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VALIDACIÓN DE
MÉTODOS
BIOANALÍTICOS
TÉCNICA
¾ Es el desarrollo experimental de un
principio físico o fisicoquímico, que ha
probado ser útil para proporcionar
información cuantitativa o cualitativa.
RIA
EMIT
CROMATOGRAFÍA DE GASES
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
TDX
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
MÉTODO
¾ Es la adaptación de una
técnica para la obtención de
resultados específicos o para
la resolución de un
problema.
¾ “Determinación de isoniacida
y acetil isoniacida por
cromatografía de líquidos de
alta resolución partir de
micromuestras de plasma”.
PROTOCOLO
Data Management
Analysis
61%
Collection
Errores en el análisis de una
muestra
6% 6%
7% Sample Processing
4%
8% Operator
Columns
Calibration
9%
30% Instrument
Chromatography
Integration
11%
Sample Introduction
Contamination
19%
R.E. Majors, ”An Overview of Sample Preparation”, LC-GC, 9, 1, 1991
VALIDACIÓN DE MÉTODOS
BIOANALÍTICOS
“Proceso mediante el cual se establece,
con estudios de laboratorio, que las
características de desempeño del
método, reúne los requerimientos para
las aplicaciones previstas.”
La validación incluye todos los procedimientos
requeridos para demostrar que el método utilizado
para la determinación cuantitativa de la
concentración de un fármaco ( y\o metabolito) en
una matriz biológica es confiable para sus
aplicaciones
obtener de:
– la respuesta de un número apropiado de
muestras blanco.
– Los interceptos de un número apropiado
de curvas de calibración.
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
La concentración más baja de analito en una
muestra, que es cuantificada con precisión y
exactitud aceptables.
– Señal de ruido
Se comparan muestras de concentraciones conocidas
muy bajas con las señales de muestras blanco. El límite de
cuantificación aceptado en una relación 10:1.
Limite de cuantificación con el método EURACHEM.
Tolerancia.
Grado de reproducibilidad de los resultados
cuando las muestras se analizan bajo una
variedad de condiciones, tales como
laboratorios, analistas, instrumentos, lotes de
reactivos, temperaturas y tiempo del ensayo.
Robustez.
Mide la capacidad de un método analítico para
mantenerse inalterado por pequeñas
variaciones deliberadas en los parámetros del
método.
PARAMETRO MEXICO FDA
(NOM-177, 1998.) (Guía Mayo 2001)
Selectividad No interferencia. No interferencia.
Matriz de al menos 6 voluntarios. Matriz de al menos 6 fuentes.
Límite de Detección Requerido. Distinguir del nivel de No requerido.
ruido
Límite de Cuantificación No requiere cómo se identifica. Demostrar respuesta de al
Por quintuplicado la concentración menos 5 veces la respuesta de
más baja del intervalo de trabajo. un blanco.
Valor promedio entre ± 20 % del Por quintuplicado.
valor nominal y un C.V. ≤ 20 % Valor promedio entre ± 20 %
del valor nominal y un C.V. ≤
20 %
Linealidad Requerida. No requerida.
Definir modelo, continuo y
reproducible.
Rango/Curva de Calibración Cinco concentraciones más Cuatro a seis concentraciones
blanco, la más baja debe ser el LC. más blanco, con o sin réplicas,
Puede haber más de un intervalo. la más baja debe ser el LC.
Valor promedio entre ± 20 %
del valor nominal y un C.V. ≤
20 % para la concentración más
baja y un valor promedio entre
± 15 % del valor nominal y un
C.V. ≤ 15 % para las otras
concentraciones.
PARAMETRO MEXICO FDA
(NOM-177, 1998.) (Guía Mayo 2001)
Recuperación Por triplicado un mínimo de 3 Comparación de los resultados
absoluta/Recuperación niveles de concentración dentro de la extracción a tres niveles
del rango y comparar con de concentración, con
soluciones de los mismos niveles soluciones representando el
de concentración. 100 % recuperado.
El porcentaje de la relación de
respuestas debe ser reproducible y
no necesariamente del 100%.
Estabilidad Por duplicado a tres niveles de Tres alícuotas (para tres
concentración. análisis) a dos niveles de
- Bajo las condiciones de concentración (alto y bajo)
almacenamiento hasta el - Bajo las condiciones de
análisis almacenamiento hasta el
- Dos ciclos de congelación- análisis
descongelación - Dos ciclos de congelación-
Los valores obtenidos deber ser descongelación
precisos y exactos - A TA de 4 a 24 horas
- Soluciones almacenadas
- Muestras procesadas
PARAMETRO MEXICO FDA
(NOM-177, 1998.) (Guía Mayo 2001)
Precisión Repetibilidad. En un mismo día Por quintuplicado al menos 3
por quintuplicado 3 niveles de niveles de concentración.
concentración diferentes a la El C.V. debe ser ≤ 15 %,
curva de calibración, pero dentro excepto en el Límite Inferior de
del rango. El C.V. debe ser ≤ 15 Cuantificación que es ≤ 20 %.
%. La precisión se subdivide para
Reproducibilidad intralaboratorio. considerar la precisión con el
Por duplicado durante 3 días 3 tiempo y puede incluir
niveles de concentración diferentes analistas,
diferentes a la curva de instrumentos, reactivos y
calibración, pero dentro del rango. laboratorios
El C.V. debe ser ≤ 15 %.
Exactitud El valor promedio de los datos de Por quintuplicado al menos 3
repetibilidad y reproducibilidad niveles de concentración.
deben estar dentro de ± 15 % del El valor promedio de los datos
valor nominal de repetibilidad y
reproducibilidad deben estar
dentro de ± 15 % del valor
nominal, excepto en el Límite
Inferior de Cuantificación que
es ± 20 % del valor nominal
PARAMETRO MEXICO FDA
(NOM-177, 1998.) (Guía Mayo 2001)
Citerios de validez de Por duplicado muestras Por duplicado muestras
una corrida analítica control a tres niveles de control a tres niveles de
concentración (alto, medio concentración (alto,
y bajo) medio y bajo (3xLC))
Dos de diferente Dos de diferente
concentración, pueden concentración, pueden
estar fuera de ± 20 % de la estar fuera de ± 15 % de
concentración nominal la concentración
respectiva. nominal respectiva.
EJERCICIO
Estándares de calibración:
1) 0.319
2) 0.320 Determinar
3) 0.318 X =
4) 0.321 DE =
5) 0.319 CV =
6) 0.320 Interpretación:
Linealidad del
Método
m =
b =
Interpretación:
UTILIZAR PROGRAMAS SIGMA STAT Y SIGMA PLOT
Sigma Stat
Parámetro Valor
r2
DEm m
DEb
CV regresión % b
n
Concentración y
Porcentaje
recuperado
Concentración Conc. Conc. Conc.
(ug/ml) Recuperada 1 Recuperada 2 Recuperada 3
1.0
2.5
5.0
7.5
10.0
15.0
m =
b =
Interpretación:
UTILIZAR PROGRAMAS SIGMA STAT Y SIGMA PLOT
Porcentaje de recuperación del fármaco
Concentración Porcentaje
(μg/mL) de recobro
1.0
2.5
5.0
7.5
15
Promedio
DE
CV
Repetibilidad Reproducibilidad
Controles
Número de
Concentración (µg/mL) Controles
réplica
2.0 6.0 14.0 Día Concentración (µg/mL)
1 a repetición 2.0 6.0 14.0
2 a repetición Uno
3 a repetición Dos
4 a repetición Tres
5 a repetición Media
Media DE
DE %CV
%CV % Bias
% Bias
Estabilidad
Suma de X^2
DIA 1 DIA 2 Suma ANAL X^2 ANAL ANAL
ANALISTA 1 98.1 100.5 1197.1 1433048.41 2861790.5
101 101
100.2 99.5
99.3 100
97.5 99
102 99
ANALISTA 2 100 99 1195.3 1428742.09
97 103
102.5 100
98 96
99.6 98
101.2 101
Suma DIA 1196.4 1196
X^2 DIA 1431372.96 1430416
Suma X^2
DIA 2861788.96
PRECISIÓN
ANOVA
Conc. Conc.
nominal calculada
(µg/mL) (µg/mL)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Media
DE
%CV
% bias