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Enzimas:
Atividade Enzimática
Desnaturação
Procedimento Experimental
Inicialmente foram marcados dois conjuntos de 4 tubos de ensaio: T0, T1, T2, T3 ; P0,
P1, P2, P3. Em cada um dos tubos pipetou 1 mL da solução de caseína e 1 mL de solução das
enzimas Tripsina (T) e Protease (P), respectivamente aos tubos T e P. Misturou-se bem e
adicionou-se imediatamente aos tubos T0 e P0, 2 mL de TCA 0,4 M. Incubou os tubos T1, T2 e
T3 ; P1, P2 e P3 em banho-maria a 40ºC e começar a marcar o tempo.. Decorridos os tempos de
5, 10 e 15 minutos, interrompeu respectivamente a reação enzimática nos tubos T1, T2 e T3 ; P1,
P2 e P3 pela adição de 2 mL de TCA 0,4 M aos tubos correspondentes aos respectivos tempos.
Filtrou-se o conteúdo de todos os 8 tubos utilizando funil de vidro e papel de filtro, recolhendo os
filtrados em tubos de ensaio devidamente identificados. A seguir, identificou-se 10 tubos de
ensaio e procedeu seguindo a orientação da tabela abaixo:
Tabela 1 - Procedimento para trabalhar com o reativo folin-Cioucalteu
Tubo Branco T0/P0 T1/P1 T2/P2 T3/P3 Padrão
Tempo - 0 min 5 min 10 min 15 min -
Filtrado - 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL -
Padrão - - - - - 1 mL
tirosina
Água 1 mL - - - - -
Destilada
Na2CO3 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Folin- 1 mL 1mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Ciocalteu
Resultados e Discussão
As proteases estão entre as enzimas hidrolíticas mais importantes, e podem ser chamadas de C-N
hidrolases, pois catalisam o rompimento dessas reações (figura 1). Fonte:
Neste experimento utilizou-se a caseína é utilizada como substrato para determinação da atividade
proteolítica. Assim, após incubar as proteínas Tripisina (T) e Protease (P) com a caseína, nos tubos
conforme descrito no procedimento experimental. Assim, conseguimos filtrar notando que, no tempo de 20
minutos notou-se uma maior precipitação no tubo que continha protease.
Após filtrar, tratou-se o filtrado como descrito na tabela 01, usando o reagente de Folin-Ciocalteu.
A tabela 02 dispõe os resultados quanto a coloração e a absorbância obtida para cada tubo.
A leitura foi feita em 660 nm, pois a cor das soluções foi azul, assim como mostrado na figura 02.
1,4
Tripsina
1,2 Protease
1,0
0,8
Absorbância
0,6
0,4
0,2
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (minutos)
Conclusão
Assim, pode-se concluir que a protease foi muito mais ativa do que a tripsina na quebra das
ligações C-N da caseína do leite. Sendo as concentrações de tirosina obtidas com a protease maiores do que
a com a tripsina. Mostrando que é um teste simples e de fácil execução, sendo quali e quantitativo, por
comparação de cor e quantificação da concentração por densidade ótica.
Referencias
CÉSAR, A.C.W.; SILVA, R.; LUCARINI, A.C. Recuperação das enzimas proteolíticas presentes nas
casca e talo do abacaxi, p. 47-54, São Carlos, 1999.
FORGATY, W.M. & KELLY, C.T. Topics in enzyme and fermentation. Biotechnology. v. 3, Chichester,
G, Howood-J. Wiley & Sons, 1979.
WISEMAN, A. Handbook of enzyme biotechnology. 2.ed, Edited by Ellis Horwood, New York, EUA,
p. 460, 1987.
LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L. & COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 2.ed., São Paulo-SP,
Sarvier Editora de Livros Médicos LTDA, 1995.