Vous êtes sur la page 1sur 42

M. en C.

Rosa del Carmen Milán Segovia


2007

VALIDACIÓN DE
MÉTODOS
BIOANALÍTICOS
TÉCNICA
¾ Es el desarrollo experimental de un
principio físico o fisicoquímico, que ha
probado ser útil para proporcionar
información cuantitativa o cualitativa.

„ RIA
„ EMIT
„ CROMATOGRAFÍA DE GASES
„ CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
„ TDX
„ MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
MÉTODO
¾ Es la adaptación de una
técnica para la obtención de
resultados específicos o para
la resolución de un
problema.

¾ “Determinación de isoniacida
y acetil isoniacida por
cromatografía de líquidos de
alta resolución partir de
micromuestras de plasma”.
PROTOCOLO

¾ Conjunto de instrucciones (escritas)


minuciosamente detalladas y que deben
seguirse al pie de la letra -sin
excepciones- para que los resultados
analíticos sean aceptados para un
propósito específico.
¿Qué incluye el método y
qué el protocolo?
Método Protocolo
„ Interferencias y
„ Reactivos
cómo eliminarlas
„ Equipo „ Operaciones básicas
„ Reacción de laboratorio
„ Procedimiento „ Cómo se usan
por muestra equipos, materiales y
reactivos
Buenas prácticas de laboratorio
GLP

„ Tienen que ver con la organización,


procesos y condiciones bajo las cuales
los estudios de laboratorio son
planeados, realizados, revisados,
registrados y reportados.
„ Los GLP´s buscan promover la calidad y
la validez de los resultados.
Selección de un método
„ ¿En dónde se encuentran los métodos?
– propios
– publicados (AOAC, J. Agr. & Food Chem.,
Analyst, Anal. Chem., J. Of
Chromatography, etc.)
– organizaciones-(FDA, USP, EPA, ISO, etc.)
– oficiales- (normas NOM,NMX, Codex, etc.)
Fuentes de Incertidumbre en
Mediciones Químicas

„ Error químico (no cuantitativo)


„ Error instrumental (materiales y
equipos)
„ Incertidumbre estadística
Errores de medición
„ Errores sistemáticos: son siempre del
mismo signo y magnitud y producen sesgo.
Son constantes.
„ Errores aleatorios: cambian de signo y
magnitud y son impredecibles ocurren al
azar.
„ "Pifias“: sólo son errores que ocurren
ocasionalmente y producen resultados
erróneos.
Personal
„ Documentación de nivel de
formación profesional. CV
„ Tiempo de dedicación (tiempo
completo o parcial)
„ Entrenamiento y experiencia del
grupo de trabajo , habilidad, etc.
METODOS ANALÍTICOS ƒ Manual de operaciones por escrito
ƒ PNO´s para mantenimiento, calibración y
estandarización
ƒ Documentación y Bitácoras
ƒ Transcripción o captura directa a computadoras
ƒ Calendario de calibración del equipo
ƒ Validación
ƒ Récord de las condiciones instrumentales
ƒ Análisis de las muestras
ƒ Retención cromatogramas y gráficas de las
curvas patrón
Tiempo de análisis
6%
6%
27%
Sample Preparation

Data Management

Analysis
61%

Collection
Errores en el análisis de una
muestra
6% 6%
7% Sample Processing
4%
8% Operator
Columns
Calibration
9%
30% Instrument
Chromatography
Integration
11%
Sample Introduction
Contamination
19%
R.E. Majors, ”An Overview of Sample Preparation”, LC-GC, 9, 1, 1991
VALIDACIÓN DE MÉTODOS
BIOANALÍTICOS
“Proceso mediante el cual se establece,
con estudios de laboratorio, que las
características de desempeño del
método, reúne los requerimientos para
las aplicaciones previstas.”
La validación incluye todos los procedimientos
requeridos para demostrar que el método utilizado
para la determinación cuantitativa de la
concentración de un fármaco ( y\o metabolito) en
una matriz biológica es confiable para sus
aplicaciones

¿Cuándo se valida un método?


„ Antes de comenzar un análisis de rutina.
„ Cuando se cambien las condiciones para las cuales
el método fue validado (instrumento con otras
características).
„ Cuando se haya modificado el método y se
encuentre fuera de los límites esperados.
Estrategia de validación
„ Definir la aplicación o uso del método.

„ Desarrollar un protocolo o un SOP´s para la validación.

„ Definir los parámetros de desempeño y los criterios de


aceptación o rechazo.

„ Definir los experimentos de validación.

„ Calificar los materiales, ejm. estándares y reactivos.

„ Realizar experimentos de pre-validación

„ Analizar cada paso del método para determinar el grado en


que cada uno de los factores , matriz, material, tiempo de
almacenamiento y tiempo de análisis pueden afectar la
determinación.
„ Ajustar parámetros del método y/o criterios de aceptación si fuera
necesario.

„ Realizar experimentos (internos y externos) de validación.

„ Desarrollar protocolos para implementar el procedimiento durante los


análisis de rutina

„ Definir criterios para la revalidación

„ Definir tipo y frecuencia de pruebas de desempeño del sistema y/o las


pruebas de control de calidad para la rutina

„ Documentar experimentos de validación y resultados obtenidos.


Reactivos y
soluciones
„ Estándares (trazabilidad)
NIST: National Institute of
Standard and Technology
„ Caracterización
– pureza
– interferencias
„ Condiciones de almacenaje
„ Estabilidad
REQUERIMIENTOS DE
VALIDACIÓN
Selectividad
Linealidad
Recuperación
Precisión
Exactitud
Límite de Detección
Límite de Cuantificación
Estabilidad
„ Selectividad. Capacidad de un método para medir exacta y
específicamente un analito sin interferencia de otros
componentes presentes en la muestra. Se establece al
analizar muestras blanco de la matriz biológica proveniente
de por lo menos seis voluntarios. El método debe responder a
un solo analito.

„ Rango. Intervalo de un método analítico definido por las


concentraciones comprendidas entre los niveles superior e
inferior del compuesto, en el cual se ha demostrado que el
método es preciso, exacto y lineal. Se pueden caracterizar
uno o más intervalos conformados por lo menos por cinco
concentraciones distintas sin inlcuir las muestras blanco, e
incluyan el LC y la concentración máxima.
„ Linealidad. Medida de un método que es capaz de obtener
resultados directamente proporcionales a la concentración del
analito en la muestra. Se emplean 5 a 8 puntos excluyendo el
blanco y se analizan por lo menos por triplicado. Se debe definir
un modelo matemático que describa la relación entre
concentración y respuesta.

„ Recuperación. Eficiencia de un método analítico para cuantificar


el o los compuestos a analizar en la matriz biológica.

„ Recuperación absoluta: Analizar por triplicado un mínimo de


tres concentraciones: baja, media y alta del compuesto por
analizar en la matriz biológica. Comparar estos resultados con las
respuestas de soluciones del mismo compuesto en las mismas
concentraciones. El porcentaje de esta(s) razón(es) no
necesariamente es del 100%, pero debe ser reproducible en cada
concentración analizada.

„ Porcentaje de recobro. El proceso de extracción del fármaco se


evalúa en términos de porcentaje de recobro estimando la
concentración recuperada correspondiente a cada réplica de las
curvas de calibración analizadas.
Precisión.
Concordancia entre dos o más mediciones que se obtienen cuando el
procedimiento se aplica varias veces a diferentes porciones de la
muestra. Se evalúa como repetibilidad y reproducibilidad.

Repetibilidad. Precisión de un método analítico que expresa la


variación de un mismo laboratorio obtenida entre determinaciones
independientes bajo condiciones idénticas y usando el mismo método. Se
obtiene al analizar en un mismo día por quintuplicado tres
concentraciones conocidas en la matriz biológica: baja, media y alta,
diferentes a las de la curva de calibración, pero dentro del rango. El
coeficiente de variación no debe ser mayor al 15%.

Reproducibilidad. Precisión de un método analítico que expresa


la variación obtenida entre determinaciones independientes realizadas en
el mismo lab. pero en diferentes condiciones de análisis (días, equipo,
analistas, etc.). Analizar por duplicado durante tres días, tres
concentraciones conocidas en la matriz biológica: baja, media y alta.
Idem.
Exactitud. Concordancia entre un valor medido y un valor aceptado o real.
El valor promedio de las determinaciones de de cada nivel de concentración
de los datos de repetibilidad y reproducibilidad deben estar dentro del ±
15% del valor nominal de concentración.
Activo [ %] Relación de Unidad Recuperación
analito promedio [%]
100 1 100% 98-102
>=10 10-1 10% 98-102
>=1 10-2 1% 97-103
>=0.1 10-3 0.1 % 95-105
0.01 10-4 100 ppm 90-107
0.001 10-5 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-110
0.000001 10-8 10 ppb 60-115
0.0000001 10-9 1 ppb 40-120

Recuperación del analito a diferentes concentraciones


Límite de detección.
La concentración más baja de analito en una
muestra, que es detectada, aunque no
necesariamente cuantificada.
Visual
Se preparan muestras de concentración
conocida y se van diluyendo. Se establece la
concentración mínima a la cual el analito puede
ser detectado.
•Señal de ruido
En cromatografía se comparan muestras de
concentraciones conocidas muy bajas con las
señales de muestras blanco. El límite de
detección aceptado en una relación 3:1
„ LIMITE DE DETECCIÓN
– Desviación estándar de la
respuesta y la pendiente.
„ LD = 3.3 (d.e.)/m
„ La desviación estándar se puede

obtener de:
– la respuesta de un número apropiado de
muestras blanco.
– Los interceptos de un número apropiado
de curvas de calibración.
„ LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
La concentración más baja de analito en una
muestra, que es cuantificada con precisión y
exactitud aceptables.

„ Analizar por quintuplicado la concentración más baja del


rango de trabajo. Se considera que el punto tiene validez si
su valor promedio cae dentro del ± 20% del valor nominal
con un CV no mayor de 20%.

– Señal de ruido
„ Se comparan muestras de concentraciones conocidas
muy bajas con las señales de muestras blanco. El límite de
cuantificación aceptado en una relación 10:1.
Limite de cuantificación con el método EURACHEM.
Tolerancia.
„ Grado de reproducibilidad de los resultados
cuando las muestras se analizan bajo una
variedad de condiciones, tales como
laboratorios, analistas, instrumentos, lotes de
reactivos, temperaturas y tiempo del ensayo.

Robustez.
„ Mide la capacidad de un método analítico para
mantenerse inalterado por pequeñas
variaciones deliberadas en los parámetros del
método.
PARAMETRO MEXICO FDA
(NOM-177, 1998.) (Guía Mayo 2001)
Selectividad No interferencia. No interferencia.
Matriz de al menos 6 voluntarios. Matriz de al menos 6 fuentes.
Límite de Detección Requerido. Distinguir del nivel de No requerido.
ruido
Límite de Cuantificación No requiere cómo se identifica. Demostrar respuesta de al
Por quintuplicado la concentración menos 5 veces la respuesta de
más baja del intervalo de trabajo. un blanco.
Valor promedio entre ± 20 % del Por quintuplicado.
valor nominal y un C.V. ≤ 20 % Valor promedio entre ± 20 %
del valor nominal y un C.V. ≤
20 %
Linealidad Requerida. No requerida.
Definir modelo, continuo y
reproducible.
Rango/Curva de Calibración Cinco concentraciones más Cuatro a seis concentraciones
blanco, la más baja debe ser el LC. más blanco, con o sin réplicas,
Puede haber más de un intervalo. la más baja debe ser el LC.
Valor promedio entre ± 20 %
del valor nominal y un C.V. ≤
20 % para la concentración más
baja y un valor promedio entre
± 15 % del valor nominal y un
C.V. ≤ 15 % para las otras
concentraciones.
PARAMETRO MEXICO FDA
(NOM-177, 1998.) (Guía Mayo 2001)
Recuperación Por triplicado un mínimo de 3 Comparación de los resultados
absoluta/Recuperación niveles de concentración dentro de la extracción a tres niveles
del rango y comparar con de concentración, con
soluciones de los mismos niveles soluciones representando el
de concentración. 100 % recuperado.
El porcentaje de la relación de
respuestas debe ser reproducible y
no necesariamente del 100%.
Estabilidad Por duplicado a tres niveles de Tres alícuotas (para tres
concentración. análisis) a dos niveles de
- Bajo las condiciones de concentración (alto y bajo)
almacenamiento hasta el - Bajo las condiciones de
análisis almacenamiento hasta el
- Dos ciclos de congelación- análisis
descongelación - Dos ciclos de congelación-
Los valores obtenidos deber ser descongelación
precisos y exactos - A TA de 4 a 24 horas
- Soluciones almacenadas
- Muestras procesadas
PARAMETRO MEXICO FDA
(NOM-177, 1998.) (Guía Mayo 2001)
Precisión Repetibilidad. En un mismo día Por quintuplicado al menos 3
por quintuplicado 3 niveles de niveles de concentración.
concentración diferentes a la El C.V. debe ser ≤ 15 %,
curva de calibración, pero dentro excepto en el Límite Inferior de
del rango. El C.V. debe ser ≤ 15 Cuantificación que es ≤ 20 %.
%. La precisión se subdivide para
Reproducibilidad intralaboratorio. considerar la precisión con el
Por duplicado durante 3 días 3 tiempo y puede incluir
niveles de concentración diferentes analistas,
diferentes a la curva de instrumentos, reactivos y
calibración, pero dentro del rango. laboratorios
El C.V. debe ser ≤ 15 %.
Exactitud El valor promedio de los datos de Por quintuplicado al menos 3
repetibilidad y reproducibilidad niveles de concentración.
deben estar dentro de ± 15 % del El valor promedio de los datos
valor nominal de repetibilidad y
reproducibilidad deben estar
dentro de ± 15 % del valor
nominal, excepto en el Límite
Inferior de Cuantificación que
es ± 20 % del valor nominal
PARAMETRO MEXICO FDA
(NOM-177, 1998.) (Guía Mayo 2001)
Citerios de validez de Por duplicado muestras Por duplicado muestras
una corrida analítica control a tres niveles de control a tres niveles de
concentración (alto, medio concentración (alto,
y bajo) medio y bajo (3xLC))
Dos de diferente Dos de diferente
concentración, pueden concentración, pueden
estar fuera de ± 20 % de la estar fuera de ± 15 % de
concentración nominal la concentración
respectiva. nominal respectiva.
EJERCICIO

Estándares de calibración:

1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0 ug/ml

Precisión del Sistema.


Lecturas espectrofotométricas del estándar de concentración de
5.0 ug/ml.

1) 0.319
2) 0.320 Determinar
3) 0.318 X =
4) 0.321 DE =
5) 0.319 CV =
6) 0.320 Interpretación:
Linealidad del
Método

Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 3


(ug/ml)
1.0 0.062 0.064 0.063
2.5 0.160 0.162 0.158
5.0 0.323 0.318 0.321
7.5 0.486 0.487 0.485
10.0 0.651 0.652 0.648
15.0 0.975 0.975 0.969

Determinar Parámetros de Regresión Lineal


r =
r2 =

m =
b =
Interpretación:
UTILIZAR PROGRAMAS SIGMA STAT Y SIGMA PLOT
Sigma Stat
Parámetro Valor

r Parámetro Límites de confianza 95%

r2

DEm m

DEb

CV regresión % b

n
Concentración y
Porcentaje
recuperado
Concentración Conc. Conc. Conc.
(ug/ml) Recuperada 1 Recuperada 2 Recuperada 3
1.0
2.5
5.0
7.5
10.0
15.0

Determinar Parámetros de Regresión Lineal


r =
r2 =

m =
b =
Interpretación:
UTILIZAR PROGRAMAS SIGMA STAT Y SIGMA PLOT
Porcentaje de recuperación del fármaco

Concentración Porcentaje
(μg/mL) de recobro
1.0
2.5
5.0
7.5
15
Promedio
DE
CV
Repetibilidad Reproducibilidad

Controles
Número de
Concentración (µg/mL) Controles
réplica
2.0 6.0 14.0 Día Concentración (µg/mL)
1 a repetición 2.0 6.0 14.0
2 a repetición Uno
3 a repetición Dos
4 a repetición Tres
5 a repetición Media
Media DE
DE %CV
%CV % Bias
% Bias
Estabilidad

% de bias con respecto a tiempo


inicial
15 días 30 días 60 días 90 días
PRECISIÓN
ANOVA

Suma de X^2
DIA 1 DIA 2 Suma ANAL X^2 ANAL ANAL
ANALISTA 1 98.1 100.5 1197.1 1433048.41 2861790.5
101 101
100.2 99.5
99.3 100
97.5 99
102 99
ANALISTA 2 100 99 1195.3 1428742.09
97 103
102.5 100
98 96
99.6 98
101.2 101
Suma DIA 1196.4 1196
X^2 DIA 1431372.96 1430416
Suma X^2
DIA 2861788.96
PRECISIÓN
ANOVA

Fuente de Grados de Suma de Suma de


Variación Libretad Cuadrados Cuadrado Medio F
A 1 0.135 0.135 0.04169731
B 1 0.006666667 0.006666667 0.00205913
Residual 21 67.99 3.237619048
Total 23 68.33333333 2.971014493
A = Analista
B = Día
Límite de cuantificación

Conc. Conc.
nominal calculada
(µg/mL) (µg/mL)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Media
DE
%CV
% bias

Vous aimerez peut-être aussi