Universidad Nacional

Autónoma de Honduras

Laboratorio de Química Orgánica II

LQ-323

Practica #8

DETERMINACIÓN DE VITAMINA A EN AZUCAR

FORTIFICADA

Instructora: Joshira Zaldívar

Andrea Claudeth Espinal 20161000784 Sección 0800 Ing. Diana Velásquez

Edgard Daniel Vega Guzmán 20171004432 Sección 1300 Ing. Óscar Ortiz
Rodolfo Aarón Rubio Romero 20161900234 Sección 1300 Ing. Oscar Ortiz
Osmin Eduardo Gómez Martínez 20151001856 Sección 0800 Ing. Diana Velásquez
 INTRODUCCION
El análisis en este caso de la concentración de retinol en la azúcar de mesa es uno de los
estudios más importantes a nivel regional pues el déficit de vitamina A que es
generalmente el resultado de una deficiencia prolongada de ingesta de vitamina a que se
agrava frecuentemente por enfermedades infecciosas dándose en países de vías de
desarrollo como el nuestro. Proponiéndose como alternativa el consumo de alimentos
fortificados con dicha vitamina como lo es la Azúcar.
Por lo tanto, en un laboratorio es indispensable la correcta operación de programas y
metodologías analíticas para verificar la concentración del retinol en pre-mezclas como
en el azúcar fortificado.
El método utilizado para la determinación de vitamina a en azúcar fortificada de esta
práctica es una adaptación del método propuesto de Arroyave y Fúnez (1974), en este
método se da la extracción de palmito de retinol en el hexano y la concentración de retinol
es determinada por su absorbancia medida en un espectrofotómetro. A continuación, se
presenta una recopilación de datos, análisis y observaciones obtenidas en una
determinación de vitamina A en azúcar fortificada a nivel de laboratorio básico.
 Objetivos

General:

Poner en práctica el uso de un espectrofotómetro mediante la determinación de la

cantidad de vitamina “A” (Trans-retinol) que se utiliza para fortificar la azúcar de mesa.

Específicos:

 Preparar una muestra correcta mediante la extracción de la vitamina A contenida

en la azúcar utilizando un disolvente orgánico.

 Determinar los parámetros de control, y condiciones particulares para obtener

una mejor lectura en el aparato.

 ANALISIS DE RESULTADOS

El trans-retinol es extraído y cuantificado mediante la técnica espectrofotométrica en un

equipo UV-vis, el cual funciona con un principio desarrollado a partir de la ley de Beer
(interacciones del espectro electromagnético). Estos equipos, tienen una importante
aplicación cuando se desea hacer cuantificaciones muy exactas y cuando la concentración
del analito es muy pequeña. Por tanto, aunque la calidad del análisis la asegura el
sofisticado sistema del equipo, la veracidad del resultado depende de los pasos anteriores
en la preparación de la muestra y posterior extracción, que son factores que acarrean
errores importantes al momento de colocar la muestra en la celda del equipo y realizar la
respectiva lectura.

La ley de Beer: ABS = abc, dicta que la absorbancia a una longitud de onda determinada,
es directamente proporcional a la concentración del analito, a la longitud de la celda y la
absortividad del compuesto.

Teniendo en cuenta lo anterior y que la técnica se basa en la absorción de la luz (o

espectro) que corresponde a la naturaleza de cada compuesto presente en la celda, se
discuten los siguientes puntos en cuanto al resultado obtenido respecto a la concentración:

 Al tratarse de un compuesto que tiene muchos enlaces dobles conjugados, la luz

natural puede tener un efecto en cuanto a las transiciones electrónicas que pueden
ocurrir en los distintos orbitales moleculares de la molécula, incidiendo en la
cantidad de energía que pueda absorber al momento de realizarse la lectura en el
espectrofotómetro. Por tanto, todos los frascos que se usan tienen que estar
correctamente forrados con papel aluminio y evitar el paso de la luz a las
soluciones. Pero, aunque se realice esto, es imposible evitar en su totalidad el paso
de la luz, y claramente esto afecta al resultado final.
 La temperatura inicial para lograr disolver el azúcar en relativamente poca
cantidad de agua, debe mantenerse en un rango ya establecido, porque así lo dicta
el método seguido. En tanto que salirse del rango de temperatura, así como ocurre
en algunos momentos durante la agitación en esta etapa, marca alguna desviación
a considerar por efectos de solubilidad.
 El uso de un agitador magnético, en vez del agitador de vidrio que se usa en esta
práctica, lograría mejorar el proceso durante la etapa de disolución inicial.
La absorbancia (medida a 325 nm) leída para la muestra es 1.203 y para el blanco es
0.801, dando una diferencia considerable. Los factores discutidos anteriormente
conllevan a que en la fase que contiene el trans-retinol exista una concentración
elevada de este analito. Al mismo tiempo que deja en evidencia que debido a la
absorbancia que presenta el blanco (disolución de NaOH y la disolución de azúcar)
existe una importante absorción de compuestos ajenos al analito de interés.
 Conclusiones

 Un espectrofotómetro es un equipo muy necesario en los laboratorios debido a la

gran cantidad de funciones que puede realizar, lo que facilita la recolección de

datos para prácticas de laboratorio simples o trabajos de investigación

especializados.

 La extracción se realiza con un disolvente orgánico por que la vitamina “A” es

una de las vitaminas liposolubles, por lo que puede disolver en sustancias

orgánicas no polares, como lo es el hexano utilizado en la práctica.

 Algunos de los parámetros que puede afectar la lectura de la muestra es la

concentración de la solución de azúcar a la que se le extrae la vitamina “A”, la

que debe controlarse por medio de control de temperatura y agitación; además

de la pureza de los elementos usado.

 INVESTIGACIÓN
1. ¿Por qué se protege de la luz las disoluciones de azúcar forticada con vitamina
A, justifique con alguna reacción que sufre el trans-retinol?

- El palmitato de retinol es susceptible a la oxidación en presencia de luz natural o

artificial. El envasado de la pre mezcla en bolsas negras de polietileno reduce la
exposición a la luz y la degradación de la vitamina “A”.

- Es sensible a la luz, se oxida fácilmente debido a la gran cantidad de dobles

enlaces que poseen sus moléculas.

2. ¿Por qué algunos compuestos orgánicos son coloridos y se pueden usar como
cromóforo (investiguen que es un cromóforo y enliste tres de ellos)?
Un colorante es un compuesto orgánico que al aplicarlo a un sustrato (generalmente una
fibra textil pero también a cuero, papel, plástico o alimento) le confiere un color más o
menos permanente. Un colorante se aplica en disolución o emulsión y el sustrato debe
tener cierta afinidad para absorberlo. Los colorantes en general son solubles en el medio
en el que se aplican o en el producto final. La producción mundial de colorantes es del
orden de 90 millones de kg al año.
Un pigmento, por el contrario, es una sustancia coloreada e insoluble que se dispersa en
un medio adecuado para su uso. Se emplean principalmente para colorear plásticos y
para pinturas y tintas de imprenta.

El color de las sustancias depende del número de dobles enlaces conjugados. A medida
que aumenta la extensión del sistema conjugado el tono de color se desplaza a verdes,
azules y negros. El color aparece siempre como consecuencia de la acción conjunta de
dos agrupaciones atómicas diferentes: el cromóforo y el auxocromo. El grupo cromóforo
(del griego portador de color) es un grupo funcional tal como -C=C-, -N=N- (grupo azo)
y anillos aromáticos con bastantes electrones en orbitales n y/o π que dan origen al color
que observamos. El cromóforo es por si solo el responsable del color. Los sistemas
cromóforos más importantes son:
  Cromóforos etilénicos: Ar-(CH=CH)n-Ar; (n≥4)
 Cromóforos azo: -R-N=N-R
 Cromóforos aromáticos:
o derivados del trifenilmetano: [Ar3CH]
o derivados de la antraquinona
o ftalocianinas
o derivados heteroaromáticos

3. El Licopeno es un compuesto natural que puede ser extraído de tomates y sandía,

investigue como podría determinar concentraciones de Licopeno en tomates.
PROCEDIMIENTO:
2.2. Deshidratado:
Los tomates se lavaron y se cortaron en mitades. Se tomaron muestras de 10 kilos por variedad
cada una las cuales se sometieron a los pre-tratamientos que se detallan a continuación: •
Testigo: espolvoreado con sal gruesa. • Pre-tratamiento 1: inmersión en solución de
metabisulfito de sodio al 5% y cloruro de sodio al 4% durante 5 minutos. • Pre-tratamiento 2:
inmersión en solución de metabisulfito de sodio al 10% y cloruro de sodio al 4% durante 5
minutos. Luego se deshidrataron en horno piloto a gas, de carros con flujo de aire
contracorriente perteneciente al INTA EEA Rama Caída, a una temperatura constante de 60 °C.
Este ensayo se realizó por triplicado para cada variedad.
2.3. Rendimiento por variedad:
Se dividió el peso inicial en fresco de cada muestra (10 kg) por el peso del producto
deshidratado corregido a 20 % de humedad final. Para ello luego de deshidratadas se pesaron las
muestras, y se les determinó humedad por el método de Dean Stark. Descripción del método: Se
cortaron en pequeñas partes 10 g de muestra se colocaron en un balón de 200 cm3 , se
agregaron 70 ml de tolueno, se calentó el balón a ebullición y se destiló hasta que el destilado
dejó de ser lechoso y pasó límpido. Se suspendió el calentamiento; se agregó por la parte
superior del refrigerante un poco de tolueno con pipeta, para arrastrar hacia una trampa
eventuales gotitas de H20, se dejó en reposo y se efectuó la lectura en el tubo graduado (el agua
queda en la parte inferior de la trampa). La lectura efectuada da directamente en gramos por
ciento al pesar 10 g exactos de muestra. Con los valores de humedad obtenidos se corrigió el
peso del tomate deshidratado a un 20% de humedad final. Este ensayo se realizó por triplicado
para cada variedad.
2.4. Medición del color:
El color de piel se evaluó con un colorímetro Kónica-Minolta CR400. Se tomaron tres puntos
de medición por tomate. El instrumento se calibró con un plato cerámico de color blanco. La
escala de color utilizada fue CIE L*a*b* la cual es una escala uniforme en la que el espacio de
color está organizado en forma de cubo. El valor máximo de L* es 100 que representa una
perfecta reflectancia difusa, el valor mínimo es 0, el cual representa el negro. Los valores de a*
y b*, no tienen un límite numérico específico. Cuando a* es positiva representa el rojo y cuando
es negativa el verde. Cuando b* es positivo representa amarillo y cuando es negativo azul.
2.5. Reactivos utilizados para las determinaciones de licopeno:
Para las determinaciones analíticas se utilizó etanol absoluto pro-análisis Merck con una pureza
mínima del 99,8%, acetona Sintorgan grado HPLC y n-hexano Sintorgan grado HPLC.
2.6. Preparación de las muestras:
Todos los pasos descriptos a continuación se efectuaron con luz tenue y a temperatura ambiente
de 20°C ± 1°C. Los tomates frescos congelados se procesaron de dos modos. El primer método
consistió en cortar cada tomate en 4 partes y luego procesarlo con una cantidad equivalente en
peso de agua deionizada. En el segundo método se cortó cada tomate a la mitad y se le
extrajeron las semillas, la pulpa y piel se procesaron con una cantidad equivalente en peso de
agua deionizada. Se analizaron 15 unidades por método y por variedad. Los tomates
deshidratados se procesaron de dos modos. En el primer método se cortaron 2 mitades enteras lo
más pequeñas posible con tijera, luego se pulverizaron con nitrógeno líquido. Se pesó un gramo
de polvo en tubo plástico de centrífuga con tapa a rosca que contenía previamente 10 ml de agua
deionizada y se agitó durante 5 minutos, con el objeto de hidratar las muestras. En el segundo
método se procedió de igual modo con excepción en que se procesó solo pulpa y piel evitando
la presencia de semillas. Se analizaron 30 unidades por método y por variedad.
2.7. Método espectrofotométrico para determinación de licopeno:
Para la determinación de licopeno se utilizó el método descripto por Fish et al. (2002) con
algunas modificaciones. Se pesó 0.6 g (con aproximación de 0.01 g) de muestra, se colocó en
tubo para centrifuga de 50 ml (con tapa a rosca) cubierto con papel aluminio que contenía
previamente 5 ml de 0.05% (w/V) hidroxibutiltolueno (BHT) en acetona, 5 ml de etanol, y 10
ml de n-hexano. Las muestras se centrifugaron a 1000 rpm durante 15 minutos a 0 °C en
centrifuga refrigerada Damon PR-J. Luego se agregaron 3 ml de agua deionizada y se
centrifugaron 5 minutos más en iguales condiciones. Posteriormente se dejaron en reposo a
temperatura ambiente por un lapso de 5 minutos para permitir la separación de fases polares y
no polares. Se midió la absorbancia de la capa superior (capa de hexano) en cubetas de cuarzo
de 1 cm de paso a una longitud de onda de 503 nm en espectrofotómetro UNICO SQ 3802
UV/Vis. Se utilizó como blanco n-hexano.
El contenido de licopeno de cada muestra fue luego estimado usando la absorbancia leída y el
peso de la muestra con la siguiente ecuación.

Donde 17,2*104/M/cm es el coeficiente molar de extinción para licopeno en hexano. Se trabajó

con una longitud de onda de 503 nm para minimizar la interferencia con otros carotenoides.

4. ¿Cuál es la importancia de fortificar el azúcar con vitamina “A”, además investigue

que materia prima utilizan los ingenios del país para realizar esta fortificación? .
La fortificación es un medio eficaz para compensar las deficiencias de micronutrientes que sufre
la población. Entre las deficiencias de micronutrientes, la deficiencia de vitamina A es una de
las más difundidas, ya que afecta a más de 250 millones de niños en todo el mundo. Una
estrategia para eliminar este problema ha sido la fortificación del azúcar con vitamina A.
El objetivo es asegurar que se satisfagan las necesidades de vitamina A de los grupos con
mayores riesgos de sufrir deficiencia, sin que las personas que consumen cantidades altas de
azúcar tengan una ingesta excesiva de dicha vitamina.
Debido a que la cantidad de vitamina A que se agrega es tan pequeña, la producción de un
producto fortificado en forma homogénea se facilita, mediante la dilución del palmitato de
retinol (la forma de vitamina A usada en la fortificación) en una pequeña cantidad de azúcar
para formar una premezcla.
La premezcla contiene:
• Azúcar regular
• Microesferas de vitamina A en forma de palmitato solubles
en agua fría que contienen 75 000 µg/g (250 000 UI/g).
• Un aceite vegetal con bajo contenido de grasa no saturada y de peróxido (ej. aceite de coco o
de maní), que adhiere la microesfera de vitamina A al cristal de azúcar (Fig. 2). Esto
impide la separación de vitamina A y el cristal de azúcar y produce un producto fortificado en
forma homogénea, sin cambios notorios en las propiedades organolépticas del azúcar.
• Un antioxidante obtenido de antioxidantes naturales (palmitato de ascorbilo, DL-alfa tocoferol,
y lecitina) que se agrega para impedir que el aceite se ponga rancio. El aceite rancio
desestabiliza la vitamina A y tiene efectos adversos sobre las características organolépticas del
azúcar. Al mezclar el aceite con el antioxidante en un medio inerte y libre de oxígeno, es decir,
en presencia de gas de nitrógeno, impide la oxidación del aceite.

5. Determine con la ley de Lambert-Beer y teniendo en cuenta que se realizan

diluciones y una extracción como se llegó a la ecuación de los mg de Vitamina
“A”/Kg de azúcar.

Fc= Factor de corrección

R=Recuperación
D= Dilución
V1=Volumen inicial
𝐹𝑐 = 0.905

[ℎ𝑥 ]
𝑅= = 𝐾𝑝
[𝐻2 𝑂]

𝑉1 = 250𝑚𝐿

Ley de Lambert-beer:

𝐴 =∈ 𝑏𝑐

Simplificando:
𝐴𝐵𝑆 ∙ 𝑉ℎ ∙ 𝑉𝐼 ∙ 𝐷 ∙ 𝐹𝐶𝜆 ∙ 𝑃𝑀𝑅𝑒𝑡𝑖𝑛𝑜𝑙
𝑉𝑖𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎A =
𝜀 ∙ 𝑏 ∙ 𝑉𝑎𝑧 ∙ 𝑚𝑚𝑡𝑎 ∙ 𝑅 ∙ 𝑃𝑀𝑝𝑎𝑙𝑚𝑖𝑡𝑎𝑡𝑜𝑑𝑒𝑅𝑒𝑡𝑖𝑛𝑜𝑙

Resumiendo la ecuación anterior y colocando los datos dados en el manual obtenemos:

𝑉𝑖𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 A (mg/Kg de azúcar) = 49.5776 ∙ 𝐴𝐵𝑆