PRÁCTICA No.

8: MICROBIOLOGÍA DE AGUAS
PARTE 1.
ANALISIS DE AGUA POTABLE: METODO ESTÁNDAR DETERMINACIÓN DE BACTERIAS
COLIFORMES TOTALES POR EL MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA

1. INTRODUCCIÓN
Las bacterias pertenecientes al grupo coliforme, y más específicamente la especie
Escherichia coli, habitante normal del intestino del hombre y otros mamíferos, son
utilizadas como indicadores de contaminación fecal. En el Decreto número 475 del
Ministerio de Salud de 1994, por el cual se expiden las normas técnicas de calidad
del agua potable estan definidas de la siguiente manera:

ESCHERICHIA COLI, (E-coli): Bacilo aerobio gram-negativo que no produce esporas,

pertenece a la familia de los enterobacteriaceas y se caracteriza por poseer las
enzimas b - Galactosidasa y b - glucoroanidasa. Se desarrolla a 44 ± 0.5 ºC en
medios complejos, fermenta la lactosa liberando ácido y gas, produce indol a partir
del triptófano y no produce oxidasa.

GRUPO COLIFORME: Es el que comprende todas las bacterias Gram Negativas en

forma bacilar que fermenta la lactosa a temperatura de 35 a 37 ºC, produciendo
ácido y gas (CO2) en un plazo de 24 a 48 horas, aerobias o anaerobias facultativas,
son oxidasa negativa, no forman esporas y presentan actividad enzimática de la b
galactosidasa.

ÍNDICE COLIFORME: Es la cantidad estimada de microorganismos de grupo

coliforme presentes en cien centímetros cúbicos (100 cm 3) de agua, cuyo resultado
se expresa en términos de número más probable (NMP) por el método de los tubos
múltiples y por el número de microorganismos en el método del filtro por
membrana.

De acuerdo a lo reglamentado en el mismo decreto las normas microbiológicas para

agua potable son las siguientes:

NORMAS MICROBIOLÓGICAS

ARTICULO 24: Los métodos aceptados para análisis microbiológico del agua son los
siguientes:

PARA ESCHERICHIA COLI: Filtración por membrana y sustrato definido.

PARA COLIFORMES TOTALES: Filtración por membrana y sustrato definido.

PARAGRAFO. Método de tubos múltiples de fermentación y recuento en placa

(siembra en profundidad) se seguirá empleando hasta el año 2000; por lo tanto, a
partir de la entrada en vigencia del presente Decreto los laboratorios que no
empleen los métodos aceptados para análisis microbiológico, deberán
implementarlos y estandarizarlos; igualmente se adoptarán otras metodologías
debidamente validadas por el Instituto Nacional de Salud y aprobadas por el
Ministerio de Salud, mediante el correspondiente acto administrativo.

ARTICULO 25. El agua para consumo humano debe cumplir con los siguientes
valores admisibles desde el punto de vista microbiológico:

TECNICA FILTRACION POR SUSTRATO TUBOS MULTIPLES

UTILIZADA MEMBRANA DEFINIDO DE
MICROORGANISM FERMENTACION
OS “aceptable hasta
 INDICADORES el año 2000”
Coliformes totales 0 UFC/100 cm³ 0 <2
microorganismos/10 microorganismos/10
0 cm³ 0 cm³
Escherichia coli 0 UFC/100 cm³ 0 negativo
microorganismos/10
0 cm³

PARAGRAFO PRIMERO. Los resultados de los análisis microbiológicos se deben

reportar en las unidades de NMP/100 cm3 (número más probable), si se utiliza la
técnica del número más probable o la técnica enzimática de sustrato definido y en
UFC/100 cm3 (unidades formadoras de colonia), si se utiliza la técnica de filtración
por membrana.

PARAGRAFO SEGUNDO.- Se recomienda un valor máximo admisible de 100

Unidades Formadoras de Colonias (U.F.C.) por 100 centímetros cúbicos (cm 3), para
microorganismos mesófilos, como prueba complementaria de la calidad del agua
desde el punto de vista microbiológico.

ARTICULO 26. Ninguna muestra de agua potable debe contener E-coli en 100 cm 3 de
agua, independientemente del método de análisis utilizado.

2. OBJETIVOS
Determinar el número de coniformes presentes en una muestra de agua mediante
el método de filtración por membrana.

3. 1 MATERIALES
Muestra de agua de 100 ml mínimo.
Agar ENDO en cajas de petri de 50 mm de diámetro.
Membranas de 0,45 m de poro y 48 mm de diámetro estériles.
Pinzas.
Alcohol 90%.
Alcohol 70%.

3.2 EQUIPOS
Equipo de filtración por membrana esterilizado.
Bomba de vacío.
Incubadora.
Mechero.

4.1 PROCEDIMIENTO
1. Desinfecte el área de trabajo con alcohol 70%
2. Retire la parte superior del equipo de filtración.
3. Flameé las pinzas previamente sumergidas en alcohol 90%.
4. Tome una membrana y colóquela sobre la base filtrante del equipo.
5. Instale todo el equipo de filtración conectándolo a la bomba de vacío.
6. Vierta 100 ml de la muestra de agua.
7. Aplique el vacío hasta que todo el volumen sea filtrado.
8. Desensamble el equipo y retire la membrana con las pinzas previamente
flameadas.
9. Coloque la membrana sobre el medio de cultivo.
10. Incube a 35ºC por 24 horas.
11. Realice el conteo de colonias típicas (colonias rojas con brillo metálico).
12. Registre el número de coliformes totales como UFC /100 ml de muestra.
PARTE 2.
ANALISIS DE AGUA POTABLE: METODO ESTÁNDAR DETERMINACIÓN DE COLIFORMES
FECALES POR EL MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA

4.2 PROCEDIMIENTO
Seguir el mismo procedimiento explicado para coliformes totales pero utilizando el
medio selectivo para coliformes M-FC y la temperatura de incubación de 44,5º C,
por 24 horas, contando las colonias azules.

Composición medio M-FC. (Standard Methods)

Triptosa 10.0 g
Peptona proteosa o polipeptona No. 3 5.0 g
Extracto de levadura 3.0 g
NaCl 5.0 g
Lactosa 12,5 g
Sales biliares No. 3 1,5 g
Azul de anilina 0,1 g
Agar 15.0 g
Agua destilada 1 L

PARTE 3.
ANALISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS. TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE.
(NMP).
COLIFORMES TOTALES

1. INTRODUCCIÓN
La técnica del número más probable, también denominado el método de tubos
múltiples o de extinción de muestra por diluciones, se basa en la presencia o
ausencia de microorganismos en una serie de diluciones consecutivas de una
muestra, con la interpretación de los resultados como un estimativo de la
probabilidad del número de microorganismos en una tabla estadística. Es un
método en el cual se estima la densidad de una población sin hacer un conteo
directo de los microorganismos o sus colonias.
Esta técnica es utilizada para la determinación de coliformes totales en muestras de
agua cuando no es posible realizar el análisis por el método de filtración de
membrana o el método de sustrato definido.
El análisis de coliformes totales se basa en la capacidad de estos microorganismos
de fermentar la lactosa mediante producción de gas y mediante la formación de
colonias típicas (brillo metálico) en agar Endo.

El análisis consta de tres pruebas:

Prueba presuntiva: Inoculación de una serie (3 o 5) de tubos de fermentación en
Caldo Lactosado o Caldo Lauryl triptosa con volúmenes décimales de la muestra
(múltiplos o submúltiplos de 1ml).
Prueba confirmativa: Inoculación de Caldo Bilis Verde Brillante a partir de los
tubos positivos (presencia de gas) de la prueba presuntiva.
Prueba completa: a)Siembra en agar Endo, a partir de los tubos positivos
(presencia de gas) de la prueba confirmativa. b)Siembra en agar nutritivo y en
Caldo Lactosado de las colonias típicas (brillo metálico) de agar Endo. c) Tinción de
Gram.

2. OBJETIVO
Determinar la presencia de coliformes en muestras de agua, como indicadores de la
presencia de contaminación fecal, mediante la técnica del número más probable.

3. MATERIALES Y EQUIPOS
Tubos de fermentación con Caldo Lactosado
Cajas de petri con agar Endo
Pipetas estériles
Tubos con 9 ml de solución salina estéril.
Peras pipeteadoras
Tinción de Gram
Alcohol 70%
Mecheros
Incubadora 36,5oC

4. PROCEDIMIENTO
4.1 PRUEBA PRESUNTIVA
1. Homogenize la muestra y realice dos diluciones: tome 1ml de la muestra y
adiciónelo a un tubo de 9ml de solución salina (10 -1); tome 1ml de la dilución 10-1 y
adiciónelo a otro tubo con 9ml de solución salina (10-2).
2. Inocule tres series de tubos de Caldo Lactosado de 3 o 5 tubos cada serie de
la siguiente manera: primera serie: 1ml de la muestra sin diluír; segunda serie: 1ml
de la dilución 10-1; tercera serie: 1 ml de la dilución 10-2.
3. Incube los tubos inoculados a 36,5oC por 24-48 horas.
4. La presencia de una burbuja en la campana de Durham (tubo invertido) se
considera como positivo en un período de incubación máximo de 48 horas.
5. De acuerdo al número de tubos positivos en las tres series, consultar la tabla
estadística, multiplicando por 10 el resultado para calcular el número más probable
de coliformes en 100ml de muestra.

4.2 PRUEBA CONFIRMATIVA

1. A partir de cada uno de los tubos positivos de la prueba presuntiva y previa
agitación tomar la cantidad obtenida con un asa bacteriológica y transferirla a un
tubo con caldo bilis verde brillante.
2. Incubar a 36,5oC por 24-48 horas.
3. La presencia de gas se considera positivo.

4.3 PRUEBA COMPLETA

1. Siembre en estrías en cajas con agar Endo a partir de cada tubo positivo de la
prueba confirmativa, tan pronto se presente el gas, e incube a 36,5 oC por 24-26
horas.
2. De cada caja sembrada tome 1 o 2 colonias típicas (brillo metálico) y
transfierálas a un tubo de caldo lactosado y a un tubo de agar nutritivo e incube a
36,5oC por 24-48 horas.
3. Realize la tinción de Gram a partir del tubo de agar nutritivo.
4. La prueba se considera completa si se presenta gas en el tubo de caldo lactosado
y si se confirma la presencia de bacilos no esporulados gram negativos.

TINCION DE GRAM
1. Realice un frotis y fíjelo.
2. Cubra el frotis con solución de Violeta por 1 minuto.
3. Enjuague con agua de la llave.
4. Cubra el frotis con solución de Lugol por 1 minuto.
5. Enjuague con agua de la llave.
6. Decolore con alcohol acetona por 15 segundos.
7. Cubra el frotis con solución de safranina por 15 segundos.

5. BIBLIOGRAFIA
APHA, AWWA, WEF. 1975. Standard Methods for the examination of water and waste
water. 14th edition.
APHA, AWWA, WEF. Standard Methods for the examination of water and wastewater.
1992. 18th Edition. Washington, DC.
Ministerio de Salud, 1994. Decreto Número 475 Por el cual se expiden normas
técnicas de calidad del agua potable.
Valencia, H.A. 2004. Manual de Prácticas de Microbiología Básica. Facultad de
Ciencias. Departamento de Biología. Universidad Nacional de Colombia. Primera
edición. Unibiblos. Bogotá, Colombia.