Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias
Departamento de Farmacia
Caracterización macroscópica y microscópica de cultivos bacterianos
Grupo 11
Daniel Jose Duarte Blanco, Thomas Emilio Garcia Herrera

Objetivo general
Reconocer las diferentes morfologías macro y microscópicas de los bacterios, mediante la
descripción de los diferentes atributos (tamaño, forma, color, olor, consistencia, etc.)
macroscópicos y sensoriales, y de las diferencias de forma y tinción al nivel microscópico.

Objetivos específicos
 Desarrollar una correcta manipulación de cultivos microbianos realizados en medios
sólidos y líquidos dispuestos en cajas de petri.
 Reconocer las formas microscópicas de los diferentes cultivos bacterianos
aplicando técnicas de preparación de muestras fijas y coloraciones compuestas
diferenciales
 Identificar y aislar las diferentes estructuras microbianas que se pueden observar en
una bacteria mediante tinciones especiales.

Marco teórico

Principales tipos morfológicos

En la Figura 1 se muestran algunas representaciones
esquemáticas de morfologías bacterianas típicas junto
con micrografías obtenidas por contraste de fases. A
las bacterias con forma esférica u ovoide se les
denomina cocos. A las bacterias con forma cilíndrica
se les denomina bacilos.
Algunos bacilos se curvan en forma espiral, y se les
denomina espirilos. Las células de muchos procariotas
se mantienen juntas después de la división celular
formando grupos, y estas asociaciones frecuentemente
son características de diferentes organismos. Estos
grupos pueden ser inmediatamente reconocidos
gracias a sus formas peculiares. Por ejemplo, las
espiroquetas, que son bacterias con forma de
sacacorchos, las bacterias con apéndices, que
presentan protuberancias celulares en forma de largos
tubos o tallos, o las bacterias filamentosas, que
forman células largas y delgadas o cadenas de células.
[1]

Figura 1. Tipos de morfología bacteriana

Tinción de Gram
En la década de 1880 el médico Hans Christian Gram desarrolló la más importante tinción
bacteriológica, esta tinción diferencia a las bacterias en dos grandes grupos; se le llama
bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul-violeta, y se denomina
bacterias Gram negativas a las que se decoloran y después se tiñen con safranina.
Esta diferencia de tinciones se debe a la estructura de las paredes celulares de ambos tipos
de bacterias, las bacterias Gram positivas tienen una pared gruesa compuesta de
peptidoglicanos y polímeros, y es impermeable, lo que la hace resistente a la decoloración;
en cambio, las bacterias Gram negativas, tienen una capa delgada de peptidoglicanos junto
a una bicapa de lipoproteínas que se puede deshacer con la decoloración. [2]

Tinciones especiales
Son aquellas que se utilizan para colorear y aislar estructuras específicas, a veces utilizadas
como herramienta de diagnóstico. [5]

Tinción de Schaeffer-Fulton
La tinción de Schaeffer-Fulton está descrita como una tinción especial que permite poner
de manifiesto la endospora bacteriana y la exospora, una forma de resistencia producida
por algunos géneros de bacterias Gram positivas. Las endosporas aseguran la
supervivencia de estas bacterias en condiciones desfavorables (altas temperaturas,
agentes químicos, desecación, radiaciones ultravioleta y gamma) durante largos periodos
de tiempo. Se conocen como endosporas bacterianas porque se originan en el interior de
estos microorganismos. La morfología y disposición de la endospora tiene un valor
taxonómico, la mayoría presentan una disposición central y subterminal, aunque también
pueden existir de tipo deformante, generalmente son haploides. [3]
La endospora, debido a las características de sus envueltas no se tiñe con procedimientos
habituales. El método más empleado se conoce como tinción de Schaeffer Fulton donde la
suspensión de microorganismos se tiñe en caliente con colorante malaquita, el calor
modifica la permeabilidad de la endospora y permite la entrada del colorante a través de las
capas externas de la endospora. A continuación, el lavado con abundante agua produce la
decoloración de las formas vegetativas, así como de los extremos de las bacterias
esporulados que se tiñen por último con un colorante de contraste, la safranina. [4]

Tinción negativa
Es una técnica que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los
fotones para el caso que nos ocupa de microscopia óptica. este método de tinción utiliza
colorantes neutros o ácidos ya que tienen poca afinidad por la ´celula bacteriana, en este
caso se utilizó tinta china. La tinción negativa facilita las observaciones de la morfología y
tamaño de las bacterias, así como la observación de la cápsula en algunas especies
bacterianas. La cápsula es una estructura superficial mucosa, más o menos gruesa que
envuelve la pared celular formada por polisacáridos o polipeptidos que confiere protección
a las bacterias contra la desecación y la fagocitosis. A consecuencia de su elevado
contenido en agua, se tiñen debilmente por los colorantes.
En la tinción negativa se utilizan tintes ácidos, estos poseen un cromógeno negativo que no
penetra la célula de la bacteria debido a la carga negativa en la pared celular. El colorante
no tiñe los microorganismos, se queda alrededor de ellos, es por ello que la tinta china, que
es una suspensión de partículas de carbón coloidal, no tiñe la bacteria si no que se queda
alrededor. [5]
Resultados

Tinción de Gram
Para realizar este tipo de coloración compuesta se utilizaron bacterias previamente
cultivadas en una placa de agar durante 1 semana, para que estos microorganismos
crecieran se tomó una muestra del sanitario y del orinal del baño del departamento de
química, asi mismo, se empleó en cultivos de K. pneumoniae, S.aurues. P. mirabilis, P.
aeruginosa, M. luteus, E. coli, A. baumani y E. faecalis. Las observaciones se realizaron
con los objetivos de 100x, recogiendo evidencia fotográfica de esta con el fin de analizar
microscópicamente las bacterias.

Figura 2. K.pneumoniae Figura 3. A. baumannii Figura 4. E. faecalis

Figura 5. E. coli Figura 6. P. aeruginosa Figura 7. M. luteus

Figura 8. S. aureus Figura 9. P. mirabilis

Tinciones especiales: Schaeffer-Foulton y negativa

Tinción Schaeffer-Foulton
Para llevar a cabo la tinción de Schaeffer-Foulton se emplearon cultivos de E.coli, B.
thuringiensis, B. subtilis, B.spp, B. cereus y B.brevis, se realizó el correspondiente
procediemiento de la técnica y se realizaron observaciones microscópicas con el objetivo
de 100x, donde se observan endosporas y exosporas teñidas de color verde en la mayoría
de las muestras.

Figura 12. B. thuringiensis Figura 13. B. spp Figura 14. B. brevis

Tinción negativa
Para la tinción negativa se tomaron muestras de cultivos de K. pneumoniae, A. baumanii y
E. coli; en estas se observaron las cápsulas de algunas de las bacterias en el objetivo 100x,
aunque por la realización del procedimiento se dificulta la diferenciación de las mismas.

Figura 15. K. pneumoniae Figura 16. A. baumannii Figura 17. E. coli

Análisis de resultados

Tinción de Gram
Para la realización de esta tinción compuesta se tomaron 2 muestras de sitios en donde se
pensó que podía haber gran variedad y cantidad de bacterias, uno fue el sanitario y el otro
fue el orinal de los baños del primer piso del departamento de química, las dos muestras se
sembraron en una placa de agar y se cultivaron durante 1 semana aproximadamente, al
cabo de este tiempo se observó el crecimiento de bacterias en ambas placas (Figura 16 y
Figura 18).

Figura 10. Placa de agar Figura 11. Muestra de cultivo

En la muestra recogida, macroscópicamente se observó un crecimiento de colonias de

diferentes tamaños y colores, principalmente: amarillo, blanco, rojo y brillante transparente,
con bordes definidos e irregulares, con textura lisa y apariencia cremosa, además se
observa una colonia con textura algodonosa, similar a la de los hongos; para la realización
de la práctica se tomó la muestra de colonia una colonia, transparente, de gran tamaño e
irregular.

La observación se inició en 4x donde se identificó por medio de colores la presencia de

bacterias Gram positivas, junto con pequeños puntos de colores violeta y rosado,
mezclados entre ellos; se procedió a observar con el objetivo de 100x, con el que se
identificaron distintos tipos de cocos destacando los micrococos, diplococos, los
estreptococos y formas tétradas, estas últimas escasas pero presentes en la muestra.

La siguiente parte de la práctica fue la descripción de diferentes cultivos bacterianos tanto

macroscópica como microscópicamente, que se pueden apreciar a continuación.
Klebsiella pneumoniae
Se observaron colonias con caracteristicas mucoides de consistencia viscosa, forma
circular y con forma superficial planoconvexa de gran tamaño con bordes irregulares y
brillantes, además de producir un olor caracteristico de levadura, las colonias producen un
color blanco crema palido.

Figura 18. Placa de agar con siembra de

K. pneumoniae

Para esta bacteria la tincion de Gram es negativa como se observa en la Figura 2, las
pequeñas manchas que se observan de color violeta se deben a una precipitación del
colorante ya sea por un mal lavado o un mal calculo de tiempo en la realizacion de la tincion
de Gram, su morfologia es de bacilo que se pueden encontrar individualmente, en parejas
(diplobacilos) o en cadenas cortas (estreptobacilos), no tienen motilidad.

Acinobacter baumannii
Se observan colonias de color beige, viscosas, fusiformes y circulares, además de una
elevación convexa y margen entera.
Se observó que eran bacterias gran negativas como lo indica la literatura, con forma de
bacilos muy pequeños (Figura 3).

Figura 19. Placa de agar con

siembra de A. bauimannii

Enterococcus faecalis
Se identificó como gram positiva, característica por su color violeta (Figura 4), se observa
que tienen morfología de cocos y se encuentran como células aisladas, formando parejas
(diplococos) y cadenas (estreptococos) características de estas colonias, razón por la se
pueden confundir con el género Streptococcus.
 Escherichia Coli.
Las colonias de esta bacteria varían según el medio de cultivo donde crezcan, en este
podemos observar que las colonias tienen una coloración crema muy tenue y escaso, lo cual
es característico de E. coli, aunque hay otras bacterias que logran producir color verde-
metálico e incluso rosado. Se logran ver colonias aisladas, medianas, circulares, convexas,
moradas, contorno crema y bordes redondeados, con un olor característico.
Al realizar la tinción de gram, se observó que esta bacteria es de membrana gram negativas
como era de esperarse, ya que se tiñó de color violeta. Morfológicamente es de tipo bacilos,
pequeños y con borde al parecer entero pueden estar separadas en colonias tipo
streptobacillus o dipobacilos como se puede observar en la Figura 5. También se observan
dos grandes puntos de color azul, que no eran de esperarse, lo cual se puede decir que se
deben a una contaminación a la hora de realizar la tinción o que la placa no fue lavada
correctamente.

Pseudomonas aeruginosa
Al igual que las E. Coli, las colonias de esta bacteria varían según el medio de cultivo donde
crezcan, en este podemos observar que las colonias tienen una coloración crema muy tenue
y escaso. Se logran ver colonias aisladas, medianas, circulares, convexas, moradas, contorno
crema, bordes continuos o a veces ondulados con un olor característico.
Al realizar la tinción de gran (Figura 6), se observó que esta bacteria es de membrana gram
negativas como era de esperarse, ya que se tiñó de color violeta. Su morfología, al realizar un
barrido por la muestra se observaron principalmente bacilos cortos, en pareja o diplobacilos,
en cadena tipo estreptobacilos o aislados. Su borde es entero y el tamaño es muy pequeño
pero similar al de todas las bacterias.

Micrococcus luteus
Con colonias de característica viscosa, presenta una superficie de tipo umbilicada, con bordes
ondulados, presenta un olor característico de levadura y una coloración amarilla opaca.

Figura 20. Placa de agar con

siembra de M. luteus

En la Figura 7 se puede apreciar que la bacteria presento un resultado positivo para Gram
positiva en concordancia con lo reportado en la literatura, de morfología tipo coco, presenta
una organización característica de tétrada; se observan dos zonas de coloración rojiza-
naranja, debidas seguramente a una contaminación producida al momento de llevar la lámina
porta objetos al proceso de secado, paso final tras la tinción de Gram.
Sthaphylococcus aurues.
Presentan un color amarillo crema, no se observa elevaciones, se presenta en colonias,
bordes enteros, levemente convexos presenta un olor a pan.
En la Figura 8 se observan los diferentes racimos irregulares, presentan tinciones de gran
positivos, aunque se observa algunas tenciones para Gram negativos, esto se debe a que
pueden existen cepas viejas o algunos microorganismos fagocitados.

Proteus mirabilis
Es puntiforme, pequeña, pero se ve la formación de un tapete en forma radial alrededor de las colonias,
no se ve elevación, color amarillo crema, pero las colonias tienen un color blanquecino con bordes
redondos.

Figura 21. Placa de agar con

siembra de P. mirabilis

Presenta coloración característica de Gram negativo, se observa los filamentos que se asemejan como
rizos, y se extienden alrededor de la colonia.

Tinción Schaeffer-Foulton
Se tomó una muestra de cada cultivo bacteriano (E.coli, B. thuringiensis, B. subtilis, B.spp,
B.cereus y B.brevis) con el fin de identificar las esporas en cada una y clasificarlas. Por
medio de la técnica aséptica se tomó la muestra y se realizó la tinción.

Bacillus Thuringiensis

Se observa en la siguiente figura que la B. thuringiensis se caracterizan por ser colonias de color
amarillo cremoso y tener una consistencia mucosa, con bordes irregulares, sin elevación y la
expansión de flagelos.
 Figura 22. Placa de agar con
siembra de B.Thuringiensis

En la Figura 12, se observa la presencia de esporas, pero con una tinción muy leve por parte del
verde de malaquita que pudo deberse a un tratamiento inadecuado de la muestra al momento de
realizar su tinción correspondiente, además se observa la presencia de lo que parecen ser proteínas
Cry y por supuesto, la presencia bacilos gran positivos.

Bacillus spp
Como se observa en la Figura 23 las colonias de Bacillus spp macroscópicamente, se caracterizan
por ser colonias circulares alargadas, de un tamaño aproximadamente entre 2 y 4 mm, de
superficie lisa, consistencia mucosa, color cremoso y bordes regulares.

Figura 23. Placa de siembra con B. spp

Se llevo a cabo una tinción Shaeffer Fulton como se muestra en la Figura 13, en la cual se observan
las esporas teñidas con verde de malaquita y de contraste el resto de material se encuentra fucsia.
Las esporas son circulares y algunas se encuentran en forma de endosporas

BACILLUS SUBTILIS

Según lo observado, el cultivo presenta una superficie característica planoconvexa, de

forma circular y borde redondeado, con una coloración crema pálido y olor característico a
moho.
 Figura 24. Placa con siembra de B. Subtilis

Debido a un tratamiento inadecuado de la muestra al momento de realizar su tinción

correspondiente con Verde de Malaquita, no se pudo obtener un resultado adecuado para
su análisis, pues fueron muy pocos los bacilos que se fijaron a la muestra.

BACILLUS CEREUS
Presenta un color amarillo quemado, presenta colonias centrales ovaladas, bordes irregulares, son
elevación y se observa la expansión de los flagelos.

Figura 25. Placa de agar con

siembra de B. cereus

BACILLUS BREVIS
Macroscópicamente, se observa que son colonias lisas, de color amarillo quemado.

Figura 26. Placa de agar con

siembra de B. brevis

Microscópicamente se confirma la presencia de esporas, pues están coloreadas de verde como se

puede apreciar en la Figura 14, su morfología es de bacilos simples.

Tinción negativa
Se empieza por colocar una gota de solución salina en la lámina, dentro de ésta se
esparcirá una muestra de los diferentes cultivos bacterianos que se determinaron para la
identificación de su cápsula (K. pneumoniae, A. baumanii y E. coli), después se colocará
una gota de tinta china que se repartirá por toda la lámina, se deja secar al aire libre
durante 10 minutos aproximadamente y se fija con calor.

Klebsiella Pneumoniae
En la Figura 15 se muestra la determinación de la cápsula de la bacteria K.pneumoniae, se puede
observar teniendo mucha meticulocidad que se dan bordes bien marcados, definidos y nitidos, que
ayudan a permitir la caracterizacion celular de la K. Pneumoniae.

Por otra parte en la imagen se presencia multiples manchas más oscuras de color azul esto se puede
generar por factores dados por la tinta china aglomerada en este lugar por una mala extension de la
misma sobre la superficie de la lamina o a la hora de secarlo el paño con el cual se realiza si se genera
un presion muy fuerte sobre la lamina las fibras del paño se pueden pegar sobre la superficie de esta.
Ahora las manchas de color rosa pronunciadas no se encontro en la litearutura a que se deben, por
ende una suposicion que se puede plantear es una mal lavado de la fucsina la cual queda posada
sobre la lamina generando un inconveniente ya que como alli observamos bacterias concluimos que
un mal lavado puede interferir en la visualizacion en este caso de la capsula.

Muy curiosamente estudios recientes han demostrado que la expresion de la capsula impide la
capacidad de la K. Pneumoniae para adherirse e invadir las celulas epiteliales; con esto se puede
hacer una suposicion y es que la expresion de la capsula puede ser una desventaja en los
compartimientos de hospedadores pobres en suero al reducir la capacidad de las bacterias para
adherirse a las superficies epiteliales (Carsten Struve, Karen Angeliki Krogfelt; 2002).

Acinetobacter baumani
En la figura 16 se puede confirmar la presencia de cápsulas en la A.baumanni, adempas de múltiples
manchas oscuras de color negro, esto se puede deber a factores dados por la tinta china, bien sea por
la calidad de esta, una mala aplicación de la misma sobre la superficie de la lamina o al aplicar una
presion muy fuerte sobre la lamina con las fibras del paño con que se seca se pueden pegar sobre la
superficie de esta, también se puede plantear un mal procedimiento en el lavado o tiempo de espera
de la fucsina, la cual queda posada sobre la lamina que en este caso, nos afectará la visualización de
la capsula.

Escherichia Coli.
La tinción para capsulas con tinta china y fucsina de gram nos permitió observar un
contraste como se observa en la Figura 17, en la que aprecian las cápsulas además de un
medio de contraste rosado donde también se pueden observar bacilos, además de
diferentes puntos negros que pueden deberse a un mal procedimiento con la tinta china.
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