Vous êtes sur la page 1sur 170

 voisp

 
 
 
 

THESE 

Présentée  pour  l’obtention du titre  de  Docteur  de  l’université  de  la  Réunion  

Spécialité  : BIOCHIM IE 

 
 

Etude   des  modifications  structurales  et   fonctionnelles  de   l’albumine  

dans  le   diabète  de   type   2   :  identification  de   biomarqueurs  de  

glycoxydation et  de  facteurs de  risque  de  complications vasculaires 

 
Par  

Alexis Guerin‐Dubourg 

 
 
 
Soutenue  publiquement  le mercredi 03  décembre  2014  
Amphithéâtre  Charpak,  Saint  Denis de La  Réunion 
 
 
 
 
Pr.  P.  GILLERY   Professeur  et  Praticien Hospitalier,  CHU  Reims  Rapporteur  

Pr.  D.  GRUSON    Professeur,  Clinique  Universitaire  St  Luc,  Bruxelles  Rapporteur  

Dr.  O.  M EILHAC   Directeur  de  Recherches INSERM , Uté  de  La  Réunion  Examinateur 

Dr.  M  COURNOT   Docteur  et  Praticien Hospitalier,  CH G.M artin,  St  Paul    Examinateur  

Pr  E.  BOURDON    Professeur,  Université  de  la  Réunion  Directeur   

DrHDR P.  RONDEAU    Ingénieur  d’Etudes, Université  de  la  Réunion  Co ‐Directeur   

 
  2
L’ensemble des t ravaux de cet t e t hèse de sciences ont  ét é réalisés au  sein  du  laborat oire 

GEICO‐UFR Sant é‐Universit é de La Réunion  et  du  laborat oire de Biochimie du  CHU La 

Réunion ‐Hôpit al  Félix Guyon. 

 
Je  t iens  à  remercier   premièrement   t ous  ceux  qui   m’ont   sout enu   dans  ce  projet   avant   même 

la créat ion  sinon  aux premières heures du  CHU et  de l’UFR‐Sant é Universit é de La Réunion:  

 
 Professeur  Pascale GUIRAUD (Doyen  de l’UFR Sant é) :  merci  pour  t on  sout ien  amical, 
t a  confiance  t oujours  affirmée  à  mon   égard   et   pour   m’avoir   permis  de  m’épanouir   dans 
mes act ivit és de recherche et  d’enseignement  à l’UFR Sant é ces 4 dernières années. 
 
 M .  David   GRUSON   (Direct eur   général   du   CHU)  et   M .  Lionel   CALENGE  (Direct eur  
Général   Adjoint   du   CHU)  merci   pour   vot re  confiance,  vot re  disponibilit é  et   pour   m’avoir  
sout enu  dans la réalisat ion  de cet t e projet .  
 
 Professeur   Christ ian   LEFEBVRE  D’HELLENCOURT  (Direct eur   du   GEICO) :   merci     de 
m’avoir   accueilli   dès  mon   st age  de  mast er   2  dans  t on   laborat oire,  pour   t es  conseils  avert is 
et  pour  t es encouragement s à poursuivre ces t ravaux dans le cadre d’un  doct orat . 
 
 Dr   Xavier   DEBUSSCHE  (Président   de  la  DRCI) :   t u   m’as  accompagné  dès  mon   arrivée 
au  CHR, t u  m’as t oujours encouragé à aller  de l’avant  et  à me projet er  bien  au ‐delà de mes 
propres  ambit ions.  M erci   pour   t on   sout ien,  t on   amit ié,  t es  conseils  et   pour   m’avoir  
présent é bon  nombre des act eurs de la recherche à La Réunion.  
 
 M .  Christ ian   M ERIAU   (Direct eur   du   CYROI) :   pour   t on   accueil    t oujours  chaleureux  au  
CYROI, merci  d’avoir  syst émat iquement  défendu  mes différent s projet s.  
 
 Dr   M aya  CESARI   (Direct eur   scient ifique  –  CYROI),  pour   m’avoir   accompagné  dans  ma 
recherche  init iale  d’un   st age  de  M 2  sur   l’île  de  La  Réunion,  pour   m’avoir   mis  en   relat ion  
avec le duo  Emmanuel  Bourdon  ‐ Philippe Rondeau. M erci  pour  t a bienveillance.  
 
 Dr   Frank  TALLET  (Chef   du   Pôle  Plat eau   Technique  –  Chef   de  service  de  Biochimie  – 
CHU  La  Réunion)  pour   m’avoir   accueilli   les  bras  ouvert s  dans  t on   laborat oire,  pour   m’avoir  
permis  d’effect uer   ces  t ravaux  de  recherche  dans  des  condit ions  opt imales.  M erci   Frank 
pour   t es  encouragement s,  t on   amit ié  et   t ous  t es  conseils   prodigués  durant   nos  années  de 
t ravail  en  commun. Je t acherai  d’en  faire bon  usage. 
 
 
C’est   grâce  à  vot re  engagement   à  t ous  que  ce  projet   a  pu   se  concrét iser.  Sans  vous  La 

Réunion  ne disposerait  pas aujourd’hui  d’out ils performant s d’encadrement  pédagogique en  

sciences de la sant é, en  biochimie et  en  recherche clinique. 

  3
Je  remercie  t out   part iculièrement   les  act eurs  principaux  de  cet t e  t hèse  qui   m’ont  

accompagné durant  ces 4 années de t ravail  :  

 
 
A  M onsieur   Emmanuel  BOURDON ,  Professeur   Universit aire,  Responsable  pédagogique et  

Direct eur   de  Thèse  :   pour   m’avoir   accompagné  avec  bienveillance  et   pat ience  t out   au   long 

de  ces  années.  Pour   avoir   su   me  sout enir   et   encourager   quand   il   le  fallait .  Je  t e  remercie, 

ainsi   que  l’ensemble  du   groupe  GEICO,  de  m’avoir   donné  l’envie  et   le  goût   de  poursuivre 

dans la recherche et  de finaliser  ce t ravail  de t hèse. 

 
A  M onsieur   Philippe   RONDEAU ,  Ingénieur   d’Et udes,  HDR   et   Co ‐Direct eur   de  Thèse  :   rien   de 

ces  t ravaux  n’aurait   pu   êt re  possible  sans  t a  cont ribut ion.  Je  t e  remercie  pour   t on  

encadrement   et   t on   expert ise  t echnique  si   précise.  Vous  formez  avec  Emmanuel   un   duo  

remarquable  de  complément arit é  et   vous  m’avez  fait   découvrir   une  vision   conviviale  et  

humaine  de  la  recherche.  M erci   aussi   d’avoir   su   ent recouper   ces  t ravaux  par   des  pauses 

gast ronomiques  fromagères  savoyardes,  que  je  qualifierai   de  «  t art iflesques »,  dont   t oi   seul  

a le secret . 

 
A  M onsieur   Olivier   M EILHAC,  Direct eur   de  Recherche :   t on   ent housiasme  et   t on   énergie 

désormais  légendaires  sont   pour   moi   une  source  d’inspirat ion   formidable.  M erci   pour   t on  

sout ien   amical,  t on   accueil   dans  la  fut ure  équipe  DETROI  et   pour   t es  encouragement s. 

J’espère  sincèrement    que  l’avenir   nous  donnera  l’opport unit é  de  t ravailler   sur   des  projet s 

communs. 

 
A  Jennifer   BARAKA‐VIDOT,  pour   nos  échanges  scient ifiques,  professionnels  et   amicaux 

durant   ces  4  années  qui   auront   cont ribués  à  nos  t ravaux  respect ifs.  Je  t e  souhait e  un   bel  

avenir  dans la recherche scient ifique. 

 
A  Aurélie  CATAN   et   Cynt hia  PLANESSE  pour   vot re  part icipat ion   act ive  à  ces  t ravaux  et   pour  

vos sourires qui  m’ont  t oujours accueillis. 

  4
Je  remercie  également   M lle  CURDY,   M essieurs  ROBERT  et   M AILLOT,  t echniciens  de 

laborat oire, qui  m’ont  aidé à recueillir  les prélèvement s nécessaires à cet t e ét ude. 

 
M erci   aussi   à  M onsieur   Adrian   FIANU   (Biost at ist icien  :   CIC  –  CHU  La  Réunion)  pour   le  t emps 

précieux  que  t u   as  su   m’accorder   dans  l’expression   mét hodologique  et   st at ist ique  de  mes 

idées. Bon  courage à t oi  pour  la fin  de t on  projet  de t hèse. 

 
A  t ous  les  membres  du  GEICO  qui   devient   aujourd’hui   une  des  premières  unit és  INSERM   de 

La  Réunion  :   merci     aux  enseignant s  chercheurs,  doct orant s  et     t echniciens  de  recherche  

pour   vot re  accueil   et   vot re  convivialit é,  ce  fut   t oujours  un   t rès  grand   plaisir   de  quit t er   mon  

laborat oire  de  biologie  médicale  pour   venir   me  rafraîchir   les  idées  dans  vot re  laborat oire  de 

recherche. 

 
 
 
 
 
 
 
A mes grand ‐mères,  

 
 
 
A mes parent s, 

 
 
 
A mes amis, 

  5
  6
 
 
 
 
 
 
A Emeline, ma moit ié  

 
 
 
A Barnabé, Sacha et  Clément ine nos enfant s chéris 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ce sont  vos sourires qui  me donnent  la force d’avancer…. 

  7
  8
ABREVIATIONS
ADA  American  Diabet es Associat ion  
ADP  Adenosine diphosphat e 
AGEs  Advanced  Glycat ion  End  Product s 
AGJ  Anomalie de glycémie à  jeun  
AOM I  Art ériopat hie oblit érant e des membres inférieurs
AOPPs  Produit s d’oxydat ion  prot éiques avancés 
APP  Amyloid  prot ein  precursor  
AVC  Accident  Vasculaire Cérébral  
bFGF  Basic Fibroblast  Grow t h  Fact or  
CM L  Carboxy M et hyl  Lysine 
CRP  Prot éine C‐réact ive 
CV  Cardiovasculaire 
DAG  Diacylglycérol  
DDI  D‐Dimères  
DN‐RAGE   Dominant  Negat ive RAGE 
eNOS  Endot helial  nit ric oxyde synt hase 
esRAGE  Endogenous secret ory RAGE 
FID  Fédérat ion  Int ernat ionale du  Diabèt e 
FR  Fact eurs de risque  
GA  Glycat ed  Albumin  
GPxs  Glut at hion  peroxydases  
HAS   Haut e Aut orit é de Sant é 
HbA1c  Hémoglobine glyquée 
HDL  High  densit y lipoprot ein  
HGPO  hyperglycémie provoquée par  voie orale 
HM GB1  High  mobilit y group  box‐1 
HPLC  High  Perfromance Liquip  Chromat ography 
HTA  Hypert ension  Art érielle 
ICAM ‐1   Int racellular  adhesion  molecule‐1 
IDL  Int ermediat e‐densit y lipoprot ein  
IG  Int olérance au  glucose 
IL‐1β  int erleukine 1β  
IL‐6  Int erleukine 6  
IL‐6  Int erleukine 6  
IL‐8  Int erleukine 8 
IM   Infarct us du  M yocarde 
IM A  Ischemia  M odified  Albumin  
IM T  Epaisseur  Int ima ‐M edia  (int ima ‐media  t hickness)
InVS  Inst it ut  de Veille Sanit aire 
IPS  Indice de pression  syst olique  
IRS  Insulin  Responsiv Element  

  9
LDL  Low  densit y lipoprot ein  
Lp ‐PLA2   Lipoprot ein  associat ed  Phospholipase A2 
M APK  M it ogen ‐Act ivat ed  Prot ein  Kinase 
M CP‐1  M onocyt e chemot act ic‐prot ein ‐1 
M CV  M aladie cardiovasculaire 
mDia ‐1  M ammalian  diaphanous1   
M GO  M ét hylglyoxal  
NADH  Nicot inamide Adénine Dinucléot ide 
NADPH  Nicot inamide Adénine Dinucléot ide Phosphat e 
NF‐kB  Necrosis Fact or  kappa  B 
NO  M onoxyde d'azot e 
OM S  Organisat ion  mondiale de la  Sant é 
PAF  Plat elet  act ivat ing  fact or  
PAI‐1  Inhibit eur  de l'act ivat eur  du  plasminogène 
PAS  Pression  art érielle syst olique 
PGI2  Prost acycline 
PI3K  Phosphoinosit ol  3 kinase 
PKC  Prot éines kinases C  
RAGE   Recept or  for  advanced  glycat ion  end ‐product s 
RBP4   Rét inol ‐binding  prot ein ‐4 
RE  Rét iculum  endoplasmique  
ROS  React iv Oxygen  Species 
SAA  Serum  Amyloïde A 
SCA  Syndrome coronarien  aigu   
SOD  Superoxide dismut ase 
sRAGE  RAGE solubles  
TGF‐   Tumor  Grow t h  Fact or  )  
TLR  Toll  like recept or   
TNF‐   Tumor  Necrosis Fact or ‐α 
t PA  Act ivat eur  du  plasminogène t issulaire 
TT/ TH   Rapport  t our  de t aille/ t our  de hanches  
VCAM ‐1   Vascular  Cell  Adhesion  M olecule‐1 
VEGF  Vascular  endot helial  grow t h  fact or  
VLDL  very low ‐densit y lipoprot ein  
WHO  World  Healt h  Organizat ion  

  10
TABLEAUX
Tableau  1  ERM IES  données générales d’inclusion  (moyenne + / ‐ écart ‐t ype) 

Tableau  2  Données  biologiques  (moyenne  +/ ‐  écart ‐t ype)  présent ées  par   sous‐
groupes  d’at t eint es  vasculaires  relevées  à   l’inclusion   d’ERM IES  (absence 
d’at t eint e  vasculaire  vs.  Complicat ion   vasculaire  comparaison).  Les 
variables sont  comparées selon  le t est  t  de St udent  (en  gras, p  < 0,2). 
 

Tableau  3  Coefficient s  de  corrélat ion   de  Spearman   ent re  biomarqueurs  de  glycat ion  
(HbA1c,  fruct osamines,  GA),  d’oxydat ion   (IM A)  et   de  glycoxydat ion  
(AGEs).  (*  p  <0,001) 

  11
FIGURES
Figure n°1  Prévalence  du   diabèt e  de  t ype  2.  Données  2013  mondiales  et   répart it ion  
par  cont inent  

Figure n°2  M ort alit é liée au  diabèt e chez les individus de moins de 60 ans 

Figure n°3   M écanismes int racellulaires de l’insulinorésist ance 

Figure n°4   St ruct ure de la  paroi  vasculaire et  place de l’endot hélium  vasculaire 

Figure n°5   Coupe  schémat ique  d’une  art ère  saine  et   d’une  art ère  art érioscléreuse : 
place de l’endot hélium  vasculaire 

Figure n°6   Dysfonct ion   endot héliale  et   complicat ions  cardiovasculaires  du   diabèt e : 
at hérosclérose, néphropat hie et  rét inopat hie 

Figure n°7   Coupure Homolyt ique d’une molécule et  product ion  d’espèces radicalaires 

Figure n° 8   représent at ion   schémat ique  des  mécanismes  de  product ion   de  ROS  au  
cours du  diabèt e   

Figure n° 9  Principaux sit es de l’albumine impliqués dans son  act ivit é ant ioxydant e 

Figure n°10    M écanismes  physiologiques  de  générat ion   de  ROS  et   principales  défenses 
ant ioxydant es 

Figure n°11    Format ion  des produit s d’Amadori  et  réarrangement  oxydat ifs en  produit s 
avancés de glycat ion  – Phénomène de glycoxydat ion  

Figure n°12    Différent es formes d’AGEs rencont rés au  cours du  diabèt e 

Figure n°13    St ruct ure  t ridimensionnelle  de  l’albumine :   représent at ion   des  sit es  de 
liaison   spécifique  de  Sudlow   (t ype  1  et   t ype  2)  et   des  principaux  sit es  de 
glycat ion  (lysines) 

  12
Figure n°14    Produit s  avancés  de  Glycat ion   –  Sources  et   implicat ions 
physiopat hologiques  
96

Figure n°15    Récept eurs RAGE – Principales Isoformes 

Figure n°16    Effet s cellulaires de l’act ivat ion  du  RAGE – Transduct ion  du  Signal  

Figure n°17    Valeurs  comparat ives  de  concent rat ions  plasmat iques  de  biomarqueurs 
(moyenne  +/ ‐  écart ‐t ype)  ent re  les  groupes  sans  complicat ion   vasculaire 
vs. avec complicat ion  vasculaire 

Figure n°18    Dist ribut ion   des  valeurs  d’IM A  (DO)  et   d’IM A/ Albumine  ent re  les  groupes 
sans  complicat ion   vasculaire  et   avec  complicat ion   vasculaire  relevée  à  
l’inclusion   d’ERM IES.  Représent at ion   en   box‐plot   (valeur   minimale,  25  
ème

percent ile, valeur  médiane, 75  percent ile et  valeur  maximale) 


ème

Figure n°19    Courbes  ROC  (Receiver   Operat ing   Charact erist ic)  des  paramèt res 
biologiques  IM A  et   de  l’HbA1c   rapport ées  à   l’ident ificat ion   des  at t eint es 
vasculaires  relevées  à   l’inclusion   d’ERM IES.  Données  comparées  d’aire 
sous la  courbe 

Figure n°20    Dist ribut ion   des  valeurs  d’AGE    et   de  GA    ent re  les  groupes  sans 
complicat ion   vasculaire  et   avec  complicat ion   vasculaire  relevée  à  
l’inclusion   d’ERM IES.  Représent at ion   en   box‐plot   (valeur   minimale,  25  
ème

percent ile, valeur  médiane, 75  percent ile et  valeur  maximale) 


ème

  13
  14
SOMMAIRE 
ABREVIATIONS............................................................................................................................ 9  

TABLEAUX................................................................................................................................. 11  

FIGURES.................................................................................................................................... 12  

SOM M AIRE............................................................................................................................... 15  

INTRODUCTION ........................................................................................................................ 18  

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE....................................................................................................... 21  

1. LE DIABETE  DE TYPE 2...................................................................................................... 23  

1.1. Définit ion ................................................................................................................... 23  

1.2. Epidémiologie ............................................................................................................ 23  

1.2.1. Epidémiologie mondiale..................................................................................... 23  

1.2.2. Epidémiologie en  France .................................................................................... 26  

1.3. Diagnost ic et  suivi...................................................................................................... 27  

1.3.1. La glycémie ......................................................................................................... 27  

1.3.2. L’hémoglobine glyquée (HbA1c) ........................................................................ 28  

1.4. Et iologie et  immunopat hologie du  diabèt e de t ype 2 .............................................. 28  

1.4.1. Les fact eurs génét iques...................................................................................... 29  

1.4.2. Les fact eurs environnement aux......................................................................... 29  

1.4.3. Immunologie ...................................................................................................... 30  

1.5. Complicat ions  chroniques du  diabèt e...................................................................... 34  

1.5.1. Complicat ions microangiopat hiques.................................................................. 35  

1.5.2. Complicat ions macroangiopat hiques................................................................. 36  

2. COM PLICATIONS CARDIOVASCULAIRES DU DIABETE DE TYPE2 ...................................... 37  

2.1. Les complicat ions cardiovasculaires du  diabèt e ....................................................... 37  

2.1.1. Cardiopat hie ischémique ................................................................................... 37  

2.1.2. Art érit e des membres inférieurs........................................................................ 39  

2.1.3. At hérosclérose carot idienne .............................................................................. 39  

2.2. Complicat ions vasculaires et  fonct ion  endot héliale ................................................. 40  

2.2.1. L’endot hélium  vasculaire :  rôle physiologique .................................................. 40  

  15
2.2.2. Dysfonct ion  endot héliale et  pat hologies vasculaires ........................................ 43  

3. Evaluat ion  du  risque cardiovasculaire et  pat hologie diabét ique :  fact eurs de risque..... 46  

3.1. Fact eurs de risques cardiovasculaires convent ionnels............................................. 46  

3.1.1. Les dyslipidémies................................................................................................ 46  

3.1.2. L’hypert ension  art érielle .................................................................................... 47  

3.1.3. L’âge et  le sexe ................................................................................................... 48  

3.1.4. Le t abagisme ...................................................................................................... 48  

3.1.5. Le surpoids et  l’élévat ion  du  rat io  t our  de t aille/ t our  de hanches.................... 48  

3.2. Evaluat ion  du  risque vasculaire................................................................................. 49  

3.2.1. Le score de Framingham .................................................................................... 49  

3.2.2. Risque cardiovasculaire et  diabèt e de t ype 2 .................................................... 49  

3.3. Améliorer  le dépist age du  risque cardiovasculaire................................................... 51  

4. DIABETE, STRESS OXYDANT ET HYPERGLYCEM IE CHRONIQUE........................................ 53  

4.1 Hyperglycémie chronique et  st ress oxydant .............................................................. 53  

4.1.1. Définit ions des radicaux libres. .......................................................................... 53  

4.1.2. Diabèt e de t ype 2 et  hyperproduct ion  de radicaux libres ................................. 54  

4.1.3. Les défenses ant ioxydant es. .............................................................................. 57  

4.1.4. Conséquences de l’hyperproduct ion  d’espèces réact ives de l’oxygène. .......... 62  

4.2. Hyperglycémie chronique et  AGEs (advanced  glycat ion  end ‐product s)................... 65  

4.2.1. Format ion  des AGEs :  phénomène de Glycoxydat ion........................................ 65  

4.2.2. Effet s des AGEs sur  la mat rice ext racellulaire, les prot éines circulant es et  

cellulaires...................................................................................................................... 68 

4.2.3. Les Récept eurs aux AGEs. .................................................................................. 72  

OBJECTIF DU TRAVAIL .............................................................................................................. 78  

PARTIE EXPERIM ENTALE .......................................................................................................... 81  

1. ETUDES DES M ODIFICATIONS STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES DE L’ALBUM INE AU 

COURS DU DIABETE DE TYPE 2 ............................................................................................. 83  

1.1.  Int roduct ion ........................................................................................................... 83  

1.2. Résult at s.................................................................................................................... 85  

1.3.  Discussion ............................................................................................................. 107  

1.4.  Conclusion ............................................................................................................ 109  

  16
2. EFFETS CELLULAIRES DE L’ALBUM INE M ODIFIEE AU COURS DU DIABETE.................... 111  

2.1. Int roduct ion............................................................................................................. 111  

2.2. Résult at s.................................................................................................................. 112  

2.3. Discussion ................................................................................................................ 127  

2.4. Conclusion ............................................................................................................... 128  

3. ETUDE PILOTE D’ASSOCIATION DES FORM ES M ODIFIEES DE L’ALBUM INE (AGES, GA ET 

IM A) AUX ATTEINTES VASCULAIRES DES PATIENTS DIABETIQUES :  ERM IES‐ALBOX......... 131  

3.1. Et at  act uel  des connaissances................................................................................. 131  

3.1.1. Les complicat ions vasculaires du  diabèt e de t ype 2 ........................................ 131  

3.1.2. Prévent ion  des complicat ions vasculaires du  diabèt e ..................................... 131  

3.1.3. Glycat ion  des prot éines et  st ress oxydat if  dans le diabèt e ............................. 132  

3.2. Object ifs de la recherche ........................................................................................ 133  

3.3. Aspect s M ét hodologiques....................................................................................... 134  

3.3.1. Schéma de la recherche ................................................................................... 134  

3.3.2.  Crit ères d  ‘éligibilit é......................................................................................... 135  

3.3.3.   Crit ères d’évaluat ions..................................................................................... 136  

3.3.4.   M ét hodes analyt iques.................................................................................... 137  

3.3.5.   Analyse st at ist ique des données.................................................................... 139  

3.4. Résult at s.................................................................................................................. 141  

3.4.1 Descript ion  générale de la populat ion  observée .............................................. 141  

3.4.2 Corrélat ions des marqueurs biochimiques ....................................................... 144  

3.4.3 IM A et  at t eint es vasculaires.............................................................................. 145  

3.4.4 GA, AGEs et  at t eint es vasculaires ..................................................................... 147  

3.5. Discussion, conclusions et  perspect ives.................................................................. 148  

CONCLUSION .......................................................................................................................... 153  

BIBLIOGRAPHIE....................................................................................................................... 157  

  17
INTRODUCTION
Le  diabèt e  de  t ype  2  est   considéré  aujourd’hui   comme  le  mal   du   siècle.  Cet t e  maladie 

mét abolique  chronique,  liée  aux  changement s  de  mode  de  vie  et   d’habit udes  aliment aires 

de  ces  30  dernières  années,  voit   en   effet   son   incidence  croît re  de  manière  exponent ielle  et  

t ouche désormais plus de 350 millions de personnes à t ravers le monde.  

 
La  mort alit é  du   diabèt e  de  t ype  2  est   principalement   due  aux  complicat ions  vasculaires  de 

cet t e  pat hologie  amenant ,  à  t erme,  à  des  événement s  cardiovasculaires  graves  t els 

l’infarct us  du   myocarde  (IM )  ou   encore  des  accident s  vasculaires  cérébraux  (AVC).  Le  risque 
1
d’événement   cardiovasculaire  est   mult iplié  par   3  chez  les  pat ient s  souffrant   du   diabèt e . 

L’hyperglycémie  chronique  rencont rée  au   cours  du   diabèt e  est   donc  considérée  aujourd’hui  

comme un  fact eur  de risque cardiovasculaire. 

 
Des effort s import ant s doivent  t oujours êt re fournis en  t erme de dépist age et  de prévent ion  

du  diabèt e de t ype 2 à t ravers le monde pour  enrayer  la progression  de cet t e pandémie. Il  en  

est   de  même  pour   le  dépist age,  la  prévent ion   et   la  prise  en   charge  des  at t eint es  vasculaires 

liées  au   diabèt e.  En   effet     le  t rait ement   de  l’hyperglycémie  reconnue  comme  fact eur   de 

risques  cardiovasculaires  ainsi   que  celui   de  l’hypert ension   art érielle,  des  dyslipidémies  ou  

encore  de  l’obésit é,  fact eurs  de  risque  couramment   ut ilisés  et   associés  au   syndrome 

mét abolique  des  diabét iques  de  t ype  2,  permet t ent   de  ret arder   l’apparit ion   des 

complicat ions cardiovasculaires et  de limit er  la mort alit é liée au  diabèt e.  

 
Cependant   de  t rop   nombreux  pat ient s  souffrent     et   meurent   encore  des    complicat ions 

vasculaires du  diabèt e par  défaut  de prise en  charge puisqu’ils n’ont  pas ét é ident ifiés, sinon  

t rop   t ardivement ,  comme  à  haut   risque  cardiovasculaire  au   moyen   des  biomarqueurs 

convent ionnels.  Ceci   amène  à  penser   que  les  fact eurs  de  risque  cardiovasculaires 

act uellement   ident ifiés  sont   insuffisant s  et   que  les  mécanismes  physiopat hologiques 

amenant  aux at t eint es vasculaires du  diabèt e ne sont  pas encore t ot alement  élucidés. 

 
De  nombreux  t ravaux  rest ent   donc  à  ent reprendre  pour   mieux  comprendre  l’ensemble  des 

mécanismes  physiopat hologiques  qui   cont ribuent   à  l’augment at ion   des  at t eint es  vasculaires 

  18
au   cours  du   diabèt e.  Le  décrypt age  précis  de  ces  mécanismes  physiopat hologiques  nous 

permet t raient   ainsi   d’ident ifier   de  nouveaux  biomarqueurs  suscept ibles  de  dépist er  

précocement   les  pat ient s  à  haut   risque  vasculaire  et   pourraient   const it uer   des  cibles 

pharmacologiques  innovant es  dans  la  prise  en   charge  des  complicat ions  vasculaires  du  

diabèt e. 

 
Parmi   les  hypot hèses  couramment   évoquées,  le  laborat oire  GEICO  s’est   plus 

part iculièrement   int éressé  aux  mécanismes  combinés  de  l’hyperglycémie  et   du   st ress 

oxydant   rencont rés  au   cours  du   diabèt e.  Ces  deux  phénomènes  conjugués,  regroupés  sous 

le  nom   de  glycoxydat ion,  const it ueraient   en   effet   un   mécanisme  physiopat hologique  cent ral  

du  diabèt e et  de ses complicat ions vasculaires.  

 
Un  des axes import ant  de recherche au  laborat oire GEICO  consist e en  l’ét ude de l’effet  de la 

glycoxydat ion   sur   la  prot éine  circulant e  la  plus  abondant e  du   plasma, à  savoir   l’albumine. 

C’est  aut our  de cet  axe que l’ensemble des t ravaux de ce mémoire s’est  art iculé. Nous avons 

ici   t ravaillé  dans  un   premier   t emps  sur   l’ident ificat ion   des  modificat ions  des  propriét és 

st ruct urales  et   fonct ionnelles  de  l’albumine  au   cours  du   diabèt e.  Dans  un   deuxième  t emps 

nous  avons  cherché  à  ident ifier   si   ces  modificat ions  glycoxydat ives  de  l’albumine  avaient   

des  conséquences  physiopat hologiques  pouvant   êt re  reliées  aux  complicat ions 

cardiovasculaires rencont rées dans le diabèt e de t ype 2. 

  19
  20
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

  21
  22
1. Le diabète de type 2

1.1. Définition
 
Le  diabèt e est   défini   comme  une  affect ion   mét abolique,  caract érisée  par   une  hyperglycémie 

(t aux  de  sucre  dans  le  sang  t rop   élevé)  liée  à  une  déficience,  soit   de  la  sécrét ion,  soit   de 

l’act ion   de  l’insuline,  ou   des  deux.  L’insuline  est   une  hormone  produit e  par   le  pancréas, 

indispensable à la pénét rat ion  du  glucose sanguin  dans les cellules. Lorsqu’elle fait  défaut , le 

t aux  de  sucre  augment e  dans  le  sang,  or   l’organisme  est   t rès  sensible  à  ces  variat ions  :   la 

chronicit é  de  l’hyperglycémie  est   responsable  de  complicat ions  à  long  t erme  t ouchant   de 
2
nombreux organes not amment  les yeux, les reins, les nerfs, le cœur  et  les vaisseaux . 

 
La grande majorit é des cas de diabèt e se répart issent  en  deux cat égories :  le diabèt e de t ype 

1  et   le  diabèt e  de  t ype  2.  Les  aut res  cas  de  diabèt e  sont   le  diabèt e  gest at ionnel   défini  

comme  une  int olérance  au   glucose  début ant e  ou   découvert e  la  première  fois  pendant   la 
3
grossesse  ou  d’aut res t ypes plus spécifiques car  liés à :  des défaut s génét iques des cellules ß 

du   pancréas,  des  défaut s  génét iques  de  l’act ion   de  l’insuline,  des  maladies  du   pancréas 

exocrine,  des  endocrinopat hies,  secondaire  à  la  prise  de  médicament s  ou   de  subst ances 

chimiques,  secondaire  à  une  infect ion,  des  formes  non   communes  de  diabèt es  immuns  ou  
2
des diabèt es associés à des syndromes génét iques  . 

 
Le diabèt e de t ype 2 est  caract érisé par  une résist ance à l’insuline et  une carence relat ive de 

la  sécrét ion   d’insuline.  Son   apparit ion   est   lent e  :   il   peut   évoluer   avec  un   degré 

d’hyperglycémie suffisant  pour  engendrer  des at t eint es organiques et  fonct ionnelles dans de 

nombreux  t issus  mais  sans  sympt ôme  clinique  et   donc  sans  diagnost ic  pendant   plusieurs 

années.  Cet t e  forme  de  diabèt e  s’ét ablie  le  plus  souvent   chez  des  personnes  adult es  et   t rès 
4
majorit airement  en  surpoids . 

1.2. Epidémiologie

1.2.1.  Epidémiologie  mondiale  

  23
Selon   la  Fédérat ion   Int ernat ionale  du   Diabèt e  (FID),  l’épidémie  mondiale  du   diabèt e  a 

explosé pour  t oucher  en  2013, 382 millions de personnes, soit  8,3 % de la populat ion  adult e. 

Si   cet t e  t endance  se  poursuit ,  550   millions  de  personnes  environ,  soit   un   adult e  sur   10, 

seront  at t eint es de diabèt e d'ici  2030, ce qui  représent e près de 10 millions de nouveaux cas 

par   an.  Not ons  de  plus  que  la  proport ion   de  personnes  at t eint es  du   diabèt e  mais  non  
5
diagnost iquées est  est imé à près de 46% soit  environ  175 millions . 

 
En  Europe Occident ale, on  compt e aujourd’hui  33 millions de diabét iques, avec une 

prévision  de 50 millions en  2030.  

 
Figure n°1 :  Prévalence du  diabèt e de t ype 2. Données 2013 mondiales et  répart it ion  par  
cont inent .   
5

 
Environ   80   %  des  diabét iques  vivent   dans  des  pays  à  faible  et   moyen   revenus  et   la 

prévalence  est   supérieure  dans  les  zones  urbaines  par   rapport   aux  zones  rurales,  avec  une 

at t eint e  plus  grande  des  groupes  sociaux  défavorisés.  Les  principaux  élément s  responsables 

de  l’augment at ion   du   diabèt e  sont   les  changement s  de  st yle  de  vie  et   le  vieillissement   des 

  24
populat ions. En  2011, la t ranche d'âge la plus t ouchée par  le diabèt e, est  représent ée par  les 
5
40‐59 ans qui  t ot alisent  179 millions de personnes . 

 
Le diabèt e de t ype 2 est  un  problème de sant é mondial.  La mort alit é liée au  diabèt e est  t rès 

fort e  et   peut   représent er   selon   les  cont inent s  de  28%  à  76%  des  causes  de  décès  chez  les 

individus  de  moins  de  60  ans.  Sa  prévalence  est   fort ement   associée  à  l’et hnie  mais  son  

développement   accéléré  s'est   effect ué,  dans  la  plupart   des  pays,  en   parallèle  avec  les 

changement s  cult urels  et   sociaux  rapides  (l'urbanisat ion   croissant e,  les  changement s 

aliment aires, la réduct ion  de l'act ivit é physique) et  avec le vieillissement  démographique.  

 
La  mort alit é  des  diabét iques  est   principalement   due  aux  complicat ions  vasculaires 

rencont rées  dans  le  diabèt e  de  t ype  2  qui   associent   la  microangiopat hie  diabét ique 

(rét inopat hie,  néphropat hie  et   pied   diabét ique)  et   la  macroangiopat hie  diabét ique 

(at hérosclérose,  syndromes  coronariens,  accident s  vasculaires  cérébraux  (AVC),…).  En   effet , 

le risque d’at t eint e vasculaire est  fort ement  augment é et  les complicat ions cardiovasculaires 

associées  (AVC,  infarct us  du   myocarde  (IM ))  sont   responsables  de  80%  des  décès  des 

personnes diabét iques. 

 
Figure n°2 :  M ort alit é liée au  diabèt e chez les individus de moins de 60 ans  
5

  25
La  prévent ion   du   diabèt e  de  t ype  2  et   de  ses  complicat ions  repose  donc  essent iellement   sur  

des  modificat ions  du   st yle  de  vie,  une  modificat ion   de  l’aliment at ion   et   une  incit at ion   à  la 

prat ique sport ive. 

1.2.2.  Epidémiologie  en France  

 
L’Inst it ut   de  Veille  Sanit aire  (InVS)  rapport e,  d’après  l’analyse  du   régime  général   de 

l’assurance  maladie,  une  prévalence  du   diabèt e  t rait é  pharmacologiquement   en   France  de 

4,4  %  de  la  populat ion,  soit   2,9  millions  de  personnes  en   2009.  Cet t e  prévalence  augment e 

de  manière  cont inue  et   cela  devrait   se  poursuivre  avec  le  vieillissement   de  la  populat ion, 

l’augment at ion   de  l’espérance  de  vie  des  diabét iques  et   l’augment at ion   de  la  prévalence  de 
4
l’obésit é .  

Il   ressort   de  l’enquêt e  épidémiologique  descript ive  ENTRED  2007   (Echant illon   nat ional  

t émoin   représent at if   des  personnes  diabét iques),  que  la  grande  majorit é  des  personnes  (92 

%) ont  un  diabèt e de t ype 2. La populat ion  diabét ique est  âgée :  la moyenne d’âge est  de 65 

ans  et   un   quart   a  75  ans  ou   plus,  et   souvent   peu   aisée  financièrement .  Sur   l’ensemble  de 

l’échant illon   représent at if,  77%  des  personnes  diabét iques  sont   nées  en   France,  12%  dans 
6
un  pays du  M aghreb  et  11% dans d’aut res pays . 

 
Les zones les plus t ouchées sont  les DOM ‐TOM  (7,4% de diabét iques en  M art inique;  8,1% en  
7
Guadeloupe;   8,8%  à  La  Réunion ;   7,3%  en   Guyane),  ainsi   que  le  nord   et   le  nord ‐est   de  la 

mét ropole  (Nord ‐Pas‐de‐Calais  5,4%;   Picardie  5,3%;   Champagne‐Ardenne  5,0%;  Alsace 
6,8
5,0%) . 

 
L’augment at ion  de l’espérance de vie part icipe également  à l’augment at ion  de la prévalence 

du   diabèt e.  En   effet ,  il   exist e  une  disparit é  import ant e  selon   les  âges  :   0,4%  pour   les  0‐44  

ans,  5,8%  pour   les  45 ‐64  ans,  13,3%  pour   les  65‐74  ans  et   13,4%  pour   les  75  ans  et   plus. 

Ainsi,  la  prévent ion,  le  dépist age  et   la  prise  en   charge  des  pat ient s  diabét iques,  ainsi   que  la 

prévent ion   et   le  t rait ement   des  complicat ions  du   diabèt e  sont   des  enjeux  majeurs  de  sant é 

publique, t ant  sur  le plan  mondial, qu’européen  ou  français. 

  26
1.3. Diagnostic et suivi 

1.3.1.  La  glycémie  

 
Le  diagnost ic  du   diabèt e  repose  sur   la  mesure  de  la  glycémie  (t aux  de  sucre  dans  le  sang), 

pour   cela  t rois  mét hodes  sont   possibles  et ,  en   l’absence  d’hyperglycémie  sans  équivoque, 

chacune  doit   êt re  confirmée  un   aut re  jour   par   la  répét it ion   d’une  de  ces  t rois  mét hodes.  Le 
9 10
pat ient  sera considéré comme diabét ique dans les sit uat ions suivant es , :   

 
‐ Glycémie  à  jeun   (absence  d’apport   calorique  depuis  au   moins  8  heures) 

supérieure ou  égale à 126 mg/ dl  ou  7mmol/ l  

‐ Glycémie  à  un   moment   quelconque  de  la  journée  en   présence  des  signes 

cliniques d’hyperglycémie (polyurie, polydipsie, pert e de poids inexpliquée 

souvent   associée  à  une  polyphagie)  supérieure  ou   égale  à  200  mg/ dl   ou  

11,1 mmol/ l  
ème
‐ Glycémie  à  la  2   heure  d’une  HGPO  (hyperglycémie  provoquée  par   voie 
orale  selon   les  recommandat ions  de  l’OM S  en   ut ilisant   une  charge  orale 

en  glucose anhydre égale à 75g dissout  dans de l’eau) supérieure ou  égale 

à 200 mg/ dl  ou  11,1 mmol/ l  

 
Les  valeurs  normales  de  glycémies  sont   inférieures  à  100  mg/ dl   à  jeun   et   inférieures  à  140  

mg/ dl   à  la  deuxième  heure  d’une  HPGO.  Aussi   exist e‐t ‐il   un   groupe  int ermédiaire  de  sujet s 

dont   les  niveaux  de  glucose  sanguin,  bien   que  ne  répondant   pas  aux  crit ères  diagnost iques 

du  diabèt e, sont  néanmoins t rop  élevés pour  êt re considérés comme normaux :  

‐ Si   la  glycémie  à  jeun   est   comprise  ent re  100  et   125  mg/ dl   (ou   ent re  5,6  et  

6,9 mmol/ l) on  parlera d’anomalie de la glycémie à jeun  (AGJ). 

‐ Si   à  la  2ème  heure  d’une  HGPO  la  glycémie  est   comprise  ent re  140  et   199  

mg/ dl   (ou   ent re  7,8  et   11,1  mmol/ l)  on   parlera  d’int olérance  au   glucose 

(IG). 

 
L’IG  et   l’AGJ  ne  sont   pas  des  ent it és  cliniques  en   elles‐mêmes  mais  des  fact eurs  de  risque 
10,9
d’un  fut ur  diabèt e ou  de maladies cardiovasculaires . 

  27
1.3.2.  L’hémoglobine  glyquée  (HbA1c)  

 
Le  dosage  de  l’hémoglobine  glyquée  permet   d’obt enir   une  est imat ion   de  la  glycémie 

moyenne  au   cours  des  deux  à  t rois  derniers  mois  de  suivi   d’un   pat ient .  Sa  valeur   est  

généralement   exprimée  en   pourcent age  et   permet   la  surveillance  de  l’équilibre  glycémique 
11
des  pat ient s  diabét iques  .  Il   s’agit   principalement   d’un   élément   de  suivi   de  l  ‘équilibre 

glycémique,  mais  un   niveau   supérieur   ou   égal   à  6,5%  d’HbA1c,  dét erminé  par   HPLC 

(chromat ographie  en   phase  liquide  à  haut e  performance),  à  deux  reprises,  a  récemment   ét é 


10
int égré aux crit ères diagnost iques du  diabèt e par  l’ADA (American  Diabet es Associat ion) . 

 
L’hémoglobine  glyquée  est   issue  de  la  glycat ion   de  l’hémoglobine  sanguine  au   cours 

d’épisodes  d’hyperglycémie  prolongée.  La  glycat ion   est   une  réact ion   non   enzymat ique  au  

cours  de  laquelle  le  glucose  se  lie  aux  prot éines  de  manière  irréversible.  Le  degré  de 

glycat ion   des  prot éines  dépend   de  l’exposit ion   au   glucose  et   donc  du   niveau  

d’hyperglycémie  associé  à  la  durée  d’exposit ion   des  prot éines  au   glucose.  Le  dosage  de 

l’HbA1c  est   le  reflet   de  l’équilibre  glycémique  sur   une  période  de  4  à  8  semaines.  Une 
12,11
corrélat ion  a ét é ét ablie ent re le t aux moyen  de glycémie et  le pourcent age d’HbA1c  . 

 
Un  bon  cont rôle de la glycémie est  représent é par  une valeur  d’HbA1c peu  élevée, et  celle‐ci  

est   at t endue  dans  la  prévent ion   de  l’apparit ion   des  complicat ions  microvasculaires  et  

macrovasculaires  du   diabèt e.  Une  augment at ion   relat ive  de  30%  des  complicat ions 
13
microvasculaires  du   diabèt e  a  ét é  observée  pour   chaque  pourcent   d’élévat ion   de  l’HbA1c . 

Cet t e  mesure,  marqueur   rét rospect if   de  la  glycémie  moyenne  des  deux  derniers  mois 

permet   d’évaluer   l’efficacit é  des  t rait ement s  pour   ainsi   les  réadapt er   en   fonct ions  des 
11
object ifs  t hérapeut iques  fixés .  Une  HbA1c  supérieure  à  7,5%  const it ue  également   un  

fact eur  de risque de  complicat ion  cardiovasculaire. 

1.4. Etiologie et immunopathologie du diabète de type 2


 
Le  développement   d'un   diabèt e  de  t ype  2  est   associé  à  de  fort es  prédisposit ions  génét iques 

combiné à des fact eurs environnement aux favorisant s. 

  28
1.4.1.  Les facteurs génétiques 

 
La  part   du   dét erminisme  génét ique  dans  le  diabèt e  de  t ype  2  est   t rès  import ant e  puisque 

l’on   est ime  que  le  risque  de  développer   la  maladie  est   de  30%  avec  un   parent   at t eint   de 

diabèt e  de  t ype  2  et   de  70%  si   les  deux  parent s  le  sont .  Le  t aux  de  concordance  ent re 

jumeaux monozygot es est  de près de 90%.  

Cependant ,  au   regard   de  l’import ant e  prévalence  du   diabèt e  de  t ype  2  dans  la  populat ion  

générale,  il  est   probable  que  les  gènes  de  suscept ibilit é  soient   t rès  nombreux,  t rès  répandus 

et  de faible pénét rance, ce qui  les rend  difficile à ident ifier. Ainsi  de nombreux gènes ont  ét é 

analysés not amment  ceux impliqués dans la régulat ion  de la sécrét ion  de l’insuline ou  de son  


4,14
act ion  mais les variat ions int erindividuelles et  int er ‐et hniques limit ent  les conclusions  .  

1.4.2.  Les facteurs environnementaux 

 
Le  fact eur   le  plus  puissant   prédisposant   au   diabèt e  de  t ype  2  est   l’obésit é,  part iculièrement  

à  répart it ion   abdominale,  puisque  80%  des  personnes  at t eint es  de  ce  t ype  de  diabèt e 

présent ent   un   excès  pondéral.  L’obésit é  est   capable  d’induire  ou   d’aggraver   une 

insulinorésist ance, imposant  au  pancréas une hypersécrét ion  permanent e d’insuline. Pour  la 

majorit é  des  personnes  obèses  le  pancréas  sera  capable  de  s’adapt er   et   de  maint enir   une 

glycémie  dans  les  valeurs  normales  mais  pour   un   t iers  d’ent re  eux  les  capacit és  de 
4
compensat ion  s’épuiseront  et  ils développeront  un  diabèt e de t ype 2 .  

 
La  sédent arit é,  de  plus  en   plus  présent e  dans  nos  sociét és  indust rialisées,  est   également  

mise  en   cause  dans  l’apparit ion   de  la  maladie,  puisque  l’act ivit é  physique  améliore  la 

sensibilit é des t issus à l’insuline et  donc présent e un  effet  prot ect eur. 

Enfin  la qualit é de la composit ion  du  régime aliment aire, not amment  la présence d’un  index 

glycémique  élevé  :   aliment at ion   riche  en   acides  gras  et   pauvre  en   fibres  double  le  risque  de 

diabèt e.  

  29
1.4.3.  Immunologie  

 
Le  diabèt e  de  t ype  2  est   le  résult at   de  deux  composant es  physiopat hologiques  :   des 

anomalies  de  la  sensibilit é  à  l’insuline  et   des  anomalies  de  sa  sécrét ion.  L’inflammat ion   est  

fort ement  mise en  cause dans la pat hogénie du  diabèt e 2. Une augment at ion  du  nombre de 

prot éines  de  la  phase  inflammat oire  aigue  (prot éine  C‐réact ive  (CRP)),  d’acide  sialique,  de 

cyt okines et  de chimiokines est  ret rouvée dans le plasma des pat ient s at t eint s de diabèt e de 

t ype  2.  Des  niveaux  élevés  d’int erleukine  1β  (IL‐1β),  d’int erleukine  6  (IL‐6)  et   de  CRP  sont  
15
également  prédict ifs d’un  diabèt e de t ype 2 .  

 
1.4.3.1. M écanismes de l’insulinorésist ance 

 
L’insulinorésist ance est  définie comme une diminut ion  de l’act ion  de l’insuline au  niveau  des 

t issus  cibles  :   les  muscles,  le  foie  et   le  t issu   adipeux,  se  t raduisant   par   des  défaut s  de 

capt at ion   du   glucose  au   sein   de  ces  t issus  et   un   moindre  frein   de  la  product ion   de  glucose 
4
par  le foie en  réponse à l’insuline . L’insulinorésist ance est  liée à des mécanismes complexes 

mêlant   réact ion   inflammat oire,  accumulat ion   d’acides  gras,  st ress  oxydant   et   dysfonct ion  

mit ochondriale (figure n°3). 

 
Longt emps  vu   comme  un   t issu   inert e,  on   sait   désormais  que  le  t issu   adipeux  part icipe  à  la 

pat hogénèse  du   diabèt e.  Les  adipocyt es  ont   une  capacit é  à  produire  des  adipokines 

(hormones  et   cyt okines)  qui   régulent   l’ut ilisat ion   et   le  st ockage  des  nut riment s  dans  les 

aut res  t issus.  L’augment at ion   de  la  masse  adipeuse  au   cours  de  l’obésit é  s’accompagne 

d’une  libérat ion   accrue  de  résist ine,  de  RBP4  (rét inol ‐binding  prot ein ‐4)  et   de  TNF‐  (Tumor  
16
Necrosis  Fact or ‐)  responsables  d’une  moindre  sensibilit é  des  t issus  à  l’insuline .  D’aut res 

adipokines  t elles  que  la  lept ine  et   l’adiponect ine  sont   considérées  comme  «   ant i ‐

diabét ogènes  »   car   elles  diminuent   la  synt hèse  de  t riglycérides,  st imulent   l’oxydat ion   du  
16
glucose  et   des  lipides  et   favorisent   l’act ion   de  l’insuline  au   niveau   du   muscle  et   du   foie . 

L’obésit é  s’accompagnerait   d’un   défaut   d’adiponect ine  et   d’une  résist ance  à  la  lept ine  et  
16
aurait  par  conséquence un  effet  diabét ogène .  

 
L’hypoxie et  la mort  de cellules adipocyt aires observées au  cours de l’obésit é cont ribuent  au  

  30
recrut ement  d’un  grand  nombre de macrophages au  sein  du  t issu  adipeux. Ces macrophages 

act ivés  part icipent   également   à  la  libérat ion   de  nombreuses  subst ances  pro ‐inflammat oires 

(TNF‐,  IL‐6…)  ent rainant   l’induct ion   et   la  maint enance  d’un   ét at   inflammat oire  associé  à 
15
l’obésit é .  

 
Au   cours  de  l’obésit é  la  sat urat ion   des  possibilit és  de  st ockage  des  lipides  au   niveau   des 

adipocyt es  ent raine  une  redist ribut ion   anormale  de  ces  lipides  responsable  d’une 

lipot oxicit é. 

 
Dans  les  hépat ocyt es,  les  défaut s  d’oxydat ion   des  acides  gras  ent rainent   une  surcharge 

mét abolique  par   accumulat ion   d’espèces  lipidiques  cyt osoliques  t elles  que  le  diacylglycérol  

(DAG),  les  céramides  et   les  t riglycérides.  Ce  phénomène  peut   êt re  at t ribué  à  l’augment at ion  

de  malonyl ‐coA,  induit e  par   le  glucose,  qui   sert   à  la  fois  d’int ermédiaire  précurseur   de  novo  

pour   la  lipogenèse  et   qui   bloque  l’enzyme  clé  de  l’ent rée  des  acides  gras,  l’acyl ‐coA,  dans  la 

mit ochondrie  et   donc  leur   oxydat ion.  L’augment at ion   d’insuline  inhibe  l’expression  

d’enzymes  ‐oxydat ives  et   ce  rôle  est   maint enu   au   cours  du   développement   de 
16
l’insulinorésist ance, alors que son  act ion  de suppression  de la néoglucogenèse diminue .  

 
L’excès  d’apport   aliment aire,  au   niveau   hépat ique  comme  au   niveau   du   t issu   adipeux,  est  

également   associé  à  un   st ress  du   rét iculum   endoplasmique  (RE).  Ce  st ress  du   RE  et  

l’accumulat ion   des  produit s  dérivés  des  lipides  act ivent   des  prot éines  de  t ype 

sérine/ t hréonine  kinases  :   les  prot éines  kinases  C  (PKC),  qui   agissent   sur   les  récept eurs  à 

l’insuline ou  sur  leurs subst rat s IRS1 et  IRS2 (Insulin  Responsive Element ), ent ravant  le signal  
14,15
de l’insuline .  

 
Dans  les  cellules  du   muscle  st rié  squelet t ique,  on   observe  également   une  accumulat ion  

cyt oplasmique  de  dérivés  lipidiques  (DAG,  céramides)  mais  l’insulinorésist ance  au   niveau  

musculaire est  principalement  liée à des dysfonct ions mit ochondriales. Dans ce modèle, la ‐

oxydat ion   a  bien   lieu   mais  n’ét ant   pas  associée  à  une  augment at ion   du   cycle  de  l’acide 

t ricarboxylique  et   de  l’act ivit é  de  la  chaine  de  t ransport   des  élect rons, elle  pourrait   conduire 

à un  mét abolisme incomplet  des acides gras dans cet t e voie et  une augment at ion  de dérivés 

t els  que  l’aryl ‐carnit ine  et   d’espèces  réact ives  de  l’oxygène  au   sein   de  la  mit ochondrie.  Ces 

  31
st ress  sont   suscept ibles  d’act iver   des  prot éines  kinases  qui   ent ravent   la  t ranslocat ion   du  
14,16
t ransport eur  de glucose GLUT4  et  donc la pénét rat ion  du  glucose au  sein  des t issus . 

 
La  liaison   de  l’insuline  à  son   récept eur   ent raine  la  phosphorylat ion   de  résidus  t yrosine  des 

subst rat s  IRS  permet t ant   l’act ivat ion   de  la  PI3K  (phosphoinosit ol   3  kinase),  puis  la 

t ranslocat ion   du   t ransport eur   de  glucose  GLUT4  dans  le  muscle  et   le  t issu   adipeux,  la 

synt hèse  de  glycogène  au   niveau   musculaire  et   hépat ique,  et   l’inhibit ion   de  la 
17
néoglucogenèse hépat ique et  de la lipolyse dans le t issu  adipeux . 

 
L’obésit é  et   l’aliment at ion   riche  en   graisse  ent rainent   donc  l’apparit ion   de  différent s  st ress 

mét aboliques.  Des  st imuli   ext racellulaires  représent és  par   les  cyt okines  comme  l’IL‐1  et   le 

TNF‐,  par   les  acides  gras  libres  et   par   les  produit s  t erminaux  de  la  glycat ion   (AGEs),  formés 

suit e  à  l’hyperglycémie, qui   se  lient   respect ivement   à  leurs  récept eurs  cellulaires  spécifiques 

:   IL‐1R,  TNFR,  t oll   like  recept or   (TLR)  et   le  récept eur   RAGE  (recept or   for   advanced   glycat ion  

end ‐product s).  Des  st ress  int racellulaires  induit s  par   la  surcharge  mét abolique  que  sont  

l’accumulat ion   de  lipides  (céramides),  l’augment at ion   de  la  product ion   d’espèces  oxygéno ‐

réact ives,  du   st ress  du   rét iculum   endoplasmique  et   l’act ivat ion   des  PKC.  Ces  différent s 

st imuli   about issent   à  l’act ivat ion   des  voies  du   IKKb   (IkB  kinase  b)‐NF‐B  au   niveau   des 
15,18
hépat ocyt es, des adipocyt es et  des macrophages qui  leur  sont  associés . 

 
La  voie  du   NF‐κB  est   act ivée  dans  de  nombreux  t issus  au   cours  du   diabèt e  de  t ype  2  et   de 

l’obésit é  et   a  un   rôle  cent ral   dans  la  promot ion   de  l’inflammat ion   t issulaire.  L’obésit é  induit  

ainsi   l’expression   de  gènes  cible  du   fact eur   de  t ranscript ion   NF‐κB  comme  les  gènes  des 
15
cyt okines  pro ‐inflammat oires  dans  le  foie  et   les  t issus  adipeux .  Ces  cyt okines,  incluant   le 

TNF‐, l’IL‐ 6 et  l’IL‐1 peuvent  ent rainer  une insulinorésist ance dans les t issus dans lesquels 

elles  sont   produit es  et   peuvent   êt re  t ransport ées  dans  la  circulat ion   sanguine  pour   affect er  

des  t issus  à  dist ance  :   parois  des  vaisseaux  sanguins,  muscle,  cœur,  reins,  et   leucocyt es 

circulant s.  La  voie  du   JNK  act ive  des  fact eurs  de  t ranscript ion   dont   le  rôle  n’est   pas 
15
complèt ement   ét abli   au   cours  de  l’insulinorésist ance .  Les  cyt okines  produit es  par   la  voie 

du  NF‐kB, not amment  IL‐1 et  TNF‐ ont  elles‐mêmes la capacit é d’act iver  la voie du  NF‐kB. 

  32
 
Figure n°3 :  M écanismes int racellulaires de l’insulinorésist ance 

 
Ces  processus  une  fois  act ivés  peuvent   donc  êt re  aut o ‐ent ret enus  par   un   feed ‐back  posit if, 
15
et  perpét uer  l’ét at  inflammat oire . 

 
1.4.3.2. M écanismes du  déficit  insulinosécrét oire 

 
Le  diabèt e  de  t ype  2  s’accompagne  d’un   défaut   quant it at if   et   qualit at if   de  la  sécrét ion  

d’insuline  évoluant   vers  une  réduct ion   progressive  de  cet t e  sécrét ion   sous‐t endue  par   des 
4
phénomènes d’apopt ose des cellules  du  pancréas . Plusieurs mécanismes ont  ét é évoqués 

pour   expliquer   la  disparit ion   progressive  de  ces  cellules.  Les  niveaux  élevés  de  cyt okines  et  

de  chimiokines  ret rouvés  au   niveau   des  îlot s  des  diabét iques  de  t ype  2  placent   à  nouveau  

l’inflammat ion  au  cœur  des processus pat hogéniques. 

 
L’exposit ion   chronique  des  îlot s  pancréat iques  à  de  fort e  quant it é  de  nut riment s 

(hyperglycémie et  excès d’acides gras libres) induit  des dysfonct ions des cellules  et  about it  

à  leur   mort   cellulaire,  définissant   le  concept   de  «   glucolipot oxicit é  ».  L’hyperglycémie 

ent raine  une  apopt ose  des  cellules    par   l’induct ion   de  l’expression   du   récept eur   pro ‐

apopt ot ique  FAS  à  la  surface  de  ces  cellules  et   cet t e  expression   est   ensuit e  posit ivement  

régulée  par   la  product ion   d’IL‐1    par   les  cellules    sous  l’influence  du   glucose.  Les  acides 

  33
gras,  surt out   en   présence  de  glucose,  sont   également   responsables  d’une  augment at ion   de 

la  product ion   d’IL‐1.  L’induct ion   init iale  d’IL‐1  peut   ensuit e  êt re  amplifiée  par   un   cycle 

d’aut o ‐inflammat ion, les cellules  exprimant  fort ement  son  récept eur  l’IL‐1R1 (IL‐1  recept or  

t ype  1)  alors  que  son   récept eur   ant agonist e  IL‐1RA  est   diminué  dans  les  îlot s  des  pat ient s 

at t eint s  de  diabèt e  de  t ype  2.  La  voie  du   NF‐κB  est   également   act ivée  dans  les  cellules   des 

îlot s par  l’int ermédiaire de l’act ion  du  glucose et  de l’  IL‐1 et  son  inhibit ion  semble prot éger  
15
ces cellules des effet s néfast es liés à la glucot oxicit é . 

 
L’hyperglycémie  est   responsable  d’une  plus  fort e  sollicit at ion   de  la  fonct ion   sécrét rice  des 

cellules  .  La  demande  accrue  d’insuline  ent raine  une  surcharge  de  t ravail   au   niveau   du  

rét iculum   endoplasmique  (RE),  conduisant   à  un   st ress  du   RE  pouvant   conduire  à  la  mort   des 
16
cellules  par  aut ophagie. 

 
L’hyperglycémie  ent raine  également   une  augment at ion   de  la  product ion   d’espèces 

oxygénoréact ives,  or   les  cellules   sont   t rès  pauvres  en   enzymes  ant ioxydant es  et   donc  t rès 
15
suscept ibles au  st ress oxydat if  ent raînant  à t erme une mort  cellulaire par  apopt ose. 

 
Enfin   l’hypersécrét ion   d’insuline  est   accompagnée  par   une  libérat ion   accrue  d’amyline 

suscept ible  de  former   des  fibres  amyloïdes  qui   s’accumulent   à  la  surface  des  cellules  , 

about issant   à  leur   dysfonct ion   et   leur   apopt ose.  Elles  induisent   la  sécrét ion   d’IL‐1   par   les 

macrophages  et   peuvent   ainsi   cont ribuer   elles  aussi   à  l’inflammat ion   des  îlot s  et   à  la 
15
dest ruct ion  progressive des cellules  du  pancréas .  

1.5. Complications chroniques du diabète


 
Les complicat ions à long t erme du  diabèt e sont  classiquement  divisées en  deux cat égories :  

‐ les  complicat ions  microangiopat hiques  :   neuropat hie,  néphropat hie  et  

rét inopat hie  dont   le  fact eur   de  risque  majeur   est   l’hyperglycémie 

chronique 

‐  les  complicat ions  macroangiopat hiques  :  maladies  cardiovasculaires  dont  


les  fact eurs  de  risque  sont   l’hyperglycémie,  l’insulinorésist ance,  des 

  34
carences en  insuline, une dyslipidémie, l’hypert ension, l’hyperlipidémie  et  
19
l’inflammat ion .  

1.5.1.  Complications microangiopathiques  

 
1.5.1.1. Rét inopat hie 

La  rét inopat hie  est   une  complicat ion   fréquent e  qui   t ouche  plus  de  50%  des  diabét iques 

après  15  ans  d’évolut ion   du   diabèt e.  Fort ement   liée  à  l’hyperglycémie  et   la  durée  du  

diabèt e,  elle  se  t raduit   par   diverses  lésions  observables  lors  d’un   examen   du   fond   d’œil   :  

micro ‐anévrismes  rét iniens,  hémorragies  rét iniennes  punct iformes,  exsudat s  et   oedèmes 
19
rét iniens, et  oœdème maculaire. Elle est  responsable, à t erme,  de cécit é . 

 
1.5.1.2. Néphropat hie 

La  néphropat hie  t ouche  préférent iellement   les  diabét iques  de  t ype  1  :   50%  des  malades  en  

sont   at t eint s.  Ses  principaux  fact eurs  d’apparit ion   et   de  progression   sont   le  mauvais 

équilibre  glycémique  et   l’hypert ension.  La  néphropat hie  diabét ique  évolue  en   plusieurs 

ét apes  et   début e  par   une  prot éinurie  discrèt e,  couramment   appelée  micro ‐albuminurie,  qui  

t raduit   des  défaut s  anat omiques  et   biochimiques  au   niveau   des  glomérules  rénaux.  Elle 

évolue  associée  à  une  hypert ension   en   un   syndrome  œdémat eux  suscept ible  d’évoluer   vers 

une  insuffisance  rénale.  Le  pat ient   est   alors  macroalbuminurique  et   les  glomérules  rénaux 

diminuent   en   nombre  et   en   capacit é  fonct ionnelle.  La  néphropat hie  diabét ique  évolue  à 
19
t erme vers une insuffisance rénale chronique sévère . 

 
1.5.1.3. Neuropat hie 

La  neuropat hie  est   la  complicat ion   la  plus  fréquent e  et   la  plus  précoce  du   diabèt e  sucré.  Il  

s’agit   d’une  démyélisat ion   segment aire  des  axones  associée  à  des  dépôt s  lipidiques  sur   les 

cellules  de    Schw ann   ent ourant   les  axones.  Sa  manifest at ion   la  plus  commune  est   la 

polynévrit e  :   at t eint e  bilat érale  et   symét rique  au   départ   dist ale  puis  qui   remont e 

progressivement   au   niveau   proximal   des  membres,  t ouchant   quasi   exclusivement   les 

membres  inférieurs.  Elle  début e  par   des  parest hésies  et   des  dysest hésies  qui   évoluent   par  

une  sympt omat ologie  douloureuse  not amment   la  nuit   et   qui   cèdent   en   général   au   cours  de 

l’exercice  physique.  On   observe  fréquemment   une  disparit ion   des  réflexes  ost éo ‐t endineux, 

  35
une  alt érat ion   des  sensibilit és  profondes  et   superficielles,  les  t roubles  mot eurs  ét ant  

except ionnels.  La  polynévrit e  diabét ique  peut   êt re  compliquée  par   des  t roubles  t rophiques, 

not amment   le  mal   perforant   plant aire.  Il   s’agit   d’une  ulcérat ion   cut anée  au   niveau   des 

point s  de  pression   du   pied,  en   général   non   douloureuse  du   fait   de  la  neuropat hie.  La 

présence  d’une  infect ion   à  ce  niveau   est   suscept ible  de  la  faire  évoluer   en   lésions 

dest ruct ives  art iculaires  et   osseuses  s’accompagnant   d’une  déformat ion   du   pied.  La 

neuropat hie  peut   également   se  manifest er   par   des  at t eint es  végét at ives  :   vasomot rices, 

génit o ‐urinaires  et   digest ives.  Sa  prévent ion   passe  essent iellement   par   le  maint ien   d’un   bon  
19
équilibre glycémique .  

1.5.2.  Complications macroangiopathiques  

 
Elles  t ouchent   t out es  les  art ères  de  l’organisme  mais  se  manifest ent   principalement   au  

niveau   des  art ères  coronaires  et   cérébrales,  et   des  membres  inférieurs.  Les  principaux 

fact eurs  de  risque  associés  sont   l’âge,  le  sexe,  l’obésit é,  le  t abagisme,  l’hyperglycémie, 

l’hypert ension   art érielle,  la  dyslipidémie  (augment at ion   des  t riglycérides,  diminut ion   du   HDL 

cholest érol   et   présence  de  pet it s  LDL  denses  t rès  at hérogènes)  ou   encore  un   syndrome 

inflammat oire sous‐jacent .  

 
Les  lésions  sont   dist ales,  souvent   calcifiées  et   les  dépôt s  lipidiques  au   niveau   des  art ères 

sont   accompagnés  de  dépôt s  glycoprot éiques.  Elles  peuvent   conduire  à  une  insuffisance 

coronaire  suscept ible  d’ent rainer   un   infarct us  du   myocarde,  à  une  at t eint e  des  t roncs 

art ériels  supra‐aort iques  responsables  d’accident s  vasculaires  cérébraux,  et   à  une 

art ériopat hie  pouvant   conduire  à  des  nécroses  dist ales  à  l’origine  d’amput at ions  le  plus 
19
souvent  des membres inférieurs . 

 
 
 
 
 
 

  36
2. COMPLICATIONS CARDIOVASCULAIRES DU DIABETE DE
TYPE2
 
La  mort alit é  des  diabét iques  est   principalement   due  aux  complicat ions  vasculaires 

rencont rées  dans  le  diabèt e  de  t ype  2  qui   associent   la  microangiopat hie  diabét ique 

(rét inopat hie,  néphropat hie  et   pied   diabét ique)  et   la  macroangiopat hie  diabét ique 

(at hérosclérose, syndromes coronariens, AVC,…).  

 
En   effet ,  le  risque  d’at t eint e  vasculaire  est   t rès  fort ement   augment é  au   cours  du   diabèt e.  Et  

les  complicat ions  cardiovasculaires  associées  (AVC,  IM )  sont   responsables  de  80%  des  décès 
5
des personnes diabét iques . 

2.1. Les complications cardiovasculaires du diabète


 
Les  conséquences  les  plus  import ant es  du   diabèt e  se  sit uent   au   niveau   macrovasculaire,  et  

en   part iculier   au   niveau   coronarien,  dont   l’at t eint e  condit ionne  le  pronost ic  vit al   des 

pat ient s.  Chez  les  pat ient s  diabét iques  la  principale  cause  de  mort alit é  est   en   effet  
6,20
cardiovasculaire (60% de décès) . En  prat ique, le diabèt e mult iplie par  t rois à cinq  le risque 

d’infarct us  du   myocarde.  En   2006  en   France,  12  639  personnes  diabét iques  ont   ét é 
6
hospit alisées pour  un  infarct us du  myocarde et  9 % en  sont  décédées . 

 
Les  at t eint es  macrovasculaires  t ouchent   les  carot ides,  l’aort e,  les  art ères  des  membres 

inférieurs, et  surt out  les coronaires. 

2.1.1.  Cardiopathie  ischémique  

 
La  cardiopat hie  ischémique  est   la  première  cause  de  mort alit é  au   niveau   mondial   :   sur   50 
21
millions de décès, ceux par  ischémie myocardique représent ent  6,3 millions .  

Dans  l’ét ude  ENTRED  2001,  17  %  des  pat ient s  diabét iques  déclaraient   avoir   eu   une 

complicat ion   ischémique  cardiaque  (angor,  IDM ,  ou   revascularisat ion   coronaire),  et   20%  des 

médecins  déclaraient   une  complicat ion   macrovasculaire  chez  leurs  pat ient s  (angor,  IM , 

  37
22
revascularisat ion  coronaire ou  AVC) . 

L’ét ude  Framingham   a  mont ré  que  les  hommes  diabét iques  ont   2  fois  plus  de  pat hologies 
23
cardiaques  et   les  femmes  diabét iques  3  à  5  fois  plus  que  les  non   diabét iques .  Cert aines 

ét udes  t endent   également   à  mont rer   que  le  t aux  d’évènement s  cardiaques  chez  le 

diabét ique  est   aussi   élevé  que  chez  le  pat ient   non   diabét ique  en   ayant   déjà  eu   un  
24
événement  cardiovasculaire  . 

 
Plusieurs  phénomènes  peuvent   expliquer   l’augment at ion   du   risque  d’infarct us  chez  les 

sujet s diabét iques et  le fait  que le pronost ic soit  plus péjorat if  :  

‐ l’ét at  d’hypercoagulabilit é associé au  diabèt e, 

‐ une at hérosclérose souvent  plus diffuse que chez un  pat ient  non  diabét ique, 

‐ une  alt érat ion   de  la  st ruct ure  des  vaisseaux,  ce  qui   rend   la  revascularisat ion   plus 

difficile 

‐ un   dysfonct ionnement   mét abolique  empêchant   les  mécanismes  compensat oires 


25
d’êt re efficaces . 

 
L’at t eint e  cardiaque  chez  le  diabét ique  peut   se  manifest er   de  différent es  manières  :  

ischémie  myocardique  silencieuse,  angor   ou   infarct us.    L’act ion   prévent ive  repose  sur   un  

t rait ement  médicament eux int ensif, permet t ant  une réduct ion  du  risque d’évènement  :  

‐ par   un   cont rôle  glycémique  (par   exemple  l’ét ude  UKPDS  a  mont ré  que  la 

diminut ion  de 1% du  t aux d’hémoglobine glyquée s’accompagnait  d’une baisse de 


26
14% du  risque d’IDM ) , 

‐ par   un   cont rôle  de  l’hypert ension   art érielle  (cet t e  même  ét ude  UKPDS  a 

démont ré  une  baisse  de  15%  de  la  mort alit é  liée  au   diabèt e  pour   t out e 
27
diminut ion  de la pression  art érielle syst olique (PAS) de 10 mm  Hg)  

‐ par   une  mait rise  des  dyslipidémies  (dans  l’ét ude  CARDS,  les  pat ient s  diabét iques 

sous  10  mg  d’at orvast at ine,  hypolipémiant   inhibit eur   de  l’HM G  CoA‐reduct ase, 

ont   une  diminut ion   de  37%  des  évènement s  cardiovasculaires  et   de  27%  de  la 
28
mort alit é) . 

 
Par   ailleurs,  l’indicat ion   d’une  revascularisat ion   peut   êt re  ret enue,  soit   par   angioplast ie  avec 

évent uelle  pose  de  st ent ,  soit   par   pont age  aort o ‐coronarien.  La  meilleure  st rat égie  de 

  38
revascularisat ion  rest e encore débat t ue et  est  discut ée au  cas par  cas.  

2.1.2.  Artérite  des membres inférieurs 

 
L’at t eint e  des  art ères  périphériques  des  membres  inférieurs  (AOM I :   art ériopat hie 

oblit érant e  des  membres  inférieurs)  a  une  incidence  de  0,12%  dans  la  populat ion   générale 

et   environ   3  fois  plus  élevée  chez  les  diabét iques  (soit   0,4%).  C’est   un   fact eur   prédict if  
29
indépendant  de mort alit é et  d’at t eint e des art ères cérébrales et  coronariennes  . 

 
L’art érit e  se  manifest e  cliniquement   par   une  claudicat ion   int ermit t ent e.  Chez  les  pat ient s 

asympt omat iques,  elle  se  dépist e  par   la  mesure de  l’indice  de  pression   syst olique  (IPS).  L’IPS 

se  mesure  en   faisant   le  rapport   ent re  la  pression   art érielle  de  la  cheville  et   du   bras.  En   cas 

d’art ériopat hie,  l’IPS  est   inférieur   à  0,9.  Une  fois  ident ifiée,  la  prise  en   charge  des  pat ient s 

repose  sur   un   t rait ement   médicament eux  int ensif   avec  une  correct ion   des  fact eurs  de 
30
risque :  

‐ un  arrêt  définit if  du  t abagisme, 

‐ une st at ine, 

‐ un  inhibit eur  de l’enzyme de conversion, 

‐ un   t rait ement   inhibit eur   de  l’agrégat ion   plaquet t aire  (qui   réduit   le  risque 

d’évènement  cardiovasculaire sévère), 

‐ un  ß‐bloquant  en  cas de cardiopat hie. 

 
Un  programme de réhabilit at ion  à l’exercice est  de plus fort ement  recommandé. 

En   cas  de  claudicat ion   int erférant   gravement   sur   le  st yle  de  vie,  ou   d’ischémie  met t ant   en  

jeu   le  pronost ic  du   membre  inférieur,  une  revascularisat ion   par   angioplast ie  et   +/ ‐  st ent ing, 

ou   pont age  vasculaire  est   alors  nécessaire,  afin   d’évit er   le  t rait ement   radical   qu’est  

l’amput at ion. 

2.1.3.  Athérosclérose  carotidienne  

 
Sa  principale  complicat ion   est   l’AVC.  L’AVC  est   la  deuxième  cause  de  mort alit é  à  t ravers  le 

monde  chez  les  personnes  de  plus  de  60  ans  (5,5  millions  en   2002).  En   France,  150  000  

  39
personnes  sont   vict imes  d’AVC  chaque  année  (dont   28  000   de  moins  de  60  ans),  ce  qui   en  
31
fait   la  première  cause  de  morbidit é  et   la  t roisième  cause  de  mort alit é .  Il   exist e  différent  

t ypes  d’AVC  :   l’accident   ischémique  t ransit oire,  ischémique  const it ué,  l’hémorragie  int ra 

parenchymat euse,  l’hémorragie  méningée.  L’AVC  ischémique  est   la  conséquence  de 

l’at hérosclérose carot idienne. Celle‐ci  rest e longt emps asympt omat ique. 

Le  premier   signe  d’at hérosclérose  est   une  augment at ion   de  l’épaisseur   int ima‐média  (IM T). 

Chez  le  diabét ique,  l’IM T  est   plus  import ant e  que  chez  le  non   diabét ique,  indépendamment  
32
de  t ous  les  aut res  fact eurs  de  risque .  Elle  est   d’aut ant   plus  élevée  que  le  diabèt e  est   mal  
33
cont rôlé  (HbA1c  élevée)  et   dure  depuis  longt emps .  La  résist ance  à  l’insuline  chez  ces 
34
pat ient s  est   un   fact eur   de  risque  de  développer   une  at hérosclérose  carot idienne .  Vient  

ensuit e  la  format ion   de  plaques  at héroscléreuses,  pouvant   provoquer   des  st énoses  et   se 

compliquer  en  accident  vasculaire. 

 
Les  lésions  endot héliales  des  macros  vaisseaux  chez  le  diabét ique  sont   la  conséquence  des 

at t eint es dues:  

‐ aux  aut res  fact eurs  de  risque  cardiovasculaire:   hypert ension   art érielle, 

dyslipidémie, t abagisme, hypercoagulabilit é, act ivat ion  plaquet t aire, 

‐ à  des  phénomènes  propres  au   diabèt e  :   désulfat isat ion   des  glycosaminoglycanes 

de  la  mat rice  vasculaire,  act ivat ion   du   syst ème  rénine‐angiot ensine‐aldost érone, 

st ress oxydat if, inflammat ion  de l’endot hélium, secondaire à la glycémie élevée, à 

l’insuline  et   ses  précurseurs,  ainsi   qu’aux  produit s  liés  à  la  glycat ion   et   à  leurs 
35
récept eurs  . 

2.2. Complications vasculaires et fonction endothéliale

2.2.1.  L’endothélium  vasculaire  : rôle  physiologique  

L'endot hélium   vasculaire  const it ue  une  couche  de  cellules  t apissant   l'int érieur   des  vaisseaux 

sanguins.  Il   joue  un   rôle  cent ral   dans  le  maint ien   de  l’homéost asie  vasculaire  de  par   sa 
36
posit ion  à l’int erface des élément s circulant s et  du  muscle lisse vasculaire (figure n°4) .  

  40
Figure n°4 :  st ruct ure de la  paroi  vasculaire et  place de l’endot hélium  vasculaire
36
 

L’endot hélium     est   premièrement   le  régulat eur   du   t onus  vasculaire  grâce  à  sa  capacit é  à 

libérer  des subst ances vasoact ives, not amment  le monoxyde d'azot e (NO) et  la prost acycline 

(propriét és  vasodilat at rices)  ainsi   que  l'endot héline  et   la  t hromboxane  A2  (propriét és 
37
vasoconst rict ives) .  En   ce  qui   concerne  le  NO  il   est   libéré  en   réponse  aux  forces  de 

cisaillement   de  l'endot hélium.  Par   ailleurs  le  NO  at t énue  la  réponse  cont ract ile  à  différent s 

vasopresseurs  comme  la  noradrénaline,  l'angiot ensine  II  et   l'endot héline.  Ces  agonist es 

act ivent  en  effet  des récept eurs endot héliaux et , par  ce biais, st imulent  la product ion  de NO. 

En   cas  d'anomalie  de  la  fonct ion   endot héliale,  la  libérat ion   de  NO  est   diminuée,  avec  pour  

résult at   une  mont ée  t ensionnelle  plus  import ant e  pendant   la  syst ole  et   un   effet  

vasoconst rict eur   accru   de  la  noradrénaline,  de  l'angiot ensine  II  et   de  l'endot héline.  Quant   à 

l'endot héline,  elle  est   libérée  par   les  cellules  endot héliales  soumises  à  un   cisaillement   ou  

st imulées par  exemple par  la t hrombine, l'angiot ensine II et  les lipoprot éines à basse densit é 


38
(LDL) oxydées .  

Le  syst ème  nerveux  aut onome  régule  également   le  t onus  vasculaire  par   le  biais  de 

l’endot hélium.  En   effet ,  l'acét ylcholine  provoque  une  vasorelaxat ion   en   libérant   du   NO  de 

l'endot hélium.  Cet t e  subst ance  induit   par   cont re  une  vasoconst rict ion   lorsqu'elle  agit  

direct ement   sur   la  musculat ure  des  vaisseaux  sanguins.  Ainsi,  en   cas  de  dysfonct ion  

  41
endot héliale,  l'effet   vasodilat at eur   de  l'acét ylcholine  est   diminué,  voire  aboli   ou   remplacé 

par  un  effet  vasoconst rict eur.  

L'endot hélium, en  raison  de sa localisat ion  à l'int erface ent re le sang et  les const it uant s de la 

paroi   vasculaire,  est   impliqué  également   de  manière  t rès  import ant e  dans  les  processus 

d'hémost ase,  ceci   en   libérant   des  fact eurs  à  act ion   ant icoagulant e  aussi   bien   que  des 

fact eurs  à  act ion   procoagulant e.  Dans  les  condit ions  normales  la  couche  endot héliale 

assume une fonct ion  ant icoagulant e prédominant e, mais en  cas d'at t eint e de l'endot hélium, 

la cont ribut ion  des fact eurs menant  à la t hrombose prend  le dessus.  

37
La cellule endot héliale int ervient  dans les phénomènes de régulat ion  de l'hémost ase .  

38
L'act ion  ant icoagulant e de l'endot hélium  comport e  :   

1) la  libérat ion   de  l'act ivat eur   du   plasminogène  t issulaire  (t PA)  qui   conduit   à  la 

format ion  de plasmine act ivée et , en  conséquence, à une dégradat ion  de la fibrine   

2) la  libérat ion   de  NO  et   de  prost acycline  (PGI2)  qui   diminuent   l'agrégabilit é 

plaquet t aire  

3) la  présence  à  la  surface  cellulaire  d'une  prot éine  (t hrombomoduline)  capable  de  lier  

la  t hrombine,  ent raînant   ainsi   une  act ivat ion   de  la  prot éine  C  et ,  par   ce  mécanisme, 

une inact ivat ion  des fact eurs V et  VIII act ivés  

4) la  présence  à  la  surface  endot héliale  d'ect onucléot idases  capables  de  dégrader   l'ADP 

libéré  lors  de  l'agrégat ion   plaquet t aire  et ,  par   ce  biais,  de  limit er   le  processus 

d'agrégat ion  induit  par  l'ADP.  

38
Quant  à la fonct ion  procoagulant e de l'endot hélium, elle met  en  jeu  :   

1) la libérat ion  du  fact eur  t issulaire qui  act ive la voie ext rinsèque de la coagulat ion   

2) la  libérat ion   de  t hromboxane  A2  et   du   «plat elet   act ivat ing  fact or»   (PAF)  qui  

augment ent  l'agrégabilit é plaquet t aire   

3) la libérat ion  de l'inhibit eur  de l'act ivat eur  du  plasminogène (PAI‐1)  

4) la  libérat ion   du   fact eur   de  von   Willebrand   qui   facilit e  l'adhésion   des  plaquet t es  au  

t issu  lésé et , t out  en  t ransport ant  le fact eur  VIII, ralent it  sa dégradat ion.  

  42
L’endot hélium   joue  également   un   rôle  essent iel   dans  la  régulat ion   du   passage  des 
37
monocyt es  sanguins  dans  la  paroi   vasculaire .  Ces  monocyt es  jouent ,  ent re  aut re,  un   rôle 

import ant   dans  la  pat hogenèse  de  l'at hérosclérose.  Ils  sont   at t irés  dans  l'int ima  par   les  LDL 

oxydées  et   le  «monocyt e  chemot act ic‐prot ein ‐1»   (M CP‐1),  un   fact eur   dont   la  libérat ion   à 

part ir   de  l'endot hélium   est   augment ée  par   l'endot héline  et   diminuée  par   le  NO.  Le 

monocyt e  une  fois  localisé  dans  l'int ima  devient   un   macrophage  qui   possède  beaucoup   de 

récept eurs capables de fixer  les LDL oxydées, ce qui  l'amène à capt er  une grande quant it é de 

ces  lipoprot éines  et   à  devenir   une  cellule  spumeuse.  Le  passage  des  monocyt es  est   facilit é 

par   les  molécules  d'adhésion   présent es  à  la  surface  des  cellules  endot héliales.  Leur  
38
expression  est  accrue par  l'endot héline, et  diminuée au  cont raire par  le NO . 

2.2.2.  Dysfonction endothéliale  et  pathologies vasculaires 

 
La  caract érist ique  principale  de  la  dysfonct ion   endot héliale  est   une  réduct ion   de  la 

biodisponibilit é  en   NO  associée  à  la  pert e  de  ses  propriét és  ant iat hérogènes  et  
39
ant it hrombot iques .  

C’est   pourquoi   la  dysfonct ion   endot héliale  est   impliquée  de  façon   précoce  dans  la 

physiopat hologie  de  l’at hérosclérose  (figure  n°5)  prédict eur   de  la  mort alit é  et   morbidit é 
40
cardiovasculaire .  

  43
 
Figure n°5 :  Coupe schémat ique d’une art ère saine et  d’une art ère art érioscléreuse :  place de 
l’endot hélium  vasculaire   
41

 
Bien   que  la  pat hophysiologie  de  la  dysfonct ion   endot héliale  soit   complexe  et   implique  de 

mult iples  mécanismes,  la  diminut ion   de  la  biodisponibilit é  du   NO  pourrait   avoir   quat re 

origines :  

 l’augment at ion  de la capt ure ou  de la dégradat ion  du  NO par  les radicaux libres;  

 la réduct ion  de l’expression  et / ou  de l’act ivit é de la eNOS ;  

 le  «  découplage »   de  la  eNOS  (en   l’absence  du   subst rat   l ‐arginine  ou   du   cofact eur  
42
BH4)  ;  

 l’alt érat ion  de la t ransmission  des événement s signalét iques init iés par  le NO . 
42

 
Ét ant   donné  le  rôle  majeur   de  la  dysfonct ion   endot héliale  dans  la  maladie  cardiovasculaire, 

on   comprend   pourquoi   elle  est   rapidement   apparue  comme  une  cible  prévent ive  et  

t hérapeut ique priorit aire. 

La  présence  de  dysfonct ion   endot héliale,  définie  comme  une  diminut ion   de  la  réponse 

vasodilat at rice  à  l'acét ylcholine,  a  ét é  démont rée  dans  différent s  t errit oires  vasculaires,  que 

ce  soit   chez  des  malades  connus  pour   êt re  coronariens  ou   des  malades  présent ant   un  

fact eur   de  risque  cardiovasculaire  (hypert ension,  hypercholest érolémie,  diabèt e, 

  44
39
t abagisme) .  Les  ét udes  ont   mont ré  qu'il   est   possible  d'améliorer   la  fonct ion   endot héliale 

grâce au  t rait ement  ant ihypert enseur, aux hypolipémiant s et  aux hypoglycémiant s.  

Il   est   dès  lors  t ent ant   de  spéculer   que  la  mise  en   évidence  d'une  dysfonct ion   endot héliale 

chez  un   malade  donné  indique  l'exist ence  d'un   processus  at hérosclérot ique  sous‐jacent , 

associé  à  un   risque  anormalement   élevé  de  présent er   une  complicat ion   cardiovasculaire  à 
43
moyen  ou  long t ermes (figure n°6) . 

Figure n°6 :  dysfonct ion  endot héliale et  complicat ions cardiovasculaires du  diabèt e :  


at hérosclérose, néphropat hie et  rét inopat hie  
43

  45
3. Evaluation du risque cardiovasculaire et pathologie diabétique :
facteurs de risque

3.1. Facteurs de risques cardiovasculaires conventionnels


 
En   dehors  de  la  not ion   de  diabèt e,  plusieurs  sit uat ions  physiopat hologiques  sont  

convent ionnellement   considérées  comme  ét ant   à  risque  de  développer   une  pat hologie 

cardiovasculaire.    Ces  fact eurs  de  risque  de  maladie  cardiovasculaire  (M CV)  peuvent   êt re 
9
répart is, selon  les classificat ions, en  modifiables ou  non  modifiables  :  

 Les fact eurs de risque non  modifiables de M CV sont  l’âge et  le sexe. 


 Les  fact eurs  de  risque  modifiables,  qui   font   l’objet   d’une  prise  en   charge 
t hérapeut ique, sont  :  

  ‐ Les dyslipidémies (hyper  LDLémie et  hypo  HDLémie principalement ) 


  ‐ L’hypert ension  art érielle 
  ‐ Le t abagisme 
  ‐ Le surpoids lié direct ement  à la not ion  de sédent arit é 
 

3.1.1.  Les dyslipidémies  

 
Plusieurs anomalies lipidiques sont  à l’origine d’un  risque accru  d’at hérosclérose. 

 
3.1.1.1. L’hyper  LDLémie 

De  nombreuses  ét udes  mont rent   qu’un   t aux  élevé  de  LDL  est   associé  à  une  augment at ion  
9
des  pat hologies  cardiaques  ou   cardiovasculaires  et   de  la  mort alit é .  Selon   la  Haut e  Aut orit é 

de  Sant é  (HAS),  chez  un   pat ient   sans  fact eur   de  risque,  le  bilan   sera  considéré  comme 

normal  si  le LDL cholest érol  est  < 1,60 g/ l  (4,1  mmol/ l). 

Chez  les  pat ient s  ayant   une  hyperLDLémie,  un   t rait ement   reposant   init ialement   sur   les 

règles  hygiéno ‐diét ét iques  sera  inst auré  durant   3  mois,  suivi   évent uellement   d’un  

t rait ement  médicament eux hypolipémiant . 

 
 

  46
3.1.1.2. L’hypo  HDLémie 

Elle  est   définie  par   un   HDL‐cholest érol   <  0,40  g/ l   (1  mmol/ l),  est   souvent   associée  à  une 

hypert riglycéridémie,  une  obésit é,  ou   un   diabèt e  de  t ype  2,  et   peut   s’inscrire  dans  un  

t ableau   de  syndrome  mét abolique.  Le  t rait ement   repose  essent iellement   sur   la  correct ion  

des  fact eurs  de  risque  associés,  except é  en   prévent ion   secondaire,  où   la  prescript ion   d’un  

fibrat e  peut   êt re  just ifiée  en   cas  d’échec  diét ét ique  (si   hypert riglycéridémie  avec  LDL‐

cholest érol<  1,0  g/ l   et   HDL‐cholest érol   <  0,40  g/ l).  L’hypo   HDLémie  est   un   fact eur   de  risque 

d’évènement   cardio ‐vasculaire  à  part   ent ière.  A  l’inverse,  un   HDL  élevé  (>0,60  g/ l   ;   soit  
44
1,5mmol/ l) est  un  fact eur  cardio ‐prot ect eur . 

 
3.1.1.3. L’hypert riglycéridémie 

Elle  est   définie  par   un   t aux  de  t riglycérides  >1,5  g/ l   (1,7mmol/ l)  et   s’inscrit   aussi   souvent  

dans  le  cadre  d’un   syndrome  mét abolique.1En   cas  d’hypert riglycéridémie  <4g/ l   (4,6mmol/ l), 

la  prise  en   charge  est   avant   t out   diét ét ique  associant   une  réduct ion   pondérale  avec 

réduct ion   des  glucides  simples,  une  act ivit é  physique,  et   une  réduct ion   de  la  consommat ion  

d’alcool. 

 
3.1.1.4. L’apolipoprot éine A1 et  l’apolipoprot éine B 

L’apoA1  est   le  principal   composant   possédant   une  act ivit é  ant i ‐at hérogène  biologiquement  

act ive  de  l'HDL  cholest érol.  L’apoB  est   un   t ransport eur   de  part icules  VLDL  (very  low ‐densit y 

lipoprot ein),  IDL  (int ermediat e‐densit y  lipoprot ein)  et   LDL,  t out es  pot ent iellement  

at hérogènes.  Un   rapport   apoB  /   apoA1  élevé  est   associé  à  un   plus  grand   nombre  d’IDM , 
45
comme  l’a  mont ré  l’ét ude  INTERHEART .  Une  mét a  analyse  mont re  que  ce  rapport   apoB  /  

apoA1  est   un   meilleur   indicat eur   d’at hérosclérose  que  le  cholest érol   LDL  ou   le  rapport  
46
cholest érol  t ot al/ HDL . 

3.1.2.  L’hypertension artérielle  

 
Chez  le  diabét ique,  l’hypert ension   art érielle  (HTA)  représent e  un   fact eur   aggravant   de  la 

néphropat hie, de la rét inopat hie, et  de la cardiopat hie diabét ique. 

  47
L’object if  t ensionnel  chez le pat ient  diabét ique est  donc plus st rict  :  PA < 130/ 80 mm  Hg. 
47
L’ét ude  UKPDS    a  mont ré  qu’un   cont rôle  t ensionnel   plus  import ant   (object if   TA<150/ 85  

mmHg,  avec  un   t rait ement   par   capt opril   ou   at enolol)  vs  un   object if   t ensionnel   moins  st rict  

(TA <180/ 105 mm  Hg) chez le diabét ique permet  d’en  diminuer  les complicat ions :  réduct ion  

de  32%  de  la  mort alit é  liée  au   diabèt e,  diminut ion   de  44%  du   nombre  d’AVC  et   enfin  

réduct ion   de  37%  des  complicat ions  microvasculaires  (rénales  ou   opht almologiques). 

Cependant ,  ce  cont rôle  doit   êt re  poursuivi   de  façon   durable  afin   que  les  bénéfices  puissent  

êt re maint enus sur  le long t erme. 

3.1.3.  L’âge  et  le  sexe  

 
La prévalence des maladies cardiovasculaires augment e avec l’âge. Un  âge supérieur  ou  égal  

à  45  ans  pour   l’homme  et   55  ans  pour   la  femme  est   considéré  comme  un   fact eur   de  risque. 

Chez  les  pat ient s  diabét iques,  par   cont re,  le  risque  relat if   de  mort   par   maladie  coronarienne 
48
est  significat ivement  plus élevé chez la femme que chez l’homme . 

3.1.4.  Le  tabagisme  

 
La  fumée  de  t abac  est   à  la  fois  un   fact eur   prot hrombot ique  et   at hérogène.  C’est   un   fact eur  

de  risque  d’IDM ,  de  mort   subit e,  d’anévrysme  aort ique,  et   d’at t eint e  vasculaire 

périphérique.  Cependant ,  l’arrêt   du   t abac,  même  après  65  ans,  ent raine  une  réduct ion   de  la 
49
mort alit é et  de la morbidit é cardiovasculaire rapide . 

3.1.5.  Le  surpoids et  l’élévation du ratio  tour  de  taille/ tour  de  hanches 

 
L’ét ude  INTERHEART  a  mont ré  que  l’IM C  n’ét ait   pas  un   bon   marqueur   de  risque.  En  

revanche, dans cet t e ét ude le rapport  t our  de t aille/ t our  de hanches (TT/ TH) ét ait  un  fact eur  

fort ement   associé  au   risque  d’IDM .  Le  t our   de  t aille  est   lui   fort ement   corrélé  au   risque 

d’IDM ,  alors  que  le  t our   de  hanches  y  est   inversement   corrélé.  Les  normes  de  t our   de  t aille 

sont     80  cm   chez  la  femme,    94  cm   chez  l’homme.  Les  normes  du   rapport   TT/ TH  :    0,85  
50
chez les femmes,   1 chez les hommes . 

  48
3.2. Evaluation du risque vasculaire

3.2.1.  Le  score  de  Framingham  

 
Le  score  de  Framingham   permet   d’est imer   le  risque  à  10  ans  de  développer   une  pat hologie 

coronarienne grave. Il  a ét é élaboré grâce aux résult at s de l’ét ude Framingham. Le risque est  


51
calculé en  fonct ion  de plusieurs données  :  

‐ Age 

‐ Sexe 

‐ Cholest érol  t ot al  

‐ HDL cholest érol  

‐ Tabagisme 

‐ Pression  art érielle syst olique 

‐ Présence ou  non  d’un  diabèt e 

‐ +/ ‐ Présence ou  non  d’une hypert rophie vent riculaire gauche 

 
Il   se  déroule  en   9  ét apes  avec  des  scores  différent s  en   fonct ion   du   sexe.  De  nombreux 

logiciels  permet t ent   cependant   de  faire  le  calcul   rapidement .  En   fonct ion   du   score,  t rois 

niveaux de risque sont  définis :  

‐ Faible :  score < 10% 

‐ Int ermédiaire :  score ent re 10 et  20% 

‐ Elevé :  score   20% 

Les sociét és savant es européennes et  américaines ont  fixé à 20% le seuil  de risque 


9,10,52
cardio ‐vasculaire global  nécessit ant  une int ervent ion  t hérapeut ique  . 

3.2.2.  Risque  cardiovasculaire  et  diabète  de  type  2  

 
La  définit ion   du   risque  vasculaire  chez  le  pat ient   diabét ique   diffère  quelque  peu   selon   les 

pays.  Aux  Et at s‐Unis,  en   1998,  Haffner   et   al.  ont   comparé  l’incidence  des IDM   sur   7  ans  chez 
53
les diabét iques et  les non  diabét iques avec ou  sans ant écédent  d’infarct us . Le risque relat if  

ent re  le  t aux  d’IDM   chez  les  non   diabét iques  en   prévent ion   secondaire  et   chez  les 

diabét iques  en   prévent ion   primaire  ét ait   de  1,2  une  fois  ajust é  aux  fact eurs  de  risque 

  49
t radit ionnels,  les  classant   donc  en   risque  équivalent .  De  même,  l’American   Heart  

Associat ion,  ainsi   que  l’American   Diabet es  Associat ion   (ADA)  considèrent   dans  leurs 

recommandat ions  que  le  pat ient   diabét ique  doit   êt re  t rait é  comme  un   sujet   à  risque 
9,10
coronaire équivalent  (ayant  déjà eu  un  évènement  cardiaque ischémique) . 

 
En   France,  selon   les  recommandat ions  HAS,  un   pat ient   diabét ique  est   considéré  comme  à 

haut   risque  cardio ‐vasculaire  (ou   risque  cardio ‐vasculaire  équivalent   à  une  prévent ion  

secondaire) s’il  présent e :  

‐ Soit   une  at t eint e  rénale,  qui   est   définie  par   la  présence  d’une  albuminurie  300  

mg/ 24h,  ou   bien   par   une  diminut ion   du   début   de  filt rat ion   glomérulaire  (calcul  

selon  la formule de Cockcroft  et  Gault ) inférieur  à 60 ml/ min. 

‐ Soit   un   diabèt e  évoluant   depuis  plus  de  10   ans  et   au   moins  2  fact eurs  de  risque 

parmi  lesquels :  

‐ Des  ant écédent s  familiaux  de  maladie  coronaire  précoce  (infarct us  ou  
er
mort  subit e chez le père ou  un  parent  du  1  degré de sexe masculin  avant  
er
55  ans,  ou   avant   65  ans  chez  la  mère  ou   un   parent   du   1   degré  de  sexe 

féminin),  des  ant écédent s  familiaux  d’AVC  const it ués  avant   l’âge  de  45  

ans 

‐ un  t abagisme act if  ou  arrêt é depuis moins de 3 ans, 

‐ une hypert ension  art érielle, 

‐ un  HDL‐cholest érol  <0,40 g/ l  (soit  1 mmol/ l), 

‐ une microalbuminurie (>30 mg/ 24  heures), 

‐ un  âge   50 ans pour  un  homme, ou  60 ans pour  une femme. 

‐  Soit ,  après  calcul   par   des  équat ions  de  risque,  un   risque  >20%  de  faire  un  
événement  coronarien  dans les 10 ans. 

 
En   2001,  dans  l’ét ude  ENTRED,  29%  des  pat ient s  diabét iques  de  t ype  2  avaient   un   risque 

vasculaire  élevé  (selon   les  définit ions  du   risque  vasculaire  de  l’HAS  suscit ées).  Ce 

pourcent age  ét ait   probablement   sous‐est imé  du   fait   des  fréquences  insuffisant es  des 

dosages  de  microalbuminurie  et   de  cholest érol.  Seulement   un   quart   (26%)  des  personnes  à 

haut  risque at t eignaient  en  2001  l’object if  de LDL  inférieur  ou  égal  à 1 g/ l. 

  50
Bien   que  discut ées  d’un   pays  à  l’aut re,  l’ensemble  de  ces  données  met   en   exergue  la  réalit é 

d’un   risque  vasculaire  t rès  élevé  chez  les  pat ient s  diabét iques  de  t ype  2.  Il   est  

communément   admis  que  le  risque  cardiovasculaire  est   5  fois  supérieur   chez  les  sujet s 

diabét iques  comparés  à  la  populat ion   non   diabét ique.  Les  complicat ions  cardiovasculaires 

qui   en   résult ent   (AVC,  IM ,  AOM I,  IRC)  sont   les  principales  causes  de  morbi ‐mort alit é  des 

pat ient s  diabét ique  const it uant   aujourd’hui   un   réel   problème  de  sant é  publique  au ‐delà  du  

dépist age et  de la prévent ion  du  diabèt e de t ype 2. 

3.3. Améliorer le dépistage du risque cardiovasculaire


 
Les  fact eurs  de  risque  (FR)  cardiovasculaire  (CV)  classiques  t els  que  la  dyslipidémie, 

l’hypert ension,  le  t abagisme  et   le  diabèt e  sucré  ont   ét é  int égrés  dans  des  modèles  à 

variables  mult iples  pour   évaluer   le  risque  de  survenue  d’un   accident   CV  dans  la  populat ion  

générale.  Ce  concept   d’est imat ion   globale  du   risque  permet   de  prédire  avec  plus  de 

vraisemblance  le  risque  CV,  t out   en   jouant   un   rôle  clé  dans  l’individualisat ion   des  mesures 
52
t hérapeut iques . 

 
Ainsi   que  l’a  démont ré  l’ét ude  INTERHEART  réalisée  sur   un   collect if   de  plus  de  30  000  

part icipant s issus de 52  pays différent s, les FR t radit ionnels sont  à même d’expliquer  plus de 


45
90%  des  infarct us  du   myocarde .  Fondés  sur   ces  FR  classiques,  les  algorit hmes  permet t ent  

de  st rat ifier   les  individus  en   t rois  cat égories  de  risque,  faible,  int ermédiaire  et   élevé. 

Cependant ,  il   faut   t out   de  même  const at er   que  ces  modèles  ne  sont   pas  parfait s.  En   effet , 

dans  le  cadre  de  l’ét ude  prospect ive  PROCAM   (Prospect ive  cardiovascular   muenst er),  un  

t iers  des  vict imes  d’infarct us  du   myocarde  a  ét é  observé  dans  le  groupe  des  sujet s  qui  
54
avaient  ét é init ialement  classifiés comme ét ant  à risque int ermédiaire .  

 
C’est  pour  cet t e raison  qu’au  cours de ces dernières années un  grand  nombre de paramèt res 

biochimiques ont  ét é évalués en  t ant  que fact eurs pot ent iels de risque CV avec pour  object if  


55
d’améliorer  l’évaluat ion  du  risque vasculaire aux moyens de mét hodes non  invasives .  

 
 

  51
Parmi  les biomarqueurs biochimiques act uellement  évalués on  compt e :  

‐ les  marqueurs  de  l’inflammat ion   (CRP  Ult rasensible,  Homocyst éine,  Serum  

Amyloïde  A  (SAA),  Lp ‐PLA2  (Lipoprot ein   associat ed   Phospholipase  A2), 

cyt okines (Il ‐6, IL‐18) et  fact eurs chimiot act iques (M CP‐1, ICAM ‐1, VCAM ‐1) 

‐ les  marqueurs  lipoprot éiques  aut res  que  les  marqueurs  convent ionnellement  

ut ilisés (LDL‐Ox, Génot ypes d’ApoE, Lp(a), Small  Dense LDL) 

‐ les  marqueurs  de  l’at hérot hrombose  (fibrinogène,  D‐Dimères  (DDI),  Act ivat eur  

t issulaire du  plasminogène (TPA),…) 

‐ les marqueurs d’oxydat ion  (homocyst éine, Lp ‐PLA2, AGEs, …) 

‐ les marqueurs de la néphropat hie diabét ique (microalbuminurie, cyst at ine C) 

 
Ces  biomarqueurs  sont   représent at ifs  de  mécanismes  physiopat hologiques  impliqués 

direct ement   dans  le  processus  de  dysfonct ionnement   endot hélial   et   d’at hérosclérose.  Ils 

pourraient   const it uer   des  crit ères  de  jugement   prédict ifs  de  l’apparit ion   d’évènement s 

cardiovasculaires  en   associat ion   ou   non   aux  fact eurs  de  risques  convent ionnels.  Dans  cet  

opt ique, des invest igat ions cliniques sont  en  cours. 

  52
4. DIABETE, STRESS OXYDANT ET HYPERGLYCEMIE CHRONIQUE
 

4.1 Hyperglycémie chronique et stress oxydant


 
Le st ress oxydat if  correspond  globalement  à un  déséquilibre ent re la product ion  cellulaire de 

radicaux  libres,  d’espèces  réact ives  de  l’oxygène  (ROS :   React ive  Oxygen   Species)  et   les 
56
défenses  ant ioxydant es  de  l’organisme .  La  t oxicit é  des  radicaux  libres  varie  en   fonct ion   de 

l’int ensit é et  de la durée de leur  format ion.  

 
La  product ion   modérée  et   t ransit oire  de  radicaux  libres  peut   servir   de  mécanisme  de 

défense  en   permet t ant   la  dest ruct ion   de  cellules  cancéreuses.  Si   la  synt hèse  d’espèces 

radicalaires  est   récurrent e  et   chronique  alors  il   y  a  un   déséquilibre  ent re  product ion   et  

dét oxificat ion   et   st ress  oxydat if.  Dans  le  cas  d’un   st ress  oxydant   prolongé,  la  product ion  

excessive  d’espèces  radicalaires  peut   engendrer   indirect ement   des  mécanismes  de  mort  
57
cellulaire programmée (apopt ose, aut ophagie) . 

4.1.1.  Définitions des radicaux libres.  

Ce  sont   des  espèces  chimiques  fort ement   réact ives  comport ant   des  élect rons  non   appariés 

au   niveau   de  leur   couche  ext erne.  La  présence  d'un   élect ron   célibat aire  confère  à  ces 

molécules,  la  plupart   du   t emps,  une  grande  inst abilit é.  Elles  ont   la  possibilit é  de  réagir   avec 

de  nombreux  composés  dans  des  processus  le  plus  souvent   non   spécifiques,  et   que  leur  

durée de vie en  solut ion   est  t rès court e. La st abilit é de ces ent it és chimiques décroît  lorsque 

le nombre d'élect rons célibat aires augment e. 

 
Les radicaux sont  généralement  obt enus par  rupt ure de liaisons chimiques (figure n°7). Ét ant  
−1
donné  que  les  liaisons  chimiques  ont   des  énergies  de  l'ordre  de  cent aines  de  kJ.mol ,  les 

condit ions  mises  en   jeu   pour   donner   des  radicaux  sont   souvent   drast iques :   haut es 

t empérat ures,  radiat ions  ionisant es,  ult raviolet s.  Ils  résult ent   de  la  coupure  homolyt ique 
58
d’une molécule .  

  53
• •

Figure n°7 :  Coupure Homolyt ique d’une molécule et  product ion  d’espèces radicalaires 

4.1.2.  Diabète  de  type  2  et  hyperproduction de  radicaux libres 

 
Au   cours  du   diabèt e, et  plus  part iculièrement   dans  le  t ype  2 lié  à  un   syndrome  mét abolique, 

l’hyperglycémie est  associée à un  st ress oxydant  lié à une hyperproduct ion  de radicaux libres 

et  ROS. 

 
59
Le st ress oxydant  lié à l’hyperglycémie a plusieurs origines (figure n°8 et  10) :   

 
 Le  glucose  sous  sa  forme  ène‐diol   en   présence  de  mét aux  de  t ransit ions  donne  un  
radical   anionique  ène‐diol.  Le  radical   ène‐diol   en   réduisant   l’oxygène  moléculaire 
•‐
libère  des  radicaux  superoxydes  (O2 ).  De  plus,  il   y  a  format ion   concomit ant e  d’un  

dérivé  carbonylé  au   cours  de  cet t e  réact ion.  L’anion   superoxyde  peut   se  dismut er   en  

peroxyde  d’hydrogène  qui   en   présence  de  mét aux  de  t ransit ions  produit   un   radical  
• 58
hydroxyle (HO ) t rès réact if   . 

 
 La glycat ion  des prot éines est  par  elle‐même générat rice d’ROS (espèces réact ives de 
l’oxygène).  Tout es  les  ét apes  de  la  glycat ion   génèrent   des  ROS,  aussi   bien   au   st ade 

des  produit s  init iaux  que  des  produit s  int ermédiaires  et   avancés,  conduisant   à  la 

format ion   d’aldéhydes  réact ifs  comme  le  mét hylglyoxal   (M GO).  Les  produit s 

d’AM ADORI  t elle  que  l’hémoglobine  glyquée  réagissent   avec  l’oxygène  moléculaire 
57
pour  former  de l’ion  superoxyde ou  du  peroxyde d’hydrogène .  

 
 Un   déséquilibre  de  la  chaine  respirat oire  mit ochondriale  et   de  la  NADPH  oxydase 
présent e  dans  les  cellules  musculaires  et   endot héliales  génère  des  radicaux 

superoxydes.  Le  gradient   de  prot on   généré  par   la  chaine  respirat oire  mit ochondriale 
•‐
est   à  l’origine  de  la  product ion   de  radicaux  superoxydes  (O2 ).  Cet t e  product ion   de 

  54
radicaux  superoxydes  se  sit ue  au   niveau   de  la  NADH  déshydrogénase  du   complexe  I 

et  à l’int erface ent re l’ubiquinone et  le complexe III.  

 
 L’hyperglycémie  prolongée  induit   la  format ion   de  produit s  t erminaux  de  glycat ion. 
Les  AGE  st imulent   les  récept eurs  membranaires  RAGE  sit ués  à  la  surface  des  cellules 

endot héliales  et   musculaires.  L’int eract ion   AGE‐RAGE  st imule  des  voies  de 

signalisat ion  comport ant  les voies des M it ogen ‐Act ivat ed  Prot eine Kinases (M APK) et  

la  voie  du   fact eur   de  t ranscript ion   NFB  (Necrosis  Fact or   kappa  B)  induisant   la 

product ion  de radicaux libres via la st imulat ion  de la NADPH oxydase.  

 
 L’hyperglycémie  induit   l’augment at ion   de  la  product ion   de  sorbit ol   par   la  voie  des 
polyols.  La  product ion   de  sorbit ol   a  pour   conséquence  la  baisse  de  NADPH 

int racellulaire.  En   effet ,  le  NADPH  est   nécessaire  à  l’act ivit é  de  l’aldose  réduct ase 

pour   la  synt hèse  du   sorbit ol.  Le  NADPH  ét ant   diminué,  le  glut at hion   oxydé  sera 

réduit   plus  faiblement .  De  plus,  le  sorbit ol   est   oxydé  en   fruct ose  avec  réduct ion   du  
+
NAD+  en   NADH,H .  L’augment at ion   de  la  concent rat ion   en   sorbit ol   et   fruct ose 

conduit   à  un   oedème  osmot ique  au   niveau   oculaire,  ce  qui   explique  que  la  voie  des 
60
polyols joue un  rôle clé dans la cat aract e induit e par  le diabèt e .  La voie des polyols 

ent raine la baisse du  NADPH ce qui  provoque une baisse d’act ivit é de la NO‐synt hase 

qui   synt hét ise  le  NO.  Le  radical   superoxyde  induit   une  baisse  du   NO  en   réagissant  

avec  celui ‐ci   et   en   formant   un   anion   peroxynit rit e  t rès  réact if.  La  baisse  de 

concent rat ion   en   NO  pourrait   êt re  à  l’origine  de  phénomènes  d’hypert ension   car   le 

NO  est   un    puissant   vasodilat at eur.   La  biodisponibilit é  du   NO  est ,  de  plus,  diminuée 

par  t rois mécanismes :   

- Diminut ion   d’act ivit é  de  la  NO‐synt hase,  consécut ive  à  la  chut e  du   rapport  
+ +
NADPH,H / NADP .  

- Réact ion   du   NO  avec  l’anion   superoxyde  conduisant   à  la  format ion   de 

peroxynit rit e, oxydant  puissant .  

- Piégeage du  NO par  les AGE.  

  55
 L’hyperglycémie  induit   la  synt hèse  de  diacylglycerol   conduisant   à  l’act ivat ion   de  la 
voie  de  la  prot éine  kinase  C.  La  prot éine  kinase  C  st imule  la  NADPH  oxydase 
61
provoquant  la product ion  d’espèces réact ives de l’oxygène .  

 
Figure n° 8 :  représent at ion  schémat ique des mécanismes de product ion  de ROS au  cours 
du  diabèt e  (AGEs:  advanced  glycat ion  end  product s;  CAT:  cat alase;  GPX:  glut at hione 
peroxidase;  HBP:  hexosamine biosynt het ic pat hw ay;  PKC:  prot ein  kinase C;   
PP:  polyol  pat hw ay;  ROS:  react ive oxygen  species;  SOD:  superoxide dismut ase)  
59

 
 

  56
4.1.3.  Les défenses antioxydantes.   

 
L’organisme  possède  un   ensemble  de  défenses  ant ioxydant es  pour   se  prot éger   des  ROS 

(figure  n°10).  L’organisme  comport e  deux  t ypes  de  défenses  ant ioxydant es.  L’une  d’origine 

endogène  formée  d’enzymes  et   l’aut re  d’origine  exogène  const it uée  principalement   de 

vit amines et  d’oligoélément s.  

 
4.1.3.1. Les syst èmes de défenses enzymat iques.  

 
‐Les superoxydes dismut ases (SOD).  
Ces  sont   des  mét alloprot éines.  Elles  sont   en   première  ligne  dans  le  syst ème  de  défense  du  

st ress  oxydant .  Elles  assurent   la  dismut at ion   de  l’anion   superoxyde  en   peroxyde 

d’hydrogène  et   en   oxygène.  Il   exist e  t rois  isoenzymes  de  la  SOD:   la  Cu/ Zn ‐SOD1  présent e 

dans  le  cyt osol,  la  M n ‐SOD2  mit ochondriale  et   la  Cu/ Zn ‐SOD3.  La  SOD3   est   sécrét ée  par   les 

cellules  musculaires  lisses  et   représent e  le  syst ème  de  défense  majeur   dans  la  paroi   des 

art ères.  L’expression   de  la  SOD3  est   augment ée  par   les  fact eurs  vasoact ifs  comme 
56
l’hist amine, l’endot héline 1 et  l’angiot ensine 2, et  diminuée par  l’homocyst éine .  

 
‐Les glut at hion  peroxydases (GPxs).  
Les  GPxs  sont   des  sélénoprot éines.  Les  GPxs  réduisent   les  peroxydes  lipidiques  formés  par  

l’oxydat ion   des  acides  gras  polyinsat urés.  Le  t aux  de  GPxs  est   effondré  en   cas  de  déficit   en  

sélénium.  A  part ir   d’un   t aux  élevé  en   sélénium   la  concent rat ion   en   GPxs  at t eint   un   plat eau. 

Le dosage des GPxs ne peut  êt re ut ilisé comme marqueur  d’une int oxicat ion  au  sélénium. La 

synt hèse  des  GPxs  ét ant   rénale  et   hépat ique,  l’insuffisance  rénale  et / ou   hépat ique  peuvent  
56
faire varier  leurs t aux .  

 
‐Le syst ème t hiorédoxine.  
La  t hiorédoxine  est   l’ant ioxydant   majeur   qui   maint ient   les  prot éines  int racellulaires  à  l’ét at  

réduit .  La  t hiorédoxine  est   régénérée  par   le  NADPH  sous  l’act ion   de  la  t hiorédoxine 

réduct ase.  La  t hiorédoxine  cont ient   un   groupement   sélénocyst éine  dans  son   sit e  act if.  De 

plus,  elle  int ervient   dans  la  dégradat ion   des  peroxydes  lipidiques  et   du   peroxyde 
56
d’hydrogène. Elle permet  la régénérat ion  du  radical  ascorbyl  en  acide ascorbique .  

  57
‐La  cat alase.  
La  cat alase  est   une  enzyme  héminique  const it uée  de  quat re  sous‐unit és  cont enant   chacune 
2+
un  groupement  héminique Fe  lié au  sit e act if. Elle est  localisée dans les peroxysomes et  les 

hémat ies.  La  réact ion   que  cat alyse  cet t e  enzyme  consist e  en   une  dismut at ion   du   peroxyde 
60
d’hydrogène (H2O2) en  oxygène et  eau .  

4.1.3.2. Les syst èmes de défenses non  enzymat iques.  

 
‐Le glut at hion   
Le  glut hat ion   est   formé  par   la  condensat ion   de  t rois  acides  aminés  (acide  glut amique, 

cyst éine  et   glycine).  Il   est   la  source  majorit aire  de  résidus  t hiols  (‐SH)  dans  la  cellule  où   il   est  

présent   sous  forme  réduit e  (GSH).  En   condit ion   physiologique  normale,  sa  forme  oxydée 

(GSSG)  est   présent e  en   t rès  faible  concent rat ion.  Le  rapport   GSH/ GSSG  est   un   excellent  

marqueur   de  la  peroxydat ion   lipidique.  Ce  rapport   t end   à  diminuer   lors  d’un   exercice 
56
physique int ense et  au  cours du  vieillissement .  

 
    ‐  L’albumine et  les prot éines‐t hiols 
Tout es  les  prot éines  circulant es  qui   cont iennent   des  groupement s  t hiols  part icipent   aux 
62
défenses ant ioxydant es cont re les ROS .   

 
Parmi   ces  prot éines,  l’albumine  t ient   une  place  prépondérant e,  cet t e  prot éine  est   la  plus 

abondant e  du   plasma,  elle  const it ue  le  principal   t ampon   cont re  les  ROS  circulant s.  Cet t e 

prot éine  de  585  acides  aminés  est   composée  de  3  domaines  homologues  divisés  en   9 

boucles  dont   la  st abilit é  est   assurée  par   17  pont s  disulfures,  conférant   à  cet t e  prot éine  une 
63
cert aine flexibilit é (figure n°9) . 

 
L’albumine  const it ue  donc  l’ant ioxydant   prot éique  majeur   du   plasma,  compart iment  

fort ement   sollicit é  par   le  st ress  oxydat if   et   en   cont act   direct   avec  l’endot hélium   vasculaire. 

La  plupart   de    ses  propriét és  ant ioxydant es  sont   at t ribuées  à  sa  capacit é  de  fixat ion   de 

nombreux  ligands  de  par   l’adapt abilit é  import ant e  de  sa  st ruct ure.  L’albumine  est   en   effet  

une  prot éine  de  t ransport   de  nombreux  mét abolit es,  xénobiot iques,  lipides  ou   encore  de 

  58
mét aux divalent s. Dans ce cadre elle présent e un  effet  ant ioxydant  indirect  puisqu’elle limit e 
64
l’effet  de molécules prooxydant es par  liaison  à l’albumine.  

 
Figure n° 9:  Principaux sit es de l’albumine impliqués dans son  act ivit é ant ioxydant e . 
64

 
De  plus  son   seul   groupement   t hiol   libre  au   niveau   du   résidu   Cys34  lui   confère  d’une  par   des 

capacit és  de  fixat ion   de  ligands  supplément aires  et   surt out   la  possibilit é  de  piéger   des 
65
radicaux libres.  Chez un  adult e normal, environ  70 à 80% du  résidu  Cys34 de l’albumine est  

à  l’ét at   réduit   (S‐H).  Le  rest e  est   sous  la  forme  de  pont s  disulfures  avec  plusieurs  composés 

soufrés  comme  la  cyst éine,  l’homocyst éine  et   le  glut at hion.  Le  groupement   –SH  de 

l’albumine  représent e  un   sit e  de  prot ect ion   ant ioxydant   puissant ,  cont re  les  ROS  et   d’aut res 

espèces radicalaires. 
 

‐La  vit amine C (acide ascorbique).  


L’homme  ne  peut   synt hét iser   la  vit amine  C  et   doit   assurer   un   apport   journalier   d’environ  

100  mg  via  une  aliment at ion   riche  en   fruit s.  La  vit amine  C  est   un   piégeur   d’ROS  comme  le 

  59
radical   hydroxyle  ou   l’anion   superoxyde  en   agissant   en   synergie  avec  la  vit amine  E.  En   effet , 

elle  inhibe  la  peroxydat ion   lipidique  en   régénérant   la  vit amine  E  à  part ir   de  la  forme 
66
radicalaire issue de sa réact ion  avec des radicaux lipidiques .  

 
‐La  vit amine E.  
Le t erme de vit amine E désigne un  ensemble d’isomères qui  comprend  les t ocophérols et  les 

t ocot riénols.  Les  deux  isomères  ‐et   ‐t ocophérol   sont   int éressant s  d’un   point   de  vue 

biologique.  Ayant   un   caract ère  lipophile,  ils  s’insèrent   aux  seins  des  membranes 

cyt oplasmiques riches en  acides gras polyinsat urés. Ils réagissent  avec les radicaux peroxyles 



ROO   pour   former   un   radical   t ocophéryle,  et   ainsi   ils  limit ent   la  propagat ion   de  la 

peroxydat ion  lipidique.  

 
‐Les carot énoïdes.  
Parmi   plus  de  600  carot énoïdes  différent s,  le ‐carot ène  est   le  chef   de  file.  On   le  ret rouve 

dans  l’abricot ,  le  melon,  la  carot t e  et   les  légumes  vert s.  L’effet   bénéfique  du   ß‐carot ène 

n’est   présent   qu’à  dose  physiologique  ou   aliment aire.  A  dose  pharmacologique,  le  ß‐

carot ène  est   délét ère,  surt out   chez  le  fumeur   car   les  ROS  alt èrent   le  mét abolisme  des 
56
carot énoïdes et  libèrent  des mét abolit es pro ‐carcinogènes .  

 
‐Le Coenzyme Q10 ou  ubiquinone.  
C’est   un   dérivé  benzoquinolique  à  longue  chaîne  lat érale  isoprénique.  Sa  chaine  lat érale  lui  

confère  un   caract ère  lipophile.  Il   joue  un   rôle  essent iel   dans  la  chaine  mit ochondriale  de 
56
t ransport  d’élect rons et  il  est  un  puissant  inhibit eur  de la peroxydat ion  lipidique .  

 
‐L’acide urique.  
Il  est  présent  sous la forme d’urat e à pH physiologique et  c’est  le produit  t erminal  majeur  du  

mét abolisme des purines. L’urat e est  un  puissant  piégeur  de ROS. Ces réact ions conduisent  à 

des  espèces  radicalaires  qui   seront   réduit es,  not amment   par   la  vit amine  C.  L’allant oïne  qui  

est   un   produit   de  la  réact ion   ent re  l’urat e  et   les  ROS  est   présent   à  des  t aux  élevés  lors  d’un  
56
st ress oxydant . 

 
 

  60
‐La  bilirubine.  
La  bilirubine  est   un   produit   t erminal   de  la  dégradat ion   de  l’hème  par   les  cellules 

rét iculoendot héliales.  La  bilirubine  non   soluble  se  lie  à  l’albumine  dans  un   rapport  

st œchiomét rique  1/ 1,  ainsi   sa  liaison   à  l’albumine  l’empêche  de  pénét rer   dans  les  t issus 

riches  en   lipides  t els  que  le  cerveau.  La  bilirubine  piège  les  radicaux  ROO   et   l’oxygène 
56
singulet . Ainsi  la bilirubine prot ège l’albumine des ROS . 

 
‐Les polyphénols.  
Ils  sont   nat urellement   présent s  dans  l’aliment at ion.  Ils  sont   présent s  sous  forme 

d’ant hocyanine dans les fruit s rouges et  le vin  rouge. Ils sont  sous forme de flavonoïdes dans 

les  agrumes  et   l’huile  de  lin,  et   enfin   sous  forme  d’épicat échine  dans  le  vin,  le  t hé,  le 
67
chocolat ,  les  pommes,  les  oignons  et   les  algues  brunes .  Ce  sont   d’excellent s  piégeurs  de 

ROS et  de t rès bons chélat eurs de mét aux de t ransit ion  comme le cuivre et  le fer. 

 
‐Les oligoélément s : 
 Le sélénium. Le sélénium  est  un  cofact eur  de la GPx, il  est  donc ant ioxydant  de façon  
indirect .  On   ret rouve  le  sélénium   organique  dans  l’aliment at ion,  sous  forme  d’un  

acide aminé, la sélénocyst éine. Le sélénium  organique est  mieux absorbé, il  subit  une 

mét abolisat ion   hépat ique  conduisant   à  des  int ermédiaires  nécessaires  à  la  synt hèse 

de la GPx.  

 Le  cuivre.  A  concent rat ion   physiologique  le  cuivre  est   le  cofact eur   d’une  SOD, 
cependant ,  il   peut   jouer   un   rôle  dans  la  product ion   de  ROS  (réact ion   de  FENTON) 

lorsque sa concent rat ion  est  élevée.  

 Le zinc. Le zinc est  un  cofact eur  essent iel  de la SOD. Il  prot ège les groupement s t hiols 
des  prot éines.  Il   peut   inhiber   les  réact ions  de  format ion   de  ROS  induit es  par   les 
56
mét aux de t ransit ion  comme le fer  ou  le cuivre . 

  61
 
Figure n° 10 :  M écanismes physiologiques de générat ion  de ROS et  principales défenses 
ant ioxydant es  
56

4.1.4.  Conséquences de  l’hyperproduction d’espèces réactives de  l’oxygène.   

 
Les ROS réagissent  avec leur  environnement  et  le dégrade. Ils réagissent  avec :   

 
4.1.4.1. M odificat ions oxydat ives de l’ADN.  

Par   exemple,  la  guanine  peut   réagir   avec  un   radical   OH  pour   former   la  8‐hydroxy‐2’ ‐

désoxyguanosine  qui   s’apparie  avec  une  adénine  au   lieu   d’une  cyt osine.  Ceci   ent raine  alors 

des  mut at ions  au   sein   de  l’ADN  qui   conduisent   à  l’alt érat ion   du   message  génét ique  et   peut  
68
déclencher   un   cancer   et   augment er   le  vieillissement .  L’anion   superoxyde  provoque  des 

cassures  au   niveau   de  l’ADN,  ceci   induit   le  fonct ionnement   des  poly  (ADP‐ribose) 

polymérases  qui   sont   des  enzymes  de  réparat ion   de  l’ADN.  L’excès  d’ADP‐ribose  formé  par  

cet t e  hyperact ivit é  enzymat ique  vient   se  fixer   sur   la  glycéraldéhyde‐3‐phosphat e 

déshydrogénase  et   ainsi,  l’inhibe.  L’accumulat ion   des  mét abolit es  de  la  glycolyse  en   amont  

  62
est   responsable  de  l’act ivat ion   de  quat re  voies  mét aboliques  (voie  des  polyols,  voie  des 
68
hexosamines, voie de la PKC et  la voie des AGE) . 

 
4.1.4.2. M odificat ions oxydat ives des prot éines.  

Les  acides  aminés  les  plus  réact ifs  aux  ROS  sont   l’hist idine,  la  proline,  le  t rypt ophane,  la 

cyst éine  et   la  t yrosine.  L’at t aque  de  produit s  radicalaires  sur   les  prot éines  ent raine 

l’oxydat ion   de  cert ains  résidus  avec  pour   conséquences  l’apparit ion   de  groupement s 

carbonylés, des clivages de chaînes pept idiques et  des pont s disulfures int ra et  int er ‐chaînes.  

 
L’albumine,  prot éine  circulant   la  plus  abondant e,  présent e  une  act ivit é  ant ioxydant e  t rès 

import ant e  puisqu’elle  présent e  de  nombreux  sit es  lui   permet t ant   de  piéger   des  radicaux 
64
libres  (figure  n°9) .  Cet t e  propriét é  vaut   à  l’albumine  de  subir   d’import ant es  modificat ions 

oxydat ives  puisqu’elle  est   la  cible  privilégiée  des  radicaux  libres  circulant s.  Si   les 

modificat ions  st ruct urales  et   fonct ionnelles  de  l’albumine  au   cours  d’un   st ress  oxydat if  

prolongé  n’ont   pas  t out es  fait   l’objet   d’une  descript ion   dét aillée,  l’albumine  modifiée  par  

l’ischémie  encore  appelée  IM A (Ischemia  M odified   Albumin),  premièrement   décrit e  lors 

d’épisode  ischémiques  du   t ype  syndrome  coronarien   aigu   (SCA)  ou   infarct us  du   myocarde 
69
(IM ), est  aujourd’hui  communément  reconnue comme un  marqueur  du  st ress oxydant .  

 
Cet t e  forme  d’albumine  est   caract érisée  par   une  capacit é  de  liaison   d’ions  bivalent s 
2+
diminués, plus part iculièrement  le Co . L’IM A est  donc mise en  évidence dans le plasma par  

mesure  de  la  capacit é  de  liaison   de Cobalt   en  excès  rapport é  à  la  concent rat ion   plasmat ique 
70
d’albumine.   La  concent rat ion   d’IM A  est   inversement   proport ionnelle  à  la  concent rat ion   de 

Cobalt   non   lié  à  l’albumine  et   est   le  reflet   de  l’impact   du   st ress  oxydant   dans  le 
71
compart iment  plasmat ique.  

 
De  nombreuses  ét udes  ont   mis  en   évidences  ces  dernières  années  l’augment at ion   de  l’IM A 

dans  des  pat hologies  chroniques  sujet t es  à  un   fort   st ress  oxydant   (diabèt e, 
72,73,74,75
at hérosclérose) . 

 
 

  63
La  plupart   des  dommages  sont   irréparables  et   peuvent   ent raîner   des  modificat ions 

fonct ionnelles  import ant es  comme  par   exemple  la  non   reconnaissance  d’un   récept eur   par  

un   ligand   ou   une  pert e  d’act ivit é  enzymat ique.  Cert aines  prot éines  oxydées  sont   peu  

dégradées  et   forment   des  agrégat s  dans  les  cellules  et   dans  le  compart iment  
63,76
ext racellulaire . 

 
Les  prot éines  modifiées  par   le  st ress  oxydant   présent ent   t rès  cert ainement   un   rôle  dans  les 

mécanismes  physiopat hologiques  impliqués  dans  des  pat hologies  chroniques  comme  le 

diabèt e.  Par   exemple,  les  modificat ions  oxydat ives  de  prot éines  comme  l’albumine,  sont  

elles‐mêmes source de radicaux libres et  d’un  st ress oxydant  qui  a pu  êt re mis en  évidence in  


77
vit ro  sur  des monocyt es . 
 
 

4.1.3.3. M odificat ions oxydat ives des lipides membranaires.  

 
En  phase d’init iat ion  le radical  hydroxyle peut  arracher  un  hydrogène sur  les carbones sit ués 

ent re  une  double  liaison.  Le  radical   lipidique  réagit   avec  l’oxygène  et   forme  un   radical  

peroxyle  (ROO ).  Celui ‐ci   est   capable  d’arracher   un   hydrogène  à  l’acide  gras  polyinsat uré 

voisin   et   ainsi   de  propager   la  réact ion.  Ceci   induit   une  alt érat ion   de  la  fluidit é  membranaire 

et   conduit   à  la  mort   cellulaire.  Les  peroxydes  formés  sont   neut ralisés  par   la  glut at hion  

peroxydase,  ou,  ils  cont inuent   de  s’oxyder   et   de  se  fragment er   en   aldéhydes 

(malondialdéhyde, 4‐hydroxynonénal) qui  ont  des act ivit és pro ‐at hérogènes et  cancérigènes. 

  
4.1.3.4. M odificat ions oxydat ives des lipoprot éines.  

 
Les LDL oxydées sont  capt ées par  des récept eurs spécifiques sit ués sur  les macrophages. Les 

macrophages  se  t ransforment   alors  en   cellules  spumeuses  qui   ont   un   rôle  dans  les 

premières  ét apes  de  l’at hérosclérose.  Les  LDL  oxydées  sont   immunogènes  et   les  immuns 
56
complexes formés act ivent  la voie classique du  complément .  

  64
4.2. Hyperglycémie chronique et AGEs (advanced glycation end-
products).
 

4.2.1.  Formation des AGEs : phénomène  de  Glycoxydation  

Le  t erme  de  glycat ion   non   enzymat ique  désigne  les  modificat ions  t ardives  induit es  par   la 

fixat ion   d’oses  simples  sur   les  groupement s  aminés  des  prot éines.  C’est   une  réact ion  

générale,  spont anée,  irréversible  et   cumulat ive  procédant   en   plusieurs  ét apes.  Une  phase 

précoce  qui   commence  par   la  format ion   d’une  liaison   aldimine  (base  de  Schiff)  capable  de 

subir   un   réarrangement   moléculaire  dit   réarrangement   d’Amadori.  L’HbA1c  et   les 


57
fruct osamines sont  des exemples caract érist iques des produit s d’Amadori .  

 
Les  produit s  d’Amadori   ne  const it uent   pas  un   ét at   définit if.  Au   cours  d’une  phase  plus 

t ardive,  ils  subissent   des  réact ions  oxydat ives  formant   des  int ermédiaires  dicarbonylés 

réact ifs  (M GO  ou   le  3désoxyglucosone)  et   about issant   à  la  format ion   de  st ruct ures  plus 

complexes  appelées  AGEs:   on   parle  alors  de  glycoxydat ion,  phénomène  combinant   les 
57,78,79
mécanismes de glycat ion  et  d’oxydat ion  des prot éines (figure n°11)  .  

 
Les  AGEs  int erviennent   dans  différent s  phénomènes  t els  que  l’inflammat ion,  l’apopt ose 

cellulaire,  le  remodelage  t issulaire  ou   l’angiogénèse.  La  plupart   des  réact ions  de  glycat ion  

s’accompagnent  de réact ions d’oxydat ion  qui  sont  à l’origine du  t erme de glycoxydat ion. Les 

différent es  ét apes  de  la  glycat ion   sont   générat rices  de  ROS.  Les  ROS  induisent   la  format ion  

d’aldéhydes  réact ifs  dont   l’un   des  plus  abondant   est   le  M GO.  Ces  produit s  int ermédiaires 

réagissent  avec les groupement s aminés libres des prot éines afin  de former  des AGEs.  

  65
 
Figure n°11  :  Format ion  des produit s d’Amadori  et  réarrangement  oxydat ifs en  produit s 
avancés de glycat ion  – Phénomène de glycoxydat ion .  
57

 
 
Les  voies  de  la  glycat ion   about issent   à  des  composés  communs  avec  ceux  issus  de  la 
80
peroxydat ion  lipidique comme par  exemple la carboxymet hyllysine .  

 
Tous  les  AGEs  n’ont   pas  encore  ét é  ident ifiés  et   les  mécanismes  sous‐jacent s  à  leur  

format ion   rest ent   incomplèt ement   élucidés.  La  CM L  et   la  pent osidine  ont   ét é  les  plus 

ét udiés car  elles possèdent  des propriét és ant igéniques, ainsi  elles peuvent  êt re localisées et  

quant ifiées  à  l’aide  de  t echniques  immunologiques.  Les  t aux  sériques  de  CM L  ont   corrélés 

avec  le  développement   de  lésions  microvasculaires  chez  des  pat ient s  diabét iques  de  t ype 
81
2 . Au  cours de l’insuffisance rénale, on  observe une import ant e accumulat ion  de CM L dans 

l’organisme, liée à un  défaut  d’éliminat ion  du  rein. 

 
Les  différent s  AGEs  aujourd’hui   décrit s,  ident ifiés  à  part ir   de  mécanismes  de  glycoxydat ion  

d’albumine in  vit ro , sont  présent és dans la figure n°12 . 


79

  66
 
Figure n°12  :  Différent es formes d’AGEs rencont rés au  cours du  diabèt e  
79

  67
4.2.2.  Effets des AGEs sur  la  matrice  extracellulaire,  les protéines circulantes 

et  cellulaires.   

 
    4.2.2.1. AGEs et  mat rice ext racellulaire 

 
On   observe dans  les  t issus  une  rét iculat ion   des prot éines et   la  format ion   d’agrégat s.  Il   exist e 

plusieurs  mécanismes  à  l’origine  de  ce  phénomène.  Le  premier   mécanisme  est   l’oxydat ion  

de  groupement   sulfhydrile  en   pont s  disulfures.  Un   deuxième  mécanisme  exist ant   est   la 

format ion  de liaisons covalent es ent re produit s avancés de glycat ion. Ces liaisons covalent es 

ent re  AGEs  expliquent   l’augment at ion   des  espaces  int ermoléculaires  du   collagène 

responsable  d’hyperperméabilit é  vasculaire  et   des  défaut s  de  polymérisat ion   de  t ubuline 

axonale.  Une  t roisième  voie  est   la  format ion   de  liaisons  covalent es  de  prot éines 
63
plasmat iques  au   niveau   de  groupement s  réact ifs  générés  par   la  glycat ion .  Des  liaisons 

croisées  s’ét ablissent   ent re  AGEs,  collagène,  albumine  et   LDL  (low   densit y  lipoprot ein)  au  

niveau   des  membranes  basales,  ceci   implique  le  rôle  des  AGE  dans  la  microangiopat hie  et  
82
dans la macroangiopat hie diabét ique . Les AGEs s’accumulent  dans les t issus et  not amment  
78
sur  les prot éines à longue durée de vie comme le collagène de t ype I .  

 
Les  AGEs  peuvent   se  lier   à  la  laminine,  prot éine  st ruct urale  de  la  mat rice  ext racellulaire,  et  

induire  une  diminut ion   de  la  liaison   d’aut res  composant s  majeurs  et   not amment   les 

prot éoglycannes.  Ces  derniers  empêchent   la  fuit e  prot éique  au   niveau   de  la  membrane 
83
basale  glomérulaire  en   lui   conférant   une  charge  négat ive .  Il   exist e  une  corrélat ion   ent re  la 

concent rat ion   en   AGEs  et   la  sévérit é  de  la  pat hologie  rénale  dans  des  modèles 

expériment aux  d’animaux.  On   t rouve  une  augment at ion   en   CM L  (Carboxy  M et hyl   Lysine) 

dans  les  prot éines  solubles  et   insolubles  du   collagène  chez  les  insuffisant s  rénaux 

diabét iques.  La  dénat urat ion   du   collagène  par   les  AGEs  et   leur   capacit é  à  ret enir   les 

prot éines  plasmat iques  est   à  l’origine  de  l’épaississement   de  la  membrane  basale  du  

glomérule.  Les  AGEs  sont   à  l’origine  de  l’expansion   mésangiale  ce  qui   a  pour   conséquence 

une  baisse  de  la  filt rat ion   glomérulaire  par   compression   des  capillaires.  Il   a  ét é  démont ré 

que  les  AGEs  augment ent   la  libérat ion   de  TGF‐  (Tumor   Grow t h   Fact or   )  qui   st imule  la 
84
synt hèse de collagène et  donc l’épaississement  de la membrane basale .  

  68
    4.2.2.2. AGEs et  acides nucléiques 

 
Les  AGE  sont   suscept ibles  de  réagir   avec  les  groupement s  aminés  des  nucléot ides,  et   donc, 

de  conduire  ainsi   à  des  coupures  de  l’ADN.  Les  AGEs  pourraient   êt re  impliqués  dans  les 

embryopat hies  diabét iques.  Au   niveau   oculaire,  la  modificat ion   du   crist allin   par   les  AGEs 

explique  en   grande  part ie  l’opacificat ion   progressive  et   l’apparit ion   de  cat aract e  survenant  

au   cours  du   diabèt e.  On   ret rouve  des  concent rat ions  élevées  d’AGEs  au   niveau   de  l’humeur  
61
vit rée  du   pat ient   diabét ique,  en   rapport   avec  la  rét inopat hie  diabét ique .  Les  AGEs 

pourraient  cont ribuer  à l’augment at ion  de la perméabilit é vasculaire en  alt érant  l’adhérence 

des cellules endot héliales et  compromet t ant  leur  réplicat ion  normale.  

 
    4.2.2.3. Effet s des AGEs  sur  les prot éines :  cas part iculier  de l’albumine 

 
Il   exist e  aussi   une  glycat ion   des  prot éines  circulant es.  La  format ion   de  l’hémoglobine 

glyquée induit  une augment at ion  de sa viscosit é au  sein  des globules rouges.  

 
La  glycat ion   prot éique  peut   ent rainer   une  alt érat ion   d’act ivit és  enzymat iques,  liées  à  la 

présence  de  résidus  de  lysine  au   voisinage  du   sit e  act if   ou   à  des  modificat ions 

conformat ionnelles.  

 
L’albumine,  principale  prot éine  circulant e,  subit   également   d’import ant es  modificat ions  par  

mécanismes glycoxydat ifs pour  former  des AGEs.  

 
Nous  nous  sommes  at t achés  dans  cet t e  ét ude  à  décrire  les  effet s  de  la  glycoxydat ion   sur   de 

cet t e  prot éine  en   ét udiant   ses  propriét és  st ruct urales  mais  aussi   fonct ionnelles :   t ransport  

de  molécules  endogènes  et   xénobiot iques,  propriét é  ant ioxydant es,  maint ien   de 
85
l’homéost asie plasmat ique .  

  69
 
Figure n°13  :  St ruct ure t ridimensionnelle de l’albumine :  représent at ion  des sit es de liaison  
spécifique de Sudlow  (t ype 1 et  t ype 2) et  des principaux sit es de glycat ion  (lysines)  
79

 
 
La format ion  des AGEs sur  des prot éines int racellulaires est  possible au  niveau  des t issus non   

insulino ‐dépendant s.  L’hyperglycémie  peut   induire  une  augment at ion   int racellulaire  de 

sucres comme le fruct ose, le glucose‐6‐phosphat e et  les composés réact ifs dicarbonylés. Il  se 

forme  alors  des  AGE  à  part ir   des  prot éines  cyt osoliques  et   de  ces  sucres.  La  glycat ion   du  

bFGF  (basic  Fibroblast   Grow t h   Fact or)  dans  les  cellules  endot héliales  affect e  son   act ivit é 
86
mit ogénique . 

 
 
Les  LDL  subissent   aussi   une  glycat ion   lors  d’hyperglycémie  prolongée.  La  glycat ion   des  LDL 

est   souvent   accompagnée  d’une  oxydat ion.  Cet t e  oxydat ion   cont ribue  à  l’accumulat ion   de 

LDL oxydées pro ‐at hérogènes dans le sang. Cet t e glycat ion  empêche leur  reconnaissance par  

les  récept eurs  aux  LDL  et   ainsi   elle  diminue  leur   clairance.  De  plus,  la  glycat ion   des  HDL  a 

  70
pour   conséquence  la  baisse  de  l’act ivit é  de  la  paraoxonase.  La  paraoxonase  prévient  

l’oxydat ion   des  LDL  et   l’adhésion   des  monocyt es  aux  cellules  endot héliales  de  l’aort e,  ces 

deux  paramèt res  sont   des  évènement s  init iaux  clés  dans  la  format ion   de  la  plaque 

d’at hérome.  De  plus,  la  présence  d’AGEs  au   niveau   du   collagène  des  parois  art érielles 

permet  de piéger  les LDL et / ou  d’aut res prot éines plasmat iques favorisant  ainsi  la format ion  
84
de  la  plaque  d’at hérome .  Au   niveau   endot hélial,  les  AGEs  sont   capables  de  piéger   le 
61
monoxyde d’azot e puissant  vasodilat at eur .  

 
Figure n°14  :  Produit s avancés de Glycat ion  – Sources et  implicat ions physiopat hologiques  
20

  71
4.2.3.  Les Récepteurs aux AGEs.   

 
4.2.3.1 Les différent s récept eurs aux AGE.  

Les  AGEs  ont   la  capacit é  de  se  lier   à  différent es  prot éines  membranaires  spécifiques  :  les 

RAGE  (recept or   for   advanced   glycat ion   end   product s),  les  AGE  récept eurs  1  (prot éine  OST48  

du   complexe  oligosaccharyl ‐t ransférase),  les  AGE  récept eurs  2  (prot éine  80K‐H,  subst rat  

membranaire  de  prot éines  kinases),  les  AGE  récept eurs  3  (galect ine‐3)  et   les  récept eurs 
87,88
scavengers  de  classe  A  et   B .  Les  récept eurs  scavengers  int ernalisent   les  AGE  et   peuvent  
89
fixer  les LDL glycoxydées .  

 
4.2.3.2 Le Récept eur  RAGE 

Le RAGE est  un  récept eur  mult i ‐ligands t ransmembranaire appart enant  à la super  famille des 

immunoglobulines.  Le  RAGE  est   une  prot éine  de  45  kDa  présent e  à  la  surface  de 

nombreuses  cellules  comme  les  cellules  endot héliales,  les  lymphocyt es,  les  monocyt es,  les 
68
polynucléaires  et   les  neurones .  Il   est   const it ué  d’une  région   ext racellulaire  comprenant   un  

domaine  V  variable  et   de  deux  domaines  C  et   C’   const ant s,  d’un   seul   domaine 
81
t ransmembranaire et  d’un  domaine cyt oplasmique court  (moins de 50  acides aminés) .  

 
90,91,88
Il  exist e plusieurs isoformes de RAGE (figure n°15)   :  
 
 Les  RAGE  membranaires  peuvent   êt re  ent iers  ou   t ronqués.  Les  formes  t ronquées  ne 
t ransmet t ent   pas  le  signal.  Les  RAGE  ent iers  t ransmet t ent   un   signal   pat hogène  à  la 

cellule.  

 Les RAGE solubles (sRAGE) sont  présent s dans la circulat ion  sanguine. Les sRAGE sont  


82
le  résult at   d’un   clivage  des  RAGE  membranaires  par   des  mét alloprot éinases .  Les 

RAGE  solubles  ont   la  propriét é  de  se  lier   aux  AGE  circulant s,  et   donc  de  limit er   leurs 

effet s  pat hologiques.  Les  diabét iques  de  t ype  2  ont   un   t aux  circulant   de  sRAGE 

diminué par  rapport  à une personne non  diabét ique.  

 Les  esRAGE  (endogenous  secret ory  RAGE)  sont   le  résult at   d’un   épissage  alt ernat if   de 
la  part ie  C‐t erminale  de  RAGE.  Les  esRAGE  ne  possèdent   pas  de  domaines 

membranaires et  cyt oplasmiques.  

  72
 Les  DN‐RAGE  (Dominant   Negat ive  RAGE)  présent s  au   niveau   de  la  membrane 
plasmique. Cet t e forme de RAGE présent e une part ie ext racellulaire ident ique à celle 

du   RAGE  mais  est   dépourvue  de  sit e  d’act ion   cyt oplasmique  empêchant   t out e 

t ransduct ion  du  signal. 

 
 

Figure n°15  :  Récept eurs RAGE – Principales Isoformes  


88

 
4.2.3.3. Les ligands de RAGE 

 
Il  exist e cinq  familles de ligands aux RAGE :   

 Les AGEs ou  produit s t erminaux de glycat ion.  


 La  famille  des  S100/ calgranulines  dont   le  polypept ide  EN‐RAGE.  Ce  sont   des 
polypept ides  capables  de  déclencher   une  réponse  pro ‐inflammat oire  et  
92
prooxydant e . 

  73
 Les  AOPPs  (produit s  d’oxydat ion   prot éiques  avancés).  Ils  sont   le  résult at   de  l’act ion  
du  st ress oxydant  sur  les prot éines. Par  exemple, l’albumine glyquée int eragit  avec le 

RAGE  et   conduit   à  l’augment at ion   de  la  product ion   d’IL‐8  (int erleukine‐8)  et   de  M CP‐

1 dans les cellules épit héliales rét iniennes pigment aires. En  agissant  en  synergie avec 

une cyt okine inflammat oire, le TNF‐, déclenche une voie de signalisat ion  impliquant  

Raf   et   les  M AP  Kinases.  L’albumine  glyquée  st imule  la  synt hèse  de  la  mat rice 

ext racellulaire  en   act ivant   la  product ion   de  fact eurs  de  croissance  comme  le  TGF‐1  

par   l’int ermédiaire  de  la  voie  de  la  PKC  et   des  M APK  de  t ype  ERK.  Dans  les  cellules 

musculaires  lisses,  elle  induit   l’augment at ion   de  la  sécrét ion   de  NO  via  la  NO 
93
synt hase induct ible .  

 Le pept ide ‐amyloïde. Il  est  le produit  de clivage de la prot éine APP (amyloid  prot ein  


94
precursor). Il  est  impliqué dans la maladie d’Alzheimer .  

 L’   HM GB1  (high   mobilit y  group   box‐1)  ou   amphot érine.  Elle  est   décrit e  comme  une 
prot éine  nucléaire  de  t ype  non   hist one.  Elle  favorise  la  croissance  des  neurit es  au  

cours  du   développement .  En   sit uat ion   de  st ress  ou   de  st imulat ion,  les  cellules 

libèrent   cet t e  prot éine.  L’HM GB‐1  est   capable  de  modifier   les  propriét és  des  cellules 

qui   expriment   les  RAGE  t els  que  les  cellules  inflammat oires  (lymphocyt es, 

monocyt es,  macrophages,  cellules  dendrit iques),  les  cardiomyocyt es  en   inhibant   les 

canaux  pot assiques  ainsi   que  les  canaux  calciques  de  t ype  L,  les  neurones  et   les 

cellules  cancéreuses.  L’inhibit ion   de  la  signalisat ion   induit e  par   l’int eract ion   RAGE‐

amphot érine  inhibe  la  croissance  et   la  capacit é  invasive  des  cellules  t umorales 
95
gliales .  

 
4.2.3.4 Transduct ion  du  signal  des AGE par  les RAGE. 

 
Les mécanismes de t ransduct ion  du  signal  et  d’act ivat ion  du  récept eur  RAGE sont  décrit s sur  
96
la figure n°16  . 

 
Les  récept eurs  des  AGE  sont   dépourvus  de  domaine  t yrosine  kinase.  Une  homodimérisat ion  

des  RAGE  est   essent ielle  à  la  t ransduct ion   du   signal.  Les  sRAGE  peuvent   inhiber  
68,89
l’homodimérisat ion  des RAGE et  ainsi  empêcher  la t ransduct ion  du  signal . La fixat ion  des 

AGE  sur   le  RAGE  déclenche  une  signalisat ion   ent raînant   un   st ress  oxydant   int racellulaire.  Le 

  74
st ress  oxydant   est   renforcé  par   l’act ivat ion   de  la  NADPH  oxydase.  La  NADPH  oxydase 
•‐
cat alyse  la  réduct ion   de  l’oxygène  moléculaire  en   anion   superoxyde  (O2 ).  De  plus,  cet t e 

fixat ion   induit   l’expression   des  gènes  impliqués  dans  la  réponse  inflammat oire  ent rainant   le 

recrut ement  des M AP Kinases, et  l’act ivat ion  du  fact eur  de t ranscript ion  NFB. Le fact eur  de 

t ranscript ion   NFB  st imulé  pénèt re  dans  le  noyau   et   se  lie  à  son   élément   de  réponse  sur   le 
68,89
promot eur  des gènes cibles .  

 
 

 
Figure n°16  :  Effet s cellulaires de l’act ivat ion  du  RAGE – Transduct ion  du  Signal  
96

 
Le domaine int ra‐cyt oplasmique du  RAGE int eragit  avec la prot éine mammalian  diaphanous1  

(mDia‐1)  appart enant   à  la  famille  des  formines.  La  prot éine  mDia‐1  est   essent ielle  à  la 
96
t ransduct ion  du  signal  about issant  à la migrat ion  cellulaire .  

  75
La  st imulat ion   des  RAGE  induit   aussi   une  baisse  d’act ivit é  des  glyoxalases  1.  Les  glyoxalases 

sont   des  enzymes  qui   mét abolisent   les  composés  pré‐AGE  (M GO).  Cet t e  baisse  d’act ivit é  a 

pour   conséquence  une  amplificat ion   de  la  format ion   des  AGE,  des  LDL  oxydées  et   aut res 
96
AOPPS .  

 
Au   niveau   des  reins,  les  RAGE  sont   fort ement   exprimés  à  la  surface  des  podocyt es.  La 

st imulat ion  des RAGE sur  les podocyt es conduit  à leur  apopt ose et  à la libérat ion  de fact eurs 

inflammat oires  comme  NFB  et   M CP1.  La  st imulat ion   des  RAGE  des  podocyt es  induit   aussi  

une  surexpression   du   VEGF  (vascular   endot helial   grow t h   fact or).  Ces  fact eurs  libérés  vont  

êt re  en   relat ion   avec  la  sclérose  du   glomérule.  Ceci   a  pour   conséquence  la  pert e  d’int égrit é 
68,96
de  la  membrane  basale  et   ainsi   favorise  l’albuminurie   ret rouvées  dans  la  néphropat hie 
diabét ique. 

 
Au   niveau   endot hélial,  la  fixat ion   des  AGE  sur   le  RAGE  ent raine  l’act ivat ion   de  la  product ion  

de  cyt okines  t elles  que  l’IL1‐,  l’IL‐6  ou   le  TNF‐  et   de  chimiokines  t els  que  le  M CP‐1.  Ces 

molécules  induisent   en   ret our   l’expression   de  molécules  d’adhésion   t elles  que  ICAM ‐1 

(int racellular   adhesion   molecule‐1)  et   VCAM ‐1  (Vascular   Cell   Adhesion   M olecule‐1) 

impliquées  dans  le  recrut ement   des  leucocyt es.  Les  cellules  ainsi   recrut ées  libèrent   des 

cyt okines  (S100/ calgranulines,  M AC‐1  et   HM GB‐1)  ligands  des  RAGE.  De  plus,  NFB  induit  

une  augment at ion   de  l’expression   des  RAGE.  La  réponse  inflammat oire  est   alors  aut o  

ent ret enue,  elle  devient   chronique  et   prolongée  cont ribuant   à  l’augment at ion   du   st ress 

cellulaire et  aux  lésions  cellulaires  que  l’on   peut   observer   dans  les  complicat ions  du   diabèt e, 

le  vieillissement ,  les  t umeurs  et   aut res  maladies  neurodégénérat ives.  De  plus,  le  fact eur  

NFB  induit   un   ét at   pro ‐coagulant   par   l’augment at ion   de  la  synt hèse  du   fact eur   t issulaire  FT 
96
et  de la t hrombomoduline . 

 
 
 
 
 
 

  76
A  t ravers  cet t e  part ie  bibliographique,  nous  avons  pu   mont rer   qu’au   cours  du   diabèt e  de 

t ype 2, l’hyperglycémie chronique associée à un  syndrome mét abolique ét ait  à l’origine d’un  

st ress  oxydat if   import ant   lié  à  une  fort e  product ion   endogène  de  ROS.  L’hyperglycémie 

associée  à  ce  st ress  oxydat if   est   à  l’origine  de  modificat ion   post ‐t ranslat ionnelles 

import ant es  des  prot éines  circulant es  par   des  mécanismes  de  glycat ion   et   d’oxydat ion  

combinés  regroupés  sous  le  t erme  de  glycoxydat ion.  Cet t e  glycoxydat ion   amène  à  la 

format ion  de pept ides et  de prot éines modifiées appelés AGEs. 

 
Les  complicat ions  cardiovasculaires  du   diabèt e  sont   liées  à  un   phénomène  de  dysfonct ion  

endot héliale.  Ce  dysfonct ionnement   endot hélial   init ial   aux  at t eint es  vasculaires  chroniques 

du   diabèt e  est   dû   à  des  mécanismes  physiopat hologiques  mêlant   à  la  fois  réact ion  

inflammat oire  et   st ress  oxydat if.   Ces  at t eint es  oxydat ives  de  l’endot hélium   vasculaires  sont  

dues  aux  effet s  direct s  des  ROS,  des  radicaux  libres  et   aussi   des  AGEs  circulant   sur   ces 

cellules  qui   sont   en   cont act   direct   avec  l’environnement   plasmat ique.  La  capt ure  du   NO  par  
•–
l’O2  semble êt re l’événement  majeur  de la dysfonct ion  endot héliale. L’act ivat ion  combinée 

par   les  AGEs  du   RAGE  présent   à  la  surface  des  cellules  endot héliales  induit   des  effet s  pro ‐

oxydant s  et   pro ‐inflammat oires.  Le  st ress  oxydant ,  la  product ion   associée  de  ROS  et  

d’AGE au   cours  du   diabèt e  de  t ype  2  et   l’act ivat ion   du   RAGE  const it uent   donc  l’hypot hèse 

physiopat hologique dominant e des complicat ions cardiovasculaires du  diabèt e. 

 
Dans  la  part ie  expériment ale  de  ces  t ravaux,  nous  avons  donc  cherché  dans  un   premier  

t emps  à  caract ériser   et   à  quant ifier   les  modificat ions  st ruct urales  et   fonct ionnelles  des 

prot éines  au   cours  du   diabèt e  et   plus  part iculièrement   celles  de  l’albumine,  prot éine 

circulant e  la  plus  abondant e  et   aux  propriét és  ant ioxydant es  majeures.  Nous  avons  ensuit e 

ét udié  l’implicat ion   pot ent ielle  des  formes  modifiées  d’albumine  dans  la  physiopat hologie 

des  complicat ions  vasculaires  du   diabèt e  à  t ravers  une  ét ude  cellulaire  in   vit ro .  Pour   finir, 

nous  avons  évalué  l’int érêt   pot ent iel   de  ces  formes  modifiées  comme  biomarqueurs  de  ces 

complicat ions  dans  une  ét ude  clinique  pilot e  préambule  à  un   projet   de  recherche  clinique 

prospect if  de plus grande ampleur.  

 
 

  77
OBJECTIF DU TRAVAIL
 
Au   cours  de ces  t ravaux,  not re  object if   a  ét é  de caract ériser  les  modificat ions  st ruct urales  et  

fonct ionnelles  des  prot éines,  et   plus  part iculièrement   l’albumine,  au   cours  de  la  pat hologie 

diabét ique.  En   effet ,  l’hyperglycémie  chronique  et   le  st ress  oxydant ,  rencont rés  au   cours  du  

diabèt e de t ype 2, sont  à l’origine de modificat ions glycoxydat ives des prot éines circulant es. 

Si   des  modificat ions  de  l’albumine  ont   bien   ét é  caract érisées  à  part ir   de  modèles  de 

glycat ion   in   vit ro   en   présence  de  glucose  ou   de  mét hylglyoxal   (M GO),  les  modificat ions 

st ruct urales  et   fonct ionnelles  de  l’albumine  rencont rées  in   vivo     ont   nécessit é  des  ét udes 

spécifiques, objet s de ce mémoire. 

 
Le  laborat oire  GEICO  a  développé  ces  dernières  années  des  compét ences  propres  en  

mat ière  d’ext ract ion   et   de  purificat ion   d’albumine  à  part ir   de  plasma  humain.  Nous  nous 

sommes  donc  appuyés  sur   cet t e  expert ise  pour   ét udier   de  manière  plus  approfondie  les 

modificat ions  st ruct urales  et   fonct ionnelles  de  l’albumine  purifiée  issue  de  plasmas  de 

pat ient s  diabét iques  de  t ype  2  en   comparaison   avec  différent es  formes  d’albumines, 

commerciales  ou   purifiées,  glyquées  in   vit ro .  Ces  t ravaux  font   l’objet   de  la  première  part ie 

de l’ét ude expériment ale de ce rapport . 

 
Dans un  deuxième t emps, nous avons ét udié les effet s de l’albumine de pat ient s diabét iques 

sur   des  modèles  cellulaires  de  macrophages  et   d’adipocyt es.  Ces  cellules  sont   impliquées 

dans  les  mécanismes  physiopat hologiques  du   diabèt e  et   de  ses  complicat ions 

cardiovasculaires.  L’albumine,  prot éine  la  plus  abondant e  du   plasma  joue  un   rôle  essent iel  

de  t ampon   du   st ress  oxydant   en   raison   de  ses  propriét és  ant ioxydant es.  L’albumine  est  

profondément   modifiée  par   l’hyperglycémie  chronique  et   le  st ress  oxydant   au   cours  de  la 

pat hologie diabét ique. Ces modificat ions peuvent  amener  l’albumine de pat ient  diabét ique à 

jouer   un   rôle  de  mémoire  du   st ress  oxydant   en   ét ant   elle‐même  à  l’origine  de  la  product ion  

de  ROS  et   par   là‐même  jouer   un   rôle  direct   dans  la  physiopat hologie  des  complicat ions 

vasculaires du  diabèt e de t ype 2. 

  78
Pour   finir,  au   t ravers  d’une  ét ude  clinique  pilot e  descript ive  ERM IES  Alb ‐Ox,  s’appuyant   sur  

les  données  d’inclusion   du   projet   de  recherche  clinique  régional   d’éducat ion   t hérapeut ique 

ERM IES,  nous  avons  évalué  les  niveaux  de  concent rat ion   plasmat ique  de  plusieurs  produit s 

de  glycat ion,  de  glycoxydat ion   issus  de  l’albumine  dans    une  populat ion   de  pat ient s 

diabét iques  de  t ype  2  anciens  fort ement   déséquilibrés  présent ant   à  l’inclusion   des 

t ypologies  de  complicat ions  vasculaires    hét érogènes.  L’object if   de  ce  projet   pilot e  est   de 

mont rer   si   des  différences  significat ives  exist ent    ent re  les  concent rat ions  plasmat iques  des 

marqueurs  de  glycat ion   et   de  glycoxydat ion   à  des  niveaux  différent s  d’at t eint es  vasculaires, 

et   ainsi   dét erminer   s’ils pourraient   const it uer   des  biomarqueurs  d’int érêt   dans  le  suivi   ou   le 

dépist age des complicat ions vasculaires du  diabèt e. 

  79
  80
 

PARTIE EXPERIMENTALE
 

  81
  

  82
1. ETUDES DES MODIFICATIONS STRUCTURALES ET
FONCTIONNELLES DE L’ALBUMINE AU COURS DU DIABETE DE
TYPE 2
 

1.1. Introduction
 
L’Albumine  est   la  prot éine  la  plus  abondant e  du   plasma    ou   du   sérum   humain.  Cet t e 

prot éine  est   en   effet   présent e  à  des  concent rat ions  plasmat iques  allant   de  30  à  50  G/ L.  Elle 

représent e  à  cet   égard   environ   60%  des  prot éines  plasmat iques.  La  sérum ‐albumine 

humaine  (HSA)  a  un   poids  moléculaire  de  66.7 kDa    et   est   composée  d’une  chaîne 
97
polypept idique  de  585   acides  aminés  réarrangés  par   17   pont s  disulfure .  La  part ie  N‐

t erminale  de  l’albumine  ainsi   que  ses  59  lysines  et   24  arginines  sont   aut ant   de  sit es  de 

glycat ion   pot ent iels  de  cet t e  prot éine  puisqu’ils  présent ent   des  résidus  amines  libres  cibles 

de  la  réact ion   de  M aillard.  Il   est   à  not er   cependant   que  t ous  ces  résidus  amines  libres 
79
présent s sur  cet t e prot éine ne présent ent  pas t ous la même capacit é à êt re glyqués . 

 
L’albumine  présent e  3  fonct ions  principales.  Premièrement   ses  propriét és  physico ‐

chimiques  et   son   import ant e  concent rat ion   plasmat iques  permet t ent   de  maint enir   la 

pression   osmot ique  et   le  pH  plasmat ique.  L’albumine  possède  également   2  sit es  de  liaison  

non  spécifiques lui  conférant  une t rès import ant e capacit é de t ransport  pour  des subst ances 

endogènes  (hormones  de  bas  poids  moléculaire,  acide  gras)  et   de  nombreux  xénobiot iques 
97,79
(médicament s,  mét abolit es,…) .  Cet t e  propriét é  influe  sur   les  dét erminant s 

pharmacocinét iques  et   plus  part iculièrement   le  volume  de  dist ribut ion   de  nombreux 

médicament s qui  sont  fort ement  liés à l’albumine. 

 
La  t roisième  propriét é  de  l’albumine,  qui   nous  apparaît   ici   comme  ét ant   la  plus  import ant e, 
64
est   son   rôle  de  prot ect ion   cont re  le  st ress  oxydant .  En   effet ,  l’albumine,  comme  de 

nombreuses  prot éines  présent ant   une  fonct ion   t hiol   libre,  a  la  capacit é  de  piéger   et   de 

neut raliser  les ROS. Ce t hiol  libre est  représent é par  une cyst éine présent e en  posit ion  34  de 

la  prot éine.  L’albumine  agit   donc  comme  un   t ampon   cont re  le  st ress  oxydant   au   niveau  

  83
plasmat ique  et   permet   de  limit er   les  réact ions  en   chaîne  de  product ion   de  ROS  dans  la 

circulat ion  sanguine.  

 
Cet t e  fonct ion   ant ioxydant e  de  l’albumine  est   donc  mise  à  rude  épreuve  au   cours  du  

diabèt e, maladie chronique au  cours de laquelle nous ret rouvons au  niveau  plasmat ique à la 

fois  une  hyperglycémie  chronique  et   un   st ress  oxydant   profond   marqué  par   une  product ion  

accrue  de  radicaux  libres  oxygénés.  L’albumine  au   cours  du   diabèt e  peut   donc  êt re  sujet t e  à 

plusieurs  modificat ions  post ‐t raduct ionnelles  liée  d’une  part   à  des  mécanismes  de  glycat ion  

sur  ces résidus amines libres et  d’aut re part  à des mécanismes oxydat ifs. 

 
Si   des  modificat ions  st ruct urales  et   fonct ionnelles  de  l’albumine  ont   pu   êt re  mises  en  

évidence  à  part ir   de  sérum   albumine  humaine  (SAH)  au   moyen   de  modèles  de  glycat ion   in  

vit ro   comme  une  exposit ion   prolongée  à  un   excès  de  glucose  ou   à  du   mét hyglyoxal   (M GO), 

ces  modèles  rest ent   aujourd’hui   largement   discut és  puisque  les  ét at s  hyperglycémiques 

ut ilisés  (glucose  100mM )  sont   largement   supérieurs  à  ceux  ret rouvés  au   niveau  
63
physiologique  (5mM )  ou   même  au  cour   d’un   diabèt e  déséquilibré (25  mM ) .  Egalement ,  les 

phénomènes  de  glycat ion   et   de  st ress  oxydant   rencont rés  in   vivo     sont   à  priori   largement  

plus complexes et  pourraient  limit er  sinon  accent uer  les phénomènes rencont rés in  vivo . 

 
Cet t e  ét ude  s’est   donc  port ée  premièrement     sur   la  caract érisat ion   des  modificat ions 

st ruct urales  et   fonct ionnelles  de  l’albumine  au   cours  de  la  pat hologie  diabét ique.  Nous 

avons  pour   cela  comparé  les  propriét és  st ruct urales  et   fonct ionnelles  d’albumines  ext rait es 

et   purifiées  de  pat ient s  diabét iques  à  celles  ext rait es  de  pat ient s  non   diabét iques  ainsi   qu’à 

de la sérum  albumine humaine commerciale modifiées ou  non  par  glycat ion  in  vit ro  (glucose 

ou   M GO).  Ces  t ravaux  ont   fait   l’objet   de  deux  art icles  publiés  présent és  ci ‐dessous  en  
98,99
résult at s . 

 
 

  84
1.2. Résultats
 
Article  1  :  St ruct ural  modificat ions of  human  albumin  in  Diabet es. Diabet es and  M et abolism. 

2011;  38 :171‐178. A.  Guerin‐Dubourg, A.  Catan,  E.  Bourdon ; P.  Rondeau.  

  85
 

  86
AVA ILA B LE ONLINE A T

WWW.SCIE NCE DIRE CT.COM

Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178

Original article

Structural modifications of human albumin in diabetes


A. Guerin-Dubourg a,b , A. Catan a , E. Bourdon a , P. Rondeau a,∗
a Laboratoire de biochimie et génétique moléculaire (LBGM), groupe d’étude sur l’inflammation chronique et l’obésité (GEICO),
université de La Réunion, 15, avenue René-Cassin, BP 7151, 97715 Saint-Denis Messag cedex 09, Réunion
b Unité fonctionnelle de recherche biochimie, centre hospitalier Félix-Guyon, 97405 Saint-Denis, Réunion

Received 7 July 2011; accepted 9 November 2011

Abstract
Aim. – Albumin, a major protein in the blood circulation, can undergo increased glycation in diabetes. From recent studies, it has become evident
that glycation has important implications for albumin actions and impact on cell functioning. This study compares the structural and functional
properties of albumin glycated by glucose and methylglyoxal (MGO) with those of albumin purified from diabetic patients.
Methods. – Human serum albumin (HSA) was purified from diabetic patients and control subjects using affinity chromatography, and oxidation
parameters in various albumin preparations were determined. Tryptophan and 1-anilino-8-naphthalene sulphonic acid (ANSA) probe fluorescence,
redox state, antioxidant and copper-binding capacities of the different preparations of albumin were also determined and compared.
Results. – Occurrence of oxidative modifications was enhanced in albumin whether purified from diabetic patients, or glycated by glucose or
MGO, after determination of their fructosamine and free thiol and amino group contents, carbonyl content and antioxidant activities. Whereas more
quantitative changes in oxidative and structural parameters were observed in the glucose- and MGO-modified albumins, significant impairment of
albumin function (free-radical-scavenging and copper-binding capacities) were demonstrated in the HSA purified from diabetics. These findings
reveal different structural and functional features of diabetic HSA compared with in vitro models.
Conclusion. – This study provides new information supporting albumin as an important biomarker for monitoring diabetic pathophysiology. In
addition, it reconfirms the influence of experimental conditions in which advanced glycation end-products (AGEs) are generated in tests designed
to mimic the pathological conditions of diabetes.
© 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Keywords: Albumin; AGEs; Oxidative stress; Diabetes

Résumé
Modifications structurales de l’albumine au cours du diabète.
But. – Le stress oxydant et les modifications oxydatives des protéines sont directement impliqués dans les complications du diabète. Un facteur
puissamment protecteur contre le stress oxydant, produit par notre organisme, n’est autre que l’albumine, protéine la plus abondante du plasma.
Mais, en particulier chez les diabétiques, la structure de l’albumine se trouve modifiée par des phénomènes de glycation qui confèrent à la protéine
des propriétés biologiques néfastes. Dans cette étude, nous avons cherché à comparer les modifications structurales et fonctionnelles de l’albumine
glyquée in vitro avec celles de l’albumine purifiée à partir de patients diabétiques.
Méthodes. – L’albumine humaine a été purifiée à partir de patients diabétiques ou de témoins en utilisant la chromatographie d’affinité. La
glycation in vitro d’albumine humaine a été effectuée par des incubations en présence de méthylglyoxal (MGO) ou de glucose. Les statuts
structuraux et fonctionnels (pouvoir antioxydant) des différentes préparations d’albumine ont été déterminés et comparés au moyen notamment de
mesures de propriétés électrophorétiques, de fluorescence, de capacités de liaison de métaux ou de neutralisation de radicaux libres.

Abbreviations: AAPH, 2,2′ azobis 2-amidinopropane; AGEs, Advanced glycation end-products; HRP, Horseradish peroxidase; HSA, Human serum albumin;
HSA-C, Commercial human serum albumin; HSA-ND, Human serum albumin from non-diabetic patients; HSA-D, Human serum albumin from diabetic patients;
mPAGE, Phenylboronate polyacrylamide electrophoresis; PBS, Phosphate-buffered saline; –SH, sulfhydryl group; SMBG, Self-monitoring of blood glucose;
TNBS, 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid.
∗ Corresponding author.

E-mail address: rophil@univ-reunion.fr (P. Rondeau).

1262-3636/$ – see front matter © 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
doi:10.1016/j.diabet.2011.11.002
172 A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178

Résultats. – Une augmentation importante et significative des modifications de type oxydatif a été observée à la fois au niveau des préparations
d’albumine glyquée in vitro par le glucose ou le MGO, mais également dans la protéine lorsqu’elle purifiée à partir de patients diabétiques. En
particulier, une altération des propriétés antioxydantes de piégeage des radicaux libres et de fixation des métaux a été mise en évidence pour
l’albumine provenant de diabétiques.
Conclusion. – Ce travail contribue à montrer l’importance de l’albumine comme un biomarqueur majeur à privilégier pour le développement de
stratégies nutritionnelles ou pharmaceutiques afin de limiter les désordres inhérents à la pathologie diabétique.
© 2011 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Albumine ; Produits de glycation avancée ; Stress oxydant ; Diabète

1. Introduction human), the nature and concentration of carbohydrates (glucose,


methylglyoxal [MGO]) and the duration of incubation (3 weeks
Non-enzymatic glycation is one of the underlying modifi- or more) [16]. These heterogeneous glycation products derived
cation factors that contribute to various alterations of intrinsic from albumin are often used as glycation models in studies deal-
protein functions. It is the result of covalent binding of glucose ing with the involvement of AGEs in cellular pathophysiology
to amino groups of circulating proteins, such as haemoglobin in the context of diabetes. However, the question remains as
(HbA1c ) and albumin, or proteins present in the extracellular to whether these glycated albumins in vitro constitute relevant
matrix (such as collagen and laminin) [1]. Because of its long models in diabetes-associated cellular disorders. For this reason,
half-life (about 21 days) compared with other proteins and its it was important to compare the structural and functional differ-
high concentrations in the circulatory system, serum albumin is ences between in vitro glycated albumins and albumin purified
a plasmatic protein that is highly sensitive to glycation. Elevated from diabetic patients.
levels of glycated albumin (two- to threefold increases) in cases The present study examined the differential structural and
of diabetes mellitus can lead to irreversible damage associated functional aspects of albumin purified from diabetic and non-
with metabolic disorders such as retinopathy, nephropathy, neu- diabetic subjects. The study was also extended to compare
ropathy and coronary artery disease [2,3]. The development of commercial albumin glycated by glucose and MGO incubation.
these diabetic complications is attributed to the formation of
deleterious and irreversible conjugates called “advanced glyca- 2. Methods
tion end-products” (AGEs) during the glycation process [3].
The two main clinical parameters used for chronic glycaemic 2.1. Materials
control are glycated HbA1c levels and SMBG [4]. Measurement
of glucose in blood, a short-term indicator, reflects the diabetic The bicinchoninic acid, albumin from human serum
status over a 24-hour period, while the HbA1c value represents (96 to 99%), MGO solutions (40% aqueous), anti-DNPH
a long-term glycaemic indicator. However, the HbA1c is not (dinitrophenyl hydrazine) antibody, 2,2′ -azobis-(2-methy-
always a relevant indicator of glycaemic control in patients with lpropionamidine) dihydrochloride (AAPH) and 3,3′ ,5,5′ -
diabetes-associated pathologies that affect erythrocyte lifespan, tetramethylbenzidine liquid substrate system for the enzyme-
such as haemolytic or renal anaemia and liver cirrhosis [5,6]. In linked immunosorbent assay (Elisa) tests were all obtained
such cases, glycated albumin appears to be an alternative marker from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). ECLTM anti-rabbit
for glycaemic control: the glycated albumin level is thought to immunoglobulin G (IgG) and HRP-linked whole antibody
indicate blood glucose status over a short period (2 to 4 weeks), (from donkey) were purchased from GE Healthcare Ltd (Little
while HbA1c reflects the glycaemic state over a longer period Chalfont, Buckinghamshire, UK), and the monoclonal anti-AGE
(2 months). Indeed, numerous studies support the use of gly- antibody was from Cosmo Bio Co., Ltd (Tokyo, Japan).
cated albumin levels in the detection of short-term changes in
glycaemic control [7–9]. 2.2. Purification of albumin
Albumin is known to have a set of diverse beneficial func-
tions, including oncotic pressure regulation, and binding and Blood was obtained from a pool of diabetic patients and
transport capacities for a wide variety of metabolites, includ- non-diabetic subjects, and anticoagulated in EDTA tubes (BD
ing those of therapeutic drugs [10,11]. For this reason, albumin Vacutainer® ) in the biochemistry laboratory of our insti-
can play an important role in drug disposition and efficacy [12]. tution in Saint-Denis, Réunion. Albumin purification was
However, the most prominent property of albumin is its major conducted using pooled serum from 15 diabetic patients (HbA1c :
antioxidant activity in a circulatory system that is constantly sub- 12.0 ± 1.8%) and 38 non-diabetic subjects (HbA1c : 5.3 ± 0.3%).
jected to powerful oxidative stress [13]. Previous reports from Included in the diabetic pool were only those patients with
our group have demonstrated impairment of these properties high albuminaemia levels (> 40 g/L) but no acute inflam-
with the glycation process [14,15]. In these studies, modified matory syndrome (C-reactive protein [CRP] levels < 2 mg/L),
albumin in vitro exhibited different structural and functional acute coronary syndrome (troponin Ic < 0.03 ␮g/L) and high
properties attributed to the heterogeneous products formed by hypertriglyceridaemia (> 3.5 g/L) in the 2 months prior to the
glycation, depending on the nature of albumin used (bovine or analysis (Table S1, Supplementary data). Patients with HbA1c
A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178 173

abnormalities and/or hyperleukocytosis were excluded from the Various concentrations of l -cysteine (10 to 100 nmol) were used
plasma pool. to perform the standard curve. Thiol group content was measured
Purification of serum albumin from fresh human plasma was by reading the absorbance at 412 nm. Results were expressed as
based on extensive dialysis against 50 mM Tris/HCl (pH 7.4) the number of free–SH groups per mol of bovine serum albumin
followed by affinity chromatography using Cibacron Blue 3G (BSA).
linked to agarose (Amersham catalogue number 17-0948-01) as
a ligand for albumin. A 1.5-M NaCl (pH 7.4) buffer was used for 2.7. 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS) assay
the desorption of bound albumin from Cibacron Blue–agarose,
following the elution of other plasma proteins using a 50-mM The TNBS assay is a sensitive method for determining the
Tris/HCl (pH 7.4) buffer. Each fraction of eluate was examined primary free amino groups in proteins [20]. Again, this method
by gel electrophoresis, and the most purified and concentrated has been described in detail elsewhere [16].
extracts were pooled before extensive dialysis against phosphate
buffered saline (PBS), then stored at –80 ◦ C. 2.8. Methacrylamido phenylboronic acid (MPBA)
polyacrylamide gel
2.3. Preparation of advanced glycation end-products
(AGEs) Discriminating analysis between glycated and non-glycated
albumin has previously been performed using MPBA polyacry-
AGEs were prepared, as described elsewhere [15], by incu- lamide electrophoresis [21]. MPBA-resolving acrylamide gels
bating 0.37 mM of HSA-C and purified HSA from a HSA-ND were prepared by adding 1% (w/v) of MPBA (provided by J. van
pool without and with glucose (100 mM) in PBS (pH 7.4) under den Elsen, Department of Biology and Biochemistry, University
sterile conditions at 37 ◦ C for 3 weeks or with MGO (10 mM) for of Bath, UK) to 8% acrylamide solution. The 4% stacking acry-
2 days. The proteins were dialysed against PBS, sterile-filtered lamide gel was prepared without boronic acid. Albumin samples
with a 0.2-␮m Millipore filter and stored at –80 ◦ C. (20 ␮g) were applied to the gel in denaturing sodium dodecyl
sulphate (SDS) and reductive dithiothreitol (DTT) buffers.
2.4. Fructosamine assay and albuminaemia

Albumin concentrations were determined using an albumin 2.9. Copper-binding affinity


reagent kit (ALB2, COBAS® ) based on a colorimetric assay
at 570 nm of albumin mixed with bromocresol green (BCG, The capacity of albumin to bind copper ions can be mea-
3′ ,3′′ ,5′ ,5′′ -tetrabromo-m-cresolsulphonephthalein) [17]. Fruc- sured spectrophotometrically using bathocuproinedisulphonic
tosamine was determined by the method developed by Johnson acid (BCS, Fluka #11870) [22,23]. AGE preparations (40 nmol
et al. [18] using a commercial reagent kit (FRA, COBAS® ). The in 0.15 M of NaCl) were incubated in triplicate for 2 h with
results were expressed as mmol/L of 1-deoxy-1-morpholino- 50 nmol CuSO4 in a final volume of 500 ␮L. The unbound
d-fructose (DMF), a synthetic ketoamine used as a primary ligand fractions were separated from the albumin-linked lig-
standard. and fractions by ultrafiltration, using the Amicon© Ultra system
(Millipore, Billerica, MA, USA), with centrifugation at 3000 g
2.5. Quenching of tryptophan and 1-anilino-8-naphthalene for 20 min. The concentration of copper bound to albumin was
sulphonic acid (ANSA) fluorescences determined by adding BCS (1.2 mM) diluted in 1 mM of sodium
ascorbate solution, followed by an absorbance reading at 480 nm
Fluorescence spectra were carried out on a Perkin-Elmer after 5 min of incubation at room temperature. The concentra-
LS55 spectrometer with protein samples at a concentration of tions of copper bound to modified albumins were calculated
10 ␮M in PBS. Tryptophan emission spectra were obtained in using a calibration standard curve by increasing the amount of
the range of 250 to 600 nm under excitation at 270 nm. All CuSO4 up to 100 nmol.
fluorescence spectra were corrected for their different respective
absorptions. 2.10. Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa)
1-anilino-8-naphthalene sulphonic acid (ANSA) was dis- quantification of carbonylated proteins
solved in 5-␮M albumin samples at an ANSA/albumin ratio of
approximately 0.4 (mol/mol) to ensure that the dye was linked The degree of carbonylation of glycoxidized albumin was
to the hydrophobic sites of albumin. ANSA–protein complex determined by carbonyl Elisa assay based on recognition of
emission fluorescence spectra were performed in the range of protein-bound DNPH in carbonylated proteins with an anti-DNP
350 to 700 nm under an excitation wavelength of 470 nm. antibody. This method has been described in detail in previous
published studies from our group [16,24].
2.6. Oxidative modification of –SH
2.11. Haemolysis test
Thiol groups in native and modified albumin were mea-
sured by Ellman’s assay using 5,5′ -dithiobis-(2-nitrobenzoic Each well of a 96-well plate was filled with 100 ␮L (about
acid) (DTNB) [19], as has been well described elsewhere [14]. 1.108 erythrocytes; final concentration: 400,000 cells/␮L) of a
174 A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178

diluted solution of red blood (1/10 in 0.15 M of NaCl). Differ- were determined using one-way analysis of variance (Anova)
ent albumin samples (final concentration: 10 ␮M) were added followed by Tukey’s test for multiple comparisons, with a P
in triplicate. Haemolysis was initiated by adding 100 ␮L of value < 0.05 required for significance.
0.45 M of AAPH solution to each well. Turbidimetry at 450 nm
was recorded at 10-min intervals using a 37 ◦ C thermostated 3. Results
microplate reader. Results were expressed as 50% of maximum
haemolysis time (HT50 ) in min. 3.1. Biochemical characterizations of human serum
albumin (HSA) samples
2.12. Statistical analysis
Clinical and biochemical characteristics of the diabetic
Data were expressed as the means ± standard deviation (SD) plasma samples are presented in Table S1, Supplemen-
of a minimum of three experiments. Statistical significances tary data. All purified albumin samples exhibited approximately

Fig. 1. Characterization of purified human serum albumin from non-diabetic patients (HSA-ND) and human serum albumin from diabetic patients (HSA-D) and
commercial human serum albumins (HSA-C) modified by glycation; a: coomassie staining of human serum albumin (HSA) samples separated by sodium dodecyl
sulphate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (12%); b: electrophoretic migration profile of native polyacrylamide gel electrophoresis (12%); c:
advanced glycation end-product (AGE) content of human serum albumin samples as assessed by Western blotting (WB); d: separation of human serum albumin
samples using phenylboronate acrylamide gel electrophoresis (mPAGE).
A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178 175

identical molecular weights (about 66 kDa), with a slight vari- with glucose. Significant differences in the levels of free thiol
ation of a few Daltons for modified HSA corresponding to and amino groups and carbonyl rate were also found between
attachment to the protein of one or several glucose (162 Da) albumin from non-diabetic subjects (HSA-NDG0 ) and diabetic
or MGO (54 Da) units (Fig. 1a). In contrast, these albumins patients (HSA-D). Their free amino group modification level
differed in their net charge, as confirmed by native polyacry- and carbonyl rate values were similar to the values obtained for
lamide gel electrophoresis (PAGE, Fig. 1b). In this situation, the HSA-NDG100 . In contrast, free thiol content was more affected
protein charge constituted the main factor affecting its migra- in diabetic albumin than in MGO-modified albumin in vitro
tion. A higher migration was observed for albumins (HSA-ND compared with non-modified and non-diabetic albumins.
and HSA-C) modified by glucose and MGO compared with Fructosamine levels (␮g/g of HSA) were significantly
native HSA. Indeed, electrophoretic migration was dramatically enhanced in albumin from diabetic patients compared with the
enhanced for albumin modified by MGO. Such enhanced migra- controls. In comparison to diabetic albumin, fructosamine levels
tions for HSA-ND and HSA-C modified by glucose and MGO vs increased markedly with modification by glucose in vitro and, to
native HSA indicate impairment of the isoelectric point of albu- a lesser extent, by MGO of both albumins (HSA-ND and HSA-
min following glycation. Also, there was a decrease in cationic C). The lower fructosamine level for HSAMGO can be explained
charges in albumin after glycation that could be attributed to the by the higher reactivity of MGO compared with glucose, thereby
involvement of positively charged residues (arginine and lysine) giving rise more quickly to AGE formation.
in condensation with carbohydrate [14]. In numerous studies, boronate affinity chromatography has
The end stage of the glycation process gives rise to irre- proved its efficacy in separating Amadori products (ketoamine)
versible conjugates known as AGEs [3]. Of these AGEs, from non-modified albumin [14,27]. According to Morais
N␧ -carboxymethyl-lysine (CML) and N␧ -carboxyethyl-lysine et al. [21], Amadori products such as fructosamine can also
(CEL) were formed during the incubation of albumin with glu- be directly characterized by using phenylboronate incorpo-
cose and MGO, respectively. Western blotting (Fig. 1c) revealed rated into acrylamide gel electrophoresis. Phenylboronic acid
that using antibodies directed against AGEs showed enhanced has also shown its capacity to function as a saccharide
signals only for HSA modified by 100 mM of glucose, whereas receptor in the aqueous solution of many sensory systems
no signal was observed for HSA purified from the plasma of [26,27].
diabetic patients. The lack of signal for MGO-modified albu- In mPAGE gel profiles (Fig. 1d), a shift in the main protein
min suggests that our AGE antibody was directed against CML band to a higher molecular weight (> 90 kDa) was observed for
rather than CEL. modified commercial and purified HSA, and accompanied by
Several oxidative parameters in our albumin preparations are broadening for MGO-modified HSA. A slight shift in the protein
shown in Table 1. As expected, levels of free thiol and amino band (≈ 80 kDa) was observed for diabetic HSA.
groups decreased significantly in albumin after glycation by
glucose and MGO. For both parameters, the decrease was more 3.2. Fluorescence studies
evident with MGO HSA-ND (HSA-C) modification than with
glucose, although such severe decreases with MGO have been Tryptophan fluorescence emission (at 350 nm) decreased
previously reported [25]. Similarly, the increase in carbonyl rate, in both modified HSA (HSA-NDG100 and HSA-NDMGO ) and
attributed to enhanced oxidation of albumin HSA-ND (HSA-C) diabetic HSA (HSA-D). The quenching of fluorescence was
with in vitro modification, was more marked with MGO than stronger for HSA-NDMGO than for HSA-NDG100 in comparison

Table 1
Oxidation parameters for various albumin preparations from three independent experiments.
Methods Frutosamine/human serum Thiols/human serum Free amino groups Carbonyl rate increase
albumin (HSA) (␮g/g) albumin (HSA) (mol/mol) (% /control) (% /control)

Purified HSA-NDa
HSA-NDG0 1.96 ± 0.08 0.483 ± 0.023 100.00 ± 4.70 100.00 ± 5.72
HSA-NDG100 45.77 ± 1.83*** 0.371 ± 0.019* 60.39 ± 6.72*** 87.12 ± 11.25
HSA-NDMGO 31.02 ± 1.24*** 0.307 ± 0.016** 29.43 ± 1.39*** 593.76 ± 16.39***
Purified HSA-Da
HSA-DG0 5.65 ± 0.10*** 0.263 ± 0.003*** 79.07 ± 3.20** 195.66 ± 19.39***
Commercial HSAb
HSA-CG0 2.62 ± 0.23 0.372 ± 0.004 100.00 ± 5.05 100.00 ± 7.96
HSA-CG100 47.54 ± 1.90*** 0.325 ± 0.006** 61.45 ± 2.35*** 86.55 ± 8.13
HSA-CMGO 29.76 ± 1.19*** 0.329 ± 0.008* 21.99 ± 3.39*** 348.13 ± 22.33***

Fructosamine levels were obtained by nitroblue tetrazolium (NBT assay); free thiol group content was assessed by Ellman’s method; unmodified primary amino
group content in proteins was by trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS) assay; carbonyl rate (%) was assessed by Elisa carbonyl assay; all data are expressed as
means ± SD; *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05.
a Effect of glycation or diabetes in purified human serum albumin (HSA) (vs HSA-ND ).
G0
b Effect of glycation in commercial human serum albumin (vs HSA-C ).
G0
176 A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178

enhanced ANSA fluorescence in comparison to non-modified


albumin. These data show the differential conformational
changes induced by glucose- and MGO-induced glycation.

3.3. Functional properties

To assess the effect of glycation on the antioxidant proper-


ties of albumin, their free-radical-scavenging properties were
investigated in a free-radical-induced haemolysis test. In the
test, the intrinsic capacity of albumin to protect erythro-
cytes from haemolysis induced by free radicals was evidenced
by a higher haemolysis half-time (HT50 ) vs a PBS con-
trol (Fig. 2a). While in vitro glycoxidation of both albumins
by glucose and MGO did not significantly affect their anti-
radical activity, this protective effect was partially lost in
the case of diabetic HSA. Compared with HSA-NDG0 , a
reduction of about 20% (P < 0.05) in HT50 for HSA-D was
observed.
The antioxidant capacity of albumin is also related to its affin-
ity to several metals. Copper deserves special consideration as
most mammalian albumins bind to this cation more tightly and
more specifically than in other animals [28]. Copper absorbed
through the intestines is transported by albumin in the portal cir-
culation before being incorporated in ceruloplasmin in the liver
[29]. While glucose-mediated glycation did not affect albumin
affinity for copper (0.5 mol of copper per mol of albumin), modi-
fication by MGO drastically increased albumin capacity to bind
to the metal (1.1 mol of copper per mol of albumin; Fig. 2b).
Albumin affinity for copper was also significantly affected in
cases of diabetes. HSA-D showed a significant decrease (–16%,
P < 0.05) in its copper affinity compared with non-diabetic
HSA.

4. Conclusion

Glycation-induced albumin structural and functional changes


are of particular interest as numerous studies in vivo have
Fig. 2. Impairment of functional albumin properties in diabetes; a: antioxidant reported the strong involvement of glycated albumin in the devel-
activities as assessed by free-radical-mediated blood haemolysis test (HT): his- opment and progression of chronic diabetes complications. Most
tograms represent haemolysis test half-time (HT50 in min) expressed as the
means ± SD of three separate experiments. The thin line allows comparison
of these studies were focused on the structural and functional
with controls (no albumin). Statistical analyses were performed using one-way changes of commercial BSA-induced glycoxidation in vitro.
Anova for multiple comparisons. * Effect of HSA-ND or HSA-C (vs. con- However, only a few studies compared the structural and func-
trol): ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05; effect of glycation in commercial tional changes between models of glycoxidation of human
human serum albumin (vs HSA-CG0): b: copper-binding capacity of human albumin in vitro with albumin in hyperglycaemia in vivo. For
serum albumin (HSA) samples as assessed by the bathocuproinedisulphonic
(BCS) method: histograms represent copper-binding capacity of modified albu-
this reason, the present study was undertaken to evaluate the
min (nmol/␮mol albumin). Data are expressed as means ± SD (n = 3); statistical suitability of in vitro models of glycation mimicking diabetic
analyses were performed using one-way Anova for multiple comparisons. Effect pathology.
of glycation or diabetes in purified human serum albumin (vs HSA-NDG0 ): Using different techniques, modifications in intrinsic proper-
** P < 0.01, * P < 0.05. Effect of glycation in commercial human serum albumin
ties were studied in HSA induced by glycation in vitro with
(vs HSA-CG0 ): ## P < 0.01.
glucose (100 mM) and with MGO (10 mM). Comparison of
these modifications with those observed in diabetic albumin
to native HSA-ND, while HSA-D samples had an intermediate could constitute a key factor in helping investigators to choose
fluorescence emission that was in between those of both gly- the most suitable glycation model for cellular physiology stud-
cated HSA-ND samples (Supplementary data, Fig. S1a). While ies. Of albumin properties, the redox state, scavenging capacity
the emission fluorescence spectra (Supplementary data, Fig. and binding affinity of the protein were also investigated. As
S1b) showed extrinsic fluorescence quenching at 300 nm for expected and consistent with previous studies, the incubation
MGO-modified HSA and diabetic HSA, glycation by glucose of human albumin with glucose and MGO in vitro contributed
A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178 177

to the increase in fructosamine and carbonyl rates, indicat- cardiovascular complications. Also, activated macrophage cells
ing the formation of Amadori products accompanied by an lines, key elements of atherosclerosis development, may be
oxidation process. This increase in oxidative state was con- the most suitable cell model for evaluating the physiological
firmed by the impaired redox states of the single thiol group in impact of the in vivo diabetic albumin model. While considering
albumin (Cys 34). The glycation of albumin also induced a glycated HbA1c levels from SMBG as the best indicator of dia-
decrease in free amino group levels, indicating the involve- betic status, glycated albumin would appear to be a suitable
ment of several exposed negatively charged lysine and arginine marker for the monitoring of diabetes-associated complications.
residues that were neutralized by glucose and MGO during gly- Albumin plays an important role in the systemic distribu-
cation. The increase in the net negative electrical charge has tion of many therapeutic drugs [35,36]. A reduced affinity of
already been described for oxidized lipoproteins increasingly albumin for drugs with a narrow therapeutic index can result in
involved in atherosclerosis [30]. The tertiary structure is also their toxic effect because of an increase in concentrations in their
partially affected by in vitro glycation by glucose or a deriva- free forms and the impact of their pharmacological properties. It
tive, as confirmed by tryptophan and ANSA fluorescence results. would be of great interest to extend the present study to an anal-
Overall modification of the three-dimensional structure was also ysis of albumin affinity for specific therapeutic drugs relevant to
induced by glycation with, in particular, a conformation change diabetes to obtain a better understanding of the impact of dia-
in hydrophobic pockets. Consequently, these structural changes betes on the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
associated with modification of the redox state have a direct bear- of these drugs.
ing on the intrinsic biological functionality of albumin, including
its free-radical-scavenging properties and copper-binding affin-
Disclosure of interest
ity. In albumin, the single reduced cysteine unit constitutes an
important redox regulator in extracellular compartments [31,32].
The authors declare that they have no conflicts of interest
Under our experimental conditions, glucose-mediated glyca-
concerning this article.
tion did not affect albumin antioxidant activity, as assessed by
the haemolysis test, as also observed elsewhere [16]. On the
other hand, in MGO-modified albumins, alteration of the pro- Acknowledgements
tective effect of albumin was consistent with the redox state of
cysteine. These results could be attributed to the different ter- This work was supported by the Ministère de l’Enseignement
tiary structures of HSAG100 and HSAMGO , as revealed by the Supérieur et de la Recherche (Department for Higher Education
fluorescence results of the ANSA probe. The partial unfold- and Research), the Ministère de l’Outre-Mer (Department of
ing of hydrophobic pockets of albumin induced by incubation Overseas Territories), the Regional Council of Réunion and the
with glucose revealed specific amino acids, previously buried University of Réunion.
in the native conformation of HSA, to be potential free-radical Author contributions: A. Guerin-Dubourg researched data,
scavengers. contributed discussion, reviewed the manuscript. A. Catan
The antioxidant capacity of albumin also depends on the researched data. E. Bourdon contributed discussion, reviewed
protein’s capacity to bind copper ions. HSA contains one high- the manuscript. P. Rondeau researched data, wrote, reviewed
affinity site for copper, the N-terminal tripeptide Asp-Ala-His and edited the manuscript.
[33]. Protein sequestration of copper ions has been shown to pre-
vent reactive oxygen species (ROS)-generating reactions [34].
Given that albumin conformation plays a key role in its transport Appendix A. Supplementary data
capacity, the significant increase in affinity for copper observed
in MGO-modified albumin can be attributed to the specific ter- Supplementary material (Table S1 and Fig. S1) associated
tiary structure induced by glycation. with this article can be found at http://www.sciencedirect.com,
Regarding the data for diabetic HSA, the fundamental ques- at doi:10.1016/j.diabet.2011.11.002.
tion to emerge was: are the structural and functional properties of
models in vitro relevant to diabetic HSA characteristics? While References
most quantitative changes in oxidative and structural parameters
were observed in glucose- or MGO-modified albumins, signif- [1] Charonis AS, Reger LA, Dege JE, Kouzi-Koliakos K, Furcht LT,
icant impairment of albumin function (free-radical-scavenging Wohlhueter RM, et al. Laminin alterations after in vitro nonenzymatic
and copper-binding capacities) was demonstrated in HSA puri- glycosylation. Diabetes 1990;39:807–14.
[2] Brownlee M. The pathological implications of protein glycation. Clin Invest
fied from diabetics. However, these findings showed different Med 1995;18:275–81.
structural and functional features in diabetic HSA compared [3] Cohen MP. Intervention strategies to prevent pathogenetic effects of gly-
with in vitro models. cated albumin. Arch Biochem Biophys 2003;419:25–30.
As for structural and biological results, glycated albumin in [4] Roohk HV, Zaidi AR. A review of glycated albumin as an interme-
vivo appears to be the most relevant model for mimicking hyper- diate glycation index for controlling diabetes. J Diabetes Sci Technol
2008;2:1114–21.
glycaemia or diabetes. The diabetic model of HSA in vivo may be [5] Ichikawa H, Nagake Y, Takahashi M, Nakazono H, Kawabata K, Shikata
more suitable than in vitro cellular physiology studies examining K, et al. What is the best index of glycemic control in patients with diabetes
the relationship between albumin status and diabetes-associated mellitus on hemodialysis? Nippon Jinzo Gakkai Shi 1996;38:305–8.
178 A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178

[6] Panzer S, Kronik G, Lechner K, Bettelheim P, Neumann E, Dudczak R. [21] Morais MP, Mackay JD, Bhamra SK, Buchanan JG, James TD, Fossey JS,
Glycosylated hemoglobins (GHb): an index of red cell survival. Blood et al. Analysis of protein glycation using phenylboronate acrylamide gel
1982;59:1348–50. electrophoresis. Proteomics 2009;10:48–58.
[7] Yoshiuchi K, Matsuhisa M, Katakami N, Nakatani Y, Sakamoto K, [22] Argirova MD, Ortwerth BJ. Activation of protein-bound copper ions
Matsuoka T, et al. Glycated albumin is a better indicator for glucose during early glycation: study on two proteins. Arch Biochem Biophys
excursion than glycated hemoglobin in type 1 and type 2 diabetes. Endocr 2003;420:176–84.
J 2008;55:503–7. [23] Bourdon E, Loreau N, Lagrost L, Blache D. Differential effects of cys-
[8] Okumura A, Mitamura Y, Namekata K, Nakamura K, Harada C, Harada T. teine and methionine residues in the antioxidant activity of human serum
Glycated albumin induces activation of activator protein-1 in retinal glial albumin. Free Radic Res 2005;39:15–20.
cells. Jpn J Ophthalmol 2007;51:236–7. [24] Ramful D, Tarnus E, Rondeau P, Robert Da Silva C, Bahorun T, Bourdon E.
[9] Nagayama H, Inaba M, Okabe R, Emoto M, Ishimura E, Okazaki S, Citrus fruit extracts reduce advanced glycation end products (AGEs)- and
et al. Glycated albumin as an improved indicator of glycemic control H2 O2 -induced oxidative stress in human adipocytes. J Agric Food Chem
in hemodialysis patients with type 2 diabetes based on fasting plasma 2010;58:11119–29.
glucose and oral glucose tolerance test. Biomed Pharmacother 2009;63: [25] Faure P, Troncy L, Lecomte M, Wiernsperger N, Lagarde M, Ruggiero D,
236–40. et al. Albumin antioxidant capacity is modified by methylglyoxal. Diabetes
[10] Scatchard G, Batchelder AC, Brown A. Chemical, clinical, and immuno- Metab 2005;31:169–77.
logical studies on the products of human plasma fractionation. Vi. The [26] James TD. Boronic acids in organic synthesis and chemical biology. In:
osmotic pressure of plasma and of serum albumin. J Clin Invest 1944;23: Hall DG, editor. Weinheim: Wiley-VCH; 2005.
458–64. [27] James TD, Shinkai S. Artificial receptors as chemosensors for carbohy-
[11] Waldmann TA. Albumin structure, function and uses. In: Rothschild MAE, drates. Top Curr Chem 2002;218:159–200.
editor. New York: Pergamon Press; 1977. [28] Peters TJ. All about albumin – biochemistry, genetics and medical appli-
[12] Kratz F. Albumin as a drug carrier: design of prodrugs, drug conjugates cations. San Diego: Academic Press; 1996.
and nanoparticles. J Control Release 2008;132:171–83. [29] Gordon DT, Leinart AS, Cousins RJ. Portal copper transport in rats by
[13] Halliwell B. Albumin – an important extracellular antioxidant? Biochem albumin. Am J Physiol 1987;252(3 Pt 1):E327–33.
Pharmacol 1988;37:569–71. [30] Bourdon E, Loreau N, Davignon J, Bernier L, Blache D. Involvement
[14] Chesne S, Rondeau P, Armenta S, Bourdon E. Effects of oxidative modifi- of oxysterols and lysophosphatidylcholine in the oxidized LDL-induced
cations induced by the glycation of bovine serum albumin on its structure impairment of serum albumin synthesis by HEPG2 cells. Arterioscler
and on cultured adipose cells. Biochimie 2006;10:1467–77. Thromb Vasc Biol 2000;20:2643–50.
[15] Rondeau P, Singh N, Caillens H, Bourdon E. Oxidative stresses induced [31] Carballal S, Alvarez B, Turell L, Botti H, Freeman BA, Radi R. Sulfenic
by glycated human or bovine serum albumins on human monocytes. Free acid in human serum albumin. Amino Acids 2007;32:543–51.
Radic Biol Med 2008;45:799–812. [32] Gutteridge JM. Antioxidant properties of the proteins caeruloplasmin,
[16] Rondeau P, Navarra G, Cacciabaudo F, Leone M, Bourdon E, Militello V. albumin and transferrin. A study of their activity in serum and syn-
Thermal aggregation of glycated bovine serum albumin. Biochim Biophys ovial fluid from patients with rheumatoid arthritis. Biochim Biophys Acta
Acta 2010;1804:789–98. 1986;869:119–27.
[17] Rodkey FL. Direct spectrophotometric determination of albumin in human [33] Laussac JP, Sarkar B. Characterization of the copper (II)- and nickel (II)-
serum. Clin Chem 1965;11:478–87. transport site of human serum albumin. Studies of copper (II) and nickel
[18] Johnson RN, Metcalf PA, Baker JR. Fructosamine: a new approach to the (II) binding to peptide 1-24 of human serum albumin by 13 C and 1H NMR
estimation of serum glycosylprotein. An index of diabetic control. Clinica spectroscopy. Biochemistry 1984;23:2832–8.
Chimica Acta 1983;127:87–95. [34] Roche M, Rondeau P, Singh NR, Tarnus E, Bourdon E. The antioxidant
[19] Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys properties of serum albumin. FEBS Lett 2008;582:1783–7.
1959;82:70–7. [35] Kragh-Hansen U. Molecular aspects of ligand binding to serum albumin.
[20] Snyder SL, Sobocinski PZ. An improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic Pharmacol Rev 1981;33:17–53.
acid method for the determination of amines. Anal Biochem 1975;64: [36] Otagiri M. A molecular functional study on the interactions of drugs with
284–8. plasma proteins. Drug Metab Pharmacokinet 2005;20:309–23.
SUPPLEMENTARY DATA

Non diabetics (ND) Diabetics (D)

N (females) 38 (21) 15 (8)

Age (years) 46.2 ± 18.5 48.5 ± 16

HbA1c (%) 5.3 ± 0.3 12.0 ± 1.8***

Fructosamines (ng/mL) 202.1 ± 17.1 419.1 ± 90.0***

Creatinin (µmol/L) 79.8 ± 13.9 97.3 ± 29.5**

Albumin (g/L) 43.5 ± 3.4 40.5 ± 4.6*

Total proteins (g/L) 73.1 ± 6.1 71.6 ± 5.9

CRP (mg/L) 5.6 ± 6.8 14.0 ± 14.2**

Table S1: Clinical and biochemical characteristics of diabetic and non diabetic patients
and plasma samples.
Data are expressed as means ± SD and are compared using Student’s t test for unpaired
samples. ***p<0.001, **p<0.01,*p<0.05.
Figure S1: a) Fluorescence spectra of tryptophan with excitation wavelength at 270 nm; b)
ANSA emission fluorescence spectra at excitation wavelength of 470 nm for HSA-NDG0 (—),
HSA-NDG100 (…...), HSA-NDMGO (– – –) and HSA-D (--). Fluorescence spectra of all samples
are shown after having normalized the data.
Article  2: Impaired  drug binding capacit ies of  in  vit ro  and  in  vivo   glycat ed  albumin. Biochimie 

2012  ;  94 :  1960‐1967. J.  Baraka ‐Vidot,  A.  Guerin‐Dubourg, E.  Bourdon, P.  Rondeau.  

  97
  98
Bioch im ie 94 (2012) 1960e 1967

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Bioch im ie
j o u r n al h o m ep ag e: w w w .el sev i er .co m /l o cat e/b i o ch i

Research paper

Im paired drug-bin din g capacities of in vitro an d in vivo glycated album in


Jen n ifer Baraka-Vidot a , Alexis Guerin -Dubourg a , b , Em m an uel Bourdon a , Ph ilippe Ron deau a , *
a
Groupe d ’Etude sur l’In fla m m a tion Chronique et l’Obésité (GEICO), Structure fédéra tive Environnem ent Biodiversité Sa nté-FED4126, Université de La Réunion,
Pla teform e CYROI, 15, a venue René Ca ssin e BP 7151, 97715 Sa int Denis Messa g Cedex 09, La Réunion, Fra nce
b
Unité fonctionnelle de recherche Biochim ie, Centre Hospita lier Universita ire Félix Guyon, Sa int Denis de La Réunion, Fra nce

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Album in , th e m ajor circulatin g protein in blood, can un d ergo in creased glycation in diabetes. On e of th e
Received 13 February 2012 m ain properties of th is plasm a protein is its stron g affin ity to bin d m any th erapeutic dru gs, in cludin g
Accepted 9 May 2012 w arfarin an d ketoprofen . In th is stu dy, w e in vestigated w h eth er or n ot th ere w ere any sign ifican t ch an ges
Available on lin e 22 May 2012
related to in vitro or in vivo glycation in th e structural properties an d th e bin din g of h um an album in to both
th erapeutic drugs. Structural param eters, in cludin g redox state an d ketoam in e con ten ts of in vitro an d
Keyw ords:
in vivo glycated purified album in s, w ere in vestigated in parallel w ith th eir affin ity for w arfarin an d keto-
Hum an album in
profen . High -perform an ce liquid ch rom atography w as used to determ in e th e free drug con cen tration s an d
Diabetes
Warfarin
dissociation con stan ts accordin g to th e Scatch ard m eth od . An altern ative m eth od based on fluorescen ce
Ketoprofen spect roscopy w as also used to assess drug-bin d in g properties. Oxidation an d glycat ion levels w ere foun d to
Glycation be en h an ced in album in purified from diabetic patien ts or glycated w ith glucose or m ethylglyoxal, after
determ in ation of th eir ketoam in e, free th iol, am in o group an d carbonyl con ten ts. In parallel, sign ifican t
im pairm en ts in th e bin din g affin ity of in vitro an d in vivo glycated album in , as in dicated by th e h igh er
dissociation con stan t values an d con firm ed by h igh er free drug fraction s, w ere observed. To a lesser exten t,
th is alteration also sign ifican tly affected diabetic album in affin ity, in dicated by a low er static quen ch in g in
fluorescen ce spectroscopy. Th is w ork provides usefu l in form ation sup portin g in vivo diabetic album in
could be th e best m od el of glycat ion for m on itorin g diabetic physiopath ology an d sh ould be valuable to
kn ow if glycation of album in could con tribute to variability in drugs respon se durin g diabetes.
Ó 2012 Elsevier Masson SAS. All righ ts reserved.

1. Int r oduct i on adducts in duce irreversible dam age associated w ith th e m etabolic
disorders observed in diabetes m ellitus, such as retin opathy,
Diabetes h as reach ed pan dem ic proportion s an d affects aroun d n eph ropathy, n europathy, an d coron ary artery disease [2,3].
6%of th e w orld’s adult population in 20 06. Th is disease is con sid- Am on g th e blood protein s, h em oglobin an d album in are th e
ered to be on e of th e w orld’s m ost im portan t causes of expen diture, m ost com m on protein s th at are likely to be glycated. Th e glycated
m ortality, disability, an d lost econ om ic grow th . Diabetes m ellitus is h em oglobin (HbA1C) level is con sidered as on e of th e m ain clin ical
ch aracterized by an elevated level of glucose in th e blood, w h ich param eters used for m on itorin g ch ron ic glycem ic con trol via blood
can affect th e m ain circulatin g protein s th rough a n on -en zym atic glucose m easurem en ts (Self-Mon itorin g of Blood Glucose, SMBG)
process kn ow n as glycation or glycoxidation . Th is con den sation [4]. W ith a sh orter h alf-life th an h em oglobin in blood, glycated
reaction in volves circulatin g protein s an d glucose an d leads to th e h um an serum album in (HSA) appears to be an altern ative m arker
form ation of Am adori products, w h ich can give rise to irreversible for glycem ic con trol as it can in dicate blood glucose status over
con jugates called advan ced glycation en d products (AGE) in th e a sh ort period (2e 4 w eeks) [5,6]. In vivo , th e proportion of glycated
case of un ch ecked hyperglycem ia [1]. Elevated levels of th ese album in in h ealthy people is in th e ran ge of betw een 1% an d 10%
[7,8], an d in th e case of diabetes m ellitus, th is proportion can
in crease tw o- to th ree-fold [9].
Abbrevia tions: AGE, advan ced glycation en d-products; HSA, h um an serum Hum an serum album in (HSA), as th e m ost prom in en t protein in
album in ; HSA-ND an d HSA-D, purified h um an serum album in from n on -diabetic plasm a, is th e m ajor carrier of various en dogen ous an d exogen ous
an d diabetic patien ts, respectively; HbA1C, glycated h em oglobin level; PBS, ph os- m etabolites in blood th rough out th e body. This plasm a protein could
ph ate-buffered salin e; SMBG, self-m on itorin g of blood glucose; TNBS, 2,4,6-
serve as a circulating depot for m any drugs [10]. In particular, it could
trin itroben zen esulfon ic acid.
* Correspon din g auth or. Tel.: þ33 262 262 93 86 48; fax: þ33 262 262 93 82 37. play a m ajor role in affectin g therapeutic drug absorption, distribu-
E-m a il a ddress: roph il@un iv-reun ion .fr (P. Ron deau). tion , m etabolism , an d excretion [11]. In deed, binding to h um an

030 0-9084/$ e see fron t m atter Ó 2012 Elsevier Masson SAS. All righ ts reserved.
doi:10.1016/j.bioch i.2012.05.017
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967 1961

album in in creases th e lifetim e of a drug before it is m etabolized, an d


it also allow s som e hydroph obic drugs to becom e m ore soluble in
blood [12,13]. After delivery by album in , unbound drugs could easily
reach target organs through th e plasm a. In contrast, bound drugs can
h ardly reach th e action site th rough the blood w ith out losin g their
pharm acological activities an d toxicity. Am on g th e therapeutic
drugs, som e h ave a n arrow th erapeutic in dex, such as w arfarin , an d
are easily toxic in th e unbound state. In deed, it w as established th at
Min im al Effective Con cen tration (MEC) of w arfarin is com prised
betw een 1 an d 7 mg/m L, w h ile its Min im al Toxic Con cen tration (MTC)
is above 10 mg/m L [14]. Som e path ological states, w hich im pair liver
or ren al fun ctions, triggerin g hypoalbum inem ia, could in crease the
effects of drugs h igh ly bound to album in [15].
Fi g. 1. Structures of w arfarin an d ketoprofen .
Album in h as tw o m ajor bin din g sites for drugs called Sudlow
site I an d Sudlow site II [16]. Because of its large size an d adapt- 2.2. Hum a n a lbum in purifica tion
ability, site I ten ds to bin d bulky h eterocyclic com poun ds in cludin g
sulfon am ides, salicylate an d coum arin com poun ds such as w arfarin Blood w as obtain ed from a pool of diabetic patien ts an d n on -
[17,18]. In con trast, site II, w h ich is sm aller an d less flexible, in duces diabetic subjects an d an ticoagulated in EDTA tubes (BD Vacu-
th e m ore stereospecific bin din g of arom atic carboxylic acids an d tain er) at th e Bioch em istry laboratory of th e Cen tre Hospitalier
profen s such as ibuprofen or ketoprofen [19,20]. Th e in teraction of Un iversitaire (CHU, Sain t-Den is, La Réun ion ). Th e procedures an d
drugs w ith album in can be affected by m odification s of th e protein th e collection of h um an m aterials w ere approved by th e local
such as glycation or oxidation [21,22]. Several reports h ave foun d govern m en tal Fren ch Eth ical Com m ittee. Th e album in w as purified
th at th e m ain glycation reaction s occur n ear both Sudlow sites usin g pooled serum from 39 diabetic (%HbA1C ¼ 11.0  1.9) an d 14
[23,24]. But con flictin g results h ave been reported on th e im pact of n on -diabetic (% HbA1C ¼ 5.5  0.4) patien ts. Pool of diabetics
th e glycation of album in on its affin ity to several drugs in cludin g in cludes patien ts w ith both types of diabetes. Patien ts w ith
w arfarin [11,25e 27]. Th ese con tradictory fin din gs h ave resulted a h em oglobin abn orm ality an d/or hyperleukocytosis w ere
from several differen ces in : th e m ode of album in purification , th e excluded from th e pool of plasm a. All biological data related to both
w ay th at in vitro glycation is perform ed, an d th e m eth ods used for pools are given in Table 1.
th e m easurem en t of ligan d bin din g. Th ese previous studies h igh - Th e purification of serum album in from fresh h um an plasm a
ligh t th e im portan ce of h avin g accurate kn ow ledge of th e prepa- w as based on exten sive dialysis again st Tris/HCl (pH 7.4; 50 m M)
ration of in vitro glycated album in m odels an d th e n ecessity of follow ed by affin ity ch rom atography usin g Cibacron Blue 3G lin ked
usin g an in vitro m odel of album in w ith bioch em ical ch aracteristics to agarose (Am ersh am cat# 17-0948-01) as a ligan d for th e album in .
typical of th ose expected of serum album in in diabetes. A NaCl (pH 7.4; 1.5 M) buffer w as used for th e desorption of boun d
Few studies h ave reported th e bin din g affin ities of album in album in from Cibacron Blue-agarose follow in g th e elution of oth er
in vivo , in case of ch ron ic hyperglycem ia, for m any th erapeutic drugs. plasm a protein s w ith a Tris/HCl (pH 7.4; 50 m M) buffer. Each
Regardin g th ese previous fin din gs, th e drug-bin din gs properties of fraction of eluate w as exam in ed by gel electroph oresis an d th e
in vitro glycated album in m odels sh ould be investigated an d m ost purified an d con cen trated extracts w ere pooled before th e
com pared w ith glycated album in from diabetic patients. This drug- rem ain in g im m un oglobulin s w ere rem oved w ith seph arose-
bin din g study should be perform ed on three differen t in vitro gly- protein A, follow ed by exten sive dialysis again st PBS an d th en
cation m odels. Tw o of th em , w h ich are com m on glycated album in storage at 80  C.
m odels, are considered controversial an d use suprapathological
concentration s of glucose (10 0 m M) or m ethylglyoxal (10 m M). The
th ird m odel, w h ich uses a path ological concentration of glucose 2.3. Prepa ra tion of in vitro glyca ted HSA
(25 m M), is m ore typical of diabetic album in . The bin din g param eters
of th ese in vitro m odels sh ould be com pared w ith n ative an d diabetic Advan ced glycation en d products (AGE) w ere prepared as
HSA. Tw o th erapeutic drugs w ere selected for th is study. Warfarin , an previously described [28] by in cubatin g 0.37 m M purified HSA from
an ti-coagulan t drug, an d ketoprofen (Fig. 1), a n on-steroidal an ti- a n on -diabetic pool (HSA-ND) w ith out an d w ith glucose (25 m M or
inflam m atory drug w ith an algesic an d an tipyretic effects, w ere 10 0 m M) in PBS, pH 7.4, un der sterile con dition s, at 37  C for 3
ch osen as site-selective probes for Sudlow sites I an d II, respectively. w eeks, or w ith m ethylglyoxal (10 m M) for 2 days. Th e protein s
The aim of th is study is to iden tify differences betw een in vitro an d
in vivo m odified album in m odels th rough th e determ ination of their
Tabl e 1
bin din g properties for tw o probes. The w arfarin an d ketoprofen Clin ical an d bioch em ical ch aracteristics of diabetic an d n on -diabetic patien ts an d
bin din g ch aracteristics obtain ed for our different album in prepara- plasm a sam ples.
tion s, by usin g h igh -perform an ce liquid ch rom atography an d fluo-
Com poun ds Non diabetic (ND) Diabetic (D)
rescence spectroscopy, as w ell, could provide a better know ledge of
N (fem ales) 14 (7) 39 (16)
album in structural m odification s durin g its glycation process. Age 33  9 51.5  20.1**
HbA1c (%) 5.5  0.4 11.0  1.9***
2. Mat er i al and m et hods Fructosam in es (n g/m L) 218.3  10.9 390.0  131.5***
Creatin in (mm ol/L) 89.8  12.3 88.0  16.2
Album in (g/L) 46.4  2.6 38.8  5.5***
2.1. Chem ica ls a nd rea gents
Total protein (g/L) 73.8  4.0 67.7  7.7**
CRP (m g/L) 2.6  2.5 7.0  8.0*
Aqueous m ethylglyoxal solution s (40%), D-glucose, an ti- Ch olesterol (m m ol/L) 4.6  0.7 4.5  1.3
din itroph enyl hydrazin e (DNPH) an tibody, th e 3,3 0 ,5,5 0 -tetra- Triglycerides (g/L) 0.9  0.4 1.6  1.0***
m ethyl-ben zidin e liquid substrate (TMB) system for ELISA, w arfarin Data are expressed as m ean s  SD an d w ere com pared usin g th e Studen t’s t test for
an d ketoprofen w ere all purch ased from Sigm a. un paired sam ples; ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.
1962 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967

w ere dialyzed again st PBS, sterile-filtered th rough a 0.2 mm Milli- residue (Trp-214). Differen t series of assay solution s w ere prepared
pore filter an d stored at 80  C. by m ixin g 10 mM of n ative or diabetic HSA w ith w arfarin or keto-
profen at variable con cen tration s ran gin g from 5 to 70 mM. Each
2.4. Structura l a na lysis of m odified a lbum ins solution w as h eated for 5 m in at 37  C an d tran sferred in to a quartz
cell. Th e fluorescen ce spectra w ere recorded in th e ran ge of
Fructosam in e an d ketoam in e derivatives, useful in dex of dia- 250e 50 0 n m un der excitation at 283 n m . Th e bin din g param eters
betic con trol, w ere determ in ed usin g th e m eth od developed by ( i.e. th e bin din g con stan t KA an d th e bin din g site n um ber n ) for both
Joh n son et al. [29] w ith th e n itroblue tetrazolium (NBT) reagen t. drugs w ere obtain ed from th e equation given below [37]:
Th e th iol groups in n ative, m odified album in w ere m easured by
Ellm an ’s assay usin g 5,5 0 -dith iobis-(2-n itroben zoic acid) (DTNB) ðF0 FC Þ
log ¼ log KA þ n log½CŠ
[30], w h ich w as w ell described in a previous study [31]. FC
Th e 2,4,6-trin itroben zen esulfon ic acid (TNBS) assay is a sen si- w h ere F0 an d FC are th e tryptoph an fluorescen ce in ten sities in th e
tive m eth od for determ in in g th e prim ary free am in o groups in absen ce an d presen ce of a drug at con cen tration [C], respectively,
protein s [32]. Th is m eth od w as described in detail in a previous an d KA is th e form ation con stan t of th e com plex form ed betw een
study by our group [33]. Th e degree of carbonylation of glycoxi- th e drug an d album in , expressed as L/m ol.
dized album in w as determ in ed by th e carbonyl ELISA assay based
on th e recogn ition of protein -boun d DNPH in carbonylated protein s
w ith an an ti-DNP an tibody. Th is m eth od w as described in detail in 2.7. Sta tistica l a na lysis
previous studies by our group [33,34].
Th e data are expressed as th e m ean s  stan dard deviation (SD)
2.5. Affinity study: experim enta l design for the HPLC m ethod from a m in im um of th ree experim en ts. Statistical sign ifican ces
w ere determ in ed usin g on e-w ay ANOVA (follow ed by th e Studen t’s
Th e experim en tal design for th is study drew its in spiration from t test) for m ultiple com parison s; a p value of less th an 0.05 w as
a w ork con ducted by Olsen about th e drug-bin din g capacity of required for sign ifican ce.
ph arm aceutical grade album in s [35], an d is described below.
Stock solution s of w arfarin (10 0 m M) an d ketoprofen (10 0 m M) 3. Resul t s
w ere prepared in NaOH (0.1 M). A stan dard ran ge of con cen tration s
from 0.01 to 2 m M w as prepared from th ese stock solution s in PBS 3.1. Biochem ica l cha ra cteriza tion of the glyca ted HSA sa m ples
1X, for both drugs.
Th e sam ples w ere prepared in Eppen dorf tubes, w h ere Th ree in vitro m odels of glycated album in w ere prepared an d
150 n m ol of protein s of differen t album in sam ples w ere in cubated com pared w ith n ative an d in vivo diabetic album in . Th e HSA-NDG25
at 37  C, for 30 m in w ith 60, 80, 10 0, 120, 130, 140, 150, 160, 150 0 an d HSA-NDG10 0 m odels w ere prepared w ith 25 m M an d 10 0 m M
an d 30 0 0 n m ol of w arfarin or ketoprofen . After in cubation , th e of glucose, w h ile th e HSA-NDMGO m odel correspon ded to HSA
fraction s of free drugs an d drugs boun d to album in w ere separated in cubated w ith 10 m M of m ethylglyoxal, a side-product of differen t
by ultrafiltration usin g th e Am icon Ó Ultra system (Millipore) an d m etabolic path w ays, such as th e degradation process of glucose.
cen trifugation for 20 m in at 13,0 0 0 rpm . Th e percen tage of free Th e group of Th orn alley h as sh ow n th at physiological glycation
drug fraction s recovered usin g th is m eth od w as about 93%(2.1). processes also in volve th e m odification of protein s by reactive a -
Then, th e unbound (free) drug concentrations w ere determ ined oxoaldehydes such as m ethylglyoxal. Th ese derivatives could also
by h igh perform an ce liquid ch rom atography (HPLC), coupled to a UV be form ed durin g glucose-in duced protein glycation [38]. At th e
spectroph otom eter. A solution of acetonitrilee Trise HCl (pH 7.4; first step of glycation process, glucose m odification of album in
50 m M) (35:65, v/v) w as used as th e m obile phase, delivered at a flow gives rise to th e form ation of fructosam in e w h ile m ethylglyoxal
rate of 1 m L/m in in a LiCh rosph er 100 RP-18 colum n (250  4.6 m m in duces th e gen eration of an oth er ketoam in e derivative n am ed as
i.d., s-5, 5 mm ) (Merck, Darm stadt, Germ any) at 30  C. The pum p w as early glycation product.
m ain tain ed at 147 bars an d th e an alysis w as perform ed on 50 mL of As sh ow n in Table 2, th e glycated album in obtain ed un der
each sam ple. The m easurem en ts took place at 254 n m . typical hyperglycem ia con dition s (HSA-NDG25 ) h ad a low er level of
ketoam in e, of 5.07 (0.35) m ol/m ol HSA, th an th e oth er in vitro
2.6. Affinity study: experim enta l design of the fluorescence glycated album in m odels. Th ese album in m odels w ere prepared
spectroscopy m ethod w ith suprapath ological con cen tration s of glucose (HSA-NDG10 0 ) or
m ethylglyoxal (HSA-NDMGO) an d con tain ed 12.43 (1.88) an d 9.25
Th is m eth od is based on th e quen ch in g of album in fluorescen ce (1.46) m ol of ketoam in e/m ol HSA, respectively. If its ketoam in e
in duced by its in teraction w ith drugs [36]. Th e in trin sic fluores- level is sign ifican tly h igh er (2.13  0.58 m ol) th an th at of n ative
cen ce of h um an album in is m ain ly attributed to th e tryptoph an album in (HSA-NDG0 ) (1.11  0.12 m ol), diabetic HSA (HSA-D) h as

Tabl e 2
Oxidation param eters in various album in preparation s.

Meth ods Ketoam in e/HSA (m ol/m ol) Th iols/HSA (m ol/m ol) Free am in o groups/HSA (m ol/m ol) Carbon yl rate in crease (%/con trol)
Purified HSA-ND
HSA-NDG0 1.11  0.12 0.609  0.013 13.36  0.98 100.00  7.35
HSA-NDG25 5.07  0.35*** 0.333  0.067** 12.44  0.83 111.42  10.89
HSA-NDG100 12.43  1.88*** 0.286  0.011*** 10.42  0.20** 224.84  13.93***
HSA-NDMGO 9.25  1.46*** 0.250  0.026*** 5.10  0.54*** 455.67  69.68***
Purified HSA-D
HSA-DG0 2.13  0.58* 0.307  0.012*** 10.38  0.80* 95.66  3.90**

1) Ketoam in e levels obtain ed w ith th e NBT assay; 2) free th iol group con ten t as assessed by Ellm an ’s m eth od; 3) prim ary am in o group con ten ts in protein s by th e TNBS assay;
4) percen tage carbon yl rate as assessed by th e ELISA carbon yl assay. All data are expressed as m ean s  SD from th ree in depen den t experim en ts.
Effect of glycation or diabetes on purified HSA (vs. HSA-NDG0 ); ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967 1963

a very low level of glycation in com parison to HSA-NDG25 . Th e


relatively low er ketoam in e level of HSAMGO, in com parison to HSA-
NDG10 0 could be explain ed by a h igh er reactivity of m ethylglyoxal,
w h ich gives rise to a m ore rapid form ation of AGE.
Several oxidative param eters in th ese album in preparations are
also reported in Table 2. As expected, th e levels of free th iol an d
am in o groups sign ifican tly decreased in album in w ith in vitro gly-
cation by glucose or m ethylglyoxal an d in vivo glycation , w h ereas
th e carbonyl level in creased, except in diabetic album in . Th e
un expected h igh er carbonylation level for HSA-NDG0, in com par-
ison w ith diabetic album in , could be partially explain ed by th e 3
w eeks in cubation of n ative HSA at 37  C (diabetic album in did n ot
un dergo th is in cubation step). Durin g th is in cubation tim e, oxida-
tion process could occur.
Th is oxidative state w as m ore m arked in th e case of
m ethylglyoxal-m odified HSA. Sim ilarly, th e rate of in crease of
carbonyl, attributed to th e en h an ced oxidation of album in w ith
in vitro m odification , w as m ore m arked w ith m ethylglyoxal th an
w ith glucose. As expected, th e oxidative param eters observed for
diabetic HSA correspon ded to th ose obtain ed for album in m odified
w ith 25 m M of glucose. Both types of album in displayed quite
sim ilar global n et ch arges, as attested by th e electroph oretic
m igration profile in n ative page electroph oresis (data n ot sh ow n ).

3.2. Binding of both drugs to glyca ted a lbum ins

As sh ow n in Fig. 2a an d b, w arfarin an d ketoprofen w ere h igh ly


boun d to n ative h um an album in w ith un boun d drug fraction s of 3.9
an d 2.7%, respectively. As n oticed for both drugs, th e free fraction s
w ere h igh er for both in vitro an d in vivo glycated album in s. Th is
in crease, w h ich w as m ore m arked for HSA-NDMGO, w as by
approxim ately eigh t an d seven tim es for w arfarin an d ketoprofen ,
w h ereas th e diabetic album in exh ibited a free drug fraction of
aroun d tw ice h igh er as w ell for w arfarin (7.3%) as for ketoprofen
(5.4%) in com parison w ith n ative album in .
Hum an album in , glycated or n ot, h as a low er affin ity for keto-
profen th an for w arfarin . Deeper an alyses w ere perform ed to Fi g. 2. Percen tage of un boun d w arfarin an d ketoprofen con cen tration s in various
album in preparation s. All data are expressed as m ean s  SD from th ree in depen den t
obtain m ore in form ation on th e bin din g param eters for differen t
experim en ts. *Effect of glycation or diabetes on purified HSA (vs. HSA-NDG0 );
glycated HSA sam ples w ith both drugs. Fig. 3 sh ow s th e results of ***p < 0.0 01, *p < 0.05.
th e bin din g studies, in a Scatch ard plot form , at various con cen -
tration s of w arfarin (Fig. 3a) an d ketoprofen (Fig. 3b) w ith HSA-
NDG0 , HSA-NDMGO, an d HSA-D. Th e Scatch ard plot w as perform ed an d w arfarin ( Kd ¼ 11.74 mm ol/L). Th is partial loss of affin ity w as n ot
over a ran ge of drug con cen tration s, givin g an r value (m ol n um ber accom pan ied by an in crease in th e n um ber of bin din g sites (aroun d
of boun d drug per m ol of album in ) of betw een 0.4 an d 1.1, corre- 1.3 for both drugs).
spon din g to th e specific bin din g study. As seen in Fig. 3, th e drug-
bin din g yielded straigh t lin es w ith correlation coefficien ts ( r ) above 3.3. Binding of both drugs to in vivo glyca ted a lbum in
0.985, w h ich could in dicate th e n um ber of specific bin din g sites ( n )
an d th e dissociation con stan t ( Kd ). Th ese bin din g param eters for In order to strength en th e previous fin din gs, th e in teraction s
w arfarin an d ketoprofen are sum m arized in Table 3. Th e sm aller is betw een w arfarin an d ketoprofen an d th e n ative an d diabetic HSA
th e dissociation con stan t, th e stron ger is th e bin din g betw een th e w ere also in vestigated usin g an altern ative m eth od based on
ligan d (drug) an d th e receptor (album in ). As observed for previous fluorescen ce quen ch in g. Fluorescen ce quen ch in g corresponds to
un boun d drug results, album in exerted a h igh er affin ity for keto- a process th at reduces th e in ten sity of fluorescen ce. As sh ow n in
profen ( Kd ¼ 6.98 mm ol/L) th an for w arfarin ( Kd ¼ 9.52 mm ol/L). th e fluorescen ce em ission spectrum of Fig. 4a an d b, th e m axim um
Th ese results also sh ow ed sign ifican t variation s betw een n ative fluorescen ce in ten sity of n ative album in at 337 n m , attributed to
HSA an d in vitro or in vivo glycated HSA. For both drugs, an in crease tryptoph an , decreased w ith in creasin g con cen tration s of w arfarin
in Kd values w as observed w ith th e in vitro glycation of album in , an d ketoprofen . Both drugs acted as quen ch ers via in teraction s
w h ich w as m ore m arked for HSA-NDMGO, in dicatin g a loss of w ith th e protein . How ever, th e m axim um tryptoph an em ission
affin ity. Th e bin din g affin ity for w arfarin w as reduced, accordin g to w avelen gth of aroun d 337 n m for n ative HSA w ith out drugs (th ick
an in crease in Kd values an d th e n um ber of bin din g sites (betw een lin es) w as n ot affected in th e presen ce of w arfarin or ketoprofen .
1.55 an d 2.80). In con trast, th e bin din g affin ity for ketoprofen w as Th e log plots ((F0 FC)/ FC) of HSA-NDG0 an d HSA-D versus drug
affected, w ith glycation , but w ith out sign ifican t ch an ges in th e con cen tration (log [C]) are sh ow n in Fig. 5a for w arfarin an d Fig. 5b
n um ber of bin din g sites (betw een 1.43 an d 1.67). Sim ilar to in vitro for ketoprofen . Th ese plots exh ibit a good lin earity w ith th e
glycated album in , but to a lesser exten t, in vivo glycated album in correlation coefficien ts ( r ) above 0.986 (Table 4). Th e n um bers of
from diabetic patien ts h ad a low er affin ity for both drugs w ith bin din g site n an d th e bin din g con stan ts KA, listed in Table 4 for
elevated dissociation con stan ts for ketoprofen ( Kd ¼ 9.98 mm ol/L) w arfarin an d ketoprofen , w ere calculated usin g th ese plots. Th e
1964 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967

Fig. 3. Scatch ard plots of w arfarin an d ketoprofen in various album in preparation s.


Scatch ard plot of: (a) w arfarin an d (b) ketoprofen bin din g in n ative h um an album in HSA-
NDG0 ( - ), in vitro glycated album in HSA-NDMGO (A ) an d diabetic album in HSA-D (C ). Fi g. 4. Effects of w arfarin an d ketoprofen on th e fluorescen ce em ission sp ectrum of
n ative HSA (HSA-NDG0 ). Native album in at 10 mM w as in cubated w ith out (th ick curve)
an d w ith differen t con cen tration s of (a) w arfarin an d (b) ketoprofen of betw een 5 an d
bin din g site n correspon ds to th e slope an d log KA to th e in tercept. 70 mM at 37  C for 5 m in .

Th e bin din g con stan t relative to n ative HSA w ith ketoprofen


( KA ¼ 6.15  10 6 L/m ol) is h igh er th an th e on e calculated for
Th ese bin din g site n um bers are listed in Table 4 an d are quite
w arfarin ( KA ¼ 2.23  10 6 L/m ol), as w as foun d w ith th e HPLC
sim ilar to th ose obtain ed by th e HPLC m eth od.
m eth od. In com parison to th e n ative HSA, a decrease in th e bin din g
con stan t of diabetic album in can be observed, w h ich dropped
con siderably w ith both w arfarin (120 tim es low er) an d ketoprofen 4. Di scussi on
(20 0 tim es low er). Th ese results suggest a partial loss in th e affin ity
of diabetic album in for both drugs, w h ich w as con firm ed by th e Un con trolled hyperglycem ia in severely diabetic patien ts is th e
reduced n um ber of bin din g sites to aroun d n ¼ 1.03 ( n ¼ 1.08) w ith m ain cause of th e advan ced glycation process of plasm a protein s
th e in vivo glycation of w arfarin (ketoprofen ) in com parison to th e such as h em oglobin an d album in . Th ese glycation -in duced struc-
n ative album in , w h ich h ad aroun d n ¼ 1.44 ( n ¼ 1.55) bin din g sites. tural an d fun ction al ch an ges in album in are of particular in terest
because n um erous in vivo studies h ave reported th e strong
in volvem en t of glycated album in in th e developm en t an d
Tabl e 3 progression of ch ron ic diabetic com plication s [2,3]. Furth erm ore,
Bin din g param eters of w arfarin an d ketoprofen in various album in preparation s. th is en h an ced glycation process could poten tially con tribute to an
Dissociation con stan t Kd (mm ol/L) Specific bin din g sites (n )
alteration of th e bin din g properties of album in for m any drugs,
w ith a con sequen t ch an ge in th e ph arm acokin etic an d ph arm aco-
W arfarin Ketoprofen W arfarin Ketoprofen
dyn am ic properties of th ese drugs. Th ere are several causes for th e
Purified HSA-ND decreased bin din g of album in , such as h igh con cen tration s of bili-
HSA-NDG0 9.52  0.57 6.98  1.49 1.55  0.14 1.43  0.1
HSA-NDG25 13.3  1.64** 6.65  2.19 1.60  0.02 1.49  0.02
rubin or free fatty acids, w h ich can displace drugs from th e bin din g
HSA-NDG100 24.0  4.14*** 14.3  5.07* 1.99  0.06 2.10  0.07 sites of album in , or also hypoalbum in em ia [39]. Th is w ay, glycation
HSA-NDMGO 120  24.1*** 58.5  4.57*** 2.80  0.04 1.67  0.13 is on e of several m ech an ism s th at could in duce an in crease in
Purified HSA-D un boun d circulatin g fraction s of m any album in -boun d drugs. Th e
HSA-DG0 11.74  1.46* 9.98  1.86* 1.31  0.1 1.35  0.1
un boun d drug, w h ich is con sidered to be ph arm acologically active,
Th e bin din g studies w ith w arfarin an d ketoprofen w ere perform ed w ith 0.5 m M appears to be respon sible for dose-related th erapeutic effects an d
album in sam ples. Th e bin din g param eters: specific bin din g site ( n ) an d dissociation also th e adverse drug reaction s. Glycation , in th e diabetic con text,
con stan t Kd w ere calculated accordin g to Scatch ard. All data are expressed as
m ean s  SD from four or five in depen den t experim en ts.
could in duce an alteration in th e ph arm acological properties of
Effect of glycation or diabetes on purified HSA ( vs. HSA-NDG0 ): ***p < 0.001, album in for m any drugs associated w ith adverse con sequen ces.
**p < 0.01, *p < 0.05. Th is effect of glycation on album in affin ity could be m ore relevan t
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967 1965

on th e in teraction betw een album in an d w arfarin . For in stan ce, in


on e study, th e affin ity of w arfarin for th e bin din g site I w as sh ow n
to be un affected in th e case of h um an album in glycated w ith
glucose (2 m ol glucose/m ol album in ) [22], w h ereas a decrease in
bin din g w ith early stage glycated album in , w h ich w as attributed to
con form ation al ch an ges or to steric h in dran ce of th e protein , w as
reported in oth er studies [40,41]. In con trast, an excessive glycation
(60 days) of album in w ith a large am oun t of glucose (9 m ol glucose/
m ol album in ) w as sh ow n to en h an ce w arfarin bin din g to
recom bin an t album in [26]. On ly a few studies h ave focused on th e
drug-bin din g properties of in vivo glycated HSA.
In th is study, w e first ch aracterized our differen t glycated
album in m odels ( in vitro an d in vivo ) by ch eckin g th eir redox status
via th eir th iol an d carbonyl con ten ts an d by assessin g th e glycation
level th rough ketoam in e an d TNBS assays. Th en , w e in vestigated
th e in teraction betw een tw o th erapeutic drugs an d m odified
album in m odels by usin g tw o com pletely differen t tech n iques.
Th ree in vitro glycation m odels w ere ch aracterized an d
com pared w ith un m odified album in (n ative) an d in vivo glycated
album in purified from a pool of plasm a from diabetic patien ts w ith
very h igh glycated h em oglobin levels (HbA1C ¼ 11.0%  1.9). Th e
HSA-NDG25 m odel, prepared usin g path ological con cen tration s of
glucose, closely reflects th e con dition s foun d in diabetes, w h ereas
HSA-NDG10 0 an d HSA-NDMGO are w idely used m odels th at greatly
differ from th is path ological con dition . As expected, both
suprapath ological glycation m odels displayed a con siderable level
of glycation associated w ith an in creased oxidative state.
Furth erm ore, com pared to th e data obtain ed for in vivo glycated
HSA (HSA-D), in vitro glycated HSA w ith 25 m M of glucose (HSA-
NDG25 ) appeared to be th e m ost relevan t in vitro m odel for
m im ickin g hyperglycem ia or th e diabetes m odel. How ever, our
in vivo glycated album in rem ain ed th e m ost suitable m odel for
drug-bin din g studies.
Fig. 5. Th e log plots (( F0 FC)/ FC) vs. log [C] for w arfarin an d ketoprofen bin din g w ith
n ative an d diabetic album in . F0 an d FC are th e tryptoph an fluorescen ce in ten sities of
Th e affin ity of album in for both th erapeutic drugs w as also
n ative album in , HSA-NDG0 ( - ) an d diabetic album in , HSA-D (C ) in th e absen ce an d evaluated w ith th e h elp of bin din g param eters (dissociation
presen ce of (a) w arfarin or (b) ketoprofen at differen t con cen tration s [C]. con stan t an d th e n um ber of bin din g sites) an d th e determ in ation of
free drug con cen tration s. Th e un boun d fraction s of w arfarin an d
ketoprofen w ere m easured by HPLC after ultrafiltration . An alter-
for drugs th at are h igh ly boun d (> 95%) to album in an d h ave a low n ative w ould h ave been to perform an equilibrium dialysis in stead
th erapeutic in dex, such as w arfarin . Warfarin is an an ti-coagulan t of ultrafiltration in order to recover th e un boun d drug fraction .
w ith a very low th erapeutic in dex, w h ich could trigger severe Lagran ge et al. reported th at both experim en tal m odes gen erated
h em orrh agin g if th e correct degree of its ph arm acological effect is quite sim ilar data in th e bin din g capacity of ketoprofen for HSA [20].
n ot m ain tain ed. In con trast to w arfarin , ketoprofen , a com m on Alth ough th e experim en tal con dition s used in our study w ere
m edication for th e treatm en t of in flam m ation or pain , h as a w ide quite sim ilar to th ose used by Olsen et al. [35], th ere w ere som e
th erapeutic in dex. Major studies focused on th e im pact of glycation differen ces in th e results obtain ed for th e in teraction betw een
on th e bin din g properties of album in for th erapeutic drugs w ere n ative HSA an d w arfarin . In deed, th e free fraction of w arfarin w as
exclusively based on in vitro m odels of glycation , w h ich do n ot five tim es h igh er (3.9%) th an foun d by Olsen et al. in purified
n ecessarily m eet th e biological con dition s expected in th e con text h um an album in (0.7%). Th is differen ce could be attributed to th e
of diabetes. Moreover, am on g th ese n um erous studies, som e of m ode of purification of album in in our study. After th e ch rom ato-
th em h igh ligh ted con flictin g fin din gs about th e effect of glycation graph ic purification an d im m un oglobulin rem oval steps, our
album in sam ples w ere n ot defatted. Free fatty acids can reduce th e
bin din g affin ity of album in w h en th ey are boun d to album in .
Tabl e 4 Besides th is, th e presen t study dem on strated th at th e in crease in
Bin din g param eters of w arfarin an d ketoprofen in n ative an d diabetic album in free drug fraction s foun d for w arfarin an d ketoprofen w ith th e
preparation s obtain ed by spectroscopy. glycation process w as in agreem en t w ith th e bin din g param eter
Bin din g con stan t Bin din g Correlation values obtain ed by th e Scatch ard m eth od. In parallel w ith an eigh t-
KA (L/m ol) sites ( n ) coefficien t ( r ) fold in crease in th e free w arfarin fraction for th e HSA-NDMGO m odel
Wa rfa rin ( vs. n ative HSA), th ere w as an eleven -fold decrease in th e stren gth
HSA-NDG0 2.23  10 6 1.44  0.10 0.988 of th is bin din g, as in dicated by th e dissociation con stan t values. Th e
HSA-DG0 1.77  10 4 1.03  0.07 0.986
sign ifican t decrease in bin din g for th e m ost in vitro glycated albu-
Ketoprofen
HSA-NDG0 6.15  10 6 1.55  0.05 0.995 m in s could be explain ed by th e m ajor structural ch an ges in HSA
HSA-DG0 2.97  10 4 1.08  0.03 0.989 after glycation . In particular, th e tertiary structure con form ation , as
Th e bin din g studies of w arfarin an d ketoprofen w ere in vestigated w ith 10 mM
detected by tryptoph an fluorescen ce, w as sign ifican tly affected by
album in sam ples. Th e bin din g param eters: bin din g site n um ber (n ) an d bin din g glycation (data n ot sh ow n ). Th is structural m odification h as been
con stan t KA w ere calculated as described in th e Materials an d m eth ods section . sh ow n to be accom pan ied by a partial open in g of hydroph obic
1966 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967

pockets, as detected by 1-an ilin on aph th alen e-8-sulfon ate (ANS) static quen ch in g m ode th ere is a groun d state form ation of a n on -
fluorescen ce [42], am on g w h ich are hydroph obic cavities in th e fluorescen ce com plex betw een th e fluoroph ore an d th e quen ch er.
subdom ain s IIA an d IIIA of album in , w h ere Sudlow sites I an d II are In th e dyn am ic quen ch in g m ode, follow in g th e collision of
located. As expected, th e glycation of album in un der con dition s a quen ch er durin g th e lifetim e of th e exited state, th e fluoroph ore
th at m ost closely resem ble th ose th at occur in th e blood durin g return s to groun d state, w ith out th e em ission of ph oton s. Previous
hyperglycem ia led to few er ch an ges in th e bin din g of both drugs studies reported th at th e quen ch in g m ech an ism of HSA by keto-
com pared to th e suprapath ological m odels. Th e reduced affin ities profen or w arfarin w as due to com plex form ation in th e static m ode
for w arfarin an d ketoprofen observed in th ese latter glycation rath er th an by dyn am ic collision [36,50].
m odels featured con form ation al ch an ges in th e Sudlow bin din g In th e presen ce of ketoprofen or w arfarin , a quen ch in g of
sites I an d II, respectively. Th ese im pairm en ts, w h ich occurred tryptoph an fluorescen ce occurred for both n ative an d diabetic
durin g th e glycation process, resulted in an in creased bin din g site album in w ith out any sh ift in th e m axim um em ission w avelen gth .
n um ber. Results in th e literature h ave reported th at w arfarin an d Th is result suggests com plex form ation betw een th e drugs an d
ketoprofen on ly bin d to on e h igh ly specific bin din g site (Sudlow album in , in volving ch an ges in th e m icroenviron m ent aroun d
sites I an d II, respectively) [16]. In th is study, specific bin din g site tryptoph an . Furth erm ore, w e foun d th at th e bin din g con stan t
values of betw een 1.43 an d 1.55 w ere calculated, in dicatin g th e relative to n ative HSA w ith ketoprofen ( KA ¼ 6.15  10 6 L/m ol) w as
existence of a secon dary bin din g site w ith a low er affin ity. Several m arkedly h igh er th an th e on e calculated ( KA ¼ 1.17  10 4 L/m ol) in
auth ors h ave suggested th e existen ce of a secon dary bin din g site a recen t study by Bi et al. [36]. Th ough th e experim en tal con dition s
for w arfarin [43,44] an d ketoprofen [20]. Th e in crease in th e w ere quite sim ilar to th ose in our study, th is large differen ce could
n um ber of bin din g sites for h igh ly glycated album in could in dicate be explain ed by th e use of com m ercial HSA by th is group in stead of
a displacem en t of drugs from th eir ch an ged prim ary bin din g sites fresh , purified album in from plasm a. In previous studies w e
to bin din g sites w ith a low er specificity. In a recen t study, w e reported th at com m ercial album in is often m ore oxidized th an
sh ow ed th at album in tertiary structure of album in w as m ore fresh , purified album in [28,45]. Oxidation is on e of several delete-
affected by m ethylglyoxal-in duced glycation th an by glucose [45]. rious effects th at could im pact on th e bin din g properties of plasm a
We observed a drastic alteration in album in tertiary structure protein s [21].
associated w ith ch an ge in th e protein hydroph obicity. Th is alter- Usin g th is m eth odology, w e focused on th e differen ces in th e
ation could im pair affin ity of th e Sudlow site I for w arfarin in in teraction betw een drugs an d n ative album in an d diabetic
album in an d could lead to form ation of a n ew un specific bin din g album in by assessin g th e n um ber of bin din g sites an d th e affin ity
site h avin g low affin ity. con stan t. In accordan ce w ith th e bin din g results calculated in th e
Moreover, regardin g diabetic album in , our study h igh ligh ts Scatch ard m eth od, th e in vivo glycated album in affin ities appeared
in terestin g fin din gs. In deed, th e specific bin din g of w arfarin w as to be sign ifican tly an d con siderably im paired. In deed, a reduction
sign ifican tly reduced in diabetic album in an d w as quite sim ilar to in th e bin din g con stan t associated w ith a low er n um ber of bin din g
th e glycation m odel m ost typical of th e con dition s in diabetes sites w as foun d for diabetic album in . Fin ally, th e h igh er affin ity of
(HSA-NDG25 ). Th is partial loss of affin ity w as con firm ed by a h igh er album in for ketoprofen com pared to w arfarin , as determ in ed by
free w arfarin fraction , w h ich w as m ore m arked for diabetic fluorescen ce spectroscopy, w as in agreem ent w ith th e results
album in . Th is dow nw ard trend w as also foun d for ketoprofen , obtain ed by th e HPLC m eth od (Table 2).
except for HSA-NDG25 , w h ich did n ot sh ow a sign ifican t differen ce Th e presen t study dem on strated th e reduced bin din g capacity
to n ative album in w ith respect to th e bin din g properties. Th us, of glycated h um an album in for w arfarin an d ketoprofen , w h ich
th ese results are in agreem ent w ith a m arked in crease in th e free w ere used as probes for th e m ain drug-specific sites of th is protein .
fraction s of both drugs, w h ich w ere n early doubled betw een th e Th ese results could provide supplem en tary in form ation about th e
diabetic an d n ative album in . It could be hypoth esized th at, in th e im pact of glycation on ch an ges in th e structure of album in ,
case of diabetes, th is m in or loss in affin ity could sign ifican tly particularly aroun d both Sudlow sites. Moreover, th e relevan t
im pact th e biological respon ses of m any drugs h igh ly boun d to fin din gs obtain ed for glycated album in an d, in particular, for th e
album in such as w arfarin or ketoprofen . Up to n ow, n o study h as in vivo glycated album in , em ph asize th e im portan ce to assess th e
establish ed any clin ical relevan ce for th is hypoth esis in h um an biological respon se of m any drugs in diabetic path ology. Th is could
ph arm acology con text. Warfarin con stitutes a drug exh ibitin g be of utm ost im portan ce for th erapeutic drugs h igh ly boun d to
n arrow th erapeutic w in dow an d im portan t in ter-in dividual an d album in an d w ith n arrow th erapeutic in dex, such as w arfarin
in ter-eth n ic differen ces in th e dose required for its an ticoagulation w h ose dosin g adjustm en t rem ain s ch allen gin g in path ological
effect [46]. Th e m ain factors (40%) con tributin g to th is in ter- con text.
in dividual variation rem ain un kn ow n [47]. Th erefore, it is at
utm ost im portan ce to determ in e th e con tribution of album in Aut hor cont r i but i ons
m odification s in th ese factors.
Th e effect of glycation on th e in teraction betw een both drugs J.B.V. researched data, con tributed discussion , review ed m an u-
an d album in w as determ in ed usin g th e fluorescen ce quen ch in g script. A.G.D. research ed data, con tributed discussion , review ed
techn ique. Th e in teraction of w arfarin or ketoprofen w ith album in m an uscript. E.B. con tributed discussion , review ed m an uscript. P.R.
m olecules leads to a quen ch in g of tryptoph an fluorescen ce. Th ere researched data, w rote, review ed an d edited m an uscript.
are m any reason s to accoun t for such quen ch in g, in cludin g
m olecular rearran gem en t or a ch an ge in th e m icroen viron m en t Ack now ledgem ent s
aroun d tryptoph an as a result of an un foldin g process. For in stan ce,
th e glycation process of album in leads to a quen ch in g of tryptoph an Th is w ork w as supported by th e Min istère de l’En seign em en t
fluorescen ce, as reported in n um erous studies [9,33,45]. It can be Supérieur et de la Rech erch e, th e Min istère de l’Outre-Mer, th e
n oted th at th e sole tryptoph an residue of h um an album in is located Con seil Région al de La Réun ion an d Europe, th e Un iversité de La
in subdom ain IIA n ear Sudlow site I [48]. In th ese in teraction s Réun ion an d th e fédération Environ nem en t Biodiversité San té-
betw een th e quen ch er (w arfarin or ketoprofen ) an d th e fluo- FED4126. Th e correspon din g auth or particularly ackn ow ledges Dr
roph ore (album in ), fluorescen ce quen ch in g can occur via tw o Bertran d Payet of LCSNSA for h is valuable advice con cern in g HPLC
differen t m ech an ism s: static an d dyn am ic, respectively [49]. In th e tech n iques.
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967 1967

Ref er ences serum album in as revealed by recom bin an t m utan ts, Bioch im . Bioph ys. Acta
1623 (2003) 88e 97.
[27] N. Okabe, T. Nakasaka, Drug bin din g properties of glycosylated bovin e serum
[1] P. Ron deau, E. Bourdon , Th e glycation of album in : structural an d fun ction al
album in as m easured by circular dich roism , Biol. Ph arm . Bull. 17 (1994)
im pacts, Bioch im ie 93 (2011) 645e 658.
1505e 1507.
[2] M. Brow n lee, Th e path ological im plication s of protein glycation , Clin . In vest.
[28] P. Ron deau, N. Sin gh , H. Caillen s, E. Bourdon , Oxidative stresses in duced by
Med. 18 (1995) 275e 281.
glycated h um an or bovin e serum album in s on h um an m on ocytes, Free Radic.
[3] M.P. Coh en , In terven tion strategies to preven t path ogen etic effects of glycated
Biol. Med. 45 (2008) 799e 812.
album in , Arch . Bioch em . Bioph ys. 419 (2003) 25e 30.
[29] R.N. Joh n son , P.A. Metcalf, J.R. Baker, Fructosam in e: a n ew approach to th e
[4] H.V. Rooh k, A.R. Zaidi, A review of glycated album in as an in term ediate gly-
estim ation of serum glycosylprotein . An in dex of diabetic con trol, Clin ica
cation in dex for con trollin g diabetes, J. Diabetes Sci. Tech n ol. 2 (2008)
Ch im . Acta 127 (1983) 87e 95.
1114e 1121.
[30] G.L. Ellm an , Tissue sulfh ydryl groups, Arch . Bioch em . Bioph ys. 82 (1959)
[5] K. Yosh iuch i, M. Matsuh isa, N. Katakam i, Y. Nakatan i, K. Sakam oto,
70e 77.
T. Matsuoka, Y. Um ayah ara, K. Kosugi, H. Kan eto, Y. Yam asaki, M. Hori, Gly-
[31] S. Ch esn e, P. Ron deau, S. Arm en ta, E. Bourdon , Effects of oxidative m odifica-
cated album in is a better in dicator for glucose excursion th an glycated
tion s in duced by th e glycation of bovin e serum album in on its structure an d
h em oglobin in type 1 an d type 2 diabetes, En docr. J. 55 (2008) 503e 507.
on cultured adipose cells, Bioch im ie 10 (2006) 1467e 1477.
[6] H. Nagayam a, M. In aba, R. Okabe, M. Em oto, E. Ish im ura, S. Okazaki,
[32] S.L. Sn yder, P.Z. Sobocin ski, An im proved 2,4,6-trin itroben zen esulfon ic acid
Y. Nish izaw a, Glycated album in as an im proved in dicator of glycem ic con trol
m eth od for th e determ in ation of am in es, An al. Bioch em . 64 (1975)
in h em odialysis patien ts w ith type 2 diabetes based on fastin g plasm a glucose
284e 288.
an d oral glucose toleran ce test, Biom ed. Ph arm acoth er. 63 (2009) 236e 240.
[33] P. Ron deau, G. Navarra, F. Cacciabaudo, M. Leon e, E. Bourdon , V. Militello,
[7] T.J. Peters, All about Album in e Bioch em istry, Gen etics, an d Medical Appli-
Th erm al aggregation of glycated bovin e serum album in , Bioch im . Bioph ys.
cation s, Academ ic Press, San Diego, 1996.
Acta Protein s Proteom ics 1804 (2010) 789e 798.
[8] N. Sh aklai, R.L. Garlick, H.F. Bun n , Non en zym atic glycosylation of h um an
[34] D. Ram ful, E. Tarn us, P. Ron deau, C. Robert Da Silva, T. Bah orun , E. Bourdon ,
serum album in alters its con form ation an d fun ction , J. Biol. Ch em . 259 (1984)
Citrus fruit extracts reduce advan ced glycation en d products (AGEs)- an d
3812e 3817.
H2O2-in duced oxidative stress in h um an adipocytes, J. Agric. Food Ch em . 58
[9] E. Bourdon , N. Loreau, D. Blach e, Glucose an d free radicals im pair th e an ti-
(2010) 11119e 11129.
oxidan t properties of serum album in , Faseb J. 13 (1999) 233e 244.
[35] H. Olsen , A. An dersen , A. Nordbo, U.E. Kon gsgaard, O.P. Borm er, Ph arm aceu-
[10] U. Kragh -Han sen , Structure an d ligan d bin din g properties of h um an serum
tical-grade album in : im paired drug-bin din g capacity in vitro, BMC Clin .
album in , Dan Med. Bull. 37 (1990) 57e 84.
Ph arm acol. 4 (2004) 4.
[11] K.S. Joseph , D.S. Hage, Th e effects of glycation on th e bin din g of h um an serum
[36] S. Bi, L. Yan , Y. Sun , H. Zh an g, In vestigation of ketoprofen bin din g to h um an
album in to w arfarin an d L-tryptoph an , J. Ph arm . Biom ed. An al. 53 (2010)
serum album in by spectral m eth ods, Spectroch im . Acta A Mol. Biom ol.
811e 818.
Spectrosc. 78 410e 414.
[12] G. Colm en arejo, In silico prediction of drug-bin din g stren gth s to h um an
[37] A. Marty, M. Boiret, M. Deum ie, How to illustrate ligan d-protein bin din g in
serum album in , Med. Res. Rev. 23 (2003) 275e 301.
a class experim en t: an elem en tary fluorescen t assay, J. Ch em . Educ. 63 (1986).
[13] F. Herve, S. Urien , E. Alben gres, J. Duch e, J. Tillem en t, Drug bin din g in plasm a.
[38] N. Ah m ed, P.J. Th orn alley, J. Daw czyn ski, S. Fran ke, J. Strobel, G. Stein ,
A sum m ary of recen t tren ds in th e study of drug an d h orm on e bin din g, Clin .
G.M. Haik, Meth ylglyoxal-derived h ydroim idazolon e advan ced glycation en d-
Ph arm acokin et. 26 (1994) 44e 58.
products of h um an len s protein s, In vest. Oph th alm ol. Vis. Sci. 44 (2003)
[14] M. Sch ulz, A. Sch m oldt, Th erapeutic an d toxic blood con cen tration s of m ore
5287e 5292.
th an 800 drugs an d oth er xen obiotics, Ph arm azie 58 (2003) 447e 474.
[39] J. McKich an , In fluen ce of protein bin din g an d use of un boun d (free) drug
[15] J.P. Tillem en t, F. Lh oste, J.F. Giudicelli, Diseases an d drug protein bin din g, Clin .
con cen tration s, in : Mich ael E. Burton , LMS, J.J.S, W illiam E. Evan s (Eds.),
Ph arm acokin et. 3 (1978) 144e 154.
Applied Ph arm acokin etics an d Ph arm acodyn am ics: Prin ciples of Th erapeutic
[16] G. Sudlow , D.J. Birkett, D.N. W ade, Furth er ch aracterization of specific drug
Drug Mon itorin g, Lippin cott W illiam s & W ilkin s, Baltim ore, 2006, pp. 82e 120.
bin din g sites on h um an serum album in , Mol. Ph arm acol. 12 (1976)
[40] K. Koizum i, C. Ikeda, M. Ito, J. Suzuki, T. Kin osh ita, K. Yasukaw a, T. Han ai,
1052e 1061.
In fluen ce of glycosylation on th e drug bin din g of h um an serum album in ,
[17] M. Dockal, D.C. Carter, F. Ruker, Con form ation al tran sition s of th e th ree
Biom ed. Ch rom atogr. 12 (1998) 203e 210.
recom bin an t dom ain s of h um an serum album in depen din g on pH, J. Biol.
[41] K. Mera, K. Takeo, M. Izum i, T. Maruyam a, R. Nagai, M. Otagiri, Effect of
Ch em . 275 (2000) 3042e 3050.
reactive-aldeh ydes on th e m odification an d dysfun ction of h um an serum
[18] M. Fasan o, S. Curry, E. Terren o, M. Gallian o, G. Fan ali, P. Narciso, S. Notari,
album in , J. Ph arm . Sci. 99 (2010) 1614e 1625.
P. Ascen zi, Th e extraordin ary ligan d bin din g properties of h um an serum
[42] N. Sattarah m ady, A.A. Moosavi-Movah edi, F. Ah m ad, G.H. Hakim elah i,
album in , IUBMB Life 57 (2005) 787e 796.
M. Habibi-Rezaei, A.A. Saboury, N. Sh eiban i, Form ation of th e m olten globule-
[19] P. Ascen zi, A. Bocedi, S. Notari, G. Fan ali, R. Fesce, M. Fasan o, Allosteric
like state durin g prolon ged glycation of h um an serum album in , Bioch im .
m odulation of drug bin din g to h um an serum album in , Min i Rev. Med. Ch em . 6
Bioph ys. Acta 1770 (2007) 933e 942.
(2006) 483e 489.
[43] G. Sudlow , D.J. Birkett, D.N. W ade, Th e ch aracterization of tw o specific drug
[20] F. Lagran ge, F. Pen h ourcq, M. Matoga, B. Ban n w arth , Bin din g of ketoprofen
bin din g sites on h um an serum album in , Mol. Ph arm acol. 11 (1975) 824e 832.
en an tiom ers in various h um an album in preparation s, J. Ph arm . Biom ed. An al.
[44] J.P. Tillem en t, R. Zin i, P. d ’ Ath is, G. Vassen t, Bin din g of certain acidic drugs to
23 (2000) 793e 802.
h um an album in : th eoretical an d practical estim ation of fun dam en tal
[21] K. Oettl, R.E. Stauber, Ph ysiological an d path ological ch an ges in th e redox
param eters, Eur. J. Clin . Ph arm acol. 7 (1974) 307e 313.
state of h um an serum album in critically in fluen ce its bin din g properties, Br. J.
[45] A. Guerin -Dubourg, A. Catan , E. Bourdon , P. Ron deau, Structural m odification s
Ph arm acol. 151 (2007) 580e 590.
of h um an album in in diabetic con text, Diabetes Metab. (2012).
[22] N. Okabe, N. Hash izum e, Drug bin din g properties of glycosylated h um an
[46] H.J. Ch o, K.H. Soh n , H.M. Park, K.H. Lee, B. Ch oi, S. Kim , J.S. Kim , Y.K. On ,
serum album in as m easured by fluorescen ce an d circular dich roism , Biol.
M.R. Ch un , H.J. Kim , J.W . Kim , S.Y. Lee, Factors affectin g th e in terin dividual
Ph arm . Bull. 17 (1994) 16e 21.
variability of w arfarin dose requirem en t in adult Korean patien ts, Ph arm a-
[23] A. Lapolla, D. Fedele, R. Reitan o, N.C. Arico, R. Seraglia, P. Traldi, E. Marotta,
cogen om ics 8 (2007) 329e 337.
R. Ton an i, En zym atic digestion an d m ass spectrom etry in th e study of
[47] D.E. Jon as, H.L. McLeod, Gen etic an d clin ical factors relatin g to w arfarin
advan ced glycation en d products/peptides, J. Am . Soc. Mass Spectrom . 15
dosin g, Tren ds Ph arm acol. Sci. 30 (2009) 375e 386.
(2004) 496e 509.
[48] X.M. He, D.C. Carter, Atom ic structure an d ch em istry of h um an serum
[24] D.L. Men dez, R.A. Jen sen , L.A. McElroy, J.M. Pen a, R.M. Esquerra, Th e effect of
album in , Nature 358 (1992) 209e 215.
n on -en zym atic glycation on th e un foldin g of h um an serum album in , Arch .
[49] J. Lakow itcz, Prin ciples of Fluorescen ce Spectroscopy, Spin ger, New York,
Bioch em . Bioph ys. 444 (2005) 92e 99.
2006.
[25] G. Fitzpatrick, P. Duggan , Th e effect of n on -en zym ic glycation on ligan d
[50] M. Th om as, G. Nelson , G. Paton ay, I. W arn er, An alysis of drug bin din g sites on
bin din g to h um an serum album in , Bioch em . Soc. Tran s. 15 (1987) 267e 268.
h um an serum album in usin g m ultidim en sion al fluorescen ce m easurem en ts,
[26] K. Nakajou, H. W atan abe, U. Kragh -Han sen , T. Maruyam a, M. Otagiri, Th e
Spectroch im i. Acta Part B: At. Spectrosc. 43 (1988) 651e 660.
effect of glycation on th e structure, fun ction an d biological fate of h um an
 

1.3. Discussion
 
Nous  avons  pu   met t re  en   évidence  dans  ces  deux  art icles  de  nombreuses  modificat ions 

st ruct urales  et   fonct ionnelles  de  l’albumine  au   cours  de  la  pat hologie  diabét ique. 

L’originalit é  de  ces  t ravaux  a  ét é  de  t ravailler   essent iellement   sur   de  l’albumine  modifiée  in  

vivo ,  ext rait e  et   purifiée  de  plasma de  pat ient s diabét iques.   Si   les  modificat ions  st ruct urales 

et   fonct ionnelles  observées  présent ent   de  nombreux  point s  communs  avec  des  modèles 

couramment   ut ilisés  d’albumine  glyquée  in   vit ro   par   du   glucose  ou   encore  du   M GO,  nous 

const at ons  que  les  niveaux  d’expression   de  ces  modificat ions  se  dist inguent  

part iculièrement  in  vivo. 

 
En   effet ,  si   nous  nous  concent rons  sur   les  modificat ions  st ruct urales  l’albumine  au   cours  du  

diabèt e,  nous  const at ons  premièrement   un   niveau   de  glycat ion   élevé,  exprimé  par   les 

dosages  des  résidus  amines  libres  et   des  fruct osamines,  mais  qui   rest e  moindre  sinon  

équivalent   comparat ivement   aux  modèles  de  glycat ion   par   le  glucose  100  mM   ou   le  M GO. 

Ceci   s’explique  aisément   par   un   niveau   d’imprégnat ion   glycémique  des  pat ient s  diabét iques 

qui,  même  s’ils  sont   en   sit uat ion   d’hyperglycémie  chronique,  rest e  bien   inférieur   à  des 

concent rat ions  de  l’ordre  de  100  mM   d’hexose.  En   revanche,  à  niveau   de  glycat ion  

équivalent ,  les  modificat ions  d’ordre  oxydat if,  exprimées  par   le  dosage  de  la  cyst éine  (t hiols 

libres)  ou   le  dosage  des  résidus  carbonyles,  s’expriment   beaucoup   plus  franchement   pour  

l’albumine  glyquée  in   vivo .  Ces  résult at s  sont   en   faveur   de  modificat ions  oxydat ives  plus 

import ant es  d’albumine  in   vivo     liées  à  des  processus  oxydat ifs  plus  nombreux  et   plus 

complexes.   

Les  modificat ions  des  st ruct ures  t ridimensionnelles  visualisées  au   t ravers  des  propriét és 

spect rales  de  l’albumine  sont   elles  aussi   majeures  et   s’expriment   de  manière  plus  int ense 

sur   l’albumine  modifiée  in   vivo,  ét ayant   un   peu   plus  l’hypot hèse  de  réarrangement  

st ruct uraux plus nombreux et  plus complexes de cet t e prot éine in  vivo  . 

 
L’ensemble  de  ces  observat ions  confirme  bien   que  les  mécanismes  combinés 

d’hyperglycémie  et   de  st ress  oxydant   observés  au   cours  du   diabèt e  sont   à  l’origine  de  la 

  107
format ion   de  t rès  nombreuses  formes  d’albumine  issues  des  phénomènes  combinés  de 

glycat ion   et  de  réarrangement s  oxydat ifs  complexes  et   mult iples.  Nous  ret rouvons,  en   effet , 

en   plus  des  formes  fruct osamines  correspondant   aux  formes  glyquées  simple  du   t ype 

produit   d’Amadori,  t rès  cert ainement   de  nombreuses  formes  glycoxydées  d’albumine  du  

t ype AGEs. 

 
Si   les  t echniques  classiques  d’élect rophorèse  en   gel   SDS‐PAGE,  ne  permet t ent   pas  de 

séparer    et   quant ifier   ces  différent es  formes  d’albumine  aux  masses  moléculaires  proches, 

des  t echniques  plus  résolut ives  comme  l’HPLC‐M S/ M S  ou   encore  l’élect rophorèse  capillaire, 

peuvent   êt re  ut ilisées  pour   séparer,  ident ifier   voir   même  quant ifier   ces  formes  modifiées 
100,101,102
d’albumine au  cours du  diabèt e . 

 
L’ét ude des modificat ions fonct ionnelles de l’albumine au  cours du  diabèt e mont re elle aussi  

des résult at s qui  dist inguent  clairement  les formes modifiées in  vivo   des formes modifiées in  

vit ro .  Nous  avons  ét udié  ici   deux  fonct ions  essent ielles  de  l’albumine  à  savoir   sa  capacit é  de 

prot ect ion  cont re le st ress oxydant  et  ses propriét és de t ransport . 

 
La  capacit é  de  liaison   de  l’albumine  est   t rès  impact ée  au   cours  du   diabèt e.  Nous  observons 

en   effet   une  t rès  fort e  diminut ion   de  la  capacit é  t ot ale  de  fixat ion   de  l’albumine  d’ions 
2+
bivalent s  comme  le  Cu    parallèlement   à  une  modificat ion   de  l’affinit é  de  l’albumine  pour  

cert ains médicament s qui  se lient  sur  le sit e I ou  II de Sudlow .  

 
Si   les  modificat ions  de  la  capacit é  de  liaison   de  l’albumine  aux  médicament s  ét ait   at t endue 

car   l’albumine  présent e  des  sit es  glycat ion   sur   ses  deux  sit es  de  liaison,  la  baisse  de  la 
2+
capacit é  de  liaison   d’ions  bivalent s  comme  le  Cu   est   beaucoup   plus  marquée  pour   les 

formes  d’albumine  modifiées  in   vivo .  Cet t e  modificat ion     est   à  met t re  en   lien   avec 

l’import ance  des  réarrangement s  oxydat ifs  combinés  à  la  glycat ion   observés  au   cours  du  

diabèt e. La capacit é de liaison  aux ions bivalent s est  en  effet  reliée au  niveau  d  ‘oxydat ion  de 

la part ie N‐t erminale de la prot éine et  aussi  au  niveau  d’oxydat ion  de la Cys34 de l’albumine 
70,71

  108
Ne  disposant   pas  encore  de  mét hode  direct e  de  séparat ion   et   de  quant ificat ion   des  formes 

glycoxydées  d’albumine  en   élect rophores  capillaire  ou   en   HPLC‐M S/ M S  au   laborat oire,  nous 

nous  sommes  appuyés  dans  la  suit e  de  nos  t ravaux  sur   cet t e  pert e  significat ive  de  capacit é 

de  liaison   aux  ions  bivalent s,  pour   apprécier   indirect ement   la  quant it é  d’albumine  au   cours 

du   diabèt e.  Pour   cela  nous  nous  sommes  inspirés  des  t ravaux  de  Bar ‐Or   et   al .    qui   ont  

précédemment   mis  au   point   une  mét hode  de  quant ificat ion   de  l’albumine  modifiée  par  

l’ischémie  (IM A :   Ischemia  M odified   Albumin)  au   cours  des  syndromes  coronariens  aigus  au  
2+ 69,103
moyen  de la mesure de la capacit é de liaison  du  Co  à l’albumine . 

 
Concernant   l’ét ude  de  la  capacit é  ant ioxydant e  de  l’albumine  modifiée  au   cours  du   diabèt e, 

nous  observons  une  diminut ion   t rès  import ant e  de  celle‐ci   pour   l’albumine  modifiée  in   vivo . 

Ces  résult at s  sont   en   accord   avec  la  proport ion   import ant e  des  réarrangement s  oxydat ifs 

également   observée  sur   l’albumine  ext rait e  de  pat ient s  diabét iques.  Cet t e  diminut ion   peut  

êt re  également   reliée  à  la  baisse  de  la  capacit é  de  liaison   de  l’albumine  aux  ions  bivalent s, 

puisque  l’on   sait   qu’ils  jouent   un   rôle  cent ral   dans  la  générat ion   de  ROS  circulant s.  Cet t e 

baisse  de  capacit é  ant ioxydant e  de  l’albumine  modifiée  in   vivo   t émoigne  bien   de 

l’import ance  des  réarrangement s  glycoxydat ifs  auxquels  est   confront ée  l’albumine  au   cours 

du  diabèt e. 

1.4. Conclusion
 
Les  différences  observées  ent re  l’albumine  modifiée  in   vivo   et   les  modèles  de  glycat ion   in  

vit ro   couramment   ut ilisés  confirment   bien   l’hypot hèse  que  ces  modèles  ne  sont   que  t rès 

part iellement   représent at ifs  des  mécanismes  de  réarrangement   glycoxydat ifs  observés  au  

cours de la pat hologie diabét ique. 

 
Nous  nous  sommes  at t achés  dans  la  deuxième  part ie  de  nos t ravaux  à  caract ériser   les  effet s 

cellulaires  de  l’albumine  modifiée  au   cours  du   diabèt e.  En   effet   si   les  formes  modifiées 

d’albumine  peuvent   const it uer   le  reflet   de  la  pression   glycoxydat ive  au   cours  du   diabèt e 

not re  object if   a  ét é  de  définir   si   elles  présent ent   des  effet s  cellulaires  dist inct ifs  et   si   elles 

  109
peuvent   avoir   par   conséquent   un   rôle  dans  la  physiopat hologie  du   diabèt e  et   de  ses 

complicat ions cardiovasculaires dont  on  sait  que le st ress oxydant  joue un  rôle cent ral. 

  110
2. EFFETS CELLULAIRES DE L’ALBUMINE MODIFIEE AU COURS
DU DIABETE

2.1. Introduction
 
Le st ress oxydant  se définit  comme un  déséquilibre ent re la product ion  de ROS et  la capacit é 
56,57
de  défense  ant ioxydant e  de  l’organisme .  Le  st ress  oxydant   est   aujourd’hui   ident ifié 

comme  un   des  mécanismes  menant   à  une  dysfonct ion   endot héliale.  Au   cours  du   diabèt e,  le 

st ress  oxydant   circulant   est   donc  considéré  comme  ét ant   au   cœur   des  mécanismes 

physiopat hologiques  des  complicat ions  cardiovasculaires  puisqu’il   est   en   cont act   direct   avec 
102
l’endot hélium  vasculaire . 

 
De  nombreuses  ét udes  ident ifient   ce  st ress  oxydant   comme  une  cible  t hérapeut ique 

privilégiée.  Une  diminut ion   de  ce  st ress  au   cours  du   diabèt e  pourrait   limit er   l’apparit ion   des 

complicat ions  vasculaires  chroniques  du   diabèt e  de  t ype  2,  c’est   pourquoi   de  nombreuses 

t ravaux  port ent   aujourd’hui   sur   l’ut ilisat ion   de  molécules  ant ioxydant es  comme 

t hérapeut iques  adjudant es  à  la  prise  en   charge  habit uelle  des  pat ient s  diabét iques  de  t ype 
66
2 .  

 
L’albumine  const it ue  une  des  principales  défenses  cont re  le  st ress  oxydant   circulant . 

Précédemment ,  nous  avons  pu   mont rer   qu’au   cours  du   diabèt e,  l’albumine  subit   des 

modificat ions  glycoxydat ives  avec  format ion   de  formes  avancées  de  glycat ion.  Ces  formes 

modifiées  d’albumine  ont   également   une  capacit é  de  défense  ant ioxydant e  fort ement  

diminuée ce qui  les place de façon  indirect e dans les processus physiopat hologiques menant  


98,99,63
à une dysfonct ion  endot héliale puis à des complicat ions chroniques cardiovasculaires . 

 
L’object if   de  l’ét ude  suivant e  a  ét é  d’ident ifier   si   ces  formes  modifiées  d’albumine  au   cours 

du   diabèt e  présent aient   également   des  effet s  sur   des  cult ures  cellulaires  d’adipocyt es  et   de 

macrophages.  Ces  cellules,  impliquées  dans  la  physiopat hologie  du   diabèt e  et   de  ses 

complicat ions  sont   connues  pour   réagir   en   présence  d’AGEs  via  une  réponse  inflammat oire 
104
régulée  par   le  récept eur   RAGE .  Là  encore,  nous  avons  comparé  les  effet s  cellulaires 

  111
observés  en   présence  d’albumine  modifiée  in   vivo     au   cours  du   diabèt e  de  t ype  2  à  ceux 

produit s  par   des  formes  d’albumines  humaines  de  pat ient s  non   diabét iques  modifiées  ou  

non  in  vit ro . 

2.2. Résultats
 
Article  3: New  insight s int o  delet erious impact s of  in  vivo  glycat ion  on  albumin  ant ioxydant  

act ivit ies. Biochimica et  Biophysica Act a 2013 ;  1830  :  3342‐3351. J.  Baraka ‐Vidot,  A.  Guerin‐

Dubourg, F.  Dubois,  B.  Payet,  E.  Bourdon,  P.  Rondeau.  

  112
Bioch im ica et Bioph ysica Acta 1830 ( 2013) 3532–3541

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Bioch im ica et Bioph ysica Acta


j o u r n al h o m ep ag e: w w w . el s ev i er . c o m / l o c at e/ b b ag en

New in sigh ts in to deleterious im pacts of in vivo glycation on album in


an tioxidan t activities
Jen n ifer Baraka-Vidot a , Alexis Guerin -Dubourg a,b
, Fan n y Dubois a , Bertran d Payet c,
Em m an uel Bourdon a , Ph ilippe Ron deau a,⁎
a
Groupe d'Etude sur l'In fla m m a tion Chronique et l'Obésité ( GEICO) , Structure fédéra tive Environnem ent Biodiversité Sa nté-FED4126, Université de La Réunion, Pla teform e CYROI,
Sa int Denis de La Réunion , Fra nce
b
Unité fonctionnelle de recherche biochim ie, Centre Hospita lier Universita ire Félix Guyon , Sa int Denis de La Réunion, Fra nce
c
La bora toire de chim ie des substa nces na turelles et sciences des a lim ents, Université de La Réunion, Sa int Denis de La Réunion, Fra nce

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Ba ckground: Album in con stitutes th e m ost abun dan t circulatin g an tioxidan t an d preven ts oxidative dam ages.
Received 16 Decem ber 2012 How ever, in diabetes, th is plasm atic protein is exposed to several oxidative m odification s, w h ich im pact on
Received in revised form 17 Jan uary 2013 album in an tioxidan t properties.
Accepted 18 Jan uary 2013 Methods: Most studies dealin g on album in an tioxidan t activities w ere con ducted on in vitro m odified protein .
Available on lin e 31 Jan uary 2013
Here w e tried to deciph er w h eth er reduced an tioxidan t properties of album in could be eviden ced in vivo. For
th is, w e com pared th e an tioxidan t properties of album in purified from diabetic patien ts to in vitro m odels of
Keyw ords:
Album in
glycated album in .
Glycation Results: Both in vivo and in vitro glycated album in s displayed im paired antioxidant activities in the free
Advan ced glycation en d-products radical-in duced h em olysis test. Surprisingly, th e ORAC m ethod ( Oxygen Radical Antioxidan t Capacity) show ed
Diabetes an enh an ced antioxidant activity for glycated album in . Faced w ith this paradox, w e investigated antioxidant
An tioxidan t and anti-inflam m atory activities of our album in preparation s on cultured cells ( m acrophages and adipocytes).
In flam m ation Reduced cellular m etabolism and enh an ced intracellular oxidative stress w ere m easured in cells treated w ith al-
bum in from diabetics. NF-kB –m ediated gen e induction w as h igher in m acroph ages treated w ith both type of
glycated album in com pared w ith cells treated w ith n ative album in . An ti inflam m atory activity of native album in
is significantly im paired after in vitro glycation and album in purified from diabetics significantly enh an ced IL6
secretion by adipocytes. Expression of receptor for advan ced glycation products is significantly enh an ced in
glycated album in-treated cells.
Conclusions a nd general significance: Our results bring n ew evidences on th e deleterious im pairm en ts of album in
im portant fun ction s after glycation and em phasize th e im portance of in vivo m odel of glycation in studies relied
to diabetes path ology.
© 2013 Elsevier B.V. All righ ts reserved.

1. Int r oduct i on our body and contribute to m aintain the intracellular redox hom eostasis.
Am ong endogenous antioxidants, album in represents a very abundant
Free radicals are essential to the physiological control of living organ- and im portant circulating antioxidant in plasm a [3,4], a body com part-
ism s [1]. But at high concentrations, free radicals becom e hazardous and m ent know n to be exposed to continuous oxidative stress [5]. But in par-
lead to dam ages in all m ajor biological con stituents [2]. Oxidative dam - ticular in vivo situation, album in can incur som e dam age that affects its
ages are frequently observed in num erous states of diseases. Oxidative antioxidant properties [6,7]. These m odifications could occur in diabetes
stress occurs w h en reactive oxygen species (ROS) production overpass m ellitus w hich is one of the pathological conditions associated w ith early
antioxidant defenses. Antioxidants can either be of exogenous origin, occurrence of vascular com plications, together w ith functional alter-
such as active m olecules present in foods or endogenously produced by ations of album in [8]. In this com plex pathology, album in undergoes in-
creased glycation. This phenom enon corresponds to the non-enzym atic
attachm ent of a glucose m olecule to a free prim ary am ine residue.
Abbrevia tions: AGE, advanced glycation end-products; HSA, hum an serum album in; Am adori rearrangem ent of the glycated protein gives rise to the deleteri-
HSA-ND and HSA-D, purified hum an serum album in from non-diabetic and diabetic patients, ous advanced glycation end products (AGEs) [9]. It is now very w ell
respectively; HbA1C, glycated hem oglobin level; PBS, phosphate-buffered saline established that in teraction of AGEs w ith their receptors (RAGE) induces
⁎ Correspon ding author at: GEICO-Université de la Réun ion 15, avenue René Cassin, BP
7151-97715 Saint Den is Messag Cedex 09, La Réunion , Fran ce. Tel.: + 33 262 93 86 48;
several cellular phenom ena potentially relating to diabetic com plications
fax: + 33 262 93 82 37. [10,11]. Many study h ave evidenced an AGEs-m ediated inflam m atory re-
E-m a il a ddress: roph il@un iv-reun ion .fr ( P. Ron deau) . sponses in circulating cells involving up-regulating m ultiple sign aling

0304-4165/$ – see fron t m atter © 2013 Elsevier B.V. All righ ts reserved.
h ttp://dx.doi.org/10.1016/j.bbagen .2013.01.019
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541 3533

pathw ays via RAGE [12,13]. These studies generally use glycated album in results are expressed as m m ol/L of 1-deoxy-1-m orpholin ofructose
as the source of AGEs. If plethora of studies focuses on AGE–cell interac- ( DMF), w h ich is a synth etic ketoam in e used as a prim ary standard.
tions, very few try to elucidate the im pact of in vivo glycation phenom e- TNBS ( 2, 4, 6-trin itroben zen esulfon ic acid) assay allow s th e quan -
non on album in antioxidan t activities. tification of prim ary free am in o groups in proteins [17]. Th is m eth od
Here, for th e first tim e an d by usin g several com plem en tary bio- w as described in detail in a previous study by our group [18]. Various
logical tests, w e in vestigated w h eth er in vitro or in vivo glycation of con cen tration s of L-glycin e ( 10 to 200 n m ol) w ere used to defin e th e
h um an serum album in ( HSA) m igh t alter its an tioxidan t properties stan dard curve.
in cellular an d in n on cellular assays. Thiol groups in n ative or m odified album in w ere m easured by
Ellm an's assay using 5, 5′-dithiobis, 2-n itroben zoic acid ( DTNB) [19]
2. Mat er ial s and m et hods as described previously [20]. A standard curve w as perform ed using
various con centration s of L-cysteine ( 10 to 100 n m ol) ( Sigm a). The con -
2.1. Ma teria ls tent of thiol groups for HSA sam ple w as m easured in duplicate on tw o
differen t quan tities of BSA by reading the absorban ce at 412 n m . Results
Hum an SW872 liposarcom a cells w ere purchased from Am erican are expressed as the n um ber of free \ SH groups per m ol of HSA.
Type Culture Collection (Rockville, MD). Mouse m acrophage RAW-Blue Protein carbon ylation w as determ ined by th e carbon yl ELISA assay
cells w ere purchased from InvivoGen (San Diego). Dulbecco's Modified based on th e recogn ition of protein -boun d DNPH in carbon ylated
Eagle's Medium (DMEM) high glucose, fetal bovine serum (FBS) and all protein s w ith an an ti-DNP an tibody. Th is m eth od w as described in
m edium nutrients w ere purchased from PAN Biotech Gm bh (Aidenbach). detail in previous studies [18,21].
The rabbit polyclonal anti h um an RAGE antibody, m eth ylglyoxal AGE-related m odification s w ere determ ined by th e m easure of
solution s ( 40%aq.) , D-glucose, 2, 2′-azobis ( 2-m ethylam idinopropan e) glycophore [14,22] and tryptophan fluorescen ce [23]. The fluorescence
or AAPH ( 440914) , fluorescein , p-n itroph en yl-phosph ate ( PNPP) , spectra w ere carried out on Horiba Scientific Fluorom ax-4 spectrom e-
dichlorofluorescin diacetate ( DCF-DA) and 3-( 4,5-dim ethylthiazol-2- ter. The form ation of glycophore w as m on itored at 355 n m excitation
yl)-2,5-diphen yl tetrazolium brom ide ( MTT), w ere all provided from w avelength and in 360–600 n m em ission range. The results w ere
Sigm a-Aldrich. expressed as %increase of glycophore level and calculated as follow :

2.2. Pa tient's recruitm ent ðF1 −F0 Þ


%Glycophore increa se ¼  100
ðF0 Þ
Plasm a sam p les w ere obtain ed from th irt y n in e d iabetic p atien ts
( % HbA1C = 11.0 ± 1.9) and anoth er pool w as from fourteen non- w h ere F0 is the m axim um fluorescence of HSA-NDG0 and F1 is the m ax
diabetic subject (%HbA1C = 5.5 ± 0.4) at th e Bioch em istry laboratory of fluorescen ce of in vitro or in vivo glycated album in .
the Centre Hospitalier Universitaire ( CHU, Saint-Den is, La Réun ion). Di- Tryptoph an em ission spectra w ere obtain ed in th e ran ge of
abetic panel included DID (n = 6) an d DNID (n = 33) patien ts w ith a di- 280–430 n m em ission w avelen gth ran ge after excitation at 270 n m
agnostic establish ed for m ore than one year. All diabetic patien ts [24,25].
follow ed an an tidiabetic treatm ent. Th e procedures an d the collection
of hum an m aterials w ere approved by the local governm en tal French 2.5. Ma ss spectroscopic a na lysis
Eth ical Com m ittee. Patients w ith a h em oglobin abnorm ality an d/or
hyperleukocytosis, acute coronary syndrom e, renal failure, in fectious All m ass spectroscopic m easurem en ts w ere perform ed at th e
or inflam m atory syn drom e w ere excluded. All biological data related Molecular Bioph ysics Un it ( MBU) of th e In dian In stitute of Scien ce
to both pools are given in Table S1 (Supplem entary data). ( Ban galore, In dia) . Average m olecular w eigh ts of both glycated albu-
m in sam ples w ere determ in ed by electrospray ion ization m ass spec-
2.3. Hum a n a lbum in prepa ra tions trom etry ( ESI/MS) . ESI/MS w as perform ed on Agilen t 1100 LC
coupled to Bruker Esquire3000plus operatin g in positive ion m ode.
Th e purification of serum album in from fresh h um an plasm a w as Com plete ESI/MS settin gs w ere: h igh voltage capillary, 4000 V; h igh
based on exten sive dialysis again st 50 m M-Tris/HCl, pH 7.4, follow ed voltage en d plate offset, − 500 V; n ebulizer gas pressure, 28 psi; dry
by affin ity ch rom atograph y usin g Cibacron Blue 3G lin ked to agarose gas flow rate, 7.00 l/m in ; dry gas tem perature, 340 °C an d capillary
( Am ersh am cat# 17-0948-01) as a ligan d for th e album in . A 1.5 M exit, 196.0 V; Trap Drive, 120.6. Mass spectra w ere processed by
NaCl, pH 7.4 buffer w as used for th e desorption of boun d album in usin g decon volution algorith m in order to reveal peaks w ith apparen t
from Cibacron Blue-agarose follow in g th e elution of oth er plasm atic m /z ration for m ain com ponen ts.
protein s w ith a 50 m M-Tris/HCl, pH 7.4 buffer. Each fraction of eluate
w as exam in ed by gel electroph oresis an d th e m ost purified an d con - 2.6. Red blood cell hem olysis test
cen trated extracts w ere pooled before th e rem ain in g im m un oglobu-
lin s w ere rem oved w ith seph arose-protein A, follow ed by exten sive Th e an tioxidan t properties of m odified album in s w ere exam in ed
dialysis again st PBS an d th en storage at -80 °C. Advan ced glycation w ith th e free radical-in duced blood h em olysis test [26]. Hum an
en d products ( AGE) w ere prepared as previously described [14] by blood sam ples w ere obtain ed from th e Bioch em istry departm ent of
in cubatin g 0.37 m M com m ercial h um an serum album in ( HSA-C) th e local h ospital cen ter ( CHU Felix Guyon ) an d w ere taken on
an d purified HSA from a n on -diabetic pool ( HSA-ND) w ith out an d EDTA substrate as an ticoagulan t. Th en plasm a w as rem oved an d
w ith glucose ( 25 m M an d 100 m M) in PBS, pH 7.4, un der sterile con - eryth rocytes w ere w ash ed w ith an isoton ic solution ( NaCl 0.15 M) .
dition s, at 37 °C for 3 w eeks, or w ith m eth ylglyoxal ( 10 m M) for Each w ell of a 96 w ell-plate w as filled w ith 100 μl ( about 1.10 8 eryth -
2 days. Th e protein s w ere dialysed again st PBS, sterile-filtered rocytes, 400,000 cells/μl fin al con cen tration ) of diluted solution of red
th rough a 0.2 μm Millipore filter an d stored at − 80 °C. blood ( 1/10 in 0.15 M NaCl) . Differen t album in sam ples ( 10 μM fin al
con cen tration ) w ere added in triplicates. Hem olyses w ere started by
2.4. Biochem ica l cha ra cterization of hum a n a lbum in prepa rations addin g 0.45 M of AAPH in each w ell. Turbidim etry at 450 n m w as
recorded in every 10 m in usin g a 37 °C-th erm ostated m icroplate
Fructosam in e w as determ in ed usin g the m ethod developed by reader. Results w ere expressed as 50% of m axim al h em olysis tim e
Joh nson et al. [15] usin g the n itroblue tetrazolium ( NBT) reagen t. The ( HT50 in m in ) w h ich represen ts th e total defen se again st free radicals
protocol w as described in a previous study from our group [16]. The in h um an an d an im al m odels subm itted to oxidative stress [27].
3534 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541

2.7. ORAC test stained by incubation w ith eosin solution for 7 m in. Cells w ere im aged
using a Nikon eclipse m icroscope and NIS-Elem ent softw are (Nikon).
The oxygen radical absorban ce capacity ( ORAC) developed by Ou et
al. [28] assay h as been w idely accepted as a standard tool to m easure 2.11. Determ ina tion a nd qua ntifica tion of intra cellula r ROS levels
the antioxidant activity in the n utraceutical, pharm aceutical, and food
in dustries [29]. The ORAC assay using fluorescein as th e fluorescent After 24 h of treatm en t, cells w ere w ash ed tw ice w ith PBS, and in cu-
probe m easures the antioxidan t capacity of sam ples to protect fluores- bated w ith 10 μM dich lorofluorescin diacetate ( DCF-DA) at 37 °C. After
cein from AAPH-in duced oxidative dam age. Th e autom ated ORAC assay 30 m in , cells w ere w ash ed on ce w ith PBS, and th e fluorescen ce in tensi-
w as carried out on an Infin ite M200 pro spectrofluorom etric analyzer ty of the oxidized form of DCF w as m easured in a m icroplate-reader at
( TECAN) at an excitation w avelen gth of 485 n m and an em ission w ave- 492 n m ( excitation ) an d 520 n m ( em ission). Fluorescen ce values
length of 530 n m . The reaction w as carried out in phosph ate buffer w ere calculated after backgroun d subtraction ( using identical con di-
( 75 m M, pH 7.4) con tain in g each album in sam ple ( 25 μl) in six repli- tion s w ithout DCF) . Intracellular gen eration of ROS w as also evaluated
cates and fluorescein solution ( 80 n M, 150 μl). Trolox solution s at dif- by fluorescen ce m icroscopy in precultured SW872 cells on glass cover
ferent con cen tration ( 6–50 μM) w ere used as calibration standards. slips in cubated w ith 10 μM of DCF-DA at 37 °C for 1 h follow ing by a
The fluorescen ce kinetic of fluorescein w as follow ed for 1 h at 37 °C stim ulation w ith 80 μM of HSA sam ples ( HSA-NDG0 and HSA-NDMGO)
after addin g autom atically AAPH solution ( 150 m M, 25 μl) in each for 20 m in .
w ell. The fluorescen ce w as recorded every 2 m in . An tioxidan t curves
( fluorescen ce vs. tim e) w ere first n orm alized to th e curve of the blan k 2.12. NFκB a nd AP-1 a ctiva tion
( ph osph ate buffer in stead of sam ples or trolox). Then th e area under
the fluorescen ce decay curve ( AUC) w as determ in ate. The antioxidan t RAW-Blue™ cells ( in vivogen, France) h ave been stably tran sfected
activity ( ORAC value) of sam ples w as calculated by usin g trolox calibra- RAW 264.7 m acrophages w ith a con struct in w hich NF-kB and AP1
tion standards as follow : activation s lead to the secretion of secreted em bryon ic alkaline
phosph atase ( SEAP) . RAW-Blue™ cells w ere m ain tain ed in DMEM
ðAUCsa mple −AUCbla nkÞ supplem en ted w ith FBS 10%and 100 m g/m l Zeocin in a 5%CO2 in cuba-
ORACvalue ¼  ð½TroloxŠ=½Sample ŠÞ:
ðAUCTroloxð50μM Þ−AUCbla nkÞ tor. RAW-Blue™ cells previously platted in 96-w ell plate ( 100,000 cells/
w ell) w ere exposed to n orm al culture m edium ( FBS 1%) or treated w ith
LPS ( 1 μg/m l) or/an d m odified album in sam ples ( 20 μM or 80 μM) at
37 °C in a 5% CO2 in cubator for 24 h . After in cubation, 1 ∙ 10 −3 M of
2.8. Culture of SW872 a nd RAW-Blue ™ cells p-n itrophenyl-ph osph ate ( PNPP) ( dissolved in 0.1 M glycin e buffer
con tain in g 1 m M MgCl2 , 1 m M ZnCl2 , pH 10.4) w as added to 40 μl of
Hum an SW872 liposarcom a cells w ere cultured in com pleted DMEM each supern atan t at 37 °C for 120 m in .
m edium ( 10%FBS, pen icillin ( 100 U/m l), streptom ycin ( 100 U/m l) an d PNPP + H2 O in th e presen ce of SEAP are con verted to para-
L-glutam in e ( 2 m M) ). Cells w ere grow n in a 5%CO2 incubator at 37 °C. n itroph en ol ( PNP) + Ph osph ate. PNP is yellow in alkalin e m edium
Mouse m acroph ages RAW-Blue™ cells derived from RAW 264.7 w ere an d assayed to determ in e SEAP levels usin g a spectroph otom eter at
m ain tained in sam e con dition s supplem en ted w ith 100 m g/m l of 460 n m .
Zeocin ( in vivogen) . For MTT and DCF experim en tation s cells w ere cul-
tured 24 h in 96-w ell plate ( 10,000 cells/w ell) w ith 200 μl DMEM
2.13. Qua ntifica tion of RAGE expression by rea l tim e q-PCR
contain in g 1%FBS and treated w ith m odified album in sam ples (20 μM
or 80 μM) for 24 h.
After treatm en t, total RNA w as extracted from cell cultures usin g
Trizol reagen t ( In vitrogen) . 6 μg of RNA w as reversed tran scripted
2.9. MTT proliferation a ssa y
to cDNA usin g Ran dom prim ers ( Sigm a) an d Molon ey Murin e Leuke-
m ia Virus ( MMLV, In vitrogen) . Th e cDNA w as am plified by PCR on an
The MTT-assay, usin g th e standard 3-( 4,5-dim ethylth iazol-2-yl) -
ABI PRISM 7000 th erm al cycler ( Applied Biosystem s, Fran ce) usin g
2,5-diphenyl tetrazolium brom ide ( Sigm a) , w as chosen to evaluate
th e SYBR green m aster-m ix ( Eurogen tec, Belgium ) an d specific
the effect of m odified album in sam ples ( 20 μM or 80 μM) on cell prolif-
h um an RAGE prim ers purch ased from Eurogentec. Each PCR cycle
eration [30]. This assay is based on th e cleavage of yellow tetrazolium
w as con ducted for 15 s at 95 °C an d 1 m in at 60 °C. RNA am ounts
salt MTT into purple form azan by m etabolically active cells, w h ich can
w ere calculated w ith relative stan dard curves for each m RNA of in ter-
be photom etrically quan tified. An in crease in th e n um ber of livin g
est an d 18S ribosom al RNA ( rRNA) gen e as referen ce. Norm alization
cells results in an in crease in total m etabolic activity, w h ich leads to a
to 18S w as con ducted to accoun t for variability in quality an d con cen -
h igher color form ation. After overn igh t of cell in cubation s in the
tration of total RNA, an d RT efficien cy. Th e results w ere an alyzed
presen ce of different reagen ts ( treatm en t w ith H2 O2 ( 500 μM) or/an d
usin g ABI Prism 7000 SDS softw are. Th e prim er sequen ces used
m odified album in sam ples ( 20 μM or 80 μM) ), 20 μl of th e MTT dye
w ere as follow s:
( 5 m g/m l) w as added into each w ell follow ed by 4 h of in cubation.
After discarding the m edia, 200 μl of DMSO w as added in to each w ell
18S
and plates w ere agitated in the dark for 30 m in to solubilize dark blue
form azan crystals. The plates w ere read usin g a m icroplate reader at a Forw ard prim er: 5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTCT-3′
w avelength of 595 n m . The n egative con trol w ell ( m edium alon e w ith Reverse prim er: 5′-CATTCTTGGCAAATGCTTTC-3′
n o cell and n o reagen t) w as used for zeroin g absorbance. RAGE
Forw ard prim er: 5′-GCCAGAAGGTGGAGCAGTAG-3′
2.10. Hem a toxylin –eosin sta ining Reverse prim er: 3′-CCAGTGGATTTGAGGAGAGG-5′

SW 872 cells w ere seeded on glass cover slips in 4 w ell plates and 2.14. Flow cytom etry a na lysis
treated w ith 80 μM of HSA sam ples (control cells w ere untreated). After
24 h of treatm ent, cells w ere fixed in p -form aldhyde 4%at room tem per- Cells w ere cultured in 6-w ells plate at a den sity of 3 · 10 5 cells/w ell
ature for 20 m in and stained w ith hem atoxylin solution (Vector®). Cells w ith 20 μM of glycated album in sam ples or w ith PBS for 6 h in
w ere w ashed 10 tim es in 2%glacial acetic solution, rinsed w ith w ater and DMEM/FBS 1%. Cells w ere th en w ash ed w ith PBS, detached and
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541 3535

in cubated w ith blockin g buffer ( PBS/BSA 1%) for 30 m in, follow ed by an ( sh ifted up to 430 n m for HSA-NDMGO). Th is could be attributed to alter-
in cubation w ith rabbit anti-RAGE polyclonal antibody ( 1: 200 dilution ation in album in con form ation follow in g glucose- or m eth ylglyoxal-
in PBS/BSA 1%) for 1 h an d an in cubation w ith PE-con jugated secondary in duced glycation. Concern in g diabetic album in , n o quen ch in g of
IgG ( Molecular Probes) for 30 m in . After a last w ash, SW872 cells w ere fluorescence is observed. AGE fluorescen ce in our sam ples is reported
analyzed by flow cytom etry usin g FACScan flow cytom eter ( Becton in Fig. 1b. For HSA-NDG25 an d HSA-D, an increased in glycophore fluo-
Dickin son) . Cells w ere gated for an alysis based on ligh t-scattering prop- rescen ce is observed at 450 n m , w h ile a sh ift of th e m axim um is eviden t
erties and fluorescence intensity ( FL2) w as assayed after coun tin g for HSA-NDMGO w h ich exhibits tw o m ajor fluorescen ce em issions at
10,000 events. Th e results w ere expressed as the m edian fluorescen ce 392 nm and 513 n m . Th ese data attested th e in crease of AGE level for
of labeled cells w ith respect to th e sign al obtain ed for con trol ( SW872 in vitro an d in vivo glycated album in s as in dicated in Table 1.
cells in cubated w ith PBS) . Average m olecular w eights of m ain HSA sam ples ( HSA-NDG0 ,
HSA-NDG25 , HSA-NDMGO and HSA-D) w ere assessed by ESI/MS
2.15. Secreted interleukin-6 qua ntifica tion ( Table 2 and Fig. S2). As expected, in vitro glycation of album in w ith glu-
cose or m ethylglyoxal induces an in creased in average m olecular w eigh t
Th e proinflam m atory cytokin e interleukin -6 ( IL-6) secreted in of HSA. In com parison w ith m olecular m ass of native album in
SW872 m edia after 24 h of treatm en t w ith LPS ( 1 μg/m l) in the presen ce ( 66,567 Da) , HSA-NDG25 an d HSA-NDMGO exh ibit th e m ost abun dant
of m odified album in sam ples ( 20 μM) w as quan tified using a Hum an species m olecular m ass at respectively 66,734 Da ( + 167) and
IL-6 ELISA Kit ( eBioscience). 66,733 Da ( + 166), correspon din g to album in attachm ent w ith about
on e glucose un it ( 162 Da for glucose) and th ree m ethylglyoxal un its
2.16. Sta tistical a na lysis ( 54 Da for MGO). With an average m olecular w eigh t of 66,623 Da, th e
m ost abun dant species for diabetic HSA w as in creased to approxim ately
Data w ere expressed as th e m ean s ± stan dard deviation ( SD) from 56 Da. Moreover, in vitro and in vivo glycated album ins presen t m any
a m in im um of th ree experim en ts. Statistical sign ifican ces w ere deter- very h igh m olecular m ass species ( above 67,000 Da) correspon din g to
m in ed usin g on e-w ay ANOVA ( follow ed by a studen t's test) for m ul- h ighly m odified album in form s ( Fig. S2 see supplem en tary data) .
tiple com parison s, w ith a P value of less th an 0.05 required for The antioxidan t properties of th ese glycated HSA sam ples w ere first
sign ifican ce. in vestigated usin g tw o n on cellular assays. On e test is based on the in-
trin sic capacity of album in to protect eryth rocytes from free
3. Resul t s radical-in duced h em olysis. Results reported in Fig. 2a show a h igher h e-
m olysis h alf-tim e ( HT50 ) for unm odified HSA ( vs. PBS con trol) , w h ich
This study w as con ducted on three album in preparations reflecting attests of the antioxidant capacity exerted by n ative album in in th is
different in vitro glycation m odels and com pared w ith album in purified test. This protected action of n ative HSA is partially ( −64%, p b 0.05
from diabetic or control subjects. Tw o of our in vitro glycation for HSA-NDG100 ) or totally ( −100%, p b 0.001 for HSA-NDMGO) lost
preparations constitute com m on glycated album in m odels and use w h en the protein w as in vitro glycoxidized. A m arked and significan t
suprapathological concentrations of glucose (100 m M) or m ethylglyoxal decrease ( −87%, p b 0.001) in album in antiradical properties w ere ob-
(10 m M). The third m odel, w hich uses a pathological concen tration of served for the protein purified from diabetics ( HSA-D). The secon d
glucose ( 25 m M), is m ore typical of diabetic album in. The carbonyl n on cellular test n am ed ORAC show ed rath er a strengthen in g of albu-
levels, free am ino and thiol groups and fructosam in e contents in th e dif- m in antioxidan t properties w ith glycoxidation m odification s ( Fig. 2b).
ferent preparations of album in are reported in Table 1. En hanced ORAC values are about 50% for HSA-NDMGO ( + 49.7%,
Sign ifican t m odification s w ere m easured especially in album in p b 0.001) and aroun d 15%for diabetic HSA ( + 15.6%, p b 0.001) w h en
glycated w ith supraph ysiological con cen trations of glucose, w ith com pared w ith n ative HSA. Secon dly, actions of our differen t glycated
MGO an d also ( at a low er exten t) in album in purified from diabetics HSA sam ples w ere in vestigated on cellular system s con stituted by adi-
in com parison w ith n ative album in . pocytes and m acroph ages. The MTT assay m eth od en ables evaluation
Sim ilarly, en h an ced REM an d aggregation of h igh m olecular ban ds of cell proliferation by quantification of relative cellular m etabolic
w ere observed on n ative PAGE gel for album in glycated w ith activity.
supraph ysiological con cen tration s of glucose, w ith MGO an d, at a We ch oose tw o types of cell types presen t in th e adipose tissue
low er exten t, in album in purified from diabetics in com parison w ith exertin g a determ in an t role in in flam m ation associated to diabetes/
n ative album in ( Fig. S1 see supplem en tary data) . obesity disorders: adipocytes ( SW872 cells lin e) an d m acroph ages
Fluorescence study w as perform ed in order to m on itor th e form ation ( RAW cell lin e) [14,31,32]. As observed in Fig. 3, both cellular m odels
of glycoph ore and th e quenchin g of tryptoph an fluorescen ce in album in display differen t biological respon ses w h en stim ulated w ith HSA
preparation s ( Fig. 1). As eviden t in Fig. 1a, th e fluorescence spectra re- sam ples. If a protective role album in is n oticed in adipocyte m odel,
vealed that in vitro m odified HSA ( HSA-NDG25 an d HSA-NDMGO) un der- th is property is n ot eviden ced in m acroph ages. SW872 an d RAW
go a decrease in th e tryptophan fluorescen ce em ission aroun d 340 nm cells sh ow ed sign ifican t low er m etabolic activity w h en in cubated in

Tabl e 1
Oxidative param eters in th e differen t album in preparation s.

Meth od s Carbon yl rate in crease Free am in o groups/HSA Ketoam in e/HSA Th iols/HSA Glycoph ore fluorescen ce in crease
( %con trol) ( m ol/m ol) ( m ol/m ol) ( m ol/m ol) ( %con trol)

HSA-NDGO 100.0 ± 7.3 13.3 ± 0.98 1.11 ± 012 0.609 ± 0.013 100
HSA-NDG25 111 .4 ± 10.8 12.4 ± 0.83 5.07 ± 0.35⁎⁎⁎ 0.333 ± 0.067⁎⁎ 249
HSA-NDG100 224.8 ± 13.9 10.4 ± 0.20⁎⁎ 12.4 ± 1.88⁎⁎⁎ 0.286 ± 0.011⁎⁎⁎
HSA-NDMGO 455.6 ± 69.6 5.10 ± 0.54⁎⁎⁎ 9.25 ± 1.46⁎⁎⁎ 0.250 ± 0.026 205 & 203
HSA-DG0 95.6 ± 3.9⁎⁎ 10.4 ± 0.80⁎ 2.13 ± 0.58⁎ 0.307 ± 0.012⁎⁎⁎ 259

1) Percen tage carbon yl rate as assessed by th e ELISA carbon yl assay; 2) prim ary am in o group con ten ts in protein s by th e TNBS assay; 3) ketoam in e levels obtain ed w ith th e NBT
assay; 4) free th iol group con ten t as assessed by Ellm an 's m eth od; an d 5) in crease of AGE level obtain ed by m axim um glycoph ore fluorescen ce em ission at excitation w avelen gth of
355 n m . All data are expressed as m ean s ± SD from th ree in depen den t experim en ts. ⁎Effect of glycation or diabetes on purified HSA ( vs. HSA-NDG0 ) .
⁎⁎⁎ p b 0.001, ⁎⁎ p b 0.01, ⁎ p b 0.05.
3536 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541

Fig. 1. a) Flu or e sce n ce sp e ct r a of t r yp t op h an ( 2 7 0 n m e xcit at ion w ave le n gt h ) ;


b ) Glycop h or e e m ission flu or e sce n ce sp e ct r a ( 3 70 n m e xcit at ion w avele n gt h ) Fi g. 2. Differential effect of glycated album in in tw o in vitro free radical-scavenging activity
for HSA- NDG0 ( — ) , HSA-NDG2 5 ( ……) , HSA-NDMGO ( − − −) an d HSA-D ( —) . tests. a) Effect of in vitro or in vivo glycoxidation on antiradical properties of album in w as
Flu ore sce n ce sp e ct ra of all sam p le s ar e sh ow n aft er d at a n orm alizat ion assessed by the free radical-m ediated blood hem olysis test. Histogram s represent half-tim e
accord in g t o t r yp t op h an m axim al ab sorp t ion . hem olysis (HT50 in m in) expressed as m eans ± sd (n = 3). b) Antioxidant properties of
glycoxidized album in were assessed using the ORAC test. Histogram s represent ORAC values
expressed as m eans ± sd (n = 6).

th e presen ce of 80 μM diabetic album in in com parison w ith cells in -


cubated w ith n ative album in ( Fig. 3a an d b) . As sh ow n in Fig. 4, To assess th e effect of glycated album in in in tracellular free radical
MTT assay in dicated also th e protective role exerted by n ative HSA gen eration , w e m easured dich lorofluorescein diacetate ( DCF-DA)
for preven ting partially cellular death in th e presen ce of H2 O2 fluorescen ce in adipocyte cells treated w ith 20 μM n ative or glycated
( 250 μM or 500 μM) in both cell lin es. If th is ben eficial role is partially HSA. As sh ow n in Fig. 5a, un der n orm al con dition s ( w ith 20 μM of n a-
lost upon in vitro glycoxidation , it w as n ot sign ifican tly m odified for tive HSA) , SW 872 an d RAW 264.7 cells exh ibited low er ROS levels
diabetic album in ( vs n ative album in ) in adipocyte cells ( Fig. 4b) . In th an con trol cells ( PBS) . Treatm en t w ith 20 μM of glycoxidized albu-
m acrophagic cells, th e protective role of album in is altered for m in for 24 h sign ifican tly in creased in tracellular ROS levels, th is w as
HSA-NDMGO an d for HSA-D, as w ell ( Fig 4a) . particularly observed in adipocytes treated w ith HSA-NDG100
SW872 cell m orph ology appears m odified w h en incubated in the ( + 7.2%, p b 0.05 vs. HSA-NDG0 ) an d w ith HSA-D ( + 8.1%, p b 0.05 vs.
presen ce of glycoxidized album in . HSA-NDMGO or HSA-D adipocytes HSA-NDG0 ) . Th is in tracellular ROS in crease in SW 872 in cubated
lose their typical fibroblastic m orph ology ( observed w ith HSA-NDG0) w ith 80 μM of HSA-NDMGO w as also observed by fluorescen ce m icros-
and exhibit a m ore round sh ape ( Fig. 4c). copy ( Fig. 5c) . Sim ilar in crease in in tracellular ROS form ation is ob-
served in m acrophages treated w ith in vitro glycated HSA an d
HSA-D ( + 18.2%, p b 0.05 vs. HSA-NDG0 ) ( Fig. 5b) .
Tabl e 2 Because glycated HSA sam ples stim ulate intracellular ROS produc-
ESI m ass an alysis of in vitro an d in vivo HSA. tion , NF-κB activation w as m easured in the RAW-Blue™ cell lin e.
HSA-NDG0 HSA-NDG25 HSA-NDMGO HSA-D RAW-Blue™ cells are derived from RAW 264.7 m acrophages w ith ch ro-
Num ber of com pon en ts 6 13 16 9
m osom al in tegration of a secreted em bryonic alkalin e ph osph atase
Molecular m ass of m ajor ( SEAP) reporter construct in ducible by NF-κB and AP-1. As show n in
com pon en ts ( Da) Fig. 6, cell in cubation in th e presen ce of 20 μM or 80 μM glycated albu-
A 66,567 66,734 66,733 66,623 m in s or LPS ( 1 μg/m l) sign ificantly in duced NF-κB activation . Th e m ost
B 66,756 66,910 66,626 67,901
sign ificant en han cem ents in NF-κB activation w ere m easured in cells
C 66,453 67,007 66,570 66,557
Average m olecular m ass ( Da) 66,679 66,905 68,065 66,751 treated w ith album in glycated w ith 100 m M of glucose and also w ith al-
bum in purified from diabetics.
Average m olecular m ass ( Da) of th e differen t preparations of HSA w as obtain ed by ESI/MS.
Num ber of com ponent w ith the m olecular m asses ( Da) w as determ in ed for each sam ple.
The im pact of glycoxidation on album in anti-inflam m atory properties
Average m olecular m ass determ in ation takes into account all the com pon en ts and th eir w as also evaluated in LPS-treated cells through the SEAP assay. As show n
respective abundan ces. in Fig. 7, NF-κB activation induced by LPS w as significantly reduced in
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541 3537

Fig. 3. Album in from diabetics im paired cellular viability an d m orph ology. Th e relative viability ( %) of cells ( vs. con trol PBS) in cubated 24 h w ith 20 μM or 80 μM of HSA-ND,
HSA-AGEs or HSA-D w as determ in ed by MTT assay. a) in RAW 264.7 m acroph age cells; b) in SW 872 adipocyte cells; c) H&E stain in g of a 70%con fluen ce culture of SW 872 in cu-
bated w ith 80 μM of HSA-ND, HSA-NDMGO or HSA-D. Scale bars corresp on d to 20 μm .

RAW-Blue™ cells incubated w ith 20 μM of native album in (-24%, p b 0.05


vs. LPS control), evidencing the protective anti-inflam m atory property of
the protein. As previously observed in the red blood hem olysis test, this
protective effect is progressively lost after in vitro album in glycation. In
our experim ental conditions (20 μM HSA) album in purified from dia-
betics do not show significant m odification on LPS-induced NFκΒ induc-
tion. But both in vitro glycated album in and album in purified from
diabetics exert significant enhancem ent in LPS-induced IL-6 secretions
by cells (Fig. 8).
Th e previous data revealed an in flam m atory effect of glycated HSA
in volvin g NFκB tran scription factor. Th e possible role of RAGE in in -
flam m atory respon se of SW 872 upon derived HSA–AGE stim ulation
w as in vestigated th rough its gen e expression by real tim e PCR an d
its cell surface protein expression by flow cytom etry.
As sh ow n in Fig. 9a, RAGE gen e expression is sign ifican tly en han ced
in adipocytes in cubated w ith diabetic album in (+ 193%vs. HSA-NDG0 ,
p b 0.05). To our kn ow ledge, RAGE expression at th e surface of
liposarcom a SW872 cells h as n ever been reported before.
Regardin g RAGE protein expression determ in ed by FACS, typical
dot-plot graph s for differen t m odified-HSA treated SW 872 cells an d
correspondin g m edian RAGE fluorescen ce values are reported in
Fig. 9b an d c, respectively. If after 24 h treatm en t in th e presen ce of
HSA-NDG25 , th e percen tage of cells w h ich expressed RAGE did n ot
vary sign ifican tly com pared to n ative album in con dition , th e corre-
spon din g overall even ts exh ibit a sign ifican t h igh er m edian fluores-
cen ce value ( + 20%vs. HSA-NDG0 , p b 0.05) . In con trast, th e m ajority
of SW 872 treated w ith HSA-NDMGO boun d RAGE an tibody on th eir
surface th ereby attestin g a h igh expression of th is receptor in th is
con dition . Th is elevated expression is con firm ed by th e correspon d-
in g m edian fluorescence value w h ich is 4-tim es h igh er in com parison
w ith oth er album in con dition s ( Fig. 9c) .

4. Di scussi ons
Fig. 4. Im paired protective action of album in after glycation. The relative viability (%) of cells
(vs. control DMEM wo H2O2) incubated 24 h with 80 μM of HSA sam ples in presence of H2O2 Album in is th e m ajor an tioxidan t an d th e m ost abun dan t protein
(250 μM or 500 μM) w as determ ined by MTT assay. a) in RAW 264.7 cells; b) in SW 872 cells. in th e circulatory system ( for com preh en sible review s on album in
3538 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541

Fig. 5. Album in from diabetics en h an ced in tracellular oxidative stress. In tracellular ROS production in m acroph ages an d adipocyte cells w as determ in ed by DCF fluorescen ce assay.
Th e relative in crease ( %) of DCF fluorescen ce ( vs. HSA-NDG0 ) w as determ in ed for cells in cubated 24 h w ith 20 μM of HSA-ND, HSA-AGEs or HSA-D. Data are expressed as m ean ± sd
( n = 6) . a) in RAW 264.7 cells; b) in SW 872 cells; c) fluorescen ce of DCF produced by SW 872 in th e presen ce of HSA-NDMG0 ( 80 μM for 20 m in ) an d captured by fluorescen ce
m icroscopy. Scale bars correspon d to 20 μm .

structure–fun ction relation sh ips: [3,4]) . Th e h igh lysin e an d argin in e in vestigate an d discuss th e poten tial im pairm en t of an tioxidan t prop-
residue con ten ts in album in prim ary structure m ake th e protein a erties of h um an album in after in vitro an d in vivo glycation .
h igh poten tial target for glycoxidation . Most studies h ave rath er Previous results, just based on th e red blood hem olysis test h ave
focused on th e biological im pact of album in derived AGE th an th e reported a stren gth enin g of radical trappin g capacities in bovin e
glycation effect on th e in trin sic an tioxidan t or an ti-in flam m atory serum album in glycated w ith glucose [8,14,18] w h ereas an im pairm en t
properties of th e plasm atic protein . Th is study w as un dertaken to of th ese properties w as n oticed upon aggregation process [33]. In th e
present study usin g th e sam e assay, suprapath ological conditions of glu-
cose or m ethylglyoxal in duce the lost of album in an tioxidan t properties,
w hich could be partially relied to th e aggregative state in duced by th e
protein glycation process. Faure et al. h ave already reported deleterious
effects of m eth ylglyoxal on bovin e album in [34]. This im pairm en t is also
associated w ith th e redox state of th e only on e reduced cystein ( Cys-34)
w hich is prone to oxidation upon glycation process and is able to scav-
en ge h ydroxyl radicals [35]. If in vivo diabetic album in is sim ilarly affect-
ed, its equivalen t in vitro m odel h as rath er a m ore m arked antiradical
property. Con clusion arisin g from this first set of data is th at th e red h e-
m olysis test is n ot sufficient to assess th e overall an tioxidant action of
th e protein . Th e oxygen radical antioxidant capacity ( ORAC) m eth od,
w hich is con sidered as a standard tool in the m easurem en t of antioxi-
dant activity in n utraceutical, ph arm aceutical, an d food areas [29],
gives con trary results. Accordin g to the data obtain ed by th is m ethod,
glycation process influences positively th e an tioxidan t activity of albu-
m in , for in vitro an d in vivo m odels, as w ell. Th ese conflictin g results
obtain ed by th ese m eth ods based also on th e free radical th eory
Fig. 6. Album in from diabetics en h an ced NFκB activation . NFκB activation w as deter-
m in ed in RAW-Blue cells after 24 h of in cubation w ith 20 μM or 80 μM of HSA-ND,
suggested th at th e scaven gin g properties of album in depend n ot on ly
HSA-AGEs or HSA-D. Data are presen ted as % con trol ( PBS) an d are expressed as on th e redox status of Cys-34, but also on th e structural con form ation
m ean ± sd ( n = 3) . of the protein . The conform ation al structure of glycated HSA revealed
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541 3539

in duced by LPS and this protective role seem s to be affected upon


glycation. On one han d, supraphysiological glycation m odels an d diabet-
ic album in could induced an activation of NF-κB quite sim ilar to LPS, on
the oth er hand an d con trary to native album in, these sam e in vitro
m odels could not hold dow n the inflam m ation induced by LPS. These
data are in accordan ce w ith the increased intracellular oxidative stress
observed previously and support the idea that album in AGE could
upregulate cellular inflam m ation th rough the ROS pathw ay and th e acti-
vation of NF-κB and AP-1 [41]. It is im portant to n otice that in vivo dia-
betic album in is the only glycation m odel w hich does not exhibit
paradoxal results. Indeed, w ith the low est an tioxidan t activities deter-
m in ed by red blood cells and ORAC tests, in vivo glycation of HSA induces
a decrease of cell viability associated w ith an increase of oxidative stress
and a NF-κB activation. Such deleterious im pairm ents in album in im por-
Fig. 7. Im paired an ti-in flam m atory activity of album in after glycation . NFκB activation tant functions after in vivo glycation, em phasizes the im portance of in
w as m easured in RAW-Blue cells after a 24 h in cubation w ith LPS ( 1 μg/m l) plus 20 μM vivo m odel of glycation in studies related to diabetes path ology. Indeed,
of HSA-ND, HSA-AGEs or HSA-D. Data is presen ted as %con trol ( w ith on ly LPS) an d are m ost of the available in vitro studies on the biological effects of glycated
expressed as m ean ± sd ( n = 3) . album in on cellular physiology w ere perform ed w ith in vitro AGE
m odels, w hich do not reflect th e physiopathology of a hyperglycem ic sit-
uation. In order to obtain significant cellular responses, glycated album in
specific am in o acids, previously buried in n ative con form ation, w h ich m odels have been obtained by incubating album in w ith an excessive
can im prove the free radicals trappin g capacity of th e protein as assayed am ount of glucose (up to 1 M) beyon d th e ph ysiological (5 m M) an d
in ORAC test. How ever, th e an tagon ist results sh ow ed by ORAC m eth od path ological (25 m M) concentrations, w h ich can be encountered in a
seem to be in accordance w ith previous studies w h ich h ave reported an norm al subject or diabetic patien ts, respectively. For instance, Stolzin g
in volvem en t of Maillard products in th e increase in antioxidant activity et al. focused on the ability of m icroglial cells to degrade extracellular
in m an y food system s [36–38]. Neverth eless, th e paradoxal results AGE m odified album in prepared w ith 1 M of glucose [42]. In addition ,
raised th e question of th e clin ical relevan ce of th e ORAC m eth od. It is the m ajority of the literature in this area reports the use of bovin e
n ecessary to perform cellular assays, such as viability test to get m ore in - serum album in instead of the hum an form in an in vitro m odel of
form ation on h ow antioxidant activity of album in is im pacted. glycation. A recent com parative study reported the differential biological
Th rough MTT assay, it is w ell establish ed th at album in con tributes responses of m onocyte cell lines treated w ith in vitro glycation m odels
to th e m etabolic activity of SW872 cells deprived of SVF an d also pro- derived from both BSA an d HSA [14]. In that particular study, glycated
tects again st H2 O2 deleterious effect. Th is en h an ced m etabolic activity BSA appeared to enhan ce proteolytic activities in THP-1 cells, w hereas
observed for som e glycated m odels, sh ould n ot be con sidered as a glycated HSA induced an inh ibition of these proteosom al activities.
protective action of glycated album in . In deed, th e MTT assay also Man y studies dealin g on cell activation by RAGE h ave em ployed al-
eviden ced a lost of protective effect of album in upon in vitro bum in h igh ly m odified by AGEs (30–40 m odified groups per protein) .
glycation . Th e oxidative stress in duced by som e glycated album in Protein s m odified so high ly are rarely foun d in tissues and body fluids
sam ples w h ich trigger th e cellular m etabolic activity could explain in vivo [43].
th is in crease of cell viability. Th is h ypoth esis is com forted by th e si- In th e presen t study, im paired anti-oxidant and anti-in flam m atory
m ultan eous in tracellular oxidative stress an d m etabolic activity en - properties w ere observed in album in purified from diabetics in tw o dif-
h an cem en ts observed in cells in cubated in th e presen ce of HSAG100 . ferent cellular m odels: adipocyte ( SW872) and m onocyte ( RAW) cell
Several studies have reported that glycated products are related to lin es. RAGE expression at th e surface of liposarcom a SW872 cells h as
the increase of system ic levels of inflam m atory m ediators such as n ever been reported before. Here and for th e first tim e, an en hanced ex-
TNF-α or IL-6 [39,40]. The inflam m atory response of th ese cytokin es m e- pression of RAGE receptor w as eviden ced in both SW872 and RAW cells
diated th rough the activation of the transcription factors NF-κB an d in cubated w ith album in purified from diabetics in com parison w ith
AP-1, support the clinical relevan ce of the involvem ent of AGE in m any cells treated w ith th e protein purified from con trols.
pathological processes. Here, th e SEAP activity induced in RAW-Blue™ In con clusion , our results clearly h igh ligh t stron g differences be-
cells clearly sh ow that album in can prevent from NF-κB activation tw een in vitro and in vivo m odels of glycated HSA eviden ced by th e dif-
ferential im pact of glycation in th e antioxidan t and anti-inflam m atory
properties of album in . Im portan tly and for th e first tim e very detrim en -
tal effects w ere eviden ced for the in vivo glycated form of album in con -
tributin g to th e con cept that oxidized form of the protein m ay act as a
biom arker of oxidative stress in diabetes. Furth er studies are h igh ly
w arran ted to reach a better un derstandin g of the im pact of in vivo oxi-
dative m odification on album in properties.

Aut hor cont r i but i ons

J.B.V. research ed data, con tributed to th e discussion, an d review ed


th e m an uscript.
A.G.D. researched data, con tributed to th e discussion, and review ed
m an uscript.
F.D. research ed data an d review ed th e m an uscript.
B.P. research ed data an d review ed th e m an uscript.
Fig. 8. Album in from diabetics en h an ced IL6 secretion by adipocytes. IL6 secretion w as
m easured in SW872 cells after 24 h in cubation w ith LPS ( 1 μg/m l) plus 20 μM of
E.B. con tributed to th e discussion, an d review ed an d edited
HSA-ND, HSA-AGEs or HSA-D. Data is presen ted as % con trol ( w ith on ly LPS) an d are m an uscript.
expressed as m ean ± sd ( n = 3) . P.R. research ed data, an d w rote, review ed an d edited m an uscript.
3540 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541

Fig. 9. RAGE sign alin g in flam m ation path w ay of glycoxidized HSA. a) RAGE m RNA expression levels determ in ed by real tim e q-PCR; b) RAGE cellular surface expression in duced by
PBS, HSA-NDG0 , HSA-NDG25 an d HSA-NDMGO in SW872 cells. SW 872 cells are iden tified as even ts labeled w ith RAGE in a dot plot of FL2 vs. SSC; c) Relative quan tification m edian
fluorescen ce of RAGE surface expression determ in ed by FACS. Data is presen ted as %con trol ( PBS) an d are expressed as m ean ± sd ( n = 3) .

Ack now l edgem ent s Refer ences


[1] W. Droge, Free radicals in th e ph ysiological con trol of cell fun ction , Ph ysiol. Rev.
Th is w ork w as supported by th e Ministère de l'En seignem en t 82 ( 2002) 47–95.
Supérieur et de la Recherch e, th e Min istère de l'Outre-Mer, th e Con seil [2] H. Sies, Oxidative stress: from basic research to clin ical application , Am . J. Med. 91
( 1991) 31S–38S.
Région al de La Réunion , the Université de La Réun ion an d l'Europe. JBV
[3] T.J. Peters, All About Album in — Bioch em istry, Gen etics, an d Medical Application s,
is supported by a fellow sh ip from th e Con seil Régional de La Réunion Academ ic Press, San Diego, 1996.
and l'Europe. Special th anks to A. Septem ber-Malaterre for h er h elp [4] G. Fanali, A. di Masi, V. Trezza, M. Marino, M. Fasano, P. Ascenzi, Hum an serum album in:
from bench to bedside, Mol. Aspects Med. 33 (2012) 209–290.
and excellen t expertise on th e ORAC m ethod.
[5] B. Halliw ell, Album in—an im portant extracellular an tioxidan t? Bioch em . Ph arm acol.
37 ( 1988) 569–571.
Appendi x A. Supplem ent ar y dat a [6] P. Atukeren , S. Aydin , E. Uslu, M.K. Gum ustas, U. Cakatay, Redox h om eostasis of
album in in relation to alph a-lipoic acid an d dih ydrolipoic acid, Oxid. Med. Cell.
Lon gev. 3 ( 2010) 206–213.
Supplem en tary data to th is article can be foun d on lin e at h ttp:// [7] M. Roch e, P. Ron deau , N.R. Sin gh , E. Tarn us, E. Bourdon , Th e an tioxidan t proper-
dx.doi.org/10.1016/j.bbagen .2013.01.019. ties of serum album in , FEBS Lett. 582 ( 2008) 1783–1787.
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541 3541

[8] E. Bourdon , N. Loreau, D. Blach e, Glucose an d free radicals im pair th e an tioxidan t [28] B. Ou, M. Ham psch -Woodill, R.L. Prior, Developm en t an d validation of an im -
properties of serum album in , FASEB J. 13 ( 1999) 233–244. proved oxygen radical absorban ce capacity assay usin g fluorescein as th e fluores-
[9] P. Ron deau, E. Bourdon , Th e glycation of album in : structural an d fun ction al cen t probe, J. Agric. Food Ch em . 49 ( 2001) 4619–4626.
im pacts, Bioch im ie 93 ( 2011) 645–658. [29] D. Huan g, B. Ou, M. Ham psch -Woodill, J.A. Flan agan , R.L. Prior, High -th rough put
[10] S. Horiuch i, Y. Sakam oto, M. Sakai, Scaven ger receptors for oxidized an d glycated assay of oxygen radical absorban ce capacity ( ORAC) usin g a m ultich an n el liquid
protein s, Am in o Acids 25 ( 2003) 283–292. h an dlin g system coupled w ith a m icroplate fluorescen ce reader in 96-w ell for-
[11] N. Sh an m ugam , Y.S. Kim , L. Lan tin g, R. Natarajan , Regulation of cyclooxygen ase-2 m at, J. Agric. Food Ch em . 50 ( 2002) 4437–4444.
expression in m on ocytes by ligation of th e receptor for advan ced glycation en d [30] T. Mosm ann , Rapid colorim etric assay for cellular grow th an d survival: application
products, J. Biol. Ch em . 278 ( 2003) 34834–34844. to proliferation and cytotoxicity assays, J. Im m unol. Methods 65 ( 1983) 55–63.
[12] H. Vlassara, Th e AGE-receptor in th e path ogen esis of diabetic com plication s, [31] K.P. Karalis, P. Gian n ogon as, E. Kodela, Y. Koutm an i, M. Zoum akis, T. Teli, Mech a-
Diabetes Metab. Res. Rev. 17 ( 2001) 436–443. n ism s of obesity an d related path ology: lin kin g im m un e respon ses to m etabolic
[13] S.F. Yan , R. Ram asam y, Y. Naka, A.M. Sch m idt, Glycation , inflam m ation , an d RAGE: stress, FEBS J. 276 ( 2009) 5747–5754.
a scaffold for th e m acrovascular com plication s of diabetes an d beyon d, Circ. Res. [32] E. Tarn us, H. Wassef, J.F. Carm el, P. Ron deau, M. Roch e, J. Davign on , L. Bern ier, E.
93 ( 2003) 1159–1169. Bourdon , Apolipoprotein E lim its oxidative stress-in duced cell dysfun ction s in
[14] P. Ron deau, N. Sin gh , H. Caillen s, E. Bourdon , Oxidative stresses in duced by h um an adipocytes, FEBS Lett. 583 ( 2009) 2042–2048.
glycated h um an or bovin e serum album in s on h um an m on ocytes, Free Radic. [33] P. Ron deau, S. Arm en ta, H. Caillen s, S. Ch esn e, E. Bourdon , Assessm en t of tem per-
Biol. Med. 45 ( 2008) 799–812. ature effects on beta-aggregat ion of n ative an d glycated album in by FTIR spec-
[15] R.N. Joh n son , P.A. Metcalf, J.R. Baker, Fructosam in e: a n ew approach to th e esti- troscopy an d PAGE: relation s betw een structural ch an ges an d an tioxidan t
m ation of serum glycosylprotein . An in dex of diabetic con trol, Clin . Ch im . Acta properties, Arch . Bioch em . Bioph ys. 460 ( 2007) 141–150.
127 ( 1983) 87–95. [34] P. Faure, L. Tron cy, M. Lecom te, N. Wiern sperger, M. Lagarde, D. Ruggiero, S.
[16] A. Guerin -Dubourg, A. Catan , E. Bourdon , P. Ron deau, Structural m odification s of Halim i, Album in an tioxidan t capacity is m odified by m eth ylglyoxal, Diabetes
h um an album in in diabetic con text, Diabetes Metab. 38 ( 2012) 171–178. Metab. 31 ( 2005) 169–177.
[17] S.L. Sn yder, P.Z. Sobocin ski, An im proved 2,4,6-trin itroben zen esulfon ic acid [35] S. Carballal, B. Alvarez, L. Turell, H. Botti, B.A. Freem an , R. Radi, Sulfen ic acid in
m eth od for th e determ in ation of am in es, An al. Bioch em . 64 ( 1975) 284–288. h um an serum album in , Am in o Acids 32 ( 2007) 543–551.
[18] P. Ron deau, G. Navarra, F. Cacciabaudo, M. Leon e, E. Bourdon , V. Militello, Th erm al [36] M.D. del Castillo, J.M. Am es, M.H. Gordon , Effect of roastin g on th e an tioxidan t ac-
aggregation of glycated bovin e serum album in , Bioch im . Bioph ys. Acta Protein tivity of coffee brew s, J. Agric. Food Ch em . 50 ( 2002) 3698–3703.
Proteom ics 1804 ( 2010) 789–798. [37] H.M. Woffen den , J.M. Am es, S. Ch an d ra, M. An ese, M.C. Nicoli, Effect of kiln in g on
[19] G.L. Ellm an , Tissue su lfh ydryl groups, Arch . Bioch em . Bioph ys. 82 ( 1959) 70–77. th e an tioxidan t an d pro-oxidan t activities of pale m alts, J. Agric. Food Ch em . 50
[20] S. Ch esn e, P. Ron deau, S. Arm en ta, E. Bourdon , Effects of oxidative m odification s ( 2002) 4925–4933.
in duced by th e glycation of bovin e serum album in on its structure an d on cul- [38] Q. Zh an g, J.M. Am es, R.D. Sm ith , J.W. Bayn es, T.O. Metz, A perspective on th e
tured adipose cells, Bioch im ie 10 ( 2006) 1467–1477. Maillard reaction an d th e an alysis of protein glycation by m ass spectrom etry:
[21] D. Ram ful, E. Tarnus, P. Ron deau, C. Robert Da Silva, T. Bah orun , E. Bourdon , Citrus probin g th e path ogen esis of ch ron ic disease, J. Proteom e Res. 8 ( 2009) 754–769.
fruit extracts reduce advan ced glycation end products (AGEs)- and H2 O2 -in duced [39] S.-S. Nah , I.-Y. Ch oi, B. Yoo, Y.G. Kim , H.-B. Moon , C.-K. Lee, Advan ced glycation
oxidative stress in h um an adipocytes, J. Agric. Food Chem . 58 ( 2010) 11119–11129. en d products in creases m atrix m etalloprotein ase-1, -3, an d -13, an d TNF-α in
[22] T. Ogin o, S. Okada, Oxidative dam age of bovin e serum album in an d oth er en zym e h um an osteoarth ritic ch on drocytes, FEBS Lett. 581 ( 2007) 1928–1932.
protein s by iron –ch elate com plexes, Bioch im . Bioph ys. Acta 1245 ( 1995) [40] Z. Rash eed, N. Akh tar, T.M. Haqqi, Advan ced glycation en d products in duce th e
359–365. expression of in terleukin -6 an d in terleukin -8 by receptor for advan ced glycation
[23] M. Brow n lee, H. Vlassara, A. Ceram i, Non en zym atic glycosylation an d th e path o- en d product-m ediated activation of m itogen -activated protein kin ases an d n ucle-
gen esis of diabetic com plication s, An n . In tern . Med. 101 ( 1984) 527–537. ar factor-kappaB in h um an osteoarth ritis ch on drocytes, Rh eum atology ( Oxford)
[24] V. Vetri, V. Militello, Th erm al in duced con form ation al ch an ges in volved in th e ag- 50 ( 2011) 838–851.
gregation path w ays of beta-lactoglobulin , Bioph ys. Ch em . 113 ( 2005) 83–91. [41] M.P. Coh en , E. Sh ea, S. Ch en , C.W. Sh earm an , Glycated album in in creases oxida-
[25] V. Militello, V. Vetri, M. Leone, Con form ation al changes involved in therm al aggrega- tive stress, activates NF-kappa B an d extracellular sign al-regulated kin ase
tion processes of bovine serum album in, Bioph ys. Chem . 105 ( 2003) 133–141. ( ERK) , an d stim ulates ERK-dep en den t tran sform in g grow th factor-beta 1 produc-
[26] M. Prost, Process for the Determ ination by Means of Free Radicals of the Antioxidant tion in m acroph age RAW cells, J. Lab. Clin . Med. 141 ( 2003) 242–249.
Prop erties of a Livin g Organ ism or a Poten t ially Aggressive Agen t s, U.S. Pat en t [42] A. Stolzin g, R. Widm er, T. Jun g, P. Voss, T. Grun e, Degradation of glycated bovin e
5,135,850, 1992. ( USA) . serum album in in m icroglial cells, Free Radic. Biol. Med. 40 ( 2006) 1017–1027.
[27] F. Girodon , D. Blach e, A.L. Mon get, M. Lom bart, P. Brun et-Lecom pte, J. Arn aud, M.J. [43] P.J. Thorn alley, S. Battah , N. Ahm ed, N. Karachalias, S. Agalou, R. Babaei-Jadidi, A.
Rich ard, P. Galan , Effect of a tw o-year supplem en tation w ith low doses of an tiox- Daw n ay, Quantitative screen in g of advan ced glycation endproducts in cellular an d
idan t vitam in s an d/or m in erals in elderly subjects on levels of n utrien ts an d an ti- extracellular proteins by tandem m ass spectrom etry, Bioch em . J. 375 ( 2003)
oxidan t defen se param eters, J. Am . Coll. Nutr. 16 ( 1997) 357–365. 581–592.
SUPPLEMENTARY DATA

Compounds Non diabetic Diabetic


(ND) (D)

N (females) 14 (7) 39 (16)

Age 33 ± 9 51.5 ± 20.1**

HbA1c (%) 5.5 ± 0.4 11.0 ± 1.9***

Fructosamines (ng/mL) 218.3 ± 10.9 390.0 ± 131.5***

Creatinin (µmol/L) 89.8 ± 12.3 88.0 ± 16.2

Albumin (g/L) 46.4 ± 2.6 38.8 ± 5.5***

Total protein (g/L) 73.8 ± 4.0 67.7 ± 7.7**

CRP (mg/L) 2.6 ± 2.5 7.0 ± 8.0*

Cholesterol (mmol/L) 4.6 ± 0.7 4.5 ± 1.3

Triglycerides (g/L) 0.9 ± 0.4 1.6 ± 1.0***

Table S1: Clinical and biochemical characteristics of diabetic and non-diabetic patients

and plasma samples.


Figure S1: Characterization of purified (HSA-ND and HSA-D) modified albumin by native

PAGE electrophoresis (12%)

Relative Electrophoretic Migration (REM) of modified human albumin after glycoxidation were

analyzed by native Polyacrylamide Gel (12 % of acrylamide) and stained by Coomassie blue

according to Laemmli’s method [6].


Figure S2: Mass spectroscopy analysis of native, in vitro and in vivo glycoxidized HSA.
Mass spectra was obtained by electrospray ionisation mass spectrometry (ESI/MS) and a
deconvolution was performed in order to obtain molecular mass of albumin species (m/z). a)
HSA-NDG0; b) HSA-NDG25; c) HSA-NDMGO; HSA-D.
  126
 

2.3. Discussion
Au   cours  de  cet t e  ét ude  port ant   sur   des  lignées  RAW ‐blue  de  macrophages  de  souris  et   sur  

des  lignées  SW872  de  liposarcome  humain   (adipocyt es),  nous  avons  pu   met t re  en   évidence 

plusieurs effet s d’int érêt  de l’albumine modifiée in  vivo   provenant  de pat ient s diabét ique de 

t ype 2. 

 
Premièrement   la  pert e  de  la  capacit é  ant ioxydant e  de  l’albumine  au   cours  du   diabèt e 

mont rée  précédemment   à  part ir   d’un   t est   d’hémolyse  induit e  de  globules  rouges  a  pu  
98
également   êt re  mise  en   évidence   à  part ir   de  t est   de  viabilit é  sur   des  macrophages  en  

présence  d’une  source  de  ROS.  Ces  observat ions  confirment   bien   que  les  modificat ions 

glycoxydat ives  de  l’albumine  au   cours  du   diabèt e  ont   un   impact   sur   sa  st ruct ure  et   sur   ses 

propriét és fonct ionnelles, se t raduisant  par  des effet s indirect s sur  des cult ures cellulaires en  

présence d’un  st ress oxydant . 

 
Ce qui  est  int éressant  dans cet t e ét ude, est  que nous avons  pu  mont rer  des effet s direct s de 

l’albumine modifiée au  cours du  diabèt e sur  des macrophages et  des adipocyt es. En  effet , en  

présence d’albumine purifiée de pat ient s diabét iques nous avons pu  mont rer  sur  ces cellules 

à la fois :  

 Une augment at ion  de la concent rat ion  int racellulaire de ROS 


 Une act ivat ion  du  NF‐B, fact eur  de t ranscript ion  pro ‐inflammat oire 
 Une baisse de l’act ivat ion  du  NF‐B en  présence de LPS sur  les macrophages 
 Une augment at ion  de sécrét ion  d’IL‐6 en  présence de LPS sur  les adipocyt es 
 Une  act ivat ion   de  la  synt hèse  (mRNA)  et   une  augment at ion   de  l’expression   du  
récept eur  RAGE à la surface des adipocyt es  

 
Ces  propriét és  prooxydant es  et   inflammat oires  de  l’albumine  ext rait e  de  pat ient s 

diabét iques sur   les  adipocyt es et   les  macrophages  nous  mont rent   bien  que  cert aines  formes 

modifiées  de  l’albumine  au   cours  du   diabèt e  présent ent   un   effet   direct   sur   ces  cellules  et  

qu’elles  peuvent   donc  êt re  direct ement   impliquées  dans  les  processus  physiopat hologiques 

pouvant  mener  à l’at hérosclérose et  aux complicat ions vasculaires du  diabèt e. 

  127
Il   est   à  not er   que  ces  observat ions  se  dist inguent   de  celles  obt enues  à  part ir   d’albumine 

purifiée  de  pat ient s  non   diabét iques  mais  aussi   de  formes  glyquées  in   vit ro   simulant   les 

condit ions physiopat hologiques du  diabèt e (glucose 25 mM ). 

 
Nous  confirmons  là  encore  que  les  mécanismes  de  glycat ion   et   d’oxydat ion   de  l’albumine  in  

vivo     au   cours  du   diabèt e  sont   nombreux  et   complexe  et   qu’il   est   donc  plus  pert inent   de 

t ravailler  à part ir  de modèles d’albumine ext rait es et  purifiées de pat ient  diabét ique pour  en  

mesurer  les modificat ions st ruct urales et  fonct ionnelles. 

2.4. Conclusion
Au   cours  du   diabèt e,  les  formes  modifiées  d’albumine  par   des  mécanismes  glycoxydat ifs  

présent ent   de  nombreux  effet s  délét ères :  pert es  de  capacit é  ant ioxydant e  et   ant i ‐

inflammat oire,  effet s  int racellulaire  prooxydant   et   pro ‐inflammat oire,  act ivat ion   de 

l’expression  du  récept eur  RAGE. 

 
Ces  effet s  observés  sur   des  macrophages  mont rent   que  ces  formes  modifiées  ont   un   rôle 

probable  dans  les  mécanismes  menant   à  l’at hérosclérose  et   aux  complicat ions 

cardiovasculaires  du   diabèt e.  La  recherche  d’effet s  similaires  sur   des  modèles  cellules 

endot héliales  présent erait   un   int érêt   indéniable.  Nous  pourrions  ainsi   évaluer   si   ces  formes 

modifiées  d’albumine  circulant e  sont   impliquées  dans  les  mécanismes  menant   à  la 

dysfonct ion   endot héliale  et   relier   ainsi   les  mécanismes  glycoxydat ifs  aux  complicat ions  du  

diabèt e.  De  t elles  ét udes  sont   act uellement   en   cours  au   laborat oire  GEICO  à  part ir   d’un  

modèle de barrière hémat o ‐encéphalique (BHE). 

 
Compt e  t enu   de  leur   implicat ion   dans  les  mécanismes  physiopat hologique  menant   à 

l’at hérosclérose,  les  formes  modifiées  d’albumine  peuvent   donc  const it uer   des 

biomarqueurs d’int érêt , venant  en  complément  des fact eurs de risque habit uellement  suivis, 

dans  le  dépist age  ou   l’évaluat ion   des  at t eint es  vasculaires  au   cours  du   diabèt e.  En   effet ,  ces 

formes  modifiées  d’albumine,  incluant   cert ainement   des  formes  AGEs, sont   le  reflet   à  la  fois 

de  la  glycat ion   mais  aussi   du   fort   st ress  oxydant   circulant   ret rouvés  au   cours  du   diabèt e  de 

t ype 2 et  pourraient  donc se dist inguer  de biomarqueurs usuels de glycat ion  t el  que l’HBA1c.  

  128
Nous  avons  donc  cherché,  dans  une  dernière  part ie  de  ce  t ravail     à  évaluer   l’int érêt   des 

formes  modifiées  de  l’albumine  en   t ant   que  biomarqueur   pot ent iel   des  at t eint es  vasculaires 

du   diabèt e,  à  t ravers  une  ét ude  clinique  descript ive  sur   des  sujet s  diabét iques  de  t ype  2 

fort ement  déséquilibrés (HbA1c > 7,5%). 

  129
  130
 

3. ETUDE PILOTE D’ASSOCIATION DES FORMES MODIFIEES DE


L’ALBUMINE (AGES, GA ET IMA) AUX ATTEINTES VASCULAIRES
DES PATIENTS DIABETIQUES : ERMIES-ALBOX

3.1. Etat actuel des connaissances

3.1.1.  Les complications vasculaires du diabète  de  type  2

 
Le diabèt e de t ype 2 est  une maladie mét abolique chronique en  pleine expansion  liée à l’âge 

et   à  l’évolut ion   des  modes  de  vie :   sédent arit é  et   apport s  énergét iques  inadapt és.  La 

prévalence  du   diabèt e  de  t ype  2  t rait é  est   part iculièrement   fort e  à  La  Réunion   puisqu’elle 
105,7
t ouche près de 20% de la populat ion  de plus de 30 ans . 

La  mort alit é  des  diabét iques  est   principalement   due  aux  complicat ions  vasculaires 

rencont rées  dans  le  diabèt e  de  t ype  2  qui   associent   la  microangiopat hie  diabét ique 
106
(rét inopat hie,  néphropat hie  et   pied   diabét ique)  et   la  macroangiopat hie  diabét ique 

(at hérosclérose,  syndromes  coronariens,  AVC,…).  En   effet ,  le  risque  d’at t eint e  vasculaire  est  

fort ement   augment é  et   les  complicat ions  cardiovasculaires  associées  (AVC,  IM )  sont  

responsables de 80% des décès des personnes diabét iques. 

3.1.2.  Prévention des complications vasculaires du diabète  

 
Le  suivi   médical   et   la  prise  en   charge  du   diabét ique  de  t ype  2  se  focalisent   essent iellement  

sur   un   bon   cont rôle  de  la  glycémie  vérifié  au   moyen   de  marqueurs  usuels  de  glycat ion,  ainsi  

que  sur   la  prise  en   charge  des  fact eurs  de  risque  habit uellement   associés :  surpoids, 

dyslipidémie,  HTA,  t abagisme.  L’hyperglycémie  chronique,  t raduit e  par   une  élévat ion  

significat ive  de  l’HbA1c  supérieure  ou   égale  à  7,5%  est   couramment   ut ilisée  comme 

marqueur   prédict if   des  at t eint es  vasculaires  des    pat ient s  diabét iques,  cependant   près  de 

25%  des  pat ient s  présent ant   une  at t eint e  vasculaire  ne  sont   ident ifiés  par   ce  marqueur   en  
 1,107
associat ion  ou  non  aux fact eurs de risques convent ionnels suscit és . 

  131
Il   exist e  donc  aujourd’hui   un   réel   besoin   d’ident ifier   d’aut res  marqueurs  précoces  associés  à 

un   risque  accru   de  l’at t eint e  vasculaire  dans  le  diabèt e.  L’ut ilisat ion   de  marqueurs 

direct ement   impliqués  dans  les  mécanismes  physiopat hologiques  des  at t eint es  vasculaires 

dans  le  diabèt e  qui   pourraient   par   la  suit e  const it uer   des  cibles  pharmacologiques  d’int érêt  
1 ,108
est  à privilégier . 

3.1.3.  Glycation des protéines et  stress oxydatif  dans le  diabète  

 
Au   cours  du   diabèt e  de  t ype  2,  l’hyperglycémie  chronique  amène  à  la  format ion   de  produit s 

de  glycat ion   t els  l’hémoglobine  glyquée  ou   les  fruct osamines  par   la  réact ion   de  M aillard  
63
dans  un   premier   t emps .  Il   est   également   const at é  une  augment at ion   du   st ress  oxydat if  

dans  la  pat hologie  diabét ique.  Ce  st ress  oxydat if   t ransforme  ces  produit s  de  glycat ion   en  

produit s  avancés  de  glycat ion   (AGEs)  dans  un   second   t emps  par   réarrangement s  oxydat ifs 

irréversibles.  On   parle  communément   de  phénomène  glycoxydat ion .  Il   a  ét é  mont ré  in  


77

vit ro   que  les  phénomènes  de  glycat ion   et   d'oxydat ion   sont   à  l'origine  de  modificat ions 

st ruct urales  et   fonct ionnelles  des  prot éines  dans  le  diabèt e  et   plus  part iculièrement   de 
98,99
l'albumine  qui   est   la  prot éine  circulant e  la  plus  abondant e  du   plasma .  Les  différent es 

formes  d'albumine  glyquée  –  Glycat ed   Albumin   (GA)  ‐  ou   oxydée  –  Ischemia  M odified  


69,71
Albumin   (IM A)  –  sont   reconnues  aujourd'hui   comme  des  biomarqueurs   respect ivement  
109,110
de niveau  de glycat ion  et  de l'équilibre glycémique (GA)  et  du  niveau  de st ress oxydat if  
111,112
du  plasma dans le diabèt e . 

 
Le  st ress  oxydat if   et   les  AGEs  associés  ont   mont ré  in   vit ro   et   in   vivo     une  act ivit é  pro ‐

inflammat oire  sur   les  macrophages  et   sur   les  cellules  endot héliales,  par   act ivat ion   de 
113
récept eurs  spécifiques  aux  AGEs :   RAGE .  En   plus,  ils  ent rainent   une  inhibit ion   de 

l’angiogénèse  et   des  modificat ions  épigénét iques  «  pro ‐inflammat oires »   à  long‐t erme,  qui  

persist ent  à la normalisat ion  de la glycémie.   

 
On   considère  donc  aujourd’hui   que  le  phénomène  de  glycoxydat ion   (glycat ion   et  

réarrangement  oxydat ifs irréversibles) conjoint ement  au  st ress oxydat if  (hyperproduct ion  de 

ROS)  occupe  une  place  cent rale  dans  les  mécanismes  physiopat hologiques  des  at t eint es 

vasculaires rencont rées not amment   dans le diabèt e de t ype 2.  

  132
Une augment at ion  significat ive de l’IM A ét ait  observée chez les pat ient s diabét iques de t ype  
114
2   et   plus  récemment   une  ét ude  a  pu   mont rer   une  augment at ion   significat ive  de  l’IM A 
chez  les  pat ient s  diabét iques  de  t ype  2  déséquilibrés  (HbA1C  >7,5%)  souffrant  
115
d’art ériopat hie  oblit érant e  des  membres  inférieurs  (AOM I) .  M ais  si   une  augment at ion  

significat ive  de  l’IM A  a  pu   êt re  mont rée  au   cours    d’at t eint es  vasculaires  profondes  et  

irréversibles comme l’AOM I, il  n’en  est  pas de même pour  les aut res complicat ions micro ‐  et  

macrovasculaires  du   diabèt e  pour   un   même  niveau   de  déséquilibre  glycémique.  Il   apparaît  

nécessaire  d’évaluer   l’int érêt   du   dosage  de  l’IM A  dans  le  cadre  d’at t eint es  vasculaires 

prévalent es  micro   et   macroangiopat hique  au   sein   d’une  populat ion   de  pat ient s  diabét iques 

présent ant  un  déséquilibre glycémique avéré. 

 
Une  augment at ion   des  concent rat ions  plasmat iques  de  marqueurs  de  glycoxydat ion   et   du  

st ress  oxydat if   pourrait   êt re  associée  à  une  augment at ion   du   risque  d’at t eint e 
116 102
vasculaire ,   et   les  marqueurs  associés  à  la  glycoxydat ion   (AGEs)  et   au   st ress  oxydat if  
(IM A)  pourraient   représent er     des  biomarqueurs  pot ent iels    pour   la  prédict ion     du   risque 
55,86,117
d’at t eint e vasculaire . 

3.2. Objectifs de la recherche



L’object if   principal   de  ce  projet   de  recherche  est   d’ét udier   l’associat ion   ent re  un  

biomarqueur   plasmat ique  du   st ress  oxydat if,  à  savoir   l’IM A  (Ischemia  M odified   Albumin)  et  

t out es  formes  d’at t eint es  vasculaires  du   diabèt e  (microangiopat hie,  macroangiopat hie) 

versus  aucune  at t eint e,  dans  une  populat ion   de  pat ient s  ayant   un   diabèt e  de  t ype  2  mal  

cont rôlé (HbA1c 7,5%).  

 
Les object ifs secondaires sont  les suivant s :   

 
- Et udier   l’expression   de  l’IM A  (concent rat ion   plasmat ique  moyenne)  en   fonct ion   du  

niveau  d’at t eint es vasculaires (Crit ère composit e à 4 cat égories) :  

o Pat ient s sans aucune at t eint e vasculaire (groupe t émoin)  

  133
o Pat ient s  avec  microangipat hie  diabét ique  seule  (rét inopat hie  et / ou, 
néphropat hie et / ou, neuropat hie et / ou, lésions du  pied  diabét ique) 

o Pat ient s  avec  macroangiopat hie  diabét ique  seule  (Syndrome  coronarien   aigu  
SCA  et / ou,  Angor   St able  et / ou,  Infarct us  du   myocarde  IM   et / ou,  Angioplast ie 

Coronaires et / ou, AOM I et / ou, Accident s vasculaires cérébraux AVC) 

o Pat ient s  avec  macroangiopat hie  diabét ique  et   microangiopat hie  diabét ique 
(at t eint es vasculaires combinées). 

 
- Comparer   la  valeur   discriminant e  de  l’IM A  à  celle  des  biomarqueurs  usuels  de 

glycat ion   (HbA1c,  fruct osamine),  pour   l’ident ificat ion   des  at t eint es  vasculaires 

prévalent es du  diabèt e. 

 
- Et udier   l’associat ion   ent re  le  dosage  plasmat ique  des  produit s  avancés  de  glycat ion  

et  les at t eint es vasculaires du  diabèt e. 

 
- Et udier   l’associat ion   ent re  le  dosage  plasmat ique  de  l’albumine  glyquée  (GA)  et   les 

at t eint es vasculaires du  diabèt e. 

 
- Est imer   les  corrélat ions  ent re  les  concent rat ions  plasmat iques  des  AGEs  (marqueur  

de  glycoxydat ion),  des  marqueurs  de  glycat ion   (HbA1c,  fruct osamines,  GA)  et   le 

dosage de l’IM A (marqueur  du  st ress oxydat if).

3.3. Aspects Méthodologiques

3.3.1.  Schéma  de  la  recherche  

 
Il   s’agit   d’une  ét ude  t ransversale  d’associat ion,  ancillaire  de  la  cohort e  expériment ale 

ERM IES,  réalisée  à  part ir   des  données  à  l’ent rée  dans  la  cohort e  (sérot hèque  /   recueil)  pour  

les  pat ient s inclus à la dat e du  10/ 04/ 2014. 

Le  prot ocole  de  recherche  biomédicale  ERM IES  est   un   essai   randomisé  mult icent rique 

d’int ervent ion   éducat ive  st ruct urée  ambulat oire  dans  le  diabèt e  de  t ype  2  insuffisamment  

cont rôlé  à  La  Réunion.  Ce  prot ocole  a  fait   l’objet   d’un   financement   DGOS‐PHRC  int er ‐

  134
régional   (campagne  2010).  Cet t e  ét ude  et   la  collect ion   biologique  associée  font   l’object ion  

d’un  référencement  :  

 
 Numéro  ID_RCB :  2011‐A00046‐35 

 Numéro  d’enregist rement  dans Clinicalt rials.gov :  NCT01425866 

L’analyse st at ist ique à visée explorat oire a port é sur  des caract érist iques cliniques recueillies 

en   pré‐inclusion   ou   en   inclusion   (évènement s  vasculaires  prévalent s),  ainsi   que  sur   les 

mesures  biologiques  prat iquées  en   inclusion   d’ERM IES  (HbA1c%,  fruct osamine,  bilan  

lipidique) ou  issues de la sérot hèque ERM IES au  même moment  (biomarqueurs).  

 
A  ce  jour,  l’ét at   d’avancement   de  la  recherche  ERM IES  ne  permet   pas  d’exploit er   les 

données  du   suivi   diabét ologique  t rimest riel   (sur   2  ans)  et   ainsi   d’approcher   le  caract ère 

pronost ique  des  biomarqueurs  d’int érêt .  La  t aille  de  l’ét ude  correspond   à  l’ensemble  des 

pat ient s inclus dans ERM IES à la dat e du  10/ 04/ 2014. 

 
Les  dosages  de  biomarqueurs  issus  de  la  sérot hèque  ERM IES  ont   ét é  effect ués  à  part ir   d’un  

aliquot   de  sérum   dest iné  au   laborat oire  de  Biochimie  du   CHU  La  Réunion   –  Félix  Guyon  

(part enaire  scient ifique  de  l’ét ude  ERM IES)  à  des  fins  de  recherche  conformément   au  

prot ocole de l’ét ude ERM IES :  amendement  n°2 version  2.2 du  03 Aout  2012. 

3.3.2.   Critères d ‘éligibilité  

3.3.2.1. Crit ères d’inclusion  (ERM IES) :  

 Diabèt e de t ype 2, défini  suivant  les crit ères de l’OM S 

 HbA1c   7,5% depuis 3 mois ou  plus 

 Pat ient s âgés de plus de 18 ans 

 Trait és  par   ADO  et / ou   analogues  de  la  GLP‐1  et / ou   insulinot hérapie  depuis  au   moins 

1 an  

 Schéma t hérapeut ique st able depuis au  moins 3 mois 

 Résidant  à La Réunion  

  135
 Affilié à un  régime de sécurit é sociale 

 Ayant  signé un  consent ement  de part icipat ion  de l’ét ude 

 Période d’inclusion  :  oct obre 2011  – avril  2014 

 
3.3.2.2. Crit ères de non  inclusion  (ERM IES) :  

 Trait ement  en  cours ou  programmé suscept ible d’influer  sur  le cont rôle glycémique 

 Hospit alisat ion  en  cours ou  récent e (<3 mois) en  lien  avec le diabèt e 

 Complicat ion  évolut ive sévère :  rét inopat hie ischémique ou  proliférat ive, insuffisance 

rénale chronique, insuffisance coronarienne évolut ive, lésion  du  pied  diabét ique 

 Grossesse en  cours 

 Cancer  évolut if  

 Part icipat ion  concomit ant e à un  essai  t hérapeut ique 

3.3.3.    Critères d’évaluations 

 
3.3.3.1. Exposit ion  principale :  

Dosage de l’albumine modifiée par  l’ischémie (IM A :  mét hode colorimét rique – Albumin  


103,69
Cobalt  Binding Test )  
L’IM A  est   un   marqueur   du   st ress  oxydat if   qui   n’est   pas  spécifique  d’un   organe  ou   d’une 

localisat ion   part iculière.  Un   regroupement   de  complicat ions  est   donc  envisageable  pour  

améliorer  la puissance st at ist ique des analyses de données. 

 
3.3.3.2. Exposit ions secondaires :  

 Dosage des AGEs plasmat iques (mét hode ELISA) 

 Dosage de l’albumine glyquée GA (mét hode ELISA) 

 Dosage de l’albumine plasmat ique (mét hode colorimét rique) 

 Dosage de l’HbA1c et  de la fruct osamine 

 Tout e at t eint e  vasculaire (t erminée ou  en  cours) relevée spécifiquement  à l’inclusion  

d’ERM IES :  

o M icroangiopat hies  : 
 Lésion  du  pied  diabét ique (t erminées < à 1an) 

  136
 Néphropat hie  diabét ique  t ous  st ades  d’évolut ion   (en   cours 

uniquement ) 

 Rét inopat hie diabét ique t ous st ades d’évolut ion  

 Neuropat hie diabét ique hors AOM I (en  cours uniquement ) 

o M acroangiopat hies (en  cours ou  t erminées il  y a moins d’une année) : 


 Accident  coronarien  aigu  

 Angor  

 Coronaropat hie ischémique silencieuse  

 Pont age coronarien  

 Angioplast ie coronaire 

 Accident  ischémique cérébral  

 AOM I 

3.3.4.    M éthodes analytiques 

 
    3.3.4.1. Dosage de l’HbA1c et  fruct osamines 

 
Le  dosage  de  l’hémoglobine  glyquée  HbA1c  est   effect ué  à  part ir   d’un   échant illon   de  sang 

t ot al   prélevé  sur   t ube  EDTA  (BD  Vacut ainer).  La  mét hode  de  dosage  ut ilisée  est  

l’élect rophorèse  capillaire  sur   aut omat e  Capillarys  Flex  du   laborat oire  Sebia  validée  sur   sit e 

au   laborat oire  de  Biochimie  du   CHU  La  Réunion   –  Hôpit al   Félix  Guyon.  Les  échant illons  ont  

t ous  ét é  analysés  dans  les  48  heures  suivant   le  prélèvement   et   conservés  4°C  en   at t ent e 

d’analyse.  

 
    3.3.4.2. Analyses biochimiques 

 
Les  dosages  des  prot éines  plasmat iques  t ot ales,  de  l’albuminémie,  de  la  CRP,  du   Cholest érol  

Tot al,  de  la  t riglycéridémie,  de  l’HDL‐Cholest érol,  du   LDL‐Cholest érol,  de  l’ApoA1,  de  l’ApoB 

et   des  fruct osamines  ont   ét é  réalisés  à  part ir   de  plasma  prélevé  sur   t ube  EDTA  (BD 

Vacut ainer). Ces analyses ont  ét é réalisées dans les 6 heures suivant  le prélèvement  sanguin, 

échant illons conservés à t empérat ure ambiant e ent re le prélèvement  et  l’analyse. 

  137
 
Le  dosage  de  la  glycémie  à  jeun   a  ét é  réalisé  à  part ir   de  plasma  prélevé  sur   t ube  Fluorure 

Oxalat e  (BD  Vacut ainer),  analyse  réalisée  dans  les  6  heures  suivant   le  prélèvement   sanguin, 

échant illons conservés à t empérat ure ambiant e ent re le prélèvement  et  l’analyse. 

 
Le  dosage  de  la  microalbuminurie  a  ét é  réalisé  à  part ir   d’échant illons  urinaires  prélevés  par  

mict ion   sur   flacon   st érile.  Les  urines  sont   conservées  à  t empérat ure  ambiant e  jusqu’à 

analyse biochimique dans les 6 heures suivant  le prélèvement . 

 
Tout es  les  analyses  biochimiques  décrit es  ci ‐dessus  ont   ét é  effect uées  à  part ir   de  coffret s 

réact ifs  Cobas  Roche  par   mét hode  colorimét rique  sur   un   aut omat e  Cobas  C501  du  

laborat oire  RocheDiagnost ic  au   laborat oire  de  Biochimie  du   CHU  La  Réunion   –  Hôpit al   Félix 

Guyon. 

 
    3.3.4.3. Dosage de l’IM A 

 
Le dosage de l’IM A a ét é adapt é pour  le dosage en  plaque 96 puit s à part ir  de la mét hode de 
69
référence  décrit e  précédemment   par   Bar ‐Or   et   al.   Not re  object if   a  ét é  d’améliorer   la 

reproduct ibilit é  de  cet t e  mét hode  par   l’ut ilisat ion   de  pipet t es  mult icanaux  ét alonnées  et   la 

réalisat ion  simult anée de l’ensemble des dosages t out  en  limit ant  la prise d’essai  échant illon  

(50μl   pour   un   t est   en   t riplicat a  cont re  200μl   pour   un   seul   essai   en   mét hode  de  référence)  et  

le  volume  d’essai   final   (200μl   cont re  1,5ml   en   mét hode  de  référence).  Ces  dosages  ont   ét é 

réalisés  à  part ir   de  plasmas  de  pat ient s  prélevés  sur   t ube  de  sang  EDTA  décant és  après 

cent rifugat ion  10  min  à 2000g et  conservés à ‐80°C avant  analyse. 

 
Chaque  échant illon   a  ét é  dilué  au   ¼  dans  du   t ampon   PBS  1X  (50μl   de  prise  d’essai   dans  un  
2+
volume  final   de  200μl).  Un   volume  de  20μl   d’échant illon   est   mélangé  avec  un   excès  de  Co   
2+
15μl   d’une  solut ion   de  Co   à  0,1%  préparée  à  part ir   de  chlorure  de  cobalt   anhydre  (Acros 

Organics).  Un   volume  de  125μl   de  t ampon   PBS  1X  est   ajout é,  puis  le  mélange  est   placé  15 

min   à  37°C  sous  agit at ion   lent e.  A  la  fin   de  la  première  agit at ion,  une  première  lect ure 

opt ique  est   effect uée  à  470nm   (Fluost ar   Opt ima,  BM G  LabTech)  DO  pour   évaluer   le  bruit   de 

fond   avant   réact ion   colorimét rique.  Après  incubat ion,  un   volume  de  20μl   de  DTT  (DL‐

  138
Dit hiot reilt ol,  Sigma  ref  :   D0632)  à  1,5mg/ ml   est   ajout é.  La  réact ion   colorimét rique  formée 
2+
par   le  complexe  DTT‐Co   est   st oppée  après  2  min   par   ajout   de  20 μl   de  NaCl   à  0,9M .  Une 

lect ure opt ique D1 à 470nm  est  réalisée immédiat ement  après l’arrêt  de la réact ion.  

 
La  valeur   de  l’IM A  est   exprimée  en   densit é  opt ique ΔD  =  D1‐D0.  Elle  représent e  la  quant it é 
2+
de  Co   résiduel   non   lié à  l’albumine.   Chaque  échant illon   a  ét é  t est é en   t riplicat a à  part ir   de 

la dilut ion  init iale. Les valeurs moyennes ont  fait  l’objet  de l’analyse. 

 
La  valeur   de  l’IM A  est   direct ement   proport ionnelle  à  la  quant it é  d’albumine  modifiée  par  

mécanismes  oxydat ifs  et   inversement   proport ionnelle  à  la  concent rat ion   plasmat ique  en  

albumine,  c’est   pourquoi   nous  avons  rapport é  la  valeur   de  l’IM A  à  celle  de  l’albumine  dans 

cet t e ét ude à part ir  de la formule suivant e :  

 
IM A/ ALB (G/ L)  = ΔD /  (1/  (Alb  (G/ L)) = ΔD x (Alb) (G/ L) 

 
    3.3.4.4. Dosage de l’albumine glyquée (GA) et  AGEs 

 
Les dosages de GA et  d’AGEs ont  ét é réalisés par  mét hode ELISA à part ir  de plasma de sang 

prélevé sur  t ube EDTA conservés à ‐80°C. Les coffret s réact ifs ut ilisés sont  :  Human  AGEs 

Elisa kit  et  Human  GA Elisa kit   (Sunred  Bio). Les lect ures opt iques des réact ions 

colorimét riques ont  ét é effect uées sur  spect rofluorimèt re Fluost ar  Opt ima (BGM  LabTech). 

3.3.5.    Analyse  statistique  des données 

 
L’analyse  st at ist ique  des  données  a  ét é  réalisée  au   CIC  de  la  Réunion,  à  l’aide  des  logiciels 

SAS v9.2 ® et  St at a v10.0. ® 

 
La  t aille  d’ét ude  at t endue  (N    75  pat ient s)    ne  repose  sur   aucune  hypot hèse  et   calcul   de 

nombre  de  sujet s  nécessaire,  mais  sur   la  disponibilit é  des  données  recueillies  et   saisies  à  la 

dat e  de  point ,  à  l’ét ape  de  l’inclusion   dans  l’essai   ERM IES. Ainsi,  les  analyses  st at ist iques  ont  

réalisées  selon   une  démarche  explorat oire  à  la  recherche  d’associat ions  privilégiées  ent re 

  139
biomarqueur   IM A  et   événement s  cliniques  prévalent s  d’int érêt   (object if   principal),  ce  qui  

permet t ra d’argument er  la réalisat ion  d’un  prot ocole de recherche ad  hoc (suivi  de  cohort e) 

pour  l’ét ude de la valeur  pronost ique de ce biomarqueur. 

 
La  populat ion   des  pat ient s  diabét iques  sélect ionnés  pour   cet t e  ét ude  est   décrit e 

(dénombrement , pourcent age, moyenne, écart ‐t ype, médiane et  aut res percent iles) :  niveau  

de  glycat ion,  niveau   des  biomarqueurs  de  glycoxydat ion   et   du   st ress  oxydat if   (ét ude  de 

dist ribut ion),  anciennet é‐durée  du   diabèt e  et   complicat ions  micro   et   mascrovasculaires 

(t erminées ou  en  cours). 

 
Les  analyses  comparat ives  (au   seuil   de  risque α  =  5  %)  ent re  groupes  de  complicat ions  font  

appel   aux  t est s  non   paramét riques  sur   séries  indépendant es :   t est   de  Wilcoxon   (2  groupes) 

ou   t est   de  Kruskal ‐Wallis  (>  2  groupes).  L’évaluat ion   de  la  capacit é  discriminant e  globale  des 

biomarqueurs candidat s nécessit era un  calcul  d’aire sous la courbe ROC (AUC + IC95%), ainsi  

que  le  recours  à  un    t est   non   paramét rique  de  comparaison   des  AUC  (module  roccomp   de 

St at a  v10.0).  Enfin,  l’ét ude  de  corrélat ion   ent re  biomarqueurs  est   dét erminée  à  l’aide  du  

coefficient  de corrélat ion  de Spearman. 

 
Cet t e  analyse  st at ist ique  est   unique  et   réalisée  sur   des  données  de  pré‐inclusion   ou  

d’inclusion   d’un   échant illon   de  pat ient s  recrut és  de  façon   consécut ive  dans  l’essai  

d’int ervent ion  ERM IES jusqu’à la dat e de point . 

  140
 

3.4. Résultats

3.4.1  Description générale  de  la  population observée  

 
L’ensemble  des  données  clinico ‐biologiques  de  l’échant illon   de  pat ient s  diabét iques  de  t ype 

2 issus de l’ét ude ERM IES observés dans cet t e ét ude figure dans le t ableau  n°1.  

 
75  pat ient s  d’âge  moyen   59  ans  ont   ét é  observés  (53  femmes  pour   22  hommes).  La  grande 

majorit é  des  pat ient s  présent e  au   minimum   un   surpoids  (IM C  =  30  +/ ‐  6).  En   accord   avec  les 

crit ères d’inclusion  d’ERM IES, t ous les pat ient s présent ent  un  diabèt e de t ype 2 déséquilibré 

avec  une  valeur   d’HbA1c  supérieure  à  7,5%  (9,1  +/ ‐  1,1%).  Ces  valeurs  sont ,  elles  aussi,  en  

accord  avec des t aux de fruct osamines et  de glycémie à jeun  élevés. 

 
Concernant   les  at t eint es  vasculaires  relevées  à  l’inclusion,  on   compt e  31  pat ient s  sans 

complicat ion   microangiopat hie  et   sans  macroangiopat hie.  30  pat ient s  présent ent   au   moins 

une  complicat ion   microangiopat hique.  3  pat ient s  présent ent   une  at t eint e 

macroangiopat hique  seule  et   12  pat ient s  ont   à  la  fois  une  complicat ion   microangiopat hique 

et   une  complicat ion   macroangiopat hique  relevées  à  l’inclusion   d’ERM IES.  A  not er   que  la 

durée moyenne du  diabèt e est  t rès élevée (18  +/ ‐ 9 ans). 

 
Afin   d’avoir   des  groupes  de  pat ient s  avec  des  effect ifs  st at ist iquement   significat ifs,  nous 

avons  choisi   de  présent er   l’ensemble  des  résult at s  de  cet t e  ét ude  en   dist inguant   2  groupes  

principaux.  Un   groupe  t émoin   de  pat ient s  sans  complicat ion   vasculaire  relevée  à  l’inclusion  

d’ERM IES  (n   =  31)  et   un   groupe  de  pat ient s  présent ant   t ous  t ypes  de  complicat ion  

cardiovasculaire relevée à l’examen  clinique d’inclusion  d’ERM IES (n  = 44). 

 
L’ensemble  des  paramèt res  biologiques  ut ilisés  présent ent   une  répart it ion   selon   une  loi  

normale  hormis  les  dosages  des  AGEs  et   de  GA.  Les  données  relat ives  à  ces  deux  marqueurs 

biochimiques ne sont  donc pas présent ées sous forme de moyenne +/ ‐ écart ‐t ype. 

  141
 
 
Tableau  1 :  ERM IES  données générales d’inclusion  (moyennes + / ‐ écart ‐t ype) 

Fe mme (n) 53

Ho mme (n) 22

Ab se nc e d 'a tte inte va sc ula ire (n) 31

Mic ro a ng io p a thie se ule (n) 30

Ma c ro a ng io p a thie se ule (n) 3

Mic ro a ng io p a thie e t ma c ro a ng io p a thie (n) 11

IMC 30 +/- 6

Ag e (a ns) 59 +/- 11

Duré e d u d ia b è te (a ns) 18 +/- 9

Pro té ine s To ta le s (G / L) 71 +/- 5

Alb umine (G / L) 42 +/- 3

C RP (mG / L) 6 +/- 9

Fruc to sa mine s ( μmo l/ L) 339 +/- 61

Hb A1c (%) 9,1 +/- 1,1

G lyc é mie (mmo l/ L) 9,14 +/- 2,99

C ho le sté ro l To ta l (mmo l/ L) 4,14 +/- 1,04

HDL-c ho le sté ro l (mmo l/ L) 1,12 +/- 0,29

LDL-c ho le sté ro l (mmo l/ L) 2,50 +/- 0,90

Trig lyc é rid e s (mmo l/ L) 1,60 +/- 1,09

Ap o A (mmo l/ L) 1,30 +/- 0,22

Ap o B (mmo l/ L) 0,89 +/- 0,25

Pro té ine s urina ire s (G / L) 0,16 +/- 0,21

Mic ro a lb uminurie (mG / L) 74 +/- 173

IMA (DO ) 0,410 +/- 0,115

IMA/ ALB (G / L) 17,3 +/- 4,8

G A (mG / L) 4,39

AG E (nG / mL) 1146


 
Les  données  biologiques  relat ives  aux  deux  sous‐groupes  formés  à  part ir   des  relevés 

cliniques d’inclusion  d’ERM IES sont  présent ées dans le t ableau  n°2. 

  142
 
Ent re  les  deux  groupes  de  pat ient s  avec  ou   sans  at t eint e  vasculaire  aucune  différence 

significat ive  d’expression   des  paramèt res  biologiques  ét udiés  n’est   relevée.  Seuls  le  dosage 

de  l’IM A/ ALB  présent e  une  discrèt e  différence  ent re  les  deux  groupes  de  pat ient s  sans 

t out efois présent er  de significat ivit é st at ist ique (p<0,2). 

 
Not ons  que  les  données  relat ives  aux  AGEs  et   GA,  ne  répondant   pas  à  une  loi   normale  de 

répart it ion  ne peuvent  êt re présent ées dans ce t ableau  ni  comparées aux aut res paramèt res 

biologiques selon  le t est  t  de St udent .   

 
Tableau   2 :  données  biologiques  (moyenne+/ ‐écart ‐t ype)  présent ées  par   sous‐groupes 
d’at t eint es  vasculaires  relevées  à   l’inclusion   d’ERM IES  (absence  d’at t eint e  vasculaire  vs. 
Complicat ion   vasculaire  comparaison).  Les  variables  sont   comparées  selon   le  t est   de 
Wilcoxon  (en  gras, p  < 0,15). 
 
Ab se nc e d 'a tte inte Au mo ins une c o mp lic a tio n
va sc ula ire à l'inc lusio n va sc ula ire à l'inc lusio n

n = 31 n = 44

Mo ye nne +/ - é c a rt-typ e Mo ye nne +/ - é c a rt-typ e p va lue


Pro té ine s To ta le s (G / L) 71 +/ - 5 70 +/ - 4 0,3369
Alb umine (G / L) 42 +/ - 3 43 +/ - 3 0,1565
C RP (mG / L) 4 +/ - 5 7 +/ - 11 0,1602
Hb A1c (%) 9,0 +/ - 1,2 9,1 +/ - 1,1 1,0000
Fruc to sa mine s ( μmo l/ L) 339 +/ - 73 339 +/ - 53 0,7085
G lyc é mie (mmo l/ L) 9,0 +/ - 2,9 9,2 +/ - 3,1 0,7548
C ho le sté ro l To ta l (mmo l/ L) 4,17 +/ - 0,84 4,11 +/ - 1,17 0,8071
HDL-c ho le sté ro l (mmo l/ L) 1,13 +/ - 0,30 1,12 +/ - 0,28 0,8823
LDL-c ho le sté ro l (mmo l/ L) 2,49 +/ - 0,79 2,52 +/ - 0,97 0,8870
Trig lyc é rid e s (mmo l/ L) 1,61 +/ - 1,34 1,60 +/ - 0,90 0,9690
Ap o A (mmo l/ L) 1,30 +/ - 0,22 1,30 +/ - 0,22 1,0000
Ap o B (mmo l/ L) 0,89 +/ - 0,21 0,88 +/ - 0,28 0,8665
Pro té ine s urina ire s (G / L) 0,14 +/ - 0,14 0,16 +/ - 0,25 0,6878
Mic ro a lb uminurie (mG / L) 61 +/ - 145 82 +/ - 191 0,6063
IMA (DO ) 0,391 +/ - 0,127 0,423 +/ - 0,105 0,2347
IMA/ Alb umine (G / L) 16,3 +/ - 5,1 18,0 +/ - 4,5 0,1296
 

  143
3.4.2  Corrélations des marqueurs biochimiques 

 
A  l’analyse  des  corrélat ions  ent re  les  différent s  biomarqueurs  de  glycat ion,  d’oxydat ion   ou  

de glycoxydat ion  dosés au  cours de cet t e ét ude clinique, 3 observat ions sont  remarquables :  

 
 L’IM A  n’est   corrélée  à  aucun   biomarqueur   de  glycat ion   (HbA1c,  fruct osamine,  GA)  ni  
à  aucun   biomarqueur   de  glycoxydat ion   (AGEs).  Seuls  sont   corrélés  l’IM A  (DO)  et  

l’IM A rapport ée à la concent rat ion  plasmat ique d’albumine (r  = 0,90398 ;  p<0,001) . 

 
 Aucune  corrélat ion   n’est   ret rouvée  ent re  les  dosages  des  AGEs  ou   de  la  GA  et   ceux 
des  biomarqueurs  convent ionnels  de  glycat ion   des  prot éines  (HbA1c  et  

fruct osamines) 

 
 Le dosage des AGEs et  de la GA sont  fort ement  corrélés (r  =0,84227 ; p  <0,001) 
 
Tableau  3 :  Coefficient s de corrélat ion  de Spearman  ent re biomarqueurs de glycat ion  (HbA1c, 
fruct osamines, GA), d’oxydat ion  (IM A, IM A/ ALB) et  de glycoxydat ion  (AGEs).  (*  p  <0,001) 
 
   IM A (DO)  IM A/ ALB (G/ L) AGE (nG/ mL)  GA (mG/ L) 

IM A (DO)  1  0,90398*   0,08296  0,05351 

IM A/ ALB (G/ L)     1  0,00077  0,03035 

AGE (nG/ mL)        1  0,84227*  

GA (mG/ L)           1 

HbA1c (%)  0,02645  0,03545  0,04283  0,01544 

Fruct osamines (mmol/ L)  0,07378  0,0995  0,01233  0,0529 

Fruct osamines/ prot éines 


0,08695  0,0913  0,03211  0,06719 
(mmol/ G) 
 
 
 

  144
3.4.3  IM A et  atteintes vasculaires 

En   comparant   les  niveaux  d’expression   des  différent s  biomarqueurs  de  glycat ion(HbA1c),  

d’inflammat ion   (CRP),  d’oxydat ion   (IM A/ ALB)  et   de  dyslipidémie  (LDL)  ent re  les  pat ient s  ne 

présent ant  aucune complicat ion  vasculaire relevée à l’inclusion  d’ERM IES et  ceux présent ant  

au   moins  une  at t eint e  vasculaire  micro   et / ou   macroangiopat hique  (figure  n°17),  aucune 

différence significat ive n’est  ret rouvée (t est  de Wilcoxon, p  <0,05). 

 
Figure  n°17  :   Valeurs  comparat ives  de  concent rat ions  plasmat iques  de  biomarqueurs 
(moyenne  +/ ‐  écart ‐t ype)  ent re  les  groupes  sans  complicat ion   vasculaire  vs.  avec 
complicat ion  vasculaire.  
 
Egalement , si  l’on  compare la capacit é discriminant e globale de l’IM A (DO) à celle de l’HBA1c 

dans  l’ident ificat ion   des  at t eint es  vasculaires  relevées  à  l’inclusion   de  l’ét ude  au   moyen   de 

courbes  ROC  (figure  n°19),  on   ne  const at e  pas  de  différence  significat ive  ent re  ces  deux 

biomarqueurs.  Les  valeurs  d’aire  sous  la  courbe  respect ivement   de  0,5766  et   de  0,5459   

pour   l’HbA1c  et   l’IM A  t émoignent   d’une  capacit é  faiblement   discriminant e  de  ces 

biomarqueurs  pour   dist inguer   des  pat ient s  avec  ou   sans  complicat ion   vasculaire  relevée  à 

l’inclusion  du  prot ocole ERM IES. 

  145
 
Figure  n°18  :   Dist ribut ion   des  valeurs  d’IM A  (DO)  et   d’IM A/ Albumine  ent re  les  groupes  sans 
complicat ion   vasculaire  et   avec  complicat ion   vasculaire  relevée  à   l’inclusion   d’ERM IES. 
Représent at ion   en   box‐plot   (valeur   minimale,  25   percent ile,  valeur   médiane,  75  
ème ème

percent ile et  valeur  maximale). 


 
On   remarque  malgré  t out ,  bien   que  non   significat ive,  une  t endance  à  l’augment at ion   des 

valeurs de l’IM A/ ALB chez les pat ient s présent ant  une at t eint e vasculaire (figure n°17). Cet t e 

t endance n’est  pas ret rouvée pour  les aut res paramèt res biochimiques dosés hormis pour  la 

CRP,  marqueur   de  l’inflammat ion,  mais  dont   la  dispersion   des  valeurs  rest e  t rès  import ant e 

(écart ‐t ype supérieur  à la valeur  moyenne). 

 
Si   on   observe  la  dist ribut ion   des  valeurs  d’IM A  et   d’IM A/ ALB  ent re  les  deux  groupes  avec  ou  

sans  at t eint e  vasculaire  (figure  n°18),  on   ret rouve  cet t e  t endance  à  l’augment at ion  

conjuguée  à  une  augment at ion   de  la  dispersion   des  valeurs  d’IM A  chez  les  pat ient s  avec 

at t eint e vasculaire. 

  146
 
Figure  n°  19  :   Courbes  ROC  (Receiver   Operat ing   Charact erist ic)  des  paramèt res  biologiques 
IM A et  de l’HbA1c  rapport ées à  l’ident ificat ion  des at t eint es vasculaires relevées à  l’inclusion  
d’ERM IES. Données comparées d’aire sous la  courbe. 
 

3.4.4  GA,  AGEs et  atteintes vasculaires 

 
La  dist ribut ion   des  valeurs  des  AGEs  et   de  GA  ent re  les  différent s  groupes  avec  ou   sans 

at t eint e vasculaire révélée à l’inclusion  d’ERM IES sont  présent és sur  la figure n°20. 

 
On   ne  const at e  pas  de  différence  significat ive  de  valeurs  des  AGEs  ni   de  GA  ent re  ces 

différent s  groupes,  la  dist ribut ion   des  valeurs  ent re  chaque  groupe  ét ant   ent ièrement  

chevauchant e. 

 
La  dist ribut ion   des  valeurs  des  AGEs  et   de  GA  semble  moins  hét érogène  dans  le  groupe  de 

pat ient s  avec  at t eint e  vasculaire.  Il  est   à  not er   que  les  dist ribut ions  des  valeurs  de  GA  et   des 

AGEs,  bien   que  ces  paramèt res  aient   des  ordres  de  grandeur   différent s  sont   quasiment  

superposables dans chaque groupe. 

  147
 
Figure n°20  :  Dist ribut ion  des valeurs des AGEs  et  de GA  ent re les groupes sans complicat ion  
vasculaire  et   avec  complicat ion   vasculaire  relevée  à   l’inclusion   d’ERM IES.  Représent at ion   en  
box‐plot   (valeur   minimale,  25   percent ile,  valeur   médiane,  75   percent ile  et   valeur  
ème ème

maximale). 
 

3.5. Discussion, conclusions et perspectives


 
Au   regard   des  résult at s  présent és,  nous  pouvons  premièrement   const at er   le  caract ère 

indépendant ,  relevé  par   l’absence  de  corrélat ion,  des  différent s  biomarqueurs  de  glycat ion  

(HbA1c  et   fruct osamines),  du   st ress  oxydant   (IM A)  et   de  glycoxydat ion   (AGEs)  ét udiés  au  

cours  de  ces  t ravaux.  Ce  premier   résult at   nous  confort e  sur   le  fait   que  ces  marqueurs  sont  

issus  de  processus  physiopat hologiques  différent s  et   que  le  dosage  de  l’IM A  et   des  AGEs 

apport ent   des  informat ions  complément aires  et   non   redondant es  aux  dosages  de  l’HBA1c 

ou  des fruct osamines .  

 
Nous  observons  au   cont raire  une  t rès  fort e  corrélat ion   ent re  les  valeurs  des  AGEs  et   de  GA. 

Ce  résult at   peut   apparaît re  surprenant   ce  d’aut ant   plus  que  nous  nous  at t endions  plus 

vraisemblablement   à  un   rapprochement   des  valeurs  de  GA  à  ceux  d’HbA1c  et   des 

fruct osamines.  En   effet ,  l’albumine  glyquée  (GA)  est   un   produit   de  glycat ion   non  

  148
enzymat ique  (produit   d’Amadori)  au   même  t it re  que  l’hémoglobine  glyquée  (HbA1c)  et   les 

fruct osamines (prot éines glyquées plasmat iques). Les AGEs et  la GA sont  ici  dosés à part ir  de 

kit s  commerciaux  ELISA  dont   nous  pouvons  clairement   remet t re  en   cause  la  mét hode  et   le 

développement   puisque  les  dét erminant s  ant igéniques  ut ilisés  pour   ce  dosage 

immunologique  semblent   clairement   croisés  sinon   chevauchant .  En   l’absence  de  corrélat ion  

avec  les  marqueurs  de  glycat ion   ou   du   st ress  oxydant   et   de  précisions  sur   les  dét erminant s 

ant igéniques  ut ilisés  dans  la  concept ion   de  ces  kit s  réact ifs,    il   nous  apparaît   clairement  

impossible  de  savoir   ce  que  nous  dosons  précisément   avec  ces  2  mét hodes  de  dosage.  Les 

résult at s  en   sont   donc  inexploit ables  et   leur   ut ilisat ion   sera  évit ée  pour   nos  projet s  de 

recherche fut urs. 

 
L’IM A,  marqueur   du   st ress  oxydant ,  ne  présent e  pas  de  variat ion   significat ive  d’expression  

ent re  les  pat ient s  avec  at t eint e  vasculaire  et   ceux  sans  at t eint e  vasculaire ;   seule  une 

t endance  à  une  augment at ion   des  valeurs  de  l’IM A  est   ret rouvée  ent re  les  2  groupes  que 

nous  avons  const it ué  au   cours  de  cet t e  ét ude.  Des  résult at s  cont radict oires  ont   pu   êt re 

observés  sur   d’aut res  publicat ions  port ant   sur   des  pat ient s  diabét iques  de  t ype  2  souffrant  
118
d’AOM I   ou   encore  de  pat ient s  ayant   présent é  des  AVC73.  Dans  ces  ét udes,  les  pat ient s 
diabét iques de t ype 2 souffrent  de pat hologies cardiovasculaires (macroangiopat hie) sévères 

récent es  voir   évolut ives  au   moment   du   dosage  de  l’IM A  et   d’aut res  marqueurs  de  glycat ion  

(HbA1c).   

 
Dans  le  projet   ERM IES,  les  pat ient s  souffrant   de  complicat ions  cardiovasculaires  graves 

récent es  (IM ,  AVC,  SCA  inférieures  à  un   an)  ou   évolut ives  ont   ét é  exclus.  Cet t e  ét ude  est  

descript ive  et   nous  permet   d’observer   les  données  des  pat ient s  inclus  à  un   t emps  donné. 

Nous  nous  sit uons  donc  dans  ce  t ravail   soit   a   priori   soit   a   post eriori   d’événement s 

cardiovasculaires  graves  ce  qui   nous  dist ingue  des  ét udes  cit ées  précédemment .  Au   regard  

des résult at s observés, nous ne pouvons conclure sur  l’exist ence d’une associat ion  ent re des 

valeurs  élevées  d’IM A  et   un   niveau   quelconque  d’at t eint e  vasculaire.  Les  résult at s  observés 

aujourd’hui   et   ceux  des  ét udes  cit és  ci ‐dessus  nous  poussent   donc  à  envisager   une  ét ude 

clinique  prospect ive  nous  permet t ant   d’évaluer   les  modificat ions  d’expression   sur   plusieurs 

années  (5  à  10  ans)  des  marqueurs  du   st ress  oxydant   (IM A)  et   de  la  glycoxydat ion   (AGEs) 

chez des pat ient s diabét iques de t ype 2. 

  149
 
De  plus,  la  populat ion   observée  au   cours  de  cet t e  ét ude  réalisée  à  part ir   des  données 

d’inclusion   d’ERM IES  est   const it uée  de  pat ient s  ayant   un   diabèt e  de  t ype  2  t rès  ancien, 

compliqué  et   déséquilibré  (durée  du   diabèt e  supérieure  à  10ans  et   HbA1c  supérieure  à 

7,5%)  associé  syst émat iquement   à  un   syndrome  mét abolique  (IM C  >25).  Si   l’on   peut  

dist inguer   deux  groupes  d’at t eint es  vasculaires  à  part ir   des  recueils  cliniques  réalisés  à 

l’inclusion   de  l’ét ude  ERM IES,  compt e  t enu   de  la  durée  du   diabèt e,  il   semble  donc  t rès 

probable  que  la  majeure  part ie  des  pat ient s  inclus  aient   pu   présent er   des  événement s 

vasculaires ant érieurs au  début  de ce prot ocole.  

 
Afin   d’évaluer   le  caract ère  discriminant   des  différent s  biomarqueurs  de  glycat ion,  du   st ress 

oxydant   et   de  glycoxydat ion   dans  l’ident ificat ion   des  at t eint es  vasculaires  init iales  des 

pat ient s  diabét iques  de  t ype  2,  voir   d’évaluer   un   caract ère  prédict if   d’at t eint e  vasculaire 

chez  les  pat ient s  diabét iques  de  t ype  2  à  part ir   de  ces  différent s  biomarqueurs ;   il   semble 

nécessaire  d’élaborer   un   projet   de  recherche  clinique  permet t ant   un   recueil   de  données 

clinico ‐biologiques  prospect if   de  pat ient s  diabét ique  de  t ype  2  nouvellement   pris  en   charge 

à l’aide d’out ils permet t ant  de caract ériser  le niveau  d’at t eint e vasculaire de ce ces pat ient s. 
119
L’épaisseur   int ima‐media  carot idienne  (IM T)  mesurée  par   echot racking   ou   encore 
120
l’est imat ion   de  la  rigidit é  art érielle  par   mesure  de  la  vit esse  d’onde  de  pouls   sont  
considérés  aujourd’hui   comme  des  crit ères  de  jugement   subst it ut ifs  pert inent s  du   niveau  

d’at t eint e  vasculaire  et   sont   donc  prédict ifs  du   développement   d’at hérosclérose  et  

d’évènement s  cardiovasculaires.    L’ut ilisat ion   de  t els  marqueurs  phénot ypiques  permet t rait  

d’évaluer   précisément   le  niveau   d’at t eint e  vasculaire  des  pat ient s  suivis  facilit ant   ainsi  

l’évaluat ion   de  biomarqueurs  circulant s  d’oxydat ion   et   de  glycoxydat ion   en   associat ion   aux 

biomarqueurs  usuels  de  glycat ion   et   aux  aut res  fact eurs  de  risque  cardiovasculaire 

convent ionnels.  La  durée  d’une  t elle  ét ude  devra  êt re  suffisamment   longue  pour   const at er  

la survenue d’évènement s cardiovasculaires au  cours du  diabèt e de t ype 2 (5 à 10 ans). 

 
Les  valeurs  de  dosage  de  l’IM A  ret rouvées  dans  cet t e  ét ude  port ant   sur   des  pat ient s 

diabét iques  de  t ype  2  déséquilibrés  ne  sont   pas  comparables  à  celles  ret rouvées  dans  des 

ét udes  ant érieures  port ant   sur   des  populat ions  de  même  t ype.  En   effet ,  la  valeur   moyenne 

d’IM A  (DO)  ret rouvée  ici   est   de  0,410  +/ ‐  0,115   cont re  0,535  +/ ‐  0,125  (n=  80)  dans  l’ét ude 

  150
de Kaeffer  et  al  et  de 0,536 +/ ‐ 0,250 (n=290) dans l’ét ude de Shao  Gang et  al 114 . Ces deux 
115

ét udes  port ent   t out es  deux  sur   des  populat ions  de  pat ient s  diabét iques  de  t ype  2  à 

différent s  niveaux  d’HbA1c  et   différent s  niveaux  d’at t eint es  vasculaires.  Nous  const at ons 

donc  à  la  lect ure  de  ces  art icles  que  les  valeurs  d’IM A  ret rouvées  sont   faiblement  

reproduct ibles  d’une  ét ude  à  l’aut re.  Une  des  causes  pouvant   expliquer   cet t e  faible 

reproduct ibilit é  est   le  manque  de  st andardisat ion   de  cet t e  mét hode  qui   consist e  en   une 
2+ 
mesure opt ique simple de la colorat ion  résult ant  de la réact ion  ent re un   excès de Co après 
103
réact ion   colorée  avec  du   DTT .  Les  out ils  ut ilisés  (spect rophot omèt re)  et   la  qualit é  des 
2+
solut ions  mères  de  Co   et   de  DTT  (t ampon,  qualit é  et   conservat ion   des  subst ances  pures) 

varient  d’un  laborat oire à l’aut re.  

 
L’int érêt   nouveau   de  l’IM A  dans  l’évaluat ion   du   st ress  oxydant   et   du   risque  cardiovasculaire 
72,731,18
suscit e  aujourd’hui   des  ét udes  de  plus  en   plus  nombreuses .  La  st andardisat ion   de 

cet t e  mét hode  de  dosage  aux  moyens  de  solut ions  réact ives  commerciales  st andardisées  et   

l’ut ilisat ion   d’ét alons  permet t rait   d’améliorer   l’analyse  des  différent s  t ravaux  port ant   sur  

l’IM A  et   d’en   met t re  plus  facilement   en   évidence  l’int érêt   comme  biomarqueur   du   risque 

CVD.  

 
En   dehors  du   dosage  de  l’IM A,  le  développement   de  mét hodes  analyt iques  de  séparat ion   et  

de  dosage  des  différent es  fract ions  d’albumine  modifiée  au   cours  du   diabèt e  semble 

nécessaire  pour   ident ifier   quelles  fract ions  sont   direct ement   impliquées  dans  les 

mécanismes  physiopat hologiques  des  complicat ions  cardiovasculaires  du   diabèt e.  Dans  cet  

opt ique,  l’ut ilisat ion   de  mét hodes  élect rophorét iques   comme  l’élect rophorèse  capillaire  ou  

encore de mét hodes chromat ographiques comme l’HPLC‐M SM S  semble t out  à fait  indiquée. 

 
 

  151
  152
CONCLUSION
 
Les  complicat ions  cardiovasculaires  représent ent   la  principale cause  de  mort alit é  du   diabèt e 

de  t ype  2.  Ces  at t eint es  vasculaires  peuvent ,  même  en   l’absence  d’expression   clinique,  êt re 

d’apparit ion   précoce  et  évoluer   progressivement   t out   au   long  de  cet t e maladie mét abolique 

chronique  du   vieillissement .  L’ensemble  des  pat hologies  cardiovasculaires  ret rouvées  au  

cours  du   diabèt e  de  t ype  2  t rouvent   leur   origine  dans  le  dysfonct ionnement   init ial   des 

cellules de l’endot hélium  vasculaire. 

 
Le dysfonct ionnement  endot hélial  est  dû  au  st ress oxydant , via les effet s direct s néfast es des 

ROS  sur   la  biodisponibilit é  du   NO  ou   encore  par   act ivat ion   du   RAGE  sit ué  à  la  surface  de  ces 

cellules. 

 
Au  cours du  diabèt e de t ype 2, l’hyperglycémie est  associée à un  st ress oxydant  import ant  lié 

à  une  hyperproduct ion   de  ROS.  Nous  avons  pu   mont rer   que,  ces  phénomènes  combinés, 

amènent   à  des  modificat ions  st ruct urales  et   fonct ionnelles  complexes  de  l’albumine  par  

mécanisme glycoxydat if. Nous pouvons en  effet  ret rouver  au  cours du  diabèt e de t ype 2 à la 

fois des formes glyquées, des formes oxydées et  des formes glycoxydées (AGEs) d’albumine. 

 
L’ensemble  des  modificat ions  de  l’albumine  au   cours  du   diabèt e  va  alt érer   sa  capacit é  de 

liaison   aux  molécules  endogènes  et   exogènes  ainsi   que  son   pouvoir   ant ioxydant .  Au   delà  de 

ces  effet s,  nous  avons  pu   aussi   met t re  en   évidence  que  les  formes  modifiées  de  l’albumine 

pouvaient   générer   des  effet s  cellulaires  pro ‐inflammat oires  et   pro ‐oxydant s  sur   des 

monocyt es  et   des  adipocyt es  par   act ivat ion   de  la  voie  du   NF‐κB  et   par   une  augment at ion   de 

l’expression   du   RAGE  par   ces  cellules.  Ces  observat ions  rest ent   néanmoins  à  confirmer   sur  

un   modèle  de  cellules  endot héliales  avec  des  out ils  d’analyse  mécanist ique  des  voies 

d’act ivat ion   du   RAGE.  Néanmoins,  ces  élément s  confort ent   l’hypot hèse  selon   laquelle  les 

formes  modifiées  de  l’albumine  et   plus  cert ainement   les  formes  AGEs  auraient   une 

implicat ion   direct e  dans  la  physiopat hologie  des  complicat ions  vasculaires  du   diabèt e  en  

init iant  le phénomène de dysfonct ion  endot héliale. 

  153
 
Les  formes  modifiées  d’albumine  pourraient   donc  const it uer   des  biomarqueurs  pert inent s 

du   dépist age  précoce  de  l’at t eint e  vasculaire  et   permet t raient   d'améliorer   ainsi   la  prise  en  

charge  et   la  prévent ion   des  complicat ions  des  pat ient s  diabét iques  de  t ype  2.  Il   serait  

t out efois  ut ile  d’ident ifier   si   cert aines  de  ces  formes  d’albumine  modifiées  sont   plus 

direct ement   impliquées  dans  ces  effet s  cellulaires  pro ‐oxydant s  et   pro ‐inflammat oires  : 

formes glyquées, formes oxydées ou  encore formes glycoxydées (AGEs)?  

 
Dans  un   second   t emps  la  mise  au   point   d’une  mét hode  de  dosage  rapide,  st andardisée  et  

aut omat isable  de  ces  fract ions  par   mét hode  séparat ive,  colorimét rique  ou   encore 

immunologique  permet t rait   d'en   évaluer   plus  facilement   l'int érêt   au   cours  d'une  ét ude 

clinique prospect ive orient ée sur  le suivi  vasculaire d'une cohort e de pat ient s diabét iques de 

t ype 2 sur  plusieurs années.  

 
Pour   finir,  les  voies  glycoxydat ives  qui   mènent   aux  modificat ions  de  prot éines  circulant es  ou  

encore  à  l'act ivat ion   des  cellules  endot héliales  par   ces  mêmes  prot éines  modifiées 

pourraient   également   const it uer   des  cibles  pharmacologiques  d'int érêt   permet t ant   de 

ret arder  l'apparit ion  des complicat ions vasculaires du  diabèt e de t ype 2. 

  154
  155
  156
BIBLIOGRAPHIE
 
1  Joseph  JJ, Golden  SH. Type 2 diabet es and  cardiovascular  disease:  w hat  next ?.]. Curr  

Opin  Endocrinol  Diabet es Obes April  2014  2014;  21 :  109–20. 

2  Execut ive Summary:  St andards of  M edical  Care in  Diabet es‐‐2012. Diabet es Care 

2011;  35 :  S4–10. 

3  Cosson  E. [Diagnost ic crit eria for  gest at ional  diabet es mellit us]. J Gynécologie 

Obst ét rique Biol  Reprod  2010;  39 :  S239–50. 

4  M onnier  L. Diabét ologie. Issy‐les‐M oulineaux:  Elsevier  M asson, 2010. 

5  Fédérat ion  Int ernat ional  du  Diabèt e. At las du  Diabèt e 6ème Edit ion. 2013. 

ht t p:/ / w w w .idf.org/ sit es/ default / files/ FR_6E_At las_full.pdf. 

6  Fagot ‐Campagna A, Romon  I, Fosse S, Roudier  C. Prévalence et  incidence du  diabèt e, 

et  mort alit é liée au  diabèt e en  France – Synt hèse épidémiologique. 2010;  :  12. 

7  Favier  F, Jaussent  I, M oullec NL, et  al. Prevalence of  Type 2 diabet es and  cent ral  

adiposit y in  La Reunion  Island, t he REDIA St udy. Diabet es Res Clin  Pract  2005;  67 :  234–42. 

8  Fagot ‐Campagna A, Romon  I, Fosse S, Roudier  C. Prévalence et  incidence du  diabèt e, 

et  mort alit é liée au  diabèt e en  France – Synt hèse épidémiologique. 2010;  :  12. 

9  Execut ive Summary:  St andards of  M edical  Care in  Diabet es‐‐2012. Diabet es Care 

2011;  35 :  S4–10. 

10   American  Diabet es Associat ion. St andards of  medical  care in  diabet es‐‐2008. 

Diabet es Care 2008;  31  Suppl 1 :  S12–54. 

11   Procopiou  M . [HbA1c:  review  and  recent  development s]. Rev M édicale Suisse 2006;  

2 :  1473–4, 1476–9. 

12   Gillery P. [Assays of  HbA1c and  Amadori  product s in  human  biology]. Ann  Pharm  Fr  

2014;  72 :  330–6. 

13   Kow all  B, Rat hmann  W. HbA1c for  diagnosis of  t ype 2 diabet es. Is t here an  opt imal  

cut  point  t o  assess high  risk of  diabet es complicat ions, and  how  w ell  does t he 6.5% cut off  

perform? Diabet es M et ab  Syndr  Obes Target s Ther  2013;  :  477. 

14   Féry F, Paquot  N. [Et iopat hogenesis and  pat hophysiology of  t ype 2 diabet es]. Rev 

M édicale Liège 2005;  60 :  361–8. 

15   Donat h  M Y, Shoelson  SE. Type 2 diabet es as an  inflammat ory disease. Nat  Rev 

  157
Immunol  2011;  11 :  98–107. 

16   M uoio  DM , New gard  CB. M echanisms of  disease:  molecular  and  met abolic 

mechanisms of  insulin  resist ance and  bet a‐cell  failure in  t ype 2 diabet es. Nat  Rev M ol  Cell  

Biol  2008;  9 :  193–205. 

17   Pinget  M , Boullu ‐Sanchis S. [Physiological  basis of  insulin  secret ion  abnormalit ies]. 

Diabet es M et ab  2002;  28 :  4S21–32. 

18   Shoelson  SE, Lee J, Goldfine AB. Inflammat ion  and  insulin  resist ance. J Clin  Invest  

2006;  116 :  1793–801. 

19   M onnier  L, Thuan  J‐F. [Type 1 diabet es of  t he child  and  t he adult . Type 2 diabet es of  

t he adult . Complicat ions of  diabet es]. Rev Prat  2007;  57 :  653–64. 

20   Forbes JM , Cooper  M E. M echanisms of  Diabet ic Complicat ions. Physiol  Rev 2013;  93 :  

137–88. 

21   M urray CJ, Lopez AD. Global  mort alit y, disabilit y, and  t he cont ribut ion  of  risk fact ors:  

Global  Burden  of  Disease St udy. Lancet  1997;  349 :  1436–42. 

22   Romon  I, Fosse S, Eschw ège E, et  al. Prevalence of  macrovascular  complicat ions and  

cardiovascular  risk fact ors in  people t reat ed  for  diabet es and  living in  France:  t he ENTRED 

st udy 2001. Diabet es M et ab  2008;  34 :  140–7. 

23   Kannel  WB. Framingham  st udy insight s on  diabet es and  cardiovascular  disease. Clin  

Chem  2011;  57 :  338–9. 

24   Joseph  JJ, Golden  SH. Type 2 diabet es and  cardiovascular  disease:  w hat  next ?. 

[M iscellaneous Art icle]. Curr  Opin  Endocrinol  Diabet es Obes April  2014 2014;  21 :  109–20. 

25   Lago  RM , Nest o  RW. Type 2 diabet es and  coronary heart  disease:  focus on  

myocardial  infarct ion. Curr  Diab  Rep  2009;  9 :  73–8. 

26   St rat t on  IM , Adler  AI, Neil  HA, et  al. Associat ion  of  glycaemia w it h  macrovascular  and  

microvascular  complicat ions of  t ype 2 diabet es (UKPDS 35):  prospect ive observat ional  st udy. 

BM J 2000;  321 :  405–12. 

27   Adler  AI, St rat t on  IM , Neil  HA, et  al. Associat ion  of  syst olic blood  pressure w it h  

macrovascular  and  microvascular  complicat ions of  t ype 2 diabet es (UKPDS 36):  prospect ive 

observat ional  st udy. BM J 2000;  321 :  412–9. 

28   Colhoun  HM , Bet t eridge DJ, Durringt on  PN, et  al. Primary prevent ion  of  

cardiovascular  disease w it h  at orvast at in  in  t ype 2 diabet es in  t he Collaborat ive At orvast at in  

Diabet es St udy (CARDS):  mult icent re randomised  placebo ‐cont rolled  t rial. Lancet  2004;  364 :  

  158
685–96. 

29   Diehm  C, Kareem  S, Law all  H. Epidemiology of  peripheral  art erial  disease. VASA Z Für  

Gefässkrankh  2004;  33 :  183–9. 

30   Set hi  A, Arora RR. M edical  management  and  cardiovascular  risk reduct ion  in  

peripheral  art erial  disease. Exp  Clin  Cardiol  2008;  13 :  113–9. 

31   WHO |  The w orld  healt h  report  2003 ‐ shaping t he fut ure. WHO. 2014;  published  

online July 8. ht t p:/ / w w w .w ho.int / w hr/ 2003/ en/  (accessed  July 8, 2014). 

32   Bonora E, Tessari  R, M icciolo  R, et  al. Int imal ‐medial  t hickness of  t he carot id  art ery in  

nondiabet ic and  NIDDM  pat ient s. Relat ionship  w it h  insulin  resist ance. Diabet es Care 1997;  

20 :  627–31. 

33   Shah  AS, Dolan  LM , Kimball  TR, et  al. Influence of  durat ion  of  diabet es, glycemic 

cont rol, and  t radit ional  cardiovascular  risk fact ors on  early at herosclerot ic vascular  changes 

in  adolescent s and  young adult s w it h  t ype 2 diabet es mellit us. J Clin  Endocrinol  M et ab  2009;  

94 :  3740–5. 

34   Park SW, Kim  SK, Cho  Y‐W, et  al. Insulin  resist ance and  carot id  at herosclerosis in  

pat ient s w it h  t ype 2 diabet es. At herosclerosis 2009;  205 :  309–13. 

35   Coccheri  S. Approaches t o  prevent ion  of  cardiovascular  complicat ions and  event s in  

diabet es mellit us. Drugs 2007;  67 :  997–1026. 

36   M ulvany M J, Aalkjaer  C. St ruct ure and  funct ion  of  small  art eries. Physiol  Rev 1990;  

70 :  921–61. 

37   M ichiels C. Endot helial  cell  funct ions. J Cell  Physiol  2003;  196 :  430–43. 

38   Robert s AC, Port er  KE. Cellular  and  molecular  mechanisms of  endot helial  dysfunct ion  

in  diabet es. Diabet es Vasc Dis Res Off  J Int  Soc Diabet es Vasc Dis 2013;  10 :  472–82. 

39   Sena CM , Pereira AM , Seiça R. Endot helial  dysfunct ion  —  A major  mediat or  of  

diabet ic vascular  disease. Biochim  Biophys Act a  BBA ‐ M ol  Basis Dis 2013;  1832 :  2216–31. 

40   Galkina E, Ley K. Immune and  inflammat ory mechanisms of  at herosclerosis (* ). Annu  

Rev Immunol  2009;  27 :  165–97. 

41   Koulikoff  F, Jeunemaît re X. Coupe schémat ique d’une art ère saine et  d’une art ère 

at héroscléreuse. Dossier  Inserm  :  At herosclerose. . 

42   M ünzel  T, Daiber  A, Ullrich  V, M ülsch  A. Vascular  Consequences of  Endot helial  Nit ric 

Oxide Synt hase Uncoupling for  t he Act ivit y and  Expression  of  t he Soluble Guanylyl  Cyclase 

and  t he cGM P‐Dependent  Prot ein  Kinase. Art erioscler  Thromb  Vasc Biol  2005;  25 :  1551–7. 

  159
43   Rask‐M adsen  C, King GL. Vascular  Complicat ions of  Diabet es: M echanisms of  Injury 

and  Prot ect ive Fact ors. Cell  M et ab  2013;  17 :  20–33. 

44   deGoma EM , Leeper  NJ, Heidenreich  PA. Clinical  significance of  high ‐densit y 

lipoprot ein  cholest erol  in  pat ient s w it h  low  low ‐densit y lipoprot ein  cholest erol. J Am  Coll  

Cardiol  2008;  51 :  49–55. 

45   Yusuf  S, Haw ken  S, Ounpuu  S, et  al. Effect  of  pot ent ially modifiable risk fact ors 

associat ed  w it h  myocardial  infarct ion  in  52 count ries (t he INTERHEART st udy):  case‐cont rol  

st udy. Lancet  2004;  364 :  937–52. 

46   Walldius G, Jungner  I. The apoB/ apoA‐I rat io:  a st rong, new  risk fact or  for  

cardiovascular  disease and  a t arget  for  lipid ‐low ering t herapy‐‐a review  of  t he evidence. J 

Int ern  M ed  2006;  259 :  493–519. 

47   Holman  RR, Paul  SK, Bet hel  M A, Neil  HAW, M at t hew s DR. Long‐t erm  follow ‐up  aft er  

t ight  cont rol  of  blood  pressure in  t ype 2 diabet es. N Engl  J M ed  2008;  359 :  1565–76. 

48   Lee WL, Cheung AM , Cape D, Zinman  B. Impact  of  diabet es on  coronary art ery 

disease in  w omen  and  men:  a met a‐analysis of  prospect ive st udies. Diabet es Care 2000;  23 :  

962–8. 

49   Bullen  C. Impact  of  t obacco  smoking and  smoking cessat ion  on  cardiovascular  risk 

and  disease. Expert  Rev Cardiovasc Ther  2008;  6 :  883–95. 

50   Yusuf  S, Haw ken  S, Ounpuu  S, et  al. Obesit y and  t he risk of  myocardial  infarct ion  in  

27,000 part icipant s from  52 count ries:  a case‐cont rol  st udy. Lancet  2005;  366 :  1640–9. 

51   ANAES. M ét hodes d’évaluat ion  du  risque cardiovasculaire. 2004. 

52   Wilson  PW, D’Agost ino  RB, Levy D, Belanger  AM , Silbershat z H, Kannel  WB. Predict ion  

of  coronary heart  disease using risk fact or  cat egories. Circulat ion  1998;  97 :  1837–47. 

53   Haffner  SM , Leht o  S, Rönnemaa T, Pyörälä K, Laakso  M . M ort alit y from  coronary 

heart  disease in  subject s w it h  t ype 2 diabet es and  in  nondiabet ic subject s w it h  and  w it hout  

prior  myocardial  infarct ion. N Engl  J M ed  1998;  339 :  229–34. 

54   Assmann  G, Cullen  P, Schult e H. Simple scoring scheme for  calculat ing t he risk of  

acut e coronary event s based  on  t he 10‐year  follow ‐up  of  t he prospect ive cardiovascular  

M ünst er  (PROCAM ) st udy. Circulat ion  2002;  105 :  310–5. 

55   Vinereanu  D. Risk fact ors for  at herosclerot ic disease:  present  and  fut ure. Herz 2006;  

31  Suppl 3 :  5–24. 

56   Haleng J, Pincemail  J, Defraigne JO, Charlier  C, Chapelle JP. [Oxidat ive st ress]. Rev 

  160
M édicale Liège 2007;  62 :  628–38. 

57   Gillery P. [Oxidat ive st ress and  prot ein  glycat ion  in  diabet es mellit us]. Ann  Biol  Clin  

(Paris) 2006;  64 :  309–14. 

58   Delat t re J, Bonnefont ‐Rousselot  D, Bordas‐Fonfrèdre M , Jaudon  M . [Diabet es mellit us 

and  oxidat ive st ress]. Ann  Biol  Clin  (Paris) 1999;  57 :  437–44. 

59   Chiarelli  F, M ohn  A. Angiopat hy in  children  w it h  diabet es. M inerva  Pediat r  2002;  54 :  

187–201. 

60   Bonnefont ‐Rousselot  D. Glucose and  react ive oxygen  species. Curr  Opin  Clin  Nut r  

M et ab  Care 2002;  5 :  561–8. 

61   Bonnefont ‐Rousselot  D, Beaudeux J‐L, Thérond  P, Peynet  J, Legrand  A, Delat t re J. 

[Diabet es mellit us, oxidat ive st ress and  advanced  glycat ion  endproduct s]. Ann  Pharm  Fr  

2004;  62 :  147–57. 

62   Bourdon  E, Blache D. The import ance of  prot eins in  defense against  oxidat ion. 

Ant ioxid  Redox Signal  2001;  3 :  293–311. 

63   Rondeau  P, Bourdon  E. The glycat ion  of  albumin:  St ruct ural  and  funct ional  impact s. 

Biochimie 2011;  93 :  645–58. 

64   Roche M , Rondeau  P, Singh  NR, Tarnus E, Bourdon  E. The ant ioxidant  propert ies of  

serum  albumin. FEBS Let t  2008;  582 :  1783–7. 

65   Bourdon  E, Loreau  N, Lagrost  L, Blache D. Different ial  effect s of  cyst eine and  

met hionine residues in  t he ant ioxidant  act ivit y of  human  serum  albumin. Free Radic Res 

2005;  39 :  15–20. 

66   Aruoma OI, Landes B, Ramful ‐Baboolall  D, et  al. Funct ional  benefit s of  cit rus fruit s in  

t he management  of  diabet es. Prev M ed  2012;  54,  Supplement :  S12–6. 

67   Hat ia S, Sept embre‐M alat erre A, Le Sage F, et  al. Evaluat ion  of  ant ioxidant  propert ies 

of  major  diet ary polyphenols and  t heir  prot ect ive effect  on  3T3‐L1  preadipocyt es and  red  

blood  cells exposed  t o  oxidat ive st ress. Free Radic Res 2014;  48 :  387–401. 

68   Place des produit s de glycat ion  avancés (AGEs) dans les complicat ions du  diabèt e. 

EM ‐Consult e. 2014;  published  online July 9. ht t p:/ / w w w .em ‐

consult e.com/ art icle/ 277761/ figures/ place‐des‐produit s‐de‐glycat ion ‐avances‐lagesr ‐dan  

(accessed  July 9, 2014). 

69   Bar–Or  D, Lau  E, Winkler  JV. A novel  assay for  cobalt ‐albumin  binding and  it s 

pot ent ial  as a marker  for  myocardial  ischemia—a preliminary report . J Emerg  M ed  2000;  19 :  

  161
311–5. 

70   Bar ‐Or  D, Curt is G, Rao  N, Bampos N, Lau  E. Charact erizat ion  of  t he Co2+ and  Ni2+ 

binding amino ‐acid  residues of  t he N‐t erminus of  human  albumin. Eur  J Biochem  2001;  268 :  

42–8. 

71   Bar ‐Or  D, Rael  LT, Bar ‐Or  R, et  al. The cobalt –albumin  binding assay:  Insight s int o  it s 

mode of  act ion. Clin  Chim  Act a  2008;  387 :  120–7. 

72   Zhong Y, Wang N, Xu  H, Hou  X, Xu  P, Zhou  Z. Ischemia‐modified  albumin  in  st able 

coronary at herosclerot ic heart  disease: clinical  diagnosis and  risk st rat ificat ion. Coron  Art ery 

Dis 2012;  23 :  538–41. 

73   Gunduz A, Turedi  S, M ent ese A, et  al. Ischemia‐modified  albumin  levels in  

cerebrovascular  accident s. Am  J Emerg  M ed  2008;  26 :  874–8. 

74   Dominguez‐Rodriguez A, Abreu ‐Gonzalez P. Current  role of  ischemia‐modified  

albumin  in  rout ine clinical  pract ice. Biomarkers 2010;  15 :  655–62. 

75   Piw ow ar  A, Knapik‐Kordecka M , Warw as M . Ischemia‐M odified  albumin  level  in  t ype 

2 diabet es mellit us—Preliminary report . Dis M arkers 2008;  24 :  311–7. 

76   Baraka‐Vidot  J, Navarra G, Leone M , Bourdon  E, M ilit ello  V, Rondeau  P. Deciphering 

met al ‐induced  oxidat ive damages on  glycat ed  albumin  st ruct ure and  funct ion. Biochim  

Biophys Act a  BBA ‐ Gen  Subj  2014;  published  online Feb  17. 

DOI:10.1016/ j.bbagen.2013.12.017. 

77   Rondeau  P, Singh  NR, Caillens H, Tallet  F, Bourdon  E. Oxidat ive st resses induced  by 

glycoxidized  human  or  bovine serum  albumin  on  human  monocyt es. Free Radic Biol  M ed  

2008;  45 :  799–812. 

78   Gillery P. [Advanced  glycat ion  end  product s (AGEs), free radicals and  diabet es]. J 

Sociét é Biol  2001;  195 :  387–90. 

79   Anguizola J, M at suda R, Barnaby OS, et  al. Review :  Glycat ion  of  human  serum  

albumin. Clin  Chim  Act a  2013;  425 :  64–76. 

80   Gillery P, Jaisson  S. Post ‐t ranslat ional  modificat ion  derived  product s (PTM DPs):  t oxins 

in  chronic diseases? Clin  Chem  Lab  M ed  2014;  52 . DOI:10.1515/ cclm ‐2012 ‐0880. 

81   Waut hier  J. Produit s avancés de glycat ion  AGE et  complicat ions vasculaires dans le 

diabèt e. médecine/ sciences 1994;  10 :  1165. 

82   Waut ier  J‐L, Waut ier  M ‐P. Produit s de glycat ion  avancée et  syst ème vasculaire. 

/ dat a/ revues/ 19572557/ 00040006/ 633/  2010;  published  online Dec 30. ht t p:/ / w w w .em ‐

  162
consult e.com/ en/ art icle/ 277760 (accessed  July 9, 2014). 

83   Place des produit s de glycat ion  avancés (AGEs) dans les complicat ions du  diabèt e. 

EM ‐Consult e. ht t p:/ / w w w .em ‐consult e.com/ art icle/ 277761/ figures/ place‐des‐produit s‐de‐

glycat ion ‐avances‐lagesr ‐dan  (accessed  July 9, 2014). 

84   Singh  R, Kaur  N, Kishore L, Gupt a GK. M anagement  of  diabet ic complicat ions:  a 

chemical  const it uent s based  approach. J Et hnopharmacol  2013;  150 :  51–70. 

85   Bourdon  E, Loreau  N, Blache D. Glucose and  free radicals impair  t he ant ioxidant  

propert ies of  serum  albumin. FASEB J Off  Publ  Fed  Am  Soc Exp  Biol  1999;  13 :  233–44. 

86   Chilelli  NC, Burlina S, Lapolla A. AGEs, rat her  t han  hyperglycemia, are responsible 

for  microvascular  complicat ions in  diabet es:  A ‘glycoxidat ion ‐cent ric’  point  of  view . Nut r  

M et ab  Cardiovasc Dis 2013;  23 :  913–9. 

87   Grossin  N, Boulanger  E, Waut ier  M ‐P, Waut ier  J‐L. The different  isoforms of  t he 

recept or  for  advanced  glycat ion  end  product s are modulat ed  by pharmacological  agent s. 

Clin  Hemorheol  M icrocirc 2010;  45 :  143–53. 

88   Kalea AZ, Schmidt  AM , Hudson  BI. RAGE:  a novel  biological  and  genet ic marker  for  

vascular  disease. Clin  Sci  Lond  Engl  1979  2009;  116 :  621–37. 

89   Gillery P. [Advanced  glycat ion  end  product s (AGEs), free radicals and  diabet es]. J 

Sociét é Biol  2001;  195 :  387–90. 

90   Schmidt  AM , Yan  SD, Yan  SF, St ern  DM . The mult iligand  recept or  RAGE as a 

progression  fact or  amplifying immune and  inflammat ory responses. J Clin  Invest  2001;  108 :  

949–55. 

91   Waut hier  J. Produit s avancés de glycat ion  AGE et  complicat ions vasculaires dans le 

diabèt e. médecine/ sciences 1994;  10 :  1165. 

92   Gaw dzik J, M at hew  L, Kim  G, Puri  TS, Hofmann  Bow man  M A. Vascular  remodeling 

and  art erial  calcificat ion  are direct ly mediat ed  by S100A12 (EN‐RAGE) in  chronic kidney 

disease. Am  J Nephrol  2011;  33 :  250–9. 

93   Chaw la D, Bansal  S, Banerjee BD, M adhu  SV, Kalra OP, Tripat hi  AK. Role of  advanced  

glycat ion  end  product  (AGE)‐induced  recept or  (RAGE) expression  in  diabet ic vascular  

complicat ions. M icrovasc Res 2014;  95C:  1–6. 

94   Yan  SD, St ern  D, Kane M D, Kuo  YM , Lampert  HC, Roher  AE. RAGE‐Abet a int eract ions 

in  t he pat hophysiology of  Alzheimer’s disease. Rest or  Neurol  Neurosci  1998;  12 :  167–73. 

95   Taguchi  A, Blood  DC, del  Toro  G, et  al. Blockade of  RAGE‐amphot erin  signalling 

  163
suppresses t umour  grow t h  and  met ast ases. Nat ure 2000;  405 :  354–60. 

96   Daffu  G, del  Pozo  CH, O’Shea KM , Anant hakrishnan  R, Ramasamy R, Schmidt  AM . 

Radical  roles for  RAGE in  t he pat hogenesis of  oxidat ive st ress in  cardiovascular  diseases and  

beyond. Int  J M ol  Sci  2013;  14 :  19891–910. 

97   Cart er  DC, Ho  JX. St ruct ure of  Serum  Albumin. In:  C.B. Anfinsen  JTE, Frederic M . 

Richards and  David  S. Eisenberg, ed. Advances in  Prot ein  Chemist ry. Academic Press, 1994:  

153–203. 

98   Guerin ‐Dubourg A, Cat an  A, Bourdon  E, Rondeau  P. St ruct ural  modificat ions of  

human  albumin  in  diabet es. Diabet es M et ab  2012;  38 :  171–8. 

99   Baraka‐Vidot  J, Guerin ‐Dubourg A, Bourdon  E, Rondeau  P. Impaired  drug‐binding 

capacit ies of  in  vit ro  and  in  vivo  glycat ed  albumin. Biochimie 2012;  94 :  1960–7. 

100   Zmat liková Z, Sedláková P, Lacinová K, Eckhardt  A, Pat aridis S, M ikšík I. Non ‐

enzymat ic post t ranslat ional  modificat ions of  bovine serum  albumin  by oxo ‐compounds 

invest igat ed  by high ‐performance liquid  chromat ography‐mass spect romet ry and  capillary 

zone elect rophoresis‐mass spect romet ry. J Chromat ogr  A 2010;  1217 :  8009–15. 

101   Ahmad  W, Li  L, Deng Y. Ident ificat ion  of  AGE‐precursors and  AGE format ion  in  

glycat ion ‐induced  BSA pept ides. BM B Rep  2008;  41 :  516–22. 

102   Thornalley PJ, Rabbani  N. Det ect ion  of  oxidized  and  glycat ed  prot eins in  clinical  

samples using mass spect romet ry —  A user’s perspect ive. Biochim  Biophys Act a  BBA ‐ Gen  

Subj  2014;  1840 :  818–29. 

103   Lee E, Eom  J‐E, Jeon  K‐H, et  al. Evaluat ion  of  albumin  st ruct ural  modificat ions t hrough  

cobalt ‐albumin  binding (CAB) assay. J Pharm  Biomed  Anal  2014;  91 :  17–23. 

104   Cohen  M P, Shea E, Chen  S, Shearman  CW. Glycat ed  albumin  increases oxidat ive 

st ress, act ivat es NF‐κB and  ext racellular  signal ‐regulat ed  kinase (ERK), and  st imulat es ERK‐

dependent  t ransforming grow t h  fact or ‐β1 product ion  in  macrophage RAW  cells. J Lab  Clin  

M ed  2003;  141 :  242–9. 

105   Albert i  KGM M , Zimmet  P, Shaw  J. Int ernat ional  Diabet es Federat ion:  a consensus on  

Type 2 diabet es prevent ion. Diabet  M ed  J Br  Diabet  Assoc 2007;  24 :  451–63. 

106   Ndong JR, Romon  I, Druet  C, et  al. Caract érist iques, risque vasculaire, complicat ions 

et  qualit é des soins des personnes diabét iques dans les départ ement s d’out re‐mer  et  

comparaison  à la mét ropole :  Ent red  2007‐2010, France. 2010 

ht t p:/ / opac.invs.sant e.fr/ index.php?lvl=not ice_display& id=502. 

  164
107   WHO |  Use of  glycat ed  haemoglobin  (HbA1c) in  t he diagnosis of  diabet es mellit us. 

WHO. 2014;  published  online Jan  13. 

ht t p:/ / w w w .w ho.int .gat e2.inist .fr/ diabet es/ publicat ions/ diagnosis_diabet es2011/ en/  

(accessed  Jan  13, 2014). 

108   Fox CS. Cardiovascular  Disease Risk Fact ors, Type 2 Diabet es M ellit us, and  t he 

Framingham  Heart  St udy. Trends Cardiovasc M ed  2010;  20 :  90–5. 

109   Furusyo  N, Hayashi  J. Glycat ed  albumin  and  diabet es mellit us. Biochim  Biophys Act a  

BBA ‐ Gen  Subj  2013;  1830 :  5509–14. 

110   Song SO, Kim  KJ, Lee B‐W, Kang ES, Cha BS, Lee HC. Serum  glycat ed  albumin  predict s 

t he progression  of  carot id  art erial  at herosclerosis. At herosclerosis 2012;  225 :  450–5. 

111   Roy D, Kaski  JC. Ischemia‐M odified  Albumin:  The Import ance of  Oxidat ive St ress. J Am  

Coll  Cardiol  2007;  49 :  2375–6. 

112   Sbarouni  E, Georgiadou  P, Voudris V. Ischemia modified  albumin  changes – review  

and  clinical  implicat ions. Clin  Chem  Lab  M ed  2011;  49 . DOI:10.1515/ CCLM .2011.037. 

113   Baraka‐Vidot  J, Guerin ‐Dubourg A, Dubois F, Payet  B, Bourdon  E, Rondeau  P. New  

insight s int o  delet erious impact s of  in  vivo  glycat ion  on  albumin  ant ioxidant  act ivit ies. 

Biochim  Biophys Act a  BBA ‐ Gen  Subj  2013;  1830 :  3532–41. 

114   Shao ‐gang M a, Shao ‐gang M a, Yao  Jin, et  al. Evaluat ion  of  Ischemia‐M odified  

Albumin  and  C‐React ive Prot ein  in  Type 2 Diabet ics Wit h  and  Wit hout  Ket osis. Biomark 

Insight s 2012;  :  19. 

115   Kaefer  M , Piva SJ, De Carvalho  JAM , et  al. Associat ion  bet w een  ischemia modified  

albumin, inflammat ion  and  hyperglycemia in  t ype 2 diabet es mellit us. Clin  Biochem  2010;  

43 :  450–4. 

116   Giacco  F, Brow nlee M . Oxidat ive St ress and  Diabet ic Complicat ions. Circ Res 2010;  

107 :  1058–70. 

117   Ho  E, Karimi  Galougahi  K, Liu  C‐C, Bhindi  R, Figt ree GA. Biological  markers of  oxidat ive 

st ress:  Applicat ions t o  cardiovascular  research  and  pract ice. Redox Biol  2013;  1 :  483–91. 

118   M a S‐G, Wei  C‐L, Hong B, Yu  W ‐N. Ischemia‐modified  albumin  in  t ype 2 diabet ic 

pat ient s w it h  and  w it hout  peripheral  art erial  disease. Clinics 2011;  66 :  1677–80. 

119   Kat akami  N, Kanet o  H, Shimomura I. Carot id  ult rasonography:  A pot ent  t ool  for  

bet t er  clinical  pract ice in  diagnosis of  at herosclerosis in  diabet ic pat ient s. J Diabet es Invest ig  

2014;  5 :  3–13. 

  165
120   Liao  J, Farmer  J. Art erial  st iffness as a risk fact or  for  coronary art ery disease. Curr  

At heroscler  Rep  2014;  16 :  387. 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

  166
  167
  168
Abstract

Structural and functional impairments of albumin in type 2 diabetes – Focus on


cardiovascular disease-associated biomarker identification
 
 
Type  2  diabet es  is  dramat ically  associat ed   w it h   an   enhanced   cardiovascular   complicat ion   risk.  The 

ident ificat ion   of   novel   biomarkers  associat ed   w it h   endot helial   dysfunct ion   remains  highly  w arrant ed  

t o   improve  diabet es  screening  and   prevent ion.  Oxidat ive  st ress  and   prot ein   modificat ions  are 

frequent ly  observed   in   numerous  disease  st at es.  Albumin,  t he  major   circulat ing  prot ein   in   blood,  can  

undergo   increased   glycoxidat ion   in   diabet es.  Object ives  of   my  t hesis  w ere  t o   clarify  t he  impact   of  

glycoxidat ive  modificat ion   of   albumin   on   it s  st ruct ure  and   it s  funct ions  and   t o   det ermine  w het her  

such   impairment s  may  be  encount ered   in   albumin   purified   from   diabet ics.  The  occurrence  of  

oxidat ive  modificat ions  w as  found   t o   be  enhanced   in   vit ro   glycoxidized   HSA  and   albumin   purified  

from   diabet ics,  aft er   det erminat ion   of   t heir   free  t hiol   group   cont ent ,  relat ive  elect rophoret ic 

migrat ion,  carbonyl   cont ent ,  and   ant ioxidant   act ivit ies.    In   addit ion,  glycoxidized   albumin   exhibit ed  

impaired  pharmaceut ic molecule binding capacit ies. Cells t reat ed  w it h  glycoxidized  albumin  exhibit ed  

a  proinflammat ory  st at e  at t est ed   by  an   overgenerat ion   of   int racellular   react ive  oxygen   species, 

enhancement s in  RAGE expression, and  an  accumulat ion  of  carbonylat ed  prot eins. M et hods t o  det ect  

IM A  (ischemia  modified   albumin)  w ere  developed   and   applied   t o   diabet ics  pat ient s.  Relat ionships 

have  been   est ablished   bet w een   specific  pat hological   paramet ers  (cardiovascular   disorders, 

hyperglycemia…)  w it h   an   enhanced   glycoxidat ive  modificat ion   of   albumin   in   diabet ics.  We  t hus 

propose  t hat   impaired   albumin   st ruct ure  and   funct ion   in   relat ion   in   t he  enhanced   oxidant   st ress 

observed  in  diabet ics might  be involved  in  t he increased  mort alit y risk of  t hese pat ient s. 
 
 
Subject :  Biochemist ry and  molecular  biology 
 
 
Keyw ords  :   Type  2  Diabet es,  endot helial   dysfunct ion,  albumin,  oxydat ive  st ress,  glycoxydat ion,  AGEs, 
RAGE, IM A 

  169
Résumé

Etude des modifications structurales et fonctionnelles de l’albumine dans le


diabète de type 2 : identification de biomarqueurs de glycoxydation et de facteurs de
risque de complications vasculaires

La mort alit é du  diabèt e de t ype 2 est  liée à ses complicat ions cardiovasculaires (CVD). L’ident ificat ion  

de  nouveaux  biomarqueurs  associés  à  la  dysfonct ion   endot héliale,  permet t rait   d  ‘en   améliorer   le 

dépist age, la prévent ion.  

Au   cours  du   diabèt e  de  t ype  2,  l’hyperglycémie  est   associée  à  un   fort   st ress    oxydant .  Nous  nous 

sommes  proposés  ici   d’évaluer   l’impact   de  la  glycoxydat ion   sur   la  principale  prot éine  circulant e, 

l’albumine,   et   d’ident ifier   si   les  modificat ions  glycoxydat ives   de  l’albumine  dans  le  diabèt e  avait   un  

rôle  dans  la  physiopat hologie  des  CVD  du   diabèt e  de  t ype  2.  Nous  avons  pu   met t re  en   évidence  des 

modificat ions  st ruct urales  et   fonct ionnelles  import ant es  de  l’albumine  au   cours  du   diabèt e  de  t ype  2 

avec  la  format ion   ent re  aut res  de  produit s  avancés  de  glycat ion   (AGEs).  Ces  modificat ions 

glycoxydat ives  sont   associées  à  des  effet s  cellulaires  pro ‐oxydant   et   pro ‐inflammat oire  via  une 

augment at ion  de l’expression  du  RAGE. 

Ces  observat ions  suggèrent   que  les  formes  glycoxydées  d’albumine  présent ent   un   rôle  cent ral   dans 

les  mécanismes  menant   à  la  dysfonct ion   endot héliale.  Il   rest e  néanmoins  à  évaluer   l’int érêt   du  

dosage  des  formes  modifiées  de  l’albumine  dans  le  dépist age  des  CVD  au   cours  d’une  ét ude  clinique 

prospect ive de grande ampleur. Le développement  d’une mét hode de dosage rapide et  reproduct ible 

des  fract ions  d’albumine  modifiées,  comme  celui   de  l’IM A  (albumine  modifiée  par   l’ischémie),  en  

facilit erait  la mise en  œuvre.  


 
 
 
Discipline:  Biochimie et  biologie moléculaire 
 
 
M ot s‐clés :   Diabèt e  t ype  2,  dysfonct ion   endot héliale,  albumine,  st ress  oxydant ,  glycoxydat ion,  AGEs, 
RAGE, IM A 

  170