Análisis Instrumental Espectrofotometría UV-Visible

ESPECTROFOTOMETRÍA UV - VISIBLE

1. Espectroscopia de absorción UV- Visible

2. Detección espectrofotométrica:
a. Ley de Lambert – Beer
b. Los electrones absorbentes de la radiación
3. Elementos de un espectrofotómetro
4. Tipos de instrumentos
5. Aplicaciones:
 A nivel cualitativo
 Posibilidades cuantitativas de las determinaciones espectrofotométricas
 Determinación de varios componentes de una muestra
 Medidas de constante de equilibrio
 Cálculo de la constante de reacción
 Valoraciones fotométricas

1. Espectroscopia de absorción UV- Visible:

Las moléculas absorben luz. La longitud de onda absorbida y la cantidad de esta, dependen
tanto de la estructura de la molécula como del medio en el que se halla.

En la espectroscopia de absorción UV-Visible, la muestra absorbe radiación electromagnética

de una fuente, la cantidad absorbida va relacionada con la concentración de la sustancia que
se desea analizar en disolución.

En este tipo de espectroscopia se suele hablar de longitudes de onda, en el orden de 200 a

800nm. De 100 a 200nm es la región ultravioleta lejano, de 200 a 400nm la de ultravioleta
próximo y de 400 a 800nm luz visible.

Esta técnica es la más utilizada por su sencillez instrumental y sus diversas aplicaciones en
distintos campos de investigación.

2. Detección espectrofotométrica:

Cuando una radiación incide sobre un medio homogéneo (que absorbe luz a una determinada
longitud de onda), es parcialmente absorbida y parcialmente transmitida. Así el haz de luz que
sale tras atravesar el medio tiene una intensidad menor que la del haz incidente. La relación
entre la luz incidente y la transmitida fue estudiada por Lambert y extendida por Beer.

 Ley de Lambert – Beer:

La relación mas útil en espectrofotometría de absorción se deriva de la combinación de la ley

de Lambert, que dice que cada capa de igual espesor de un material absorbente, absorbe una
fracción igual de la radiación que lo atraviesa; y la ley de Beer, que establece que la
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absorbancia de una solución es proporcional a la concentración del soluto en la muestra. Se

expresa matemáticamente como:

A = Ɛ x [soluto] x l

Donde:

A: Absorbancia, fracción de luz absorbida por la disolución. Va a depender de la naturaleza del

medio, es decir de la composición y de la longitud de la trayectoria de la luz en el medio

l : longitud en cm de la cubeta

[soluto]: concentración del soluto. Se emplean cubetas donde el volumen de medida es fijo,
de forma que la relación entre la concentración de soluto y cantidad de soluto es directa y
sencilla.

Ɛ: coeficiente de extinción molar del soluto. Es una propiedad inherente a cada tipo de
molécula, por tanto es un valor empírico, distinto para cada sustancia.

Su representación gráfica se ajusta a una línea recta que pasa por el origen de coordenadas. Si
la concentración del soluto se expresa en mol/litro, el coeficiente Ɛ se denomina absortividad
molar o coeficiente de extinción molar.

La relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica,

mientras que la relación entre la absorbancia y la concentración es directamente proporcional.
La representación gráfica en un eje de coordenadas de la absorbancia (ordenadas) frente a la
concentración (en el eje de abcisas) se denomina curva de calibración.

La ley de Lambert – Beer solo se mantiene válida hasta un cierto valor de absorbancia. Por
encima de ese valor, la propia absorción impide que la luz incidente alcance por igual a todo el
recorrido de la cubeta, haciendo que se pierda la linearidad de la relación. Por tanto, medidas
de absorbancia superiores a 0,7 deben ser ignoradas en determinaciones de concentración.

Cuando se representa gráficamente A frente a concentración y no se obtiene una línea recta,

existe una desviación de la ley de Beer, que puede ser +, si se desvía hacia el eje de ordenadas
y - si se desvía hacia el eje de abscisas. Las desviaciones pueden ser de origen físico, químico o
instrumental:

 Desviaciones de origen físico: se deben a cambios en el medio como índice de refracción,

presión, temperatura, disolvente.

 Desviaciones de origen químico: se deben a cambios en el equilibrio químico, pH,

presencia de agentes quelantes.

 Desviaciones de origen instrumental: como radiación policromática, fuente de radiación

inestable, detectores deficientes, selección de longitud de onda inadecuada, defectos en
parte óptica

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Otras posibles fuentes de error que originan desviaciones en la curva de calibrado y por ello en
la ley de Lambert-Beer son:

 Las altas concentraciones de la muestra

 Trabajar con concentraciones por debajo de 0,01M
 Que los lados de la cubeta estén rayados o con algo de suciedad
 Si la muestra se disocia, asocia o reacciona con la solución
 Longitudes de onda parásitas
 Incertidumbre o ruido asociado al instrumento

El valor de absorbancia de la muestra A depende de la relación entre la intensidad de la

iluminación incidente en el detector en ausencia (Io) y presencia (It) de la muestra de acuerdo
con la fórmula:

A = log 10

Asociado al concepto de absorbancia se define el de transmitancia, como la luz que alcanza el

detector.

La transmitancia (T) de la muestra viene dada por: T =

T: Transmitancia; relación entre la luz incidente y la luz transmitida, es decir la fracción de luz
transmitida por la disolución

La transmitancia puede tener cualquier valor entre 0 y 1 y se expresa a menudo como un

porcentaje (0 – 100%)

Por tanto, la transmitancia y la absorbancia se relacionan mediante la siguiente fórmula:

A = lgI0 / I = -lgT = -lg%T / 100

A = 2- lg%T

A = - log 10T

 Los electrones absorbentes de la radiación:

La absorción de la radiación UV-Visible se puede considerar que es un proceso en dos etapas,
primero hay una excitación electrónica y posteriormente se produce una relajación. La
absorción de la radiación proviene de la excitación de los electrones enlazantes, la
espectroscopia de absorción molecular es por tanto valiosa para la identificación de los grupos
funcionales de una molécula.
La absorción de longitud de onda larga se restringe a un grupo funcional llamado cromóforo.
Los electrones que intervienen en la absorción de las moléculas orgánicas son los que se
encuentran en la formación de enlaces entre los átomos y los electrones localizados alrededor
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del átomo y que no participan en la formación de enlaces. Las regiones entre los átomos en las
que se encuentran los electrones enlazantes se denominan orbitales moleculares. Al
combinarse dos orbitales atómicos se forma un orbital molecular enlazante de baja energía o
un orbital molecular antienlazante de alta energía.
Los orbitales moleculares que se encuentran asociados a los enlaces sencillos se llaman
orbitales σ, al igual que los electrones que los constituyen. Los dobles enlaces de las moléculas
orgánicas poseen dos tipos de orbitales moleculares, uno de ellos es σ y el otro es un orbital
molecular pi π, asociado al anterior. Además de estos existen los orbitales sigma y pi
antienlazantes, con mayor energía σ* y π.

3. Elementos de un espectrofotómetro:

Todos los espectrofotómetros comprenden los siguientes elementos:

a)- Fuente de luz de longitud de onda apropiada. Se utilizan fuentes continuas que deben
emitir a alta intensidad sin que se produzcan fluctuaciones.

Las mas comunes son de tungsteno, halógenas para utilizar entre 350 y 900nm, y de deuterio
para la región UV (200 – 400nm)

b)- Monocromador o filtro óptico, que selecciona la longitud de onda de interés.

Tienen por objeto descomponer la radiación policromática en sus componentes, permitiendo

así el paso de un haz monocromático cuya longitud de onda correspondaa la región en estudio.
Ventajas de la luz monocromática:
- La ley de Beer está basada en las radiaciones monocromáticas
- La sensibilidad de las medidas aumenta
- Las interferencias disminuyen

c)- Un compartimento donde colocar la muestra objeto de estudio. Inicialmente, debe

colocarse una muestra blanco en ese compartimento; en algunos casos, existen
compartimentos separados para el blanco y la muestra.

Asociado al tipo de espectrofotómetro, está la elección de la cubeta. Generalmente son de

1cm de paso óptico y de 1ml de volumen. Son prismáticas, y el recorrido de la luz se efectúa a
través de dos caras determinadas. También existen cubetas de 3ml y de 0,5ml para acoplar
muestras preparadas en volúmenes diferentes y que no deban concentrarse o diluirse.
Respecto a la elección del material (vidrio, cuarzo o plástico) viene dictada por la longitud de
onda a la que se realiza la medición (UV o visible). Solo el cuarzo permite la medición por
debajo de los 360nm. Algunos espectrofotómetros emplean tubos de ensayo perfectamente
calibrados, pero es necesario que se coloquen siempre en la misma posición para evitar
errores debidos a la longitud de la trayectoria de la luz o al espesor no uniforme del vidrio.
Para medidas múltiples de volúmenes pequeños, pueden realizarse determinaciones múltiples
simultáneas en placas, donde el espectrofotómetro lee las absorbancias sobre una placa de
pocillos, en lugar de en una cubeta convencional.

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d)- Un detector, normalmente un fotomultiplicador, que mide la luz emitida por la muestra.
Normalmente se utilizan las fotocélulas o los fotomultiplicadores. Suele ser un cátodo
revestido de un metal que liberará electrones que son conducidos hacia el ánodo

e)- Amplificadores y registros: para poder medir las señales transmitidas por los detectores es
necesario amplificarlas.

El amplificador recibe la señal y, a través de una serie de operaciones electrónicas, produce

una señal de salida mayor que la original. A la relación entre la señal de salida del amplificador
y la de entrada se la denomina ganancia del amplificador o factor de amplificación. La medida
de la corriente que sale del amplificador puede llevarse a cabo por medio de un amperímetro
o un potenciómetro de registro.

4. Tipos de instrumentos:

El instrumento mas sencillo es el de haz simple, en el que el selector de la longitud de onda es

o un filtro o un monocromador. La determinación de la transmitancia de la muestra supone
tres pasos: primero, un ajuste del 0% de transmitancia; segundo, ajuste al 100% de
transmitancia con el disolvente solo, y por último la medición del % de transmitancia de la
muestra colocada. Si existe alguna fluctuación en la fuente realizaremos una lectura no exacta
de la muestra.

También existen aparatos de doble haz, en los que un espejo rotatorio dirige la radiación
procedente del filtro o monocromador alternativamente a una cubeta de referencia y a la
cubeta de la muestra. En estos instrumentos si hay alguna fluctuación en la fuente se afecta
por igual a la muestra y a la referencia, por lo tanto el error es menor.

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Un tercer tipo de aparato es aquel que se basa en una serie de diodos. Precisan de una óptica
sencilla; una fuente de radiación electromagnética y una red de refracción que dirija la
radiación a la serie de diodos. Estos instrumentos se diferencian de los anteriores en que la
muestra se coloca entre la fuente y el analizador.

El espectrofotómetro es un instrumento óptico de precisión por lo que requiere un

tratamiento suave y sin brusquedades, no se debe desmontar las piezas ópticas ni manipular
incorrectamente las partes mecánicas. Debe ser colocado sobre una mesa plana,
manteniéndolo alejado del polvo, calor, humedad y vibraciones.

Una vez encendido el aparato se selecciona la longitud de onda deseada. Es conveniente

esperar unos 20 minutos para que el instrumento se estabilice. Pasado este tiempo se realiza
el ajuste a 0% de transmitancia, después se coloca una cubeta con disolvente (blanco) y se
realiza el ajuste del 100% de transmitancia. Después de ajustar el 0 y el 100 de transmitancia
se introduce la cubeta con la muestra y se mide la transmitancia o absorbancia.

Cada vez que se haga un cambio de longitud de onda es necesario ajustar de nuevo el 0 y el
100. si la longitud de onda es modificada considerablemente será necesario esperar durante
un tiempo después del ajuste de 0 y 100.

Como blanco se puede emplear aire, agua destilada, soluciones coloreadas.

Las cubetas han de ser de buena calidad, con una limpieza y secado adecuado

5. Aplicaciones:

 A nivel cualitativo:

La aplicación principal es la determinación de los grupos funcionales o estructuras químicas de

las sustancias analizadas. Sobre todo se detecta la presencia de ciertos grupos funcionales que
actúan como cromóforos. Son los grupos que dan lugar a transiciones n→π* y π→π*,
responsables de la absorción de luz en una molécula y los que confieren el color característico,
y las moléculas que los contienen se denominan cromógenas.

Grupos cromóforos: etileno – C = C - ; acetileno – C Ξ C -; cetona – C = O; aldehído – CH = O;

carboxilo – C = O; nitrilo – C Ξ N; nitroso – N = O; nitro - N = O; nitrato –ONO2
Ӏ Ӏ
OH O

Una sustancia en unas determinadas condiciones tiene un espectro característico que la

identifica pero siempre en unas condiciones fijas; tipo de disolvente, pH, concentración,etc.

 Posibilidades cuantitativas de las determinaciones espectrofotométricas:

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Lo primero que tenemos que realizar es un espectro para determinar a que longitud de onda
vamos a trabajar. Siempre trabajaremos en un máximo de longitud de onda donde la
sensibilidad es mayor y se produce una menor desviación de la ley de Lambert-Beer. Viendo la
absorbancia de distintas concentraciones de la sustancia hacemos una recta de calibrado.
Como sabemos que, A = Є x [soluto] x l; a partir de la recta de calibrado y el valor de la
absorbancia obtenemos la concentración.

La medición espectrofotométrica es una técnica sensible y rápida muy adecuada para la

cuantificación de biomoléculas en disolución. Si se emplea en su forma directa es una técnica
no desnaturalizante que permite cuantificar la concentración de proteínas y ácidos nucleicos
mediante determinación UV respectivamente a 280 y 260nm. Se han desarrollado técnicas
indirectas mucho mas sensibles, basadas en la modificación química de proteínas con
compuestos que cambian sus propiedades ópticas mediante la unión covalente a proteínas: el
Bradford, el Lowry y el BCA, esencialmente. La rapidez de estas determinaciones hace que la
detección espectrofotométrica sea la técnica más habitual, y casi la única, de cuantificar de
forma sensible, rápida y fiable la concentración de una disolución que contenga proteínas.
Para mejorar la precisión del método, siempre se emplea un estándar (generalmente de
albúmina) para realizar una recta patrón de referencia sobre la cual interpolar los datos
empíricos de absorbancia.

Métodos espectrofotométricos de detección de macromoléculas

Tipo de técnica Longitud de Rango de

molécula onda detección
Métodos no Proteínas A280 UV 10µg
modificantes Ácidos nucleicos A260 UV 5µg
Métodos Proteínas Bradford Visible 1 µg
modificantes Proteínas Lowry Visible 1 µg
proteínas BCA Visible 1 µg

- Componentes orgánicos: los compuestos con Ɛ alto se pueden determinar directamente;

en caso contrario, se debe preparar un derivado con Ɛ alto. Cuando el compuesto es puro
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o se encuentra en una mezcla en la que dicho compuesto es el único que absorbe, la

determinación es sencilla. La absorbancia se mide a la longitud de onda máxima.

- Compuestos inorgánicos: los compuestos inorgánicos tiene Ɛ muy bajos; por lo tanto es
necesario preparar un complejo cuyo Ɛ sea alto. Para obtener resultados reproducibles hay
que tener en cuenta los siguientes factores:

o La reacción debe ser estequiométrica y completa

o La constante de equilibrio debe ser alta
o El espectro del ligando no debe interferir con el espectro del complejo

 Determinación de varios componentes de una muestra:

La absorbancia total de una disolución es igual a la suma de las absorbancias de los

constituyentes individuales de una mezcla. Supongamos una muestra donde tenemos dos
componentes A y B, con espectros de absorción diferentes, un análisis de ambos es imposible
en una sola medida. Pero podemos hallar las absorbancias de la muestra a dos longitudes de
onda distintas λ’ y λ’’. De manera que podemos expresar:

A’ = ε’A l CA + ε’B l CB ( a λ’)

A’’ = ε’’A l CA + ε’’B l CB (a λ’’)

Las absortividades molares pueden obtenerse a partir de disoluciones estándar individuales de

A y de B o a partir de las pendientes de sus representaciones de la ley de Beer. Las
absorbancias se determinan experimentalmente al igual que la anchura de la cubeta. Sabiendo
estos datos nos queda resolver este sistema de dos ecuaciones en el que hay dos incógnitas
que son CA y CB que son las concentraciones de cada componente.

 Medidas de constante de equilibrio:

Es posible la determinación de las constantes de disociación o de equilibrio de indicadores

ácido-base, ya que los espectros de esas sustancias varían con el pH del medio. La relación
entre la concentración de las formas iónica y no iónica se puede conocer a partir de sus
absorbancias, ya que representando estas frente al pH, a una longitud de onda seleccionada,
se obtendrá una gráfica en forma de S (sigmoidea).

AH ↔ A- + H+

Ka = [H+] [A-]/ [HA]

pH = pKa + log [A-] / [HA]

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Cuando trabajemos con la longitud de onda máxima (la seleccionada) de la forma básica, la
absorbancia mínima representa la medida de la forma no ionizada HA, mientras que el valor de
la absorbancia máxima corresponderá a la forma disociada A-.

En el punto de semidisociación las concentraciones de HA y A- son iguales, de manera que el lg

de 1 es cero y por tanto, el pH es igual al pKa, de forma que podremos calcular Ka.

 Cálculo de la constante de reacción:

La constante de una reacción se puede calcular fácilmente conociendo la concentración inicial

de un reactivo y la concentración de dicho reactivo a un tiempo t desde que comenzó la
reacción:

Ln Cr / Cro = - Kt

Siendo t el tiempo de reacción, Cr la concentración del reactivo al tiempo t y Cro la

concentración inicial y K la constante de reacción.

Podemos expresar la concentración en función de la absorbancia de manera que la expresión

quedaría:

Ln At – A∞ / A0 – A∞ = -Kt

Siendo t el tiempo de reacción, At la absorbancia de la muestra a ese tiempo, Ao la

absorbancia antes de que se de la reacción, A∞ la absorbancia después de la reacción y K la
constante. De esta manera conociendo los datos de absorbancia podemos calcular fácilmente
la constante de la reacción.

 Valoraciones fotométricas:

Las medidas espectrofotométricas pueden utilizarse con el fin de encontrar el punto de

equivalencia de una valoración, siempre que en esta algún elemento absorba la radiación. Para
ello se emplean curvas de valoración fotométricas que son una representación de la
absorbancia con respecto al volumen de la sustancia valorante. Para poder utilizar esta técnica
es necesario que el elemento o elementos que absorben la radiación cumplan la ley de
Lambert-Beer y también hay que corregir la absorbancia frente a los cambios de volumen.

Las valoraciones se realizan en un espectrofotómetro modificado para permitir que el

recipiente donde se da la valoración esté en la zona de paso de radiación
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