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Técnicas de estudo da

célula em Biologia
Molecular

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Microscopia
 Microscopia electrónica
– É usado um feixe de electrões em vez de luz branca
– A resolução é muito maior que na microscopia óptica
devido ao menor comprimento de onda dos electrões
(~100.000x menor)
– São usadas “lentes” magnéticas em vez de lentes de
vidro (quartzo)
– A observação da amostra é feita no vácuo
– MET e MEV

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Preparacão da amostra para MET

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4
Microscopia electrônica
 MET – feixe de electrões
emitido por um canhão
acelerador de partículas
atravessa a amostra
 Resolução ~2.5nm
 Ampliação 10.000 –
100.000x
 Baixo contraste da
imagem
– Uso de “corantes” como sais
de metais pesados (Os, Pb)

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Microscopia electrônica
 Desvantagens:
– As amostras devem ser
muito finas (100nm)
devido fraca penetração
dos electrões
– As amostras devem ser
fixadas, desidratadas e
observadas em vácuo
– Encolhimento e
distorção das amostras
– Formação de artefactos

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Microscopia electrônica
 MEV – feixe de electrões
emitido por um canhão
acelerador de partículas
varre a amostra
 Produção de electrões
primários e secundários
 Resolução ~20nm
 Ampliação 1.000 –
10.000x

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Imagem de MET

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Imagem de MEV

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Semelhancas e diferencas entre
MET e MEV

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Microscopia de verredura por sonda
mecânica
 Nanotecnologia
 Criada nos anos 80 e desenvolvida nos anos 90
 Forma de funcionamento inteiramente original (ar,
líquidos, vácuo)
 Resolução a escala atómica
 Para além de imagem, permite a análise de outros
parâmetros como morfologia, condutividade
eléctrica, dureza e propriedades magnéticas

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Microscópio de varredura por sonda

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Princípio de funcionamento
 A – sonda mecânica-
colocada na superfície
da amostra
 F – amostra
 B – scanner- garante a
movimentação lateral
da amostra em relação
a sonda

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Princípio de funcionamento
 C – mecanismo de
monitoração - detecta
a interacção entre a
sonda e a amostra e
passa a informação
 E – computador-
controla o scanner e
processa a informação
 D – mecanismo de
aproximação

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Tipos de microscopia de
Varredura por sonda mecânica
 Microscopia de varredura
por tunelamento
 Microscopia de força
atómica
 Microscopia de força
lateral
 Microscopia de contraste
de fase
 Microscopia de modulação
de força

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Técnicas de centrifugação

Está baseada no comportamento de


partículas quando submetidas à um campo
gravitacional artificial.

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Centrífuga

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Centrifugação
 Separação feita na base de:
– densidade
– forma
– tamanho
 Tipos de centrifugação (finalidade)
– Finalidade
 Preparativa - separação
 Analitica – estudo de propriedades (sedimentação, estrutura,
etc.)
– Natureza
 Diferencial ou fraccionada
 Contra gradiente ou em gradiente de densidade
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Tipos de centrifugacão (diferencial)

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Tipos de centrifugacão (gradiente)

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Formas de desintegracão de tecidos

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Princípios básicos

 Parâmetros básicos de centrifugação


– velocidade do rotor
– raio do centro (eixo) ao tubo de
centrifugação
– tempo de duração do processo

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Diferentes designs de rotores

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Tipos de centrífugas

 Centrífugas pequenas (de bancada)

 Centrífugas de alta capacidade

 Centrífugas de alta velocidade

 Ultracentrífugas

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Centrífugas pequenas
– velocidade de 4000
à 6000 rpm
– RCF de 3000 à
6000g
– refrigeração usando
microtubos
velocidades até
13.000 rpm e RCF
de 10.000g
– 250mm3 à 1.5cm3
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Centrífugas de alta capacidade

– Velocidades de
6000rpm e 6500g
– 100cm3 (100ml) por
tubo com um total
de 4 à 6 dm3
– Eixo rígido (0.25g)

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Centrífugas de alta velocidade
– 25.000 rpm e
60.000g
– capacidade total vai
até 1.5dm3
– microorganismos,
fragmentos e
organelos celulares,
precipitados
protéicos, etc

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Ultracentrífugas
– 80.000 rpm e RCF de
600.000g
– camara do rotor
refrigerada, selada e
vacumizada
– controlo de temperatura
sofisticado
 bloqueio de rotor
 paredes blindadas
– eixo de rotação flexível
(máximo 0.1g)

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Electroforese

 Técnica na qual se explora o comportamento de


partículas carregadas num campo eléctrico
artificial
– carga
– massa
 Equipamento necessário - fonte de corrente
electrica e a unidade de electroforese

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SDS-PAGE

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Electroforese horizontal

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Factores que afectam a corrida
electroforética
 Campo eléctrico - voltagem, corrente e
resistência do meio
 Amostra - carga, tamanho e forma
 Tampão – composição, concentração e pH
 Meio de suporte - absorção e peneiração
– Efeito de retardamento causado pelo atrito
– Efeito electroestático entre amostra e meio circundante

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Tipos de electroforese
1. Electroforese de baixa voltagem em
camada fina
2. Electroforese em alta voltagem
3. Electroforese em gel
1. Agarose
2. Poliacrilamida
1. SDS-PAGE
3. Electroforese capilar
4. Electroforese de focagem isoeléctrica
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Cromatografia

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Conceitos gerais
 Coeficiente de distribuicão
– Quociente entre a concentração do composto
na fase móvel e na fase estacionária
 Coeficiente efectivo de distribuicão
– Quociente entre a quantidade total do composto
na fase móvel e na fase estacionária
 Princípio de separacão

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Princípio de separacão

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Tipos de cromatografia
 Permeação ou peneiração
– Baseada no tamanho e forma
 Adsorção
– Adsorção sobre a fase estacionária
 Partição ou distribuição
– Distribuição pelas duas fases
 Gás-líquida
 Troca iônica

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HPLC

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Colunas

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Radioisótopos
(isótopos radioactivos)

 Átomos do mesmo elemento mas com


diferentes números de neutrões no seu
núcleo são chamados de isótopos
 Os isótopos instáveis, são comummente
denominados de radioisótopos ou ainda
isótopos radioactivos

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Tipos de radiação ou
decomposição (desintegração)
radioactiva
 Radiação alfa: fluxo de partículas
carregadas positivamente, compostas por 2
neutrões e 2 protões (núcleo de Hélio)
– São muito ionizantes porém pouco penetrantes
– Reagem com a matéria de duas formas
 Excitação
 Ionização

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Tipos de radiação ou
decomposição (desintegração)
radioactiva
 Radiação beta: fluxos de partículas
originárias do núcleo (por isso negatrões).
Quando um radioisótopo emite uma
partícula β, o valor de sua massa não muda,
e seu número atômico aumenta em 1
unidade
– mais penetrante porém menos ionizante que a
radiação alfa
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Tipos de radiação ou
decomposição (desintegração)
radioactiva
 Radiação gama: ondas electromagnéticas.
Não apresenta carga eléctrica e não é
afectada por campos eléctricos ou
magnéticos
– É o tipo mais penetrante de radiação
– É uma radiação muito perigosa para
organismos vivos

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Marcação com Radioisótopos

 As células ou fracções celulares, são incubadas


com precursores marcados radioactivamente
(átomos substituidos por formas radioactivas) e o
seu percurso ou localização rastreada.

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Detecção de Radioisótopos
 Contadores
– GEIGER-MULLER
– Cintilador
 Radioautografia

 α > β > γ (10000:100:1)

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