Instituto Tecnológico Superior de Irapuato

Materia: Cinética química y biológica

Docente: María del Refugio González Ponce

Práctica: Determinación de azúcares reductores

Carrera: Ingeniería Bioquímica

Sexto semestre

Grupo A

Integrantes

 García Hurtado Claudia María IS15111469

 López Ramírez Olivia. IS16111078
 Márquez González Imelda IS16110544
 Montes Arias Dennisse IS16110183
 Segoviano Quintana Paulina IS16110704

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Contenido
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 3
MARCO TEÓRICO ................................................................................................................................. 4
OBJETIVO ............................................................................................................................................. 5
MATERIALES ........................................................................................................................................ 5
REACTIVOS .......................................................................................................................................... 5
METODOLOGÍA.................................................................................................................................... 6
Esquema general de trabajo ........................................................................................................... 6
Preparación de reactivo DNS......................................................................................................... 6
CÁLCULOS ............................................................................................................................................ 7
RESULTADOS ....................................................................................................................................... 9
DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................................................................................. 10
CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 11
BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................................................... 12

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INTRODUCCIÓN
En la actualidad es muy importante contar con métodos analíticos que permitan
cuantificar componentes de las células. Entre las determinaciones más usadas en
el campo de la investigación biotecnológica, se encuentra la cuantificación de
carbohidratos. El carbohidrato más común es la glucosa, un monosacárido con
formula molecular C6H12O6. La glucosa es una hexosa y es una aldosa, esto es, el
grupo carbonilo está en el extremo de la molécula es un grupo aldehído.

La glucosa se comporta como azúcar reductor gracias a la presencia de un grupo

aldehído. El método DNS determina la presencia de grupos carbónicos libres
(C=O) de los azucares reductores. El procedimiento se basa en una reacción
redox, que ocurre en la utilización de ácido 3,5 dinitrosalicílico para provocar
la oxidación de los azucares y al mismo tiempo su propia reducción
endotérmica. Un mol de azúcar reacciona con un mol de ácido 3,5 dinitrosalicílico,
dando lugar a una reacción estequiométrica que permite conocer la cantidad
de azucares reductores presentes en la muestra (Ilustración 1).

Después de esto se continua con la determinación, haciendo lecturas de

absorbancia en el espectrofotómetro a 575 nm.

Ilustración 1 Reacción de oxidación de azúcares reductores, método DNS

La reacción es colorimétrica, el ácido 3.5 dinitrosalicílico es de color amarillo,

mientras que la aparición de ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico provoca un viraje a
pardo oscuro, cuya intensidad será proporcional a la cantidad de azucares
reductores (Díaz Jorrín. 2014).

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MARCO TEÓRICO
Azúcar reductor.

Se trata de un monosacárido o disacárido que puede ceder electrones a otras

moléculas y puede, por tanto, actuar, como agente reductor. La presencia de un
grupo cetona o aldehído libre permite la mayoría de los monosacáridos y
polisacáridos actuar como azúcares reductores. Esta propiedad permite
determinar la concentración de una disolución de azúcar midiendo la cantidad de
agente oxidante que es reducido, como ocurre en la determinación del contenido
de glucosa en muestras de sangre u orina para detectar la diabetes mellitus
(Fennema, 1982). La reactividad de los distintos azúcares está dada por la
disponibilidad de su grupo carbonilo. Se sabe que la forma abierta o extendida de
los azúcares no es muy estable, a tal punto que, por ejemplo, en la glucosa
representa sólo el 0,002 % (Lehninger, 1988). Las moléculas de azúcar consiguen
estabilizarse a través de un equilibrio entre dicha forma abierta y por lo menos dos
formas cerradas (anómeros cíclicos) en las que el grupo carbonilo ha
desaparecido. Los azúcares reductores provocan la alteración de las proteínas
mediante la reacción de glucosilación no enzimática también denominada reacción
de Maillard o glicación. Esta reacción se produce en varias etapas: las iniciales
son reversibles y se completan en tiempos relativamente cortos, mientras que las
posteriores transcurren más lentamente y son irreversibles (Fennema, 1982).

La mayoría de los disacáridos son azúcares reductores porque uno de sus

carbonos anoméricos (grupo aldehído a cetona reductor) de sus estructuras no
está formando enlace glucosídico; Una excepción es la sacarosa, que tiene dos
carbonos anoméricos formando parte del enlace que une los dos monosacáridos
(Diccionarios Oxford, 2003).

Método DNS.

El método DNS o técnica de Miller, es una técnica colorimétrica que emplea el

ácido 3 5-dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una
muestra. Determina las absorbancias por medio de un espectrofotómetro en el
rango de UV-vis. Esta técnica sirve para cuantificar los azúcares reductores
producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una
reacción enzimática (Rodríguez, 2014).

El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores, pero como se

mencionó anteriormente, la sacarosa es un disacárido no reductor, por lo que, si
se necesita tratar, es necesario someterla a hidrólisis en medio ácido para que se
libere glucosa y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS
generando un producto coloreado. La intensidad del color se puede medir con

4
métodos espectrométricos, y es proporcional a la concentración de la sacarosa de
la muestra (Rodríguez, 2014).

Dado que hay una serie de fenómenos que no permiten la aplicación de la Ley de
Beer, en la práctica se realiza siempre una calibración de la técnica de medida,
con la cual obtenemos una relación matemática entre la concentración y la
absorbancia. El proceso de la calibración se basa en medir la absorbancia de
varias disoluciones patrón (de concentración conocida), en las mismas
condiciones que se mide la absorbancia de la disolución problema, y se hace una
interpolación. (Noriega & López, 2004)

Para la calibración de la técnica, la gráfica que muestra la respuesta de un método

analítico en función de cantidades conocidas de analito, se llama curva de
calibración. (Castañeda Ovando, 2011)

OBJETIVO
Que el alumno conozca la técnica para la determinación cuantitativa de azúcares
reductores por método colorimétrico y lo aplique para conocer la concentración de
cada una de ellas en una muestra.

MATERIALES
 Tubos con tapón roscado.  Piseta.
 Gradilla.  Matraces Aforados.
 Pipeta Pasteur.  Espátula.
 Propipetas.  Vasos de precipitados.
 Pipetas graduadas de 10 ml.  Plancha de calentamiento.
 Espectrofotómetro.  Baño María.
 Micropipeta  Puntas para micropipeta.

REACTIVOS

 Ácido 2,3-dinitrosalicílico (DNS).

 Sulfito de sodio anhidro.
 NaOH al 1%.
 Fenol.
 Glucosa.

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METODOLOGÍA
Esquema general de trabajo

Se prepararon 100 mL de una solución

patrón de glucosa [1 g/L]

Se preparó una solución patrón con la

tabla (1).

Se agregó 1 mL del reactivo DNS a

cada tubo y se agitaron

Se calentaron en un baño maría en

ebullición durante 5 minutos

Posteriormente, se enfriaron en un baño

de hielo

Se les agregaron 8 mL de agua destilada

a cada tubo, y se agitaron de nuevo

Se leyó la densidad óptica de cada tubo

con un espectrofotómetro previamente
calibrado con el blanco

Preparación de reactivo DNS

Se disolvieron 0.1 g de DNS en 9 ml de una solución
de NaOH al 1 %.Y se mezcló hasta disolver

Se adicionaron 0.01 g de sulfito de sodio anhidro y

0.02 g de fenol. Y se mezcló hasta disolver

Se aforó a 10 ml con la misma solución de NaOH, y

se almacenó en un recipiente cubierto de aluminio.

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Tabla 1 Concentración de glucosa en tubos.

Tubo Volumen de solución Volumen de agua (μL) Concentración de

patrón (μL) glucosa en g/L
1 0 1000 0
2 100 900 0.100
3 200 800 0.200
4 300 700 0.300
5 400 600 0.400
6 500 500 0.500
7 600 400 0.600
8 700 300 0.700
9 800 200 0.800
10 900 100 0.900
11 1000 0 1.000

CÁLCULOS
Calculo de concentraciones de glucosa

A partir de

Despejando

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

7
Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Tubo 11

Nota: El tubo 10 fue descartado.

 Cálculos para preparación de glucosa [1g/L]:

100 mL ( ) 0.1 g de glucosa

 Cálculos para correctos para preparación de 10 mL de DNS:

DNS

10 mL( ) 0.1 g de DNS

NaOH

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10 mL ( ) 9 mL de NaOH Fenol

Na2SO3 10 mL( ) 0.02 g de Fenol

10 mL( ) 0.01 g de Na2SO3

RESULTADOS
En la siguiente imagen (Ilustración 2) se pueden observar 10 tubos con una
solución a diferentes concentraciones de glucosa, reactivo DNS y agua destilada,
comenzando por el blanco donde solo lleva DNS y agua observándose amarillo y
a partir de este el color va oscureciéndose en orden creciente a la concentración
de glucosa.

Ilustración 2. Tubos con diferentes concentraciones de glucosa en orden creciente de derecha a izquierda comenzando
con el blanco.

En la tabla 2 se muestran las diferentes concentraciones de glucosa en cada tubo

de ensayo, eliminándose el tubo 10 y la absorbancia leída respectiva para cada
tubo, estos resultados servirán para crear la curva de calibración.
Tabla 2 Resultados obtenidos de la medición de la absorbancia en tubos con glucosa a diferentes concentraciones

Tubo concentraciòn(g/mL) Absorbancia(575nm)

1 0 0
2 0.1 0.103
3 0.2 0.222
4 0.3 0.27
5 0.4 0.361
6 0.5 0.449
7 0.6 0.496
8 0.7 0.612
9 0.8 0.69
11 1 0.829

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En la gráfica 1 se muestra una curva de calibración obtenida a partir de las
concentraciones de glucosa y las lecturas de absorbancia efectuadas en el
espectrofotómetro a 575 nm, obteniéndose un coeficiente de determinación (R²)
de 0.9953 por lo que se encuentra dentro de los valores establecidos.

Concentraciòn de glucosa vs
absorbancia
0.9
0.8
y = 0.8191x + 0.0264
0.7 R² = 0.9953
Absorbancia(nm)

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
[Glucosa] (g/mL)

Gráfica 1 Concentración de glucosa (g/mL) contra absorbancia, leído a 575 nm ; obteniéndose una gráfica de forma
lineal y creciente, ya que al aumentar la concentración aumenta la absorbancia.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los azúcares reductores son aquellos que, como la glucosa, fructosa, lactosa y
maltosa presentan un carbono libre en su estructura y pueden reducir, en
determinadas condiciones, a las sales cúpricas. (Castellan, 2017) La
concentración de azucares reductores se pueden detectar mediante
espectrofotometría con técnicas colorimétricas.

Los carbohidratos son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas

temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman
lugar empezando con una deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y
la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo
mismos.

Según el método Miller, los azúcares reductores pueden reducir al ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones. Cuando el ácido 3,5-
dinitrosalicílico es reducido en presencia de calor, por los azúcares reductores que
entran en contacto con él, se desarrolla un cambio de color parecido al café (con
variaciones de amarillo hasta café), como se muestra en la ilustración 3. El cambio

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de coloración puede entonces determinarse por lecturas de densidad óptica,
leídas por espectrofotometría a una determinada longitud de onda. Se basa en la
reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa al ácido 3-amino-5-
nitrosalicílico (de color rojo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la
Absorbancia en la zona de 540-570nm, para el caso de esta práctica, se leyó a
una absorbancia de 575 nm, esto nos da por entendido que el azúcar (glucosa)
fue reducido por el DNS.

La práctica realizada en el laboratorio, permitió el reconocimiento de azúcares

reductores por el método de DNS; el azúcar utilizado fue la glucosa.

Ilustración 3. Reacción del DNS con un azúcar (Glucosa)

Con la curva obtenida se realiza una gráfica de tendencia lineal que se ajusta a los
datos, el R2 obtenido para la ecuación de la recta es de 0.9953. Teniendo en
cuenta que el R2 es mayor a 0.95 los datos no tienen mucha dispersión y por lo
tanto son aceptables, lo que indica que aparentemente la absorbancia es
directamente proporcional a la concentración del material que absorbe la luz.

De acuerdo a la comparación de datos con los obtenidos en la práctica de (Natal,

2017), la regresión de los datos es buena, por lo que los datos tienen una buena
distribución.

CONCLUSIONES
En esta práctica se logró conocer la técnica para la determinación cuantitativa de
azúcares reductores por método colorimétrico.

El DNS fue reducido al entrar en contacto con la glucosa y generó un cambio de

color dependiendo de la concentración de este azúcar. Este cambio de color se
cuantificó con ayuda de un espectrofotómetro. Con los datos de absorbancia se
realizó una curva de calibración la cual ilustró la relación entre la concentración de
glucosa y la absorbancia.

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BIBLIOGRAFÍA.
 Ávila Núñez, R., Rivas Pérez, B., & Hernández Motzezak, R. (2012).
Contenido de azúcares totales, reductores. Multiciencias, 129-135.
 Castañeda Ovando, A. (Agosto de 2011). Representaciones gráficas de las
relaciones propiedad concentración con fines cuantitativos. Obtenido de
Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo
 Castellan, F. (19 de Febrero de 2017). Azúcares Reductores. Obtenido de
Universidad de Catalunya:
 Díaz Jorrín. (2014). Reacciones coloreadas para la determinación
cualitativa de azúcares. Recuperado de
https://sites.google.com/site/enzineticupiig/bradford-y-dns
 Diccionarios Oxford. (2003). “Diccionario de química”. Editorial
Complutense.
 Fennema Owen R. (1982). “Introducción a la ciencia de los alimentos”.
Editorial Reverte.
 Lehninger, Albert L. (1988). “Principios de bioquímica”. Editorial Omega.
 Noriega, I., & López, J. L. (Junio de 2004). Espectrofotometría de
Absorción. Obtenido de Instituto de Biotecnología de la UNAM
 Rodríguez Paucar Robert Nilo. (2014). “Determinación de azucares
reductores por espectrofotometría”. Universidad Nacional del Santa.
 Natal Abigail. (2017). Curvas de calibración para proteínas y azúcares
reductores. 15-Abril-19, de Laboratorio de Bioconversiones Sitio web:
https://abinh3.wixsite.com/labbioconver/practica-1

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