EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA BROMELINA DE PULPA DE PIÑA

(Ananas comosus)

Manuela de La Rosa Arbelaez - 1020819161

Laura Carolina Valencia Valero - 1030683259

Modificaciones en la metodología
Para en análisis de la actividad de la bromelina de pulpa de piña se cambió el sustrato por BAPNA
(Clorhidrato de N- benzoil-DL-arginina p-nitroanilida) debido que con el uso de caseína se tuvieron
interferencias por parte del sustrato y del extracto ya que tanto el blanco de sustrato como el de enzima
mostraban una absorbancia significativa a 280 nm.

● Estudio Cantidad de Enzima:

Nota: En primera instancia se evaluó la actividad de la enzima con los tubos B,2 y 4
Tubo B 1 2 3 4 5
Extracto(mL) 0,5 0,25 0,5 0,75 1 1,5
Buffer pH 8 1 1,25 1 0,75 0,5 -
adicionar 1 ml de ácido acético 30% al blanco, dejar termostatar los tubos por 3 min a 37°C

BAPNA(mL) - 0,5 0,5 0,,5 0,5 0,5

Dejar reaccionar por 15 min a 37°C

A.Acético 30% - 1 1 1 1 1
(mL)
retirar del termostato y medir absorbancia a 410 nm

● Estudio Temperatura óptima de reacción:

Tubo B 20°C 37°C 60°C 70°C 92°C
Extracto(mL) 1 1 1 1 1 1
Buffer pH 8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
adicionar 1 ml de ácido acético 30% al blanco, dejar termostatar los tubos por 3 min a 37°C

BAPNA(mL) - 0,5 0,5 0,,5 0,5 0,5

Dejar reaccionar por 15 min a la temperatura correspondiente

A.Acético 30% - 1 1 1 1 1
(mL)
retirar del termostato y medir absorbancia a 410 nm
● Estudio Tiempo óptimo de reacción:
Tubo B 5 min 10 min 15 min 20 min 30 min
Extracto(mL) 1 1 1 1 1 1
Buffer pH 8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
adicionar 1 ml de ácido acético 30% al blanco, dejar termostatar los tubos por 3 min a 37°C

BAPNA(mL) - 0,5 0,5 0,,5 0,5 0,5

Dejar reaccionar por el tiempo correspondiente a 37°C

A.Acético 30% - 1 1 1 1 1
(mL)
retirar del termostato y medir absorbancia a 410 nm

● Estudio pH óptimo de reacción:

Tubo B 3,99 4,83 6,00 6,81 8,04 9,14
 Extracto(mL) 1 1 1 1 1 1 1
Buffer 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
adicionar 1 ml de ácido acético 30% al blanco, dejar termostatar los tubos por 3 min a 37°C

BAPNA(mL) - 0,5 0,5 0,,5 0,5 0,5 0,5

Dejar reaccionar por 15 min a 37°C

A.Acético 30% - 1 1 1 1 1 1
(mL)
retirar del termostato y medir absorbancia a 410 nm

● Estudio cinético de la bromelina de pulpa de piña:

Tubo B 1 2 3 4 5 6 7 8
Extracto(mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Buffer pH 8 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 -
adicionar 1 ml de ácido acético 30% al blanco, dejar termostatar los tubos por 3 min a 37°C

BAPNA(mL) - 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2

Dejar reaccionar por 15 min a 37°C

A.Acético - 1 1 1 1 1 1 1 1
30% (mL)
retirar del termostato y medir absorbancia a 410 nm

● Inmovilización de la bromelina de pulpa de fruta:

Se tomaron 15 mL de alginato de sodio 4% y se mezclaron con 8 mL del Extracto de pulpa de
piña por 15 minutos con agitador magnético. Luego de este tiempo la mezcla se puso en una
bureta, desde donde se dejó gotear lentamente a un vaso de precipitado con una solución de
cloruro de calcio 4% que estaba en agitación.

Las perlas producidas se lavaron y quedaron listas para su uso.

● Estudio Cantidad de Enzima Inmovilizada:
Nota: En primera instancia se evaluó la actividad de la enzima inmovilizada con los tubos B,1 y 3
Tubo B 1 2 3
Cant perlas - 5 7 10
Buffer pH 8 3 2,5 2,5 2,5
adicionar 1 ml de ácido acético 30% al blanco, dejar termostatar los tubos por 3 min a 37°C

BAPNA(mL) - 0,5 0,5 0,,5

Dejar reaccionar por 20 min a 37°C, retirar las perlas una vez transcurrido este tiempo y medir
absorbancia a 410 nm.

Nota 2: Para los ensayos de temperatura, tiempo, pH y cantidad de enzima se mantuvieron estas
mismas condiciones utilizando 10 perlas de enzima inmovilizada y se evaluó losa mismos factores
que para la enzima sin inmovilizar.

● Evaluación de cantidad de proteína:

La evaluación de proteína en el extracto crudo, en la solución de enzima parcialmente purificada
y en las aguas de CaCl utilizadas para la inmovilización se realizó por el método de absorbancia
en UV a 280 nm. Para la cuantificación se realizó una curva de calibración con caseína. Para el
análisis de absorbancia se tomó 1 mL de la solución y se llevó a 5 mL con agua destilada, para el
caso del extracto crudo se tomaron 0,5 mL y se llevó a 5 mL con agua destilada.
Resultados:
El proceso de extracción de la enzima bromelina se realizó con el fruto y cáscara de la piña. Para evaluar
la cantidad de proteína extraída antes y después de llevar a cabo la purificación parcial por medio de la
precipitación con acetona al 70% y la inmovilización de la enzima se realizó una curva de calibración para
el método de UV Abs 280 nm, sobre la cual se interpolan las absorbancias y se encontraron las
concentraciones de los diferentes extractos obtenidos.

Curva de calibración con caseina

1,200

1,000

0,800
Abs 280nm

0,600
y = 0,9063x - 0,0197
R² = 0,9992
0,400

0,200

0,000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
[Caseina] mg/mL

Figura 1. Curva de Calibración para el método de UV Abs 280 nm de cuantificación de proteína. Note
que la relación entre absorbancia y concentración es aproximadamente proporcional y se asume lineal
(R= 0.99)

Extracto crudo Extracto parcialmente Solución CaCl2 residual

purificado (inmovilización)
Abs 280 nm 1,217 0,649 0,358
Concentración 13,65 3,69 2,08
(mg/mL)
Tabla 1: Resumen de los resultados obtenidos tras el proceso de extracción e inmovilización para la
concentración de proteína.
(1,217 + 0,0197) ∗ 10
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 = = 13,65 𝑚𝑔(𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎)/𝑚𝐿
0,09063
Nota: para el extracto parcialmente purificado y la solución de CaCl2 el factor de dilución fue de 5 no de
10.

De igual manera se evaluó la actividad de del extracto crudo, del extracto purificado y de la enzima
inmovilizada utilizando como sustrato BAPNA (Clorhidrato de N- benzoil-DL-arginina p-nitroanilida). Para
este estudio la actividad se definirá como (ΔAbs/min).
 Extracto crudo Extracto Enzima Enzima
parcialmente Inmovilizada inmovilizada
purificado reutilizada
Abs 410 nm 0,314 0,200 0,108 0,079
Tiempo Reacción min 15 15 20 20
Actividad(ΔAbs/min) 0,021 0,013 0,0054 0,0040

Tabla 2: Resultados de actividad para la bromelina extraída y la bromelina inmovilizada

𝟎, 𝟑𝟏𝟒
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 (𝜟𝑨𝒃𝒔/𝒎𝒊𝒏) = = 𝟎. 𝟎𝟐𝟏
𝟏𝟓 𝒎𝒊𝒏

De acuerdo con los resultados obtenidos en la tabla 2, el extracto crudo presenta mayor actividad que el
extracto parcialmente purificado, por tal motivo se procedió a utilizar este para la continuidad del proyecto.

Posteriormente, se comenzó a llevar a cabo un estudio cinético, en donde se evaluaron factores tales
como: volumen óptimo del extracto, tiempo óptimo de reacción, efecto de pH, efecto de la temperatura y
concentración de sustrato para la enzima sin inmovilizar utilizando el extracto crudo.

Respecto al volumen óptimo de extracto, se obtuvo la cinética mostrada en la Figura 2. De acuerdo con
los resultados se concluyó que usar un volumen de 1 mL era necesario para obtener valores de
absorbancia suficientes de tal forma que el error en la medición no fuera significativo.

Variación de enzima
0,6
0,5
Abs 410 nm

0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600
Extracto (mL)

Figura 2: Cinética de reacción respecto al cambio en la cantidad de extracto.

En cuanto al tiempo óptimo de reacción, se encontró que un tiempo adecuado de reacción eran se
encontraba entre 10 a 30 minutos ya que no se ve un cambio significativo entre este rango de tiempo,
como se puede observar en la figura 3.
 Variación de tiempo de reaccion
(Tiempo optimo)
0,360
0,340
0,320
Abs 410 nm 0,300
0,280
0,260
0,240
0,220
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo de reaccion (min)

Figura 3: Tiempo óptimo de reacción con el extracto crudo de bromelina.

Con respecto al efecto de pH, se muestra la siguiente tendencia. Note que la actividad máxima varía
entre 7 y 8 unidades de pH como se ve en la figura 4, razón por la cual se tomó como pH óptimo de
reacción 8.00.

Variación de pH (pH optimo)

0,560
0,510
0,460
Abs 410 nm

0,410
0,360
0,310
0,260
0,210
0,160
3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00
pH

Figura 4: pH óptimo de reacción con el extracto crudo de bromelina.

En cuanto al efecto de temperatura se encuentra un máximo a 37°C tomando este como la temperatura
óptima para la reacción de bromelina con el sustrato.

Variación de Temperatura
(Temperatura optima)
0,400
0,350
Abs 410 nm

0,300
0,250
0,200
0,150
0,100
20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Temperatura °C

Figura 5: Temperatura óptima de reacción con el extracto crudo de bromelina.

Con todos los parámetros definidos, se realizó el estudio del efecto de la concentración de BAPNA en la
velocidad de reacción del extracto proteico, con el fin de determinar la constante de Michaelis (Km) y la
Velocidad máxima (Vmax).

Volumen Abs 410 Abs 410 Velocidad

[s] (mg/ml) 1/[s] 1/v
s nm nm*FD (Abs/min)
0,25 0,02 0,15 0,59 0,04 53,33 25,34
0,50 0,04 0,37 1,47 0,10 26,67 10,22
0,75 0,06 0,75 2,99 0,20 17,78 5,01
1,00 0,08 0,79 3,14 0,21 13,33 4,77
1,25 0,09 0,80 3,18 0,21 10,67 4,72
1,50 0,11 0,80 3,21 0,21 8,89 4,67
1,75 0,13 0,82 3,28 0,22 7,62 4,57
2,00 0,15 0,83 3,34 0,22 6,67 4,50
Tabla 3:Estudio cinético de bromelina en extracto crudo
0.25 𝑚𝐿 ∗ 0.3(𝑚𝑔/𝑚𝐿)
[𝑠](𝑚𝑔/𝑚𝐿) = = 0.019 𝑚𝑔/𝑚𝐿
4𝑚𝐿
𝐴𝑏𝑠 410𝑛𝑚 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 = 0.148 ∗ 4 = 0.592
𝟎, 𝟓𝟗𝟐
𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 (𝜟𝑨𝒃𝒔/𝒎𝒊𝒏) = = 𝟎. 𝟎𝟑𝟗
𝟏𝟓 𝒎𝒊𝒏

0,25

0,20
Velocidad (uA/min)

0,15

0,10

0,05

0,00
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20
[s] (mg/mL)

Figura 6: Gráfica de michaelis para el estudio cinético de la bromelina de pulpa de piña

5,10

5,00

4,90
1/v (uA/min)-1

4,80
y = 0,0428x + 4,242
4,70 R² = 0,967
Km = 0,01 mM
4,60 Vmax = 0,236

4,50

4,40
5,00 7,00 9,00 11,00 13,00 15,00 17,00 19,00
1/s (mg/mL)-1

Figura 7: Linealización de la gráfica del estudio cinético de bromelina de pulpa de piña

 0,0428
𝐾𝑚 = = 0,01 𝑚𝑀
4,242
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = = 0,236𝑢𝐴/𝑚𝑖𝑛
4,242

A partir de los datos en la Figura 6 y usando métodos numéricos (su uso se discute en el análisis de
los resultados) se obtuvo que la Km era equivalente a 0,01 mM y la Vmax a 0,236 mM/min.

Finalmente, se realizó la inmovilización de la enzima en alginato de sodio. Se determino que 10

perlas eran suficientes para obtener suficiente actividad (Figura 8) y el tiempo de reacción se
mantuvo en 20 minutos. Se determinó el efecto del pH, la temperatura y la concentración de sustrato.

Variación de Bromelina
Inmovilizada
0,12

0,1

0,08

0,06

0,04
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Figura 8: Cinética de reacción respecto al cambio en la cantidad de Bromelina Inmovilizada

En cuanto al tiempo óptimo de reacción, se encontró que un tiempo adecuado de reacción eran se
encontraba entre 20 a 30 minutos ya que no se ve un cambio significativo entre este rango de tiempo,
como se puede observar en la Figura 9.

Variación de tiempo de reaccion

(Tiempo optimo)
0,155
0,150
0,145
Abs 410 nm

0,140
0,135
0,130
0,125
0,120
0,115
0,110
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo de reaccion (min)

Figura 9: Tiempo óptimo de reacción con la Bromelina Inmovilizada.

Con respecto al efecto de pH, se muestra la siguiente tendencia. Note que la actividad máxima varía
entre 8 y 9 unidades de pH como se ve en la figura 10, razón por la cual se tomó como pH óptimo de
reacción 8.00.
 Variación de pH (pH optimo)
0,400
0,350
0,300

Abs 410 nm
0,250
0,200
0,150
0,100
0,050
0,000
3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00
pH

Figura 10: pH óptimo de reacción con la bromelina inmovilizada.

En cuanto al efecto de temperatura se encuentra un máximo a 37°C tomando este como la temperatura
óptima para la reacción de bromelina con el sustrato.

Variación de Temperatura
(Temperatura optima)
0,140
0,120
Abs 410 nm

0,100
0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
0 20 40 60 80 100
Temperatura °C

Figura 11: Temperatura óptima de reacción con la bromelina inmovilizada.

Con todos los parámetros definidos, se realizó el estudio del efecto de la concentración de BAPNA en la
velocidad de reacción de la enzima inmovilizada, con el fin de determinar la constante de Michaelis (Km)
y la Velocidad máxima (Vmax).

Volumen [s] Abs 410 Abs 410 Velocidad

1/[s] 1/v
s (mg/ml) nm nm*FD (Abs/min)
0,25 0,025 0,098 0,294 0,0049 40,00 204,08
0,5 0,05 0,131 0,393 0,00655 20,00 152,67
0,75 0,075 0,156 0,468 0,0078 13,33 128,21
1,25 0,125 0,203 0,609 0,01015 8,00 98,52
1,5 0,15 0,211 0,633 0,01055 6,67 94,79
1,75 0,175 0,220 0,66 0,011 5,71 90,91
2 0,2 0,229 0,687 0,01145 5,00 87,34
3 0,3 0,213 0,639 0,01065 3,33 93,90

Tabla 4: Estudio cinético de bromelina en extracto crudo

0.25 𝑚𝐿 ∗ 0.3(𝑚𝑔/𝑚𝐿)
[𝑠](𝑚𝑔/𝑚𝐿) = = 0.025 𝑚𝑔/𝑚𝐿
3𝑚𝐿
𝐴𝑏𝑠 410𝑛𝑚 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 = 0.098 ∗ 3 = 0.294
 𝟎, 294
𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 (𝜟𝑨𝒃𝒔/𝒎𝒊𝒏) = = 𝟎. 0049
20 𝒎𝒊𝒏

Estudio Cinetico de la bromelina de

pulpa de piña inmovilizada
Velocidad (uA/min) 0,012

0,01

0,008

0,006

0,004
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
[s] (mg/mL)

Figura 12: Gráfica de michaelis para el estudio cinético de la bromelina de pulpa de piña inmovilizada.
230,00
210,00
190,00
170,00
1/v (uA/min)

150,00
130,00 y = 3,387x + 74,595
R² = 0,977
110,00 Km = 0,045 mM
90,00 Vmax = 0,0134 uA/min

70,00
50,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
1/[s] (mg/mL)-1

Figura 13: Linealización de la gráfica del estudio cinético de bromelina de pulpa de piña
3,387
𝐾𝑚 = = 0,045 𝑚𝑀
74,595
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = = 0,0134𝑢𝐴/𝑚𝑖𝑛
74,595

A partir de los datos en la Figura 13 y usando métodos numéricos (su uso se discute en el análisis
de los resultados) se obtuvo que la Km era equivalente a 0,045 mM y la Vmax a 0,0134 mM/min.

Discusión y resultados

Es importante aclarar que inicialmente se iba a utilizar caseína como sustrato para llevar a cabo la
reacción enzimática con la Bromelina y se media a 270 nm para determinar el rompimiento de
enlaces peptídicos por medio de la tirosina, la cual tiene una interacción máxima con la radiación
electromagnética a 270 nm, y se planificaba cuantificar contenido de proteínas por medio de una
curva de calibración con tirosina. Sin embargo, este procedimiento no fue posible utilizarlo puesto
que las absorbancias obtenidas con el sustrato de caseína y la enzima presentaban interferencias
en la respuesta de absorbancia, de manera que al aumentar el doble la cantidad de sustrato con la
misma cantidad de enzima no lográbamos ver una duplicación en la absorbancia. Así, el
procedimiento utilizado posteriormente fue con un sustrato analítico llamado BAPNA (Clorhidrato de
N-benzoil-DL-arginina p-nitroanilida) el cual no presentaba interferencias debido a que la hidrólisis del
BAPNA produce N-benzoil-DL-arginina y p-nitroanilina siendo el último un compuesto coloreado y
medible a 410 nm Figura 14, absorbancia a la cual el extracto no presenta una absorción máxima, esto
se evidenció al duplicarse la respuesta de absorbancia cuando aumenta la cantidad de sustrato en la
actividad de la Bromelina sobre el sustrato.

Figura 14. Reacción de la enzima con el sustrato BAPNA para producir N-benzoil-DL-arginina y p-
nitroanilina respectivamente, de los cuales el último es medible a 410nm.

Con el fin de evaluar la cantidad de proteína extraída, se determinó la concentración de proteína en cada
uno de los extractos a través del método de curva de calibración de caseína medida a 280 nm, Figura 1
y Tabla 1, dando resultados de 13,65 mg/mL para el extracto crudo, 3,69 mg/mL para el extracto
parcialmente purificado y 2,08 mg/mL de solución CaCl2 residual de la inmovilización. El último resultado
muestra como la inmovilización no fue del 100% puesto que quedó parte de la proteína en solución y no
al interior de las perlas formadas con el alginato. De acuerdo con los resultados obtenidos en la Tabla 2,
la actividad dada para el extracto crudo fue de 0,021 Abs/min, la actividad enzimática para la proteína
parcialmente purificada fue de 0,013 Abs/min el extracto crudo presenta mayor actividad que el extracto
parcialmente purificado, por tal motivo se procedió a utilizar éste para la continuidad del proyecto, debido
a que en el extracto crudo posiblemente había otras proteasas presentes en la muestra y al purificar con
acetona se perdió parte de la actividad que presentaban estas de manera que la absorbancia bajó y por
ende disminuye la actividad de la proteína parcialmente purificada.

Aunque la cantidad de proteína del extracto crudo es alta se puede decir que la concentración de
bromelina no es tan significativa en el extracto, ya que la actividad proteolítica tiende a tener valores
bajos, menores en todo caso a los que son reportados usualmente para este grupo de enzimas. Este
comportamiento es contrario al esperado, debido a que la bromelina constituye del 30 al 40 % de la
proteína total presente en A comosus, sin embargo, se ha visto que la cantidad de proteasas en la piña
varía enormemente entre las diferentes localizaciones geográficas (Rowan et al., 1954). Note además
que la mayor actividad se encontró en el extracto crudo y no en el precipitado (proteína parcialmente
purificada) tal como se esperaba para la bromelina por no ser soluble en acetona, probablemente esto
no se dio debido a que no se logró la precipitación total de las proteínas.

Llegados a este punto, se inició el estudio cinético del extracto obtenido. El volumen óptimo de extracto
(Figura 2) se determinó como 1.00 mL a 1.50 mL, volúmenes que en general son grandes (en
comparación con los volúmenes que usualmente se usan en enzimología, del orden de los microlitros).
La explicación más probable es que la concentración de enzima es baja en el extracto, por lo que para
tener una actividad cuantificable que supere el ruido de fondo y la absorbancia basal de la solución, es
necesario una cantidad “óptima” de bromelina.

Por otra parte, el tiempo óptimo de reacción se determinó como 15 minutos (Figura 3), debido a que el
aumento en absorbancia a tiempos más largos no es significativamente mayor, en otras palabras, en este
tiempo se obtiene la mejor absorbancia posible, en el sentido que es un intervalo de tiempo que permite
hacer varias determinaciones y a su vez tener respuestas significativas.

Por otro lado, el rango de pH permitió evaluar que la mayor actividad de la enzima era a valores entre 7
y 8 (Figura 4). En diversos estudios se ha encontrado que el rango de pH en el cual se presenta una
buena actividad es amplio (de 4 a 9 unidades), sin embargo, es usual que los estudios de actividad
enzimática para la bromelina se hagan cercanos a pH neutro, que como se demostró es donde existe
mayor actividad catalítica (Rowan et al., 1994; Manzoor et al., 2016; BRENDA1). Además, el rango de
temperatura optimo resulto ser 37°C. Los reportes muestran que la actividad enzimática mayor se
encuentra entre 37 y 46 °C (BRENDA1).
En vista de que ya se habían determinado las mejores condiciones de reacción, se determinó la constante
de Michaelis-Menten y la Velocidad máxima, de acuerdo al protocolo propuesto por Ánzola Velasco &
López Rico, 2013; adaptando los volúmenes al experimento de actividad proteolítica. La constante de
Michaelis fue de 0,01 mM y la Vmax de reacción fue de 0.236 uA/min. La determinación de las constantes
se hizo a partir de los datos experimentales y a través de la linealización de Lineweaver-Burk.

El Km es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de velocidad

máxima, por lo que da referencia a la afinidad de la enzima por el sustrato. Cuando Km es muy grande
menor es la afinidad enzima-sustrato, es decir, predominan las formas enzima y sustrato libres. Por lo
anterior, el valor de Km dependerá del sustrato utilizado por lo que para este estudio no se tendrá un
valor de literatura con el cual comparar debido a que no hay reporte de cinéticas de reacción de Bromelina
con BAPNA en la literatura. Lo que sí se puede decir del Km encontrado (Figuras 6 y 7) es que el valor
de 0,01 mM para el extracto crudo de bromelina de pulpa de piña indica una buena afinidad respecto al
BAPNA.

Por definición la enzima inmovilizada es aquella que esta confinada en un espacio definido, que retiene
su actividad catalítica y puede ser reutilizada de forma continua (Romero Cedillo et al., 2014). Sin
embargo, como se demostró en la tabla 2 la actividad catalítica se vio alterada siendo evidente por el
aumento del valor de Km (0,045 mM) lo que implica la disminución de la afinidad de la enzima por el
sustrato debido a diferentes factores como son: la cantidad de proteína encapsulada, ya que como fue
dicho anteriormente no toda la proteína utilizada en la inmovilización fue encapsulada, y además, el hecho
de que la enzima se encuentre encapsulada dificulta la interacción del sustrato con el sitio activo. En
cuanto a la velocidad máxima de la bromelina inmovilizada (Figuras 12 y 13) se encontró una disminución
significativa respecto a la del extracto crudo de bromelina (0,0134 vs 0,236), lo cual concuerda dado que
la disminución en la velocidad de reacción es consecuencia de una disminución en la afinidad enzima
sustrato.

Aunque la inmovilización permite mantener la actividad enzimática por un periodo más largo de tiempo
para su reutilización, se evidencio que al reutilizar las perlas 4 días después su actividad había disminuido
(tabla 2) lo cual puede explicarse por la autolisis lenta pero progresiva de la enzima. Lo cual concuerda
con resultados de otros investigadores, en los cuales queda claro que como consecuencia de la
inmovilización enzimática, algunas de sus propiedades como la actividad catalítica o la estabilidad al
cambio de pH llegan a ser alteradas, en muchas ocasiones en contravía de lo esperado debido a que
algunos soportes generan microambientes que no son similares a los de la proteína en estado libre
natural (Romero Cedillo et al., 2014).
En cuanto a las condiciones cinéticas óptimas observadas para la enzima inmovilizada, se encuentran
las mismas condiciones óptimas para la temperatura, dando un resultado de 37 °C como se muestra en
la Figura 11. Mientras que hay un cambio tanto en el tiempo de reacción como en el pH óptimo, Figura
9 y Figura 10 respectivamente, esto se explica puesto que el alginato estabiliza la enzima haciéndola
más resistente a pH Básicos y respecto al tiempo, este se aumenta ya que la interacción enzima sustrato
se dificulta debido a la encapsulación.

Conclusiones:
Bromelina (extracto crudo) Bromelina inmovilizada
Tiempo Optimo (min) 10-30 20-30
pH Optimo 7-8 8-9
Temperatura optima °C 37 37
Km (mM) 0,01 0,045
Velocidad Maxima (uA/min) 0,236 0,0134

• A partir del fruto de la piña, se logró la extracción de un grupo de enzimas proteolíticas, entre ellas
la bromelina.
• A partir del extracto crudo se pudieron determinar las condiciones óptimas para la actividad
enzimática.
• Se generó la inmovilización del extracto por encapsulación con alginato, a partir de las cuales se
determinaron las condiciones óptimas para la actividad del extracto inmovilizado.
• El extracto inmovilizado presento menor actividad, por lo que se puede concluir que en efecto la
inmovilización causa el cambio de algunas de sus propiedades.
• La Bromelina del extracto crudo presenta una mayor afinidad por el sustrato que la bromelina
inmovilizada observándose además una mayor velocidad máxima de reacción en la primera que
en la inmovilizada.

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