesar de generarse una metodología para determinación de la

eficiencia de degradación del tensoactivo dodecilbenceno sulfonato de sodio, por parte
de P. aeruginosa así como una metodología para la cinética de crecimiento del
microorganismo, la variabilidad del tiempo en las mediciones así como de otros
componentes, pueden afectar los resultados, con lo que se recomienda una revisión en
cuanto a parámetros óptimos de crecimiento, preparación de cultivos, tiempos mínimos
de medición y determinación de la absorbancia del tensoactivo dodecilbenceno sulfonato
de sodio.

● Aunque el porcentaje de degradación del tensoactivo es alto, teniendo en cuenta que la

fuente de carbono fue un factor limitante para el microorganismo, si se desea emplear
en usos industriales o a gran escala, o simplemente estimar dicha evaluación de
degradación en un periodo de tiempo más extenso, se deben vincular a medios o fuentes
de carbono alternas, que eviten que el microorganismo entre en fase estacionaria y de
muerte en tan corto periodo de tiempo, una alternativa viable puede ser el suministro de
peptona, que permitirá el sostenimiento del microorganismo sin afectar la medición en la
degradación del tensoactivo.

● Este microorganismo presenta un umbral muy estricto para su crecimiento en este caso
particular, por lo cual es importante garantizar y monitorear continuamente el suministro
de las fuentes de carbono, pH y temperatura. de manera complementaria no es posible
identificar si los componentes adicionales al dodecilbenceno sulfonato de Sodio,
presentes en el detergente influyen sobre el crecimiento y comportamiento del
microorganismo.

● El biorreactor no puede ser diseñado por aireación con burbuja, debido que una de las
características principales el tensoactivo aniónicos es la producción de espuma, al entrar
este compuesto en contacto con el aire proveniente del biorreactor, se generará una
capa espesa de espuma que impedirá el crecimiento óptimo del microorganismo y el
control de la cantidad de espuma generada.

REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

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8
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SAAM; Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales (IDEAM), Ministerio
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