PRACTICA COCOS GRAM POSITIVOS

GENERO Staphylococcus

OBJETIVOS
 Conocer las principales especies del genero Staphylococcus.
 Aprender a interpretar las pruebas de identificación para las principales especies de
Staphylococcus.
 Conocer la importancia clínica de las diferentes especies de Staphylococcus.

MARCO TEORICO

El género Staphylococcus pertenecen a la familia Micrococcaceae. El género Staphylococcus

está compuesta por 33 especies, 17 de las cuales pueden encontrarse causando infección en el
hombre. Se encuentra como flora normal en piel y en mucosas. Por ejemplo S. capitis se
encuentra en el cuero cabelludo y en piel, S. auricularis en el canal auditivo externo. Los
principales estafilococos que causan enfermedad en el hombre son los siguientes:

Staphylococcus aureus: Es el patógeno más importante, se encuentra en el ambiente y en un 20 a

40% en la fosa nasal anterior de las personas adultas. Puede ser causante de diferentes procesos
infecciosos que van desde una infección relativamente benigna en piel a una infección sistémica
que puede comprometer la vida y que incluyen neumonía, osteomielitis, endocarditis bacteriana. A
nivel hospitalario es el principal agente aislado en infecciones del sitio operatorio. Aunque es
considerado como flora normal, puede causar infecciones oportunistas en condiciones
determinadas como Inmunodeficiencias, heridas en piel, presencia de cuerpos extraños como
suturas, líneas intravenosas etc.

Posee el Staphylococcus aureus factores de virulencia que contribuyen en su habilidad de causar

enfermedades, tales como:
 Formación de cápsula
 Constituyentes de la pared celular
 Enzimas
 Hemolisinas
 Toxinas

Staphylococcus epidermidis: Es el Staphylococcus más frecuentemente aislado en muestras

clínicas; esta involucrado en infecciones como endocarditis, osteomielitis, bacteremia, infección del
tracto urinario y coloniza sitios donde se encuentren cuerpos extraños como catéteres, prótesis,
válvulas etc. Las cepas de S. epidermidis sintetizan unas macromoléculas en la pared celular y
extracelular que inicia y aumenta la adhesión a superficies plásticas de los cuerpos extraños, la
adhesión especifica de algunas cepas de S. epidermidis parece ser mediada por una adhesina del
polisacárido capsular llamado PS/A.

Staphylococcus saprophyticus: Este patógeno causa infecciones agudas principalmente en el

tracto urinario de personas sanas, jóvenes y en mujeres sexualmente activas. En esta población el
S. saprophyticus es el segundo germen causante de cistitis después de la Escherichia coli.
Estudios “in vitro” han demostrado que el S. saprophyticus se adhiere a células epiteliales de la
uretra, este tropismo que posee hacia el tejido uroepitelial puede parcialmente explicar la alta
frecuencia de infecciones en el tracto urinario causadas por este microorganismo.

IDENTIFICACION DE LAS ESPECIES DEL GENERO Staphylococcus

1. Coloración de Gram: a la tinción de Gram se observan cocos Gram positivos que se agrupan de
forma irregular, en tétradas o en racimos. Miden de 0.5 a 1.0 µm de diámetro, son inmóviles,
aerobios y anaerobios facultativos, crecen fácilmente en medios comunes y presentan cierta
resistencia a agentes externos.
2. Medio de cultivo: Las muestras son sembradas en agar sangre, incubadas a 37ºC, requieren 24
horas de incubación. Algunas cepas de S. aureus producen un pigmento amarillo o amarillo
naranja pero otras cepas pueden producir colonias grises o blancas.

3. Tipo de hemólisis: Algunas cepas de S. aureus producen hemólisis tipo Beta alrededor de las
colonias en agar sangre.

4. Prueba de catalasa: La familia Micrococcaceae es diferenciada de la familia Streptococcacea

por la prueba de catalasa. Esta prueba detecta la presencia de las enzimas citocromo oxidasa en
la familia Micrococcaceae. La catalasa es una enzima que desdobla el peróxido de hidrogeno
(H2O2) en agua y oxigeno. El H2O2 es el producto final del metabolismo aeróbico de los hidratos de
carbono.

Género Staphylococcus CATALASA POSITIVA

Género Streptococcus CATALASA NEGATIVA

Técnica:
 Colocar en la lámina portaobjetos una o dos gotas de H2O2 al 3%.
 Tomar una colonia con el asa curva. Colocarla en contacto con el H2O2
 Si observa la producción de burbujas es una prueba POSITIVA

5. Prueba de la coagulasa: La característica más confiable para la identificaron de S. aureus es la

prueba de la coagulasa, pues posee una enzima proteica capaz de transformar el fibrinógeno en
fibrina, provocando la formación de un coagulo visible que indica una reacción positiva. Existen dos
tipos de coagulasa:

Coagulasa fija o “factor clumping”: La mayoría de las cepas de S. aureus tienen una coagulasa
ligada o “factor clumping” en la superficie de la pared celular. Este factor reacciona directamente
con el fibrinógeno presente en el plasma causando una rápida aglutinación celular.
Coagulasa libre: Esta coagulasa es secretada extracelularmente y reacciona con un substrato en
el plasma llamado “factor reactante de coagulasa” formando un complejo que transforma el
fibrinógeno en fibrina (formación del coagulo).

Técnica:
 Tomar una colonia del cultivo con el asa curva y colocarla en un tubo con 0.5 ml de plasma
fresco e incubar a 37ºC.
 Observar a partir de las cuatro horas siguientes para ver la si hay formación del coagulo.

Prueba de la coagulasa en lámina.

Técnica:

 Colocar una gota de plasma (humano o de conejo) sobre la lámina

 Tomar una colonia con el asa, colocarla en contacto con el plasma y mezclar
 Si observa aglutinación o grumos, es una prueba POSITIVA

6. Prueba de la resistencia a la Novobiocina: Esta prueba se utiliza para la identificación de S.

saprophyticus, quien es el único estafilococo de importancia clínica que es resistente a la
Novobiocina a concentraciones mínimas inhibitoria (MIC) iguales o mayores a 1, 6 μg/ml.

Técnica:
  Se hace una suspensión de las colonias en caldo nutritivo.
 Se siembra masivamente con un escobillón estéril en el medio de Müeller Hinton.
 Esterilizar la pinza, tomar el disco de Novobiocina, colocarlo en el centro del medio
haciendo un poco de presión.
 Incubar a 37oC por 18 a 24 horas. Observar si hay o no presencia de halo.
 Si se forma un halo de inhibición igual o menor a 16 mm de diámetro, el microorganismo es
RESISTENTE.
 Si se forma un halo de inhibición mayor de 16 mm de diámetro el microorganismo es
SENSIBLE

7. Manitol: Esta prueba es utilizada para la identificación del S. aureus. Este microorganismo
fermenta el manitol con producción de ácido y el indicador rojo de fenol que hace parte del medio
vira de rosado a amarillo cuando hay producción de ácido. El S. aureus se caracteriza por
fermentar el Manitol.

Técnica:
 Tomar una colonia del cultivo y colocarla en el tubo de ensayo con manitol.
 Incubar a 35ºC de 18 a 24 horas. Observar cambio en el color del medio

PROCEDIMIENTO

1. Observe las características macroscópicas de las colonias del género Staphylococcus.

2. Observe los cambios que se presentan en el Agar Sangre (hemólisis).
3. Observe la coloración de Gram en los microscopios que se encuentran en su
mesón.
4. Realice la prueba de la Catalasa a partir del cultivo asignado a cada grupo.
5. Analice y observe las pruebas de identificación de las diferentes especies del
género Staphylococcus.
6. Prueba de la catalasa
 EJERCICIO

1. Cuáles especies integran el Género Staphylococcus? Escriba una patología que produzca cada
una de ellas
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2. Diga la(s) pruebas de laboratorio que identifican correctamente Staphylococcus aureus

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1. Qué especie de Staphylococcus es resistente a la novobiocina ?

 PRÁCTICA COCOS GRAM POSITIVOS
GENERO Streptococcus y Enterococcus

OBJETIVOS
 Conocer las diferentes especies de Streptococcus de importancia clínica.
 Interpretar las pruebas para la identificación de Streptococcus y Enterococcus.

MARCO TEORICO

El género Streptococcus representan un amplio grupo de microorganismos, algunos

forman parte de la microflora normal, otros se comportan como saprofitos, comensales y
algunos son patógenos produciendo infecciones en el hombre y en los animales.

Los primeros sistemas que se emplearon para clasificar los estreptococos se basaron en
la capacidad de estas bacterias en lisar los glóbulos rojos en un medio de cultivo sólido.
La taxonomía de la familia Streptococcaceae ha sufrido varios cambios en los últimos
años; dentro de esta familia se encuentran los géneros Streptococcus con varias especies
de importancia clínica, el género Enterococcus previamente clasificado en el grupo D de
la clasificación de Lancefield y el género Peptoestreptococcus.

GÉNERO Sterptococcus

Son cocos gram positivos que se disponen en pares o en cadenas, anaerobios

facultativos y homofermentativos. Algunos hacen parte de la flora normal y se comportan
como oportunistas, otros son patógenos y pueden producir infecciones diversas en el
hombre y en los animales.

Algunas especies de Streptococcus pueden ser clasificados serológicamente con base a

sus antígenos de superficie. El trabajo pionero de Rebecca Lancefield estableció que los
Streptococcus podían diferenciarse por los carbohidratos que se encuentran en la pared
celular y que actúan como antígenos. El “Sistema de agrupamiento Lancefield” para los
Streptococcus Beta hemolíticos es:

Streptococcus Beta hemolíticos Sistema de agrupamiento Lancefield

Grupo A Streptococcus pyogenes

Grupo B Streptococcus agalactiae
Grupo C Streptococcus quisimilis
Streptococcus zooepidermicus
Streptococcus equi
Grupo D Streptococcus bovis
Streptococcus equinus
Grupo F Streptococcus anginosus
Streptococcus constellatus
Streptococcus intermedius
Grupo G estreptococos de flora normal humana

Streptococcus Beta hemolíticos

El Streptococcus pyogenes es transmitido de persona a persona por vía respiratoria. La
infección mas comúnmente causada por este microorganismo es la faringitis. La mayoría
de los casos ocurren en la edad escolar, después de un periodo de incubación de 2- 4
días, los síntomas que se presentan son fiebre, dolor en la garganta, dolor de cabeza,
malestar general y dolor abdominal.

Entre sus factores de patogenicidad se encuentran la cápsula, polisacárido C, proteína M,

Estreptolisinas, etc.

El Streptococcus agalactiae es el mayor causante de enfermedad perinatal y neonatal.

La mujer es colonizada en vagina y recto, la infección es asintomática en un 5 a 35% de
las mujeres embarazadas y más de un 60% de las mujeres portan la bacteria de forma
intermitente. La enfermedad se transmite al recién nacido de forma vertical desde la
madre colonizada in útero o durante el parto. El espectro de la enfermedad incluye
bacteremia, neumonía, meningitis, shock séptico y neutropenia.

Streptococcus Alfa hemolíticos

El Streptococcus pneumoniae es el mayor causante de neumonía adquirida en la

comunidad. Los niños usualmente son colonizados a los 3-4 meses de edad y
permanecen colonizados por cerca de 4 meses con un serotipo; en adultos la colonización
persiste desde 1 mes a más de 12 a 18 meses. Infecciones graves se presentan en
niños menores de 2 años y las personas adultas mayores.
El principal factor de virulencia del S. pneumoniae es su cápsula de polisacáridos, que le
permite escapar de la ingestión y muerte por las células fagocíticas. Existen más de 80
diferentes tipos antigénicos. Los diferentes tipos de infecciones son asociadas a cada
serotipo en particular.

Streptococcus viridans Pueden ser alfa o gamma hemolíticos, la mayoría hace parte de la
flora normal de boca y tracto digestivo, respiratorio superior y urogenital. Causan
enfermedad en condiciones especiales como en pacientes con cuerpos extraños como
válvulas sintéticas o en pacientes con cáncer que están recibiendo quimioterapia.

Cuatro tipos de hemólisis presentan los Streptococcus

 Hemólisis α Alfa: Cuando se presenta una destrucción parcial de eritrocitos alrededor

de la colonia produciendo una coloración verde marrón en el medio.
 Hemólisis β Beta: Completa lisis o destrucción de los glóbulos rojos, causando un
aclaramiento del medio.
 Hemólisis γ Gamma: No hay destrucción de glóbulos rojos, por lo consiguiente no hay
cambio en el medio. Los microorganismos que no producen hemólisis son conocidos
generalmente “no hemolíticos” en lugar de gamma hemolíticos.
 Hemólisis Alfa α prima: una pequeña zona intacta de glóbulos rojos alrededor de la
colonia seguido de una zona de hemólisis completa (β Beta-hemólisis)

Identificación de las especies del género Streptococcus

1. Coloración de Gram: En las preparaciones de las muestras teñidas con la coloración

de Gram los Streptococcus se observan como cocos gram positivos en pares o en
cadenas. El Streptococcus pneumoniae se observa en pares y esto es conocido
como diplococos.
2. Medio de cultivo: Las muestras son sembradas en agar sangre, incubadas a 37º y en
atmósfera de CO2 al 5 – 7%.
3. Tipo de hemólisis: La observación y la correcta interpretación de las propiedades
hemolíticas del Streptococcus es muy importante porque es la base para decidir las
siguientes pruebas de identificación a realizar.
4. Prueba de la catalasa: Los géneros de la familia Streptococcaceae no producen las
enzimas citocromo oxidasa así que la prueba de la catalasa para el género Streptococcus
es NEGATIVA.

5. Pruebas para la identificación presuntiva de especies de Streptococcus:

 Susceptibilidad a la Bacitracina: Se utiliza para la identificación presuntiva de

Streptoccocus beta hemolíticos del grupo A el Streptococcus pyogenes. Esta prueba
es realizada en Agar sangre, a partir de un cultivo puro del microorganismo y utiliza
discos del Bacitracina con concentraciones de 0.04 unidades. Cualquier halo de
inhibición debe considerarse como sensible a la Bacitracina.

 Susceptibilidad a la Optoquina: Es utilizada para diferenciar el S. pneumoniae de

otros Streptococcus del grupo viridans. Al igual que la prueba de la Bacitracina esta es
realizada sobre agar sangre. El Streptococcus pneumoniae es sensible a la
Optoquina.

 Prueba de CAMP: Esta se utiliza para la identificaron presuntiva del Streptococcus

agalactiae. (Streptococcus del grupo B). El Streptococcus agalactiae produce una
proteína llamada “Factor CAMP” que al contacto con la enzima llamada “Bate lisina”
secretada por una cepa de Staphylococcus aureus (ATCC25923) interactúan
causando un aumento o sinergismo de la hemólisis. Esta reacción se evidencia por un
área de hemólisis en forma de cabeza de flecha.

Género Enterococcus

El género Enterococos fué previamente clasificados por Lancefield como Streptococcus

del grupo D; estos microorganismos son residentes de la flora normal de la cavidad oral,
de los tractos gastrointestinal y biliar y unos pocos se encuentran en vagina y en la uretra
masculina. Han cobrado importancia médica debido a la resistencia que presentan a los
antimicrobianos. Los Enteroccoccus son significativos por considerarlos agentes
causantes de infecciones adquiridas en la comunidad e infecciones nosocomiales. Dentro
de las especies más importantes esta Enterococcus faecalis, que se encuentra asociado
en un 80-90% de las infecciones humanas, Enterococcus faecium se ha encontrado
como agente infeccioso en la meningitis neonatal al parecer transmitido por el personal
médico.

Identificación del genero Enterococcus

1. Coloración de Gram: En las preparaciones de los especimenes teñidos con la

coloración de Gram los Enterococcus se observan como cocos gram positivos en
cadenas.
2. Prueba de la catalasa: La prueba de la catalasa para el genero Enteroccocus al igual
que toda la familia Streptococcaceae es NEGATIVA.
3. Pruebas para la caracterización de los Enterococcus: Todas las especies de
Enterococcus hidrolizan la esculina en presencia de bilis al 40%, tienen crecimiento
en NaCL al 6,5 % positivo y PYR positivos (Hidrolizan la pyrrolidonyl arylamidasa)

Comparación entre Streptococcus y Enterococcus:

GÉNERO CATALASA PYR HIDRÓLISIS CRECIMIENTO CRECIMIENTO A

ESCULINA NACL 6,5% 10ºC 45ºC
Enterococcus _ + + + + +

Streptococcus _ _ V V _ -/+

PROCEDIMIENTO

1. Observe las características macroscópicas de las colonias del género

Streptococcus.
2. Observe los cambios que se presentan en el Agar Sangre (hemólisis).
3. Observe la coloración de Gram en los microscopios que se encuentran en su
mesón.
4. Analizar y observar las pruebas de identificación de las diferentes especies del
género Streptococcus.
 EJERCICIO

1. Explicar el fundamento de la prueba de CAMP y dibuje la reacción

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2. Nombre 3 pruebas importantes para la identificación presuntiva del S. pyogenes

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3. Cuál es la prueba que permite diferenciar el Género Streptococcus del Staphylococcus,

enuncie su fundamento
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