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La replicación del ADN en células eucarióticas requiere la síntesis precisa de grandes cantidades de
ADN. Además, para producir un organismo adulto a partir de un solo ovocito fertilizado, el ADN
debe replicarse muchas veces para dar lugar a las 4 × 1013 copias de ADN que componen un
cuerpo humano. Los errores en la replicación del ADN pueden amplificarse y acumularse a lo largo
del tiempo, lo que lleva a la inestabilidad del genoma, que tiene consecuencias perjudiciales para
los órganos y tejidos y es un sello distintivo del cáncer1. Los errores de replicación del ADN
también se acumulan en las células madre de los organismos adultos y están asociados con el
envejecimiento. Además, aunque la replicación del ADN bacteriano está acoplada solo al
crecimiento celular, la replicación del ADN metazoico está acoplada tanto al crecimiento celular
como a la diferenciación celular. Por lo tanto, las características de la cromatina y la organización
de los cromosomas que determinan la identidad celular también tienen que estar estrictamente
reguladas y reproducirse con precisión durante el desarrollo.
Las células eucariotas han desarrollado varios mecanismos para preservar la estabilidad del
genoma, que incluyen asegurar la fidelidad de la replicación del ADN en las horquillas de
replicación. El control de la activación de los orígenes de replicación del ADN ahora se reconoce
como un mecanismo importante que las células eucariotas utilizan para adaptarse a su entorno, a
programas transcripcionales específicos de tejidos y a restricciones vinculadas a estructuras
complejas y variedad de conformaciones de cromosomas.
Los orígenes de replicación del ADN generalmente se definen como las regiones genómicas en las
que comienza la replicación del ADN. Sin embargo, abarcan al menos dos elementos distintos: la
región de ADN que es reconocida y unida por proteínas específicas y que formará el complejo de
pre-replicación (pre-RC) (Figura 1) y el sitio aguas abajo de la iniciación de la síntesis de ADN para
que la maquinaria de ADN polimerasa es reclutada. En Saccharomyces cerevisiae, las riginas de
replicación se identifican mediante secuencias de ADN específicas3, pero la elección de los
orígenes que se activan es flexible (ver a continuación). Por el contrario, aún no se ha identificado
ninguna firma universal o conjunto de firmas que pudieran predecir todos los orígenes de
replicación en un genoma metazoico, aunque los análisis genómicos han demostrado que los
orígenes de replicación de los metazoos pueden tener algunos motivos secuenciales preferidos.
Los orígenes de replicación en eucariotas se determinan en dos pasos posteriores (figura 1): el
reconocimiento del sitio pre-RC, una reacción conocida como "licenciamiento" de origen de
replicación y la activación de la síntesis de ADN, que se conoce como origen "disparo" . Este
mecanismo de dos pasos es crucial para evitar la repetición dentro del mismo ciclo celular
Es importante destacar que solo un subconjunto de todos los orígenes con licencia se activa en
una celda en cualquier ciclo celular. La elección de los orígenes a activar varía de una célula a otra,
incluso en la misma población de células, lo que implica que el uso del origen es flexible en las
células de mamíferos5, como es el caso de las células de levadura6,7.
Figura 1 | Formación y activación de orígenes de replicación de ADN. La figura muestra una unidad
de replicación con tres orígenes de replicación potenciales. a | La licencia de los orígenes de
replicación está restringida a la fase G1 del ciclo celular y resulta de la carga secuencial de
proteínas del complejo de pre-replicación (pre-RC) en todos los orígenes potenciales en el
genoma. Primero, el complejo de reconocimiento de origen (ORC, que comprende las seis
subunidades ORC1-6), que tiene actividad ATPasa, se recluta para los orígenes de replicación. A
esto le sigue la unión de la transcripción dependiente de CDC6 y CDC10 1 (también conocida como
factor de replicación de ADN CDT1). La carga del complejo de helicasa de mantenimiento de mini-
cromosoma (MCM), que contiene las seis subunidades MCM2-7, es el último paso de la reacción
de licencia y solo puede tener lugar si ORC, CDC6 y CDT1 ya están vinculados a los orígenes. b, c |
La activación de origen implica la formación de un complejo de preiniciación (pre-IC) y la
activación del complejo de helicasa MCM. El ensamblaje del pre-IC se desencadena por la quinasa
dependiente de DBF4 (DDK) y las quinasas dependientes de ciclina (CDK) en la transición de fase
G1-S, y su activación en un replisoma funcional ocurre en la fase S. Los más importantes )
Promover su carga en los orígenes. Además, el DDK y el CDK fosforilan directamente varios
residuos dentro del complejo MCM2-7, lo que resulta en la activación de la helicasa y el
desenrollado del ADN. Durante la activación de la helicasa, el hexámero doble MCM2–7 se divide
en dos hexámeros que funcionan en las dos horquillas de replicación que emanan del origen de la
replicación. La activación de helicasa induce el reclutamiento de otras proteínas (como el factor de
replicación C (RFC), el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA), la proteína de
replicación A (RPA) y otras polimerasas de ADN) que convierten el pre-IC en dos tenedores de
replicación funcionales que se mueven en direcciones opuestas desde el origen activado, con el
replisoma (un complejo de proteínas) en cada horquilla de replicación. Aún no está claro si uno o
dos ORC permanecen en el origen duplicado después del inicio de la síntesis de ADN. La helicasa
funcional en las horquillas es el complejo CMG (que consiste en CDC45, el hexámero MCM y el
complejo GINS). En una unidad de replicación, solo uno de cada tres orígenes está activado en
promedio, mientras que los otros orígenes adyacentes permanecen en silencio, aunque tienen
licencia. Por lo tanto, un replisome solo se forma en el origen activado. En una población celular
dada, se pueden usar diferentes orígenes en células individuales; por lo tanto, una población
celular contiene una gama de orígenes flexibles. La inhibición de orígenes adyacentes dentro de
una unidad de replicación está controlada en parte por las quinasas de punto de control Ser / Thr
proteína quinasa ATR y Ser proteína quinasa ATM que activan checkpoint quinasa 1 (CHK1) y
CHK2. Sin embargo, los mecanismos exactos que son responsables de la inhibición local de estos
orígenes flexibles siguen sin estar claros. Del mismo modo, aún no se ha determinado cómo se
seleccionan los orígenes flexibles para la activación o el silenciamiento.
Finalmente, CDC6 (Ref. 188) y CDT1 (Ref. 189) son protooncogenes, lo que resalta el posible
vínculo entre el licenciamiento excesivo y el desarrollo de cáncer. Curiosamente, las células
derivadas de tumores son más sensibles a la re-replicación que las células normales, lo que
conduce a su muerte preferencial166,190 y, por lo tanto, allanan el camino para una posible nueva
terapéutica contra el cáncer.
PCNA, antígeno nuclear de células proliferantes; Pol ε, ADN polimerasa ε; RECQL4, helicasa de
ADN dependiente de ATP Q4; RFC, factor de replicación C; TOPBP1, ADN topoisomerasa 2 proteína
de unión 1.
Después de que se autoricen los orígenes de replicación, las células deben evitar volver a otorgar
licencias durante la fase S para garantizar que los cromosomas se repliquen solo una vez por ciclo
celular16. Esto se logra a través de varios mecanismos, que incluyen la interacción de CDT1 con su
inhibidor de geminina y la ubiquitilación y degradación de CDT1 durante la fase S, así como la
fosforilación de varios factores de iniciación1.
Actualmente, un desafío importante es comprender cómo se eligen los orígenes que se van a
activar en la fase S de todos los orígenes potenciales que se ensamblan como preRC en la fase G1
8. ¿Es esta elección completamente estocástica? ¿O está dictada por características o restricciones
vinculadas a la organización nuclear y al metabolismo nuclear (incluida la actividad transcripcional
y otros eventos asociados a la cromatina) y / o por factores activadores específicos?
Los orígenes de replicación se dividen en tres categorías (consulte la figura): orígenes constitutivos
(círculos verdes), orígenes flexibles (círculos azules) y orígenes latentes (estrellas rojas). Los
orígenes constitutivos se activan en todas las células de una población celular y en todo momento
(es decir, independientemente de la etapa de desarrollo y / o las condiciones ambientales). Estos
orígenes son solo un pequeño subconjunto de todos los orígenes. La mayoría de los orígenes en
cualquier población celular o organismo son orígenes flexibles: su uso varía de una célula a otra de
manera aparentemente estocástica. Por lo tanto, aunque solo unos pocos dispararán en una celda
determinada, se puntuarán todos los orígenes flexibles en una población celular. Los orígenes
inactivos se definen como orígenes de replicación de ADN que tienen licencia pero no se activan
durante un ciclo celular normal191. Estos orígenes se activan después del daño en el ADN que
bloquea una bifurcación de replicación vecina (como se muestra en la célula inferior). Los círculos
rellenos indican los orígenes con licencia que no están activados; los círculos abiertos indican
orígenes activos.
Cuando el complejo MCM se carga por primera vez para formar el pre-RC, es un doble hexámero
cabeza a cabeza inactivo que rodea el ADN de doble cadena (FIG. 1). La activación de los orígenes
de replicación implica la disociación del hexámero MCM doble en dos hexámeros MCM activos
que forman los dos replisomas que pueden desenrollar el ADN e iniciar dos bifurcaciones de
replicación en cada origen de replicación (Figura 1). Este paso es inducido por la unión transitoria
de DDK a la cromatina, que le permite fosforilar el complejo MCM 23-25. Esta fosforilación es un
paso esencial para el posterior reclutamiento y formación del complejo CMG, que consiste en
CDC45, el complejo MCM y el complejo de replicación de ADN GINS y participa en la formación del
complejo de preiniciación (pre-IC), que es definido como el complejo de proteína que precede a la
activación del ADN helicasa23,24,26-28 (Figura 1). Sin embargo, la fosforilación por DKK solo no es
suficiente para disociar el hexámero doble de MCM que se carga en los orígenes de replicación29.
También se necesitan CDK para la fosforilación de MCM y para la unión de GINS y CDC45 a la
cromatina para establecer el pre-IC. Después de ser ensamblado y activado, el complejo CMG
desenrolla ADN bicatenario para iniciar la síntesis de ADN. En vertebrados, las CDK fosforilan
treslin (que es ortóloga a Sld3 en levadura) para promover su interacción con la proteína 1 de
unión a topoisomerasa de ADN 1 (TOPBP1; ortóloga a levadura Dbp11), una proteína que es
esencial para la activación de la helicasa CMG30-32. . Treslin y TOPBP1 son componentes del pre-
IC que se unen al hexámero MCM. Las CDK también fosforilan y activan el ADN dependiente de
ATP helicasa Q4 (RECQL4, el ortólogo vertebrado de la levadura Sld2) que, con MCM10, se
requiere para la formación del complejo CMG33,34.
reveló la presencia de orígenes de replicación ricos en GC43, lo que demuestra que la riqueza de
AT de los orígenes de replicación no es una característica universal entre los organismos
unicelulares. Además, se podría especular que se requieren diferentes combinaciones de firmas
para el proceso de dos pasos (que consiste en licencias de origen y activación de origen) que
conduce a la replicación del ADN. La acción sinérgica de varios factores podría 'enmarcar' los
orígenes que deben
se activará para distinguirlos de otros orígenes con licencia y respaldará su selección flexible en
diferentes contextos de cromatina.