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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO

PARA EL ESTUDIO DE
PARÁSITOS

Prof. Yenis Pérez Rojas


yenisperez@usb.ve

1
CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS COMPARTIDAS
ENTRE LOS PARÁSITOS

Ciclos de vida complejos (cambio de


morfología, composición antigénica y tropismo
tisular).
Cronicidad de las infecciones que producen.
Algunas infecciones pueden presentarse en
forma asintomática durante un período
prolongado en el cual el agente se replica.

2
CONCEPTO DE DIAGNÓSTICO
Diagnóstico por Armando Malebranch Eraso D.
El diagnóstico, como lo han explicado hasta la saciedad expertos
de diferentes disciplinas, es el proceso mediante el cual se llega a
descubrir las causas de los problemas que tiene o presenta aquello
que se diagnostica, puede tratarse de cualquier persona, animal, cosa
y el fenómeno, o cualquier sistema, al que generalmente se denomina
“sujeto de diagnóstico”.
Etimológicamente el concepto diagnóstico proviene del griego,
tiene dos raíces, dia- que es a través de, por y gignoskein que es
conocer, así etimológicamente diagnóstico significa conocer a través
de. El concepto de este significado (imagen que representamos en la
mente) es la identificación de la naturaleza o esencia de una situación
ó problema, y de la causa posible o probable del mismo, es el
análisis de la naturaleza de algo.

3
CONSIDERACIONES GENERALES
Una prueba diagnóstica es el proceso mediante el cual un individuo o grupo
de individuos es clasificado como poseedor o no de un determinado atributo .

En general, por simplicidad, se habla de presencia o ausencia de


enfermedad; pero puede ser aplicado a eventos de manera general.

Ejemplos:
 Exámenes clínicos (físicos)
 Exámenes laboratoriales (Ac, Ag, Aislamiento, etc.)
 Imágenes
 Procedimientos
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CONSIDERACIONES GENERALES

Se desarrollan o para detectar una enfermedad subclínica ó para


reemplazar otra técnica muy laboriosa o cara.

Debería tener una validez alta lo que significa que los porcentajes de
resultados falsos (positivos o negativos) deberían ser limitados.

La validez será expresada por la Sensibilidad y la Especificidad. Para


determinarlos es necesaria una prueba patrón llamada Prueba de Oro ó
Gold Standard.

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CONSIDERACIONES GENERALES

Las pruebas diagnósticas deberían cumplir con tres premisas:

 Todos los individuos sanos tienen un rango de valores uniforme en los


resultados de la prueba.

 Todos los individuos enfermos tienen un rango de valores uniforme en los


resultados de la prueba, pero diferente de los obtenidos en los individuos
sanos.

 Todos los resultados de la prueba diagnóstica son consistentes con la


condición del individuo sano o enfermo.

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SITUACIÓN IDEAL DE LAS PRUEBAS DE
DIAGNÓSTICO
9
8
Frecuencia (x 100)

7
6
5
4
3
2
1
Individuos negativos Individuos positivos
0
2 4 8 16 32 64 128 256
Títulos de Ac
7
Parásito Número de infectados
Protozoos
Plasmodium 300.000.000
Ameba 500.000.000
Trypanosoma cruzi 18.000.000
Leishmania 12.000.000
Toxoplasma gondii No determinado
Giardia Varios millones
Helmintos
Ascaris lumbricoides 1.000.000.000
N. americanus y A. duodenale 900.000.000
Schistosoma 200.000.000
Echinococcus granulosus 1.500.000
Taenia solium 1.000.000
8
DIAGNÓSTICO

Tratamiento adecuado

TÉCNICAS

Identificación de parásitos
o sus fases en los Identificación indirecta
productos biológicos

Inmunológicas Modernas
Parasitológicas (Biología Molecular)

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Diagnóstico Parasitológico
 Coproparasitoscópicos (CPS):
-Diagnostican parasitosis intestinales
-Producto biológico la materia fecal
 Los de cavidades:
-Productos biológicos exudados: vaginal,
prostático, raspado perianal, contenido duodenal por
sondeo.
 Los tisulares:
-Biopsia, raspado de úlcera, sangre,
secreciones de lesiones, etc.
Tipo y procedencia de producto biológico 10
Exámenes coproparasitoscópicos

Tiempo de su realización:
-Inmediatos (fresco)
-Muestra en solución
conservadora

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FROTIS FECAL DIRECTO

12
EXÁMENES COPROPARASITOSCÓPICOS

Tipo de proceso:
-Exámen directo macro o microscópico
-Concentración: flotación, sedimentación y
termotropismo
-Dilución, cultivo, tinción.

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EXÁMENES COPROPARASITOSCÓPICOS
- Cualitativos: flotación en salmuera,
técnica de Faust, técnica de formol/éter,
sedimentación simple en copas (fasciolosis)

- Cuantitativos (relaciona la eliminación de


huevos de un helminto con la masividad de la
parasitosis): técnica de Stoll, Kato-Miura,
Kato-Katz

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PARA ESTABLECER DIAGNÓSTICOS
INMEDIATOS

 TAMIZADO: mallas por donde se hace pasar


el producto biológico y se somete a chorro
de agua para liberar los paràsitos: Necátor
americanus, Ascaris lumbricoides, Trichuris
trichiura y Taenia spp.
Por lo general después del tratamiento.

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EXAMEN DIRECTO EN FRESCO:
 Solución salina isotónica,
para trofozoitos de
protozoos (E. histolítica, larvas
de Strongyloides stercoralis)
 Solución yodo-yodurada
(Lugol), identificar cualquier
forma de parásitos
intestinales
Pueden utilizarse para informes
cuantitativos, estandarizando la
cantidad de materia fecal
necesaria. En un cubreobjeto 22
x 22 mm (2 a 3 mg)

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PREPARACIONES COLOREADAS AL FRESCO

 Coloración de Quensel: identificación de


células del hospedero y su diferenciación
con los trofozoitos móviles.
 Coloración de Sudan III: Blastocystis
hominis (naturaleza lipídica) y grasas
neutras en heces.
 Coloración con lugol: núcleos de quistes
de protozoarios.

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 Hematoxilina-férrica: trofozoitos y quistes
de protozoarios intestinales, leucocitos,
macrófagos y epiteliales. E. histolítica, D.
fragilis, E. nana, características nucleares

 Zielh-Neelsen: Coccidios intestinales,


Cryptosporidium sp. y Cyclospora
cayetanensis.

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HF 100x HF 100x

fresco 40x

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CONCENTRACIÓN DE QUISTES DE
PROTOZOARIOS Y HUEVOS DE HELMINTOS
 Flotación (1921) solución saturada NaCl:
-Willis (huevos de helmintos) y cualquier forma parasitaria
menos trofozoitos.
 Flotación y centrifugación (concentración):
-Faust de alta densidad (quistes) (1938)
 Sedimentación por centrifugación (huevos de
helmintos) (formol/eter)
 Sedimentación por gravedad (huevos de helmintos y S.
mansoni)

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Técnica de concentración fecal: formol/éter
Sedimentación por centrifugación

-1,0-1,5 g de heces a 10 ml formol (fijar)


-Filtrar por malla 400 μm
-Agregar formol
-Añadir eter (liberar), mezclar
-Centrifugar 500 xg 2-3 minutos
-Eliminar sobrenadante
-Servir el sedimento y observar

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Métodos de concentración
 Cuantitativo por dilución (Stoll) (1923),
Ancylostoma duodenale y Necator americanus.
Suspensión de materia fecal 1:15 NaOH
(huevos/ml/heces).

 Kato-Miura (1954), frotis grueso

 Kato-Katz

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Técnica de Kato-Katz
Plantillas (50, 41.7 y 20 mg heces)
Rejilla de acero inóxidable

Las plantillas deben estar estandarizadas en el país.


Siempre se debe utilizar el mismo tamaño a fin de
que los datos de prevalencia e intensidad sean
comparables y reproducibles.

Papel celofán impregnado co verde de malaquita

Reportar número de huevos por gramo de heces

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Investigación de larvas de helmintos
 Método de Rugai y col: se basa en los tropismos
positivos: hidrotropismo y termotropismo.

Agua 40-45 ºC

Recoger larvas

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DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO
Es un examen del líquido seroso de la sangre (suero, el líquido
transparente que se separa cuando la sangre se coagula) que se
utiliza para detectar la presencia de anticuerpos contra un
microorganismo.
En otras palabras, la serología se refiere al estudio del contenido de
anticuerpos en el suero. Ciertos microorganismos estimulan al cuerpo
para producir estos anticuerpos durante una infección activa. En el
laboratorio, los anticuerpos reaccionan con los antígenos de formas
específicas, de tal manera que se pueden utilizar para confirmar la
identidad del microorganismo en particular.

http://www.monografias.com/trabajos31/pruebas-alergicas/pruebas-alergicas.shtml

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CRITERIOS PARA UNA PRUEBA SEROLÓGICA
Existen numerosos criterios que determinan cual es la mejor prueba
de diagnóstico para una situación dada e incluyen: COSTO,
SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, RAPIDEZ y DISPONIBILIDAD. Para el
diagnóstico clínico, muchas veces es muy importante clarificar la meta
precisa de la prueba.
a) Sensibilidad: Es la habilidad de una prueba para detectar a
TODOS los verdaderos positivos.
b) Especificidad: Es la habilidad de una prueba para detectar SOLO
a los verdaderos positivos.

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RESPUESTA
INMUNE
HUMANA

27
ESTRUCTURA DE UN ANTICUERPO IGG

Ag

28
Sub-clases de inmunoglobulinas humanas

29
Diagnóstico inmunológico

 Intradermoreacciones: (Montenegro o
Leishmanina) Leismaniasis cutánea
(hipersensibilidad tardía a antígenos).
 Serológicas:
-Fijación de complemento
-Inmunodifusión
-Inmunoelectroforesis
-ELISA (requiere Ag parasitarios)

30
31
CLASIFICACIÓN DE LOS ANTÍGENOS
PARASITARIOS
Según la composición química:
 Proteínas
 Glicoproteínas
 Glucolípidos
 Polisacáridos

32
CLASIFICACIÓN DE LOS
ANTÍGENOS PARASITARIOS
Según la fuente de donde se obtienen:
 Antígenos solubles excretados o secretados
 Antígenos solubles extraídos del parásito
 Antígenos sintéticos
 Antígenos recombinantes

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ANTÍGENOS ESPECÍFICOS
Esquema de la producción
de un antígeno recombinante

(BIOLOGÍA MOLECULAR)

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Utilidad médica diagnóstica de los
antígenos parasitarios
 Establecer el diagnóstico de infección reciente o
antigua.
 Identificar los antígenos que inducen protección y
por tanto, pueden ser útiles en la vacunación.
 Conocer los mecanismos de patogenia.
 Estudiar los factores de virulencia de los parásitos.
 Diseñar y mejorar las técnicas diagnósticas
existentes.

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TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN
 Se requiere que tanto el Ac y el Ag
se encuentren en un medio fluido en
el que sea posible la precipitación
del complejo Ag-Ac.
Las principales son:
1. Técnica de precipitación
propiamente dicha
2. Técnica de difusión radial de
Ouchterlony
3. Técnica de inmunoelectroforesis

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TÉCNICA DE DIFUSIÓN RADIAL DE OUCHTERLONY

Zona de equivalencia

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TÉCNICA DE INMUNOELECTROFORESIS
Separación de mezcla de Ag
por electroforesis

Reacción con Ac

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Técnicas de Aglutinación

 Más sensible que la difusión


 Hacer reaccionar los antígenos parasitarios
y anticuerpos sobre partículas de látex o
sobre eritrocitos (hemaglutinación).
 Extractos antigénicos que se enlazan sobre
el soporte.

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TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA (IFI)

 Fluorescencia (propiedad
de ciertas moléculas) que al
ser irradiadas con una
longitud de onda adecuada,
emiten radiación de longitud
de onda característica y
esto permite su
cuantificación.

 Se usa en la detección de
auto-Ac y Ac contra Ag de
superficie de células y
tejidos.
40
IFI DE GLOBULOS ROJOS PARASITADOS CON MALARIA

41
ANTÍGENOS ESPECÍFICOS
 Prueba de ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

La prueba de ELISA para el


diagnóstico de numerosas
enfermedades causadas por
parásitos. Es el estudio de
elección cuando se cuenta con un
antígeno específico.

42
TIPOS DE ELISAS

43
44
ELISA
 La técnica inmunoenzimática ELISA forma parte
de aquellas reacciones serológicas que utilizan
conjugados para poder visualizar la reacción
ANTIGENO-ANTICUERPO.
 Se basa en el uso de anticuerpos marcados con
una enzima (generalmente la peroxidasa), de
forma que los conjugados resultantes tengan
actividad inmunológica como enzimática.

45
ELISA

 El método ELISA está recomendado


fundamentalmente para el estudio de poblaciones.
 Es una técnica altamente sensible y de gran
especificidad, que permite realizar en un corto
espacio de tiempo estudios sobre grandes
poblaciones, de manera sencilla y económica. Esta
técnica presenta además una buena
reproducibilidad y facilidad en la interpretación
de los resultados.
46
En la primera línea se observa el suero control positivo y en la
segunda el negativo. Los sueros problema por duplicado han sido
colocados en el resto de la placa, se observan positivos azul) y
negativos (sin color).

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 DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS

La modalidad más frecuente del método ELISA


para la determinación de antígenos es el modelo
ELISA "Sandwich". En esta forma, la placa suele
ya venir con un anticuerpo fijado (monoclonal ó
policlonal) frente al antígeno problema, sobre el
que se añadirá el macerado del órgano
sospechoso, que en caso de reaccionar con el
anticuerpo de la placa, será puesto en evidencia
tras la adición del segundo anticuerpo marcado
con la enzima. Por último, se añade el substrato
para revelar la reacción.

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Fases de la técnica Elisa Sandwich. (1) Un anticuerpo monoclonal o
policlonal anti antígeno suele estar ya unido a la placa. (2) se incuba
con la muestra problema. (3) se añade el conjugado. (4) por último el
sustrato. Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.

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DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS

 Para la determinación de anticuerpos


específicos frente a un determinado
antígeno se utilizan normalmente las
siguientes modalidades del método ELISA:
1. ELISA INDIRECTO.
2. ELISA COMPETICIÓN.

50
ELISA INDIRECTO
 Es el método más utilizado para la
determinación de anticuerpos. Básicamente,
consiste en la inmovilización a la placa de ELISA
del antígeno (en los Kits ya viene fijado) del que
queremos conocer si en el suero problema existen
anticuerpos específicos. Se pueden utilizar como
antígenos, proteínas virales o bacterianas e incluso
virus completos.

51
Fase de la técnica Elisa indirecto. (1) El antígeno se pega a la placa
(2) Se añade el suero problema. (3) posteriormente, el conjugado. (4)
y por último, el sustrato.

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ANTIGENICIDAD DE EVANSAÍNA POR
ELISA INDIRECTO
Reconocimiento de EvaR entre los
días 14-50 P.I, con mayor reactividad
en el día 24 P.I., con Abs. 0,4-0,75.

Para EvaRDe, el reconocimiento es


menor que EvaR, con Abs. 0,1-0,35.

Reconocimiento de Stev, en los días


24-35 y 43-50 P.I, con Abs. 0,3-0,8,
mayor reactividad en días 43 y 50
P.I.

Los valores de los controles de este experimento fueron:


blanco: 0,093; conjugado+sustrato: 0,095; IgG
caballo+conjugado+sustrato: 1,124. 53
INMUNOELECTROTRANSFERENCIA O
WESTERNBLOT
 La inmunoelectrotransferencia "westernblot"
o "Immunoblotting" es una técnica
inmunoenzimática que se utiliza para la
detección de anticuerpos específicos.

 Serecomienda cuando no hay que estudiar


un gran número de sueros o para analizar
sueros dudosos por otras técnicas.

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ESQUEMA DE LA TÉCNICA

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INMUNOELECTROTRANSFERENCIA O
WESTERNBLOT
 Es una técnica muy sensible, de fácil manejo,
ejecución e interpretación. No necesita de equipos
especiales para su realización.
 Esta técnica está fundamentalmente indicada en el
estudio de un número no muy elevado de sueros. Al
no necesitar ningún tipo de equipo especial, es de
fácil realización incluso con pocas condiciones de
laboratorio. En la actualidad existen algunos Kits
disponibles, pero la oferta irá progresivamente en
aumento.
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ANTIGENICIDAD DE EVANSAÍNA:
INMUNOTINCIÓN CON SUEROS DE EQUINOS.
Panel A: EvaR Panel B: Stev
STD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 C 1 3 5 6 7 8 9 10 11

Panel A. EvaR, se presenta un


reconocimiento de polipéptido de
42 kDa, en los sueros de infección
experimental y de campo (5).

Panel B. Stev, se reconocen


polipéptidos de 120,90,54 y 28
kDa, tanto en sueros de campo ,
como de infectados
experimentalmente.

Electrotransferencia con gel de poliacrilamida al 12 % p/v.


Líneas 1-5: corresponden a sueros de equinos infectados con T.
evansi provenientes de campo; 6-10: corresponden a sueros equinos
con infección experimental a T. evansi (E1 y E2). Las flechas indican
polipéptidos con masa relativa aparente de 120,90, 54 y 28 kDa. 58
TÉCNICAS MOLECULARES
 Nuevas fronteras de especificidad y aumento considerable
de la sensibilidad para detectar ADN (material genético)
en la muestra de sangre u otros fluidos corporales (saliva,
orina, etc).

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Diagnostics Methods in Ocular Infections−From Microorganism Culture to Molecular Methods
Victor Manuel Bautista-de Lucio1, Mariana Ortiz-Casas1, Luis Antonio Bautista-Hernández1, Nadia Luz López-Espinosa1,
Carolina Gaona-Juárez1, Ángel Gustavo Salas-Lais1, 2, Dulce Aurora Frausto-del Río1 and Herlinda Mejía-López1

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

 Polimerasa del Thermus aquaticus (polimerasa Taq),


72ºC (temperatura óptima).
 Secuencia específica en el genoma del parásito, de
preferencia que se repita muchas veces en su ADN.
 Diseño de iniciadores que flanqueen y dirigidos en
sentido contrario.

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Replicación del DNA del ADN
DNA polimerasas. Catalizan la polimerización del ADN.
Dirección 5’ → 3’. Requieren un cebador

dNTP

Mg+2
cebador

DNA molde
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REQUERIMIENTOS DE PCR
 Se requiere pequeña cantidad de ADN (10 ng)
 Se requiere equipos especiales y áreas
absolutamente especiales para el aislamiento y
preparación de las muestras, para evitar la
contaminación y así los falsos positivos.
 Los productos de amplificación se observan en
geles de agarosa o poliacrilamida.

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ALGUNAS APLICACIONES Y VARIANTES
DE LA PCR
Diagnóstico de agentes infecciosos patógenos

 Multiplex PCR

 Clonación de genes

 “Colony” PCR

 “Nested” (anidada) PCR

 RT PCR (“reverse transcriptase”)

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GENOTIPIFICACIÓN DE VPH POR PCR

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Detección de Babesia sp. en Bovinos de campo

Gel de agarosa al 2% p/v, de productos de PCR PiroA/PiroB. Controles positivos:


B. big y B. bov. Controles negativos: Agua estéril y ADN bovino sano. Muestras: 41-
55. Salida de campo Guárico 2011
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PCR MULTIPLEX: DETECCIÓN NEUMO-BACTERIAS

Typical pneumona Atypical pneumona


- Chlamydophila
pneumoniae
- Streptococcus (CE0086)
pneumoniae - Legionella
- Haemophilus pneumophila
influenzae - Bordetella pertussis
- Mycoplasma
pneumoniae

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73
!PARA CURAR, HAY QUE DIAGNOSTICAR!

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TAREA 3
o Diseñar un juego didáctico tipo tablero de mesa para niños (6-12
años), con el siguiente contenido:
1. Basado en la biología de helmintos ó bacterias, sintomatología de
la enfermedad asociada y recomendaciones para la prevención,
ó
2. Diagnóstico de la enfermedad.
o Utilizar gráficos, imágenes, mapas.
o Presentación impresión digital (PDF), hoja carta y/o oficio, subir a la
carpeta de trabajos en Aula virtual.
o Equipos de 4-5 integrantes, entrega acorde al calendario de aula
virtual.
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