Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
var albinus”
TESIS
semamile@hotmail.com
TRUJILLO - PERÚ
2013
Resumen
Se llevó a cabo un estudio comparativo en Rattus rattus var. Albinus para investigar el efecto
coadyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. (sapindussaponina) para los
antígenos de Leishmania braziliensis. Con tal finalidad se inyectó vía intramuscular (IM) a 4
grupos de cinco ratas machos cada uno, en el músculo del muslo izquierdo solución salina
fisiológica, antígenos de Leishmania braziliensis, sapindussaponina, y la asociación
sapindussaponina - antígenos de Leishmania braziliensis correspondientemente. Para evaluar
los cambios en la fórmula leucocitaria, a las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre
periférica (cola) de los especímenes de cada grupo. Se prepararon los frotis y se realizó el
conteo de glóbulos blancos con microscopio óptico con lente de inmersión. Los resultados
porcentuales fueron sometidos al análisis de varianza ANOVA de un factor con la prueba post
hoc t de Dunnett. Se concluye que la inyección de sapindussaponina y sapindussaponina -
antígenos de Leishmania braziliensis provoca cambios en la fórmula leucocitaria; y que las
variaciones de porcentaje de leucocitos: neutrófilos, eosinófilos, linfocitos y monocitos
indican la respuesta celular a las saponinas y la asociación saponinas – fracciones antigénicas
de L. braziliensis.
I. INTRODUCCION
El hombre siempre ha estado interesado por conocer la naturaleza y aprovecharla para la
solución de diferentes problemas (Boege, n.d.) tales como la necesidad de a) alimentación para
una población humana cada día mayor, b) nuevos medicamentos para las enfermedades que
en la actualidad son incurables, y c) nuevas materias primas industriales; motivo por el cual,
se ha empeñado en investigar científicamente las sustancias presentes en los seres vivos que le
rodean, tanto plantas (Fitoquímica) como animales (Zooquímica).
Los vegetales que contienen saponinas (Evans, 1989), heterósidos llamados saponinas (del
latín sapo, jabón), se han utilizado profusamente en muchas partes del mundo por sus
propiedades detergentes.
Saponina es una sustancia capaz de formar espuma al ser agitada con agua o disuelta en
alcohol. Las contienen plantas muy diversas (Evans, 1989), entre ellas la acacia, la saponaria
o jabonera, el castaño de indias y muchas otras. Las saponinas se han utilizado mucho, y aún
se utilizan en ocasiones, como agentes limpiadores de la contaminación producida por
vertidos tóxicos. Algunas presentan propiedades hipocolesterolémicas.
Existen unas 6 familias de plantas que presentan grandes cantidades de saponinas, una de
éstas es Sapindaceas con la especie Sapindus saponaria. Las saponinas son glicósidos
resultante de la unión de la sapogenina (aglicón) con uno o más azúcares. Las Saponinas
aisladas (Tsuzuki et al., 2007) de Sapindus saponaria son las L-Hederina
(sapindussaponinas): “two pure triterpene acetylated saponins: 3-O-(4-acetyl-β-D-
xylopyranosyl)-(1→3)-α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-hederagenin (1)
and 3-O-(3,4-di-acetyl-β-D-xylopyranosyl)-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α- L-
arabynopyranosyl-hederagenin (2)”, la sapogenina es la L-Hederagenina y los azúcares:
rhamnosa y arabinosa.
2
trabajado en nuestros laboratorios con la cáscara del fruto maduro, para desarrollar una
tecnología de obtención de un extracto concentrado de saponinas. Ahora es necesario
encontrar aplicaciones científico-tecnológicas que a futuro demanden la producción industrial
y la industrialización del producto.
Se ha reportado (Bonnin y Llorens, 2011) que del Castaño de indias (Aesculus hippocastanum
L.), se usan las hojas y la corteza porque contienen escina, mezcla de saponinas triterpénicas,
que le confieren propiedades como venotónico y vitamínico P. En forma de cápsulas en
mezcla con extractos de otras plantas se usa en la terapia de la lipoesclerosis.
3
En el marco de la investigación inmunológica actual y con la finalidad de proponer como
fuente de sustancias con propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L.
“Choloque” es necesario explicar científicamente el mecanismo de la actividad de las
saponinas de esta especie vegetal. Los resultados permitirán un mejor enfoque científico,
tecnológico y ecológico de promoción de su cultivo.
En tal perspectiva se planteó el problema ¿Cuál es el efecto adyuvante de las saponinas de
Sapindus saponaria L. para antígenos de Leishmania braziliensis en músculo estriado de
Rattus rattus var albinus?
La hipótesis de trabajo fue: “Las saponinas de Sapindus saponaria L. actuando como
adyuvantes en el músculo estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la acumulación y
activación de células accesorias en la zona de depósito; potenciando las respuestas celular y
humoral para los antígenos de Leishmania braziliensis”.
Dado que en nuestro país subsiste el problema de la leishmaniasis estos resultados pueden
representar una esperanza para desarrollar una vacuna para L. braziliensis que permita
solucionar en parte la urgencia de atención de salud en las zonas endémicas como los valles
interandinos occidentales y la selva peruanos.
Material de estudio
Rattus rattus var albinus: 20 especímenes machos con peso entre 300 – 400 g; divididos al
azar en cuatro grupos, un testigo y tres grupos ensayo de 5 especímenes cada uno.
Materiales de prueba: Concentrado de Saponinas de Sapindus saponaria L. purificadas en el
laboratorio de Análisis Instrumental, suspensión de fracciones antigénicas aisladas de
Leishmania braziliensis preparada en el laboratorio de Toxicología, suero fisiológico,
reactivos para microscopia óptica.
Material de vidrio de uso corriente en el Laboratorio.
Equipos: Columna de fraccionamiento de espuma, espectrofotómetro UV/Vis HP 8452A,
microscopio óptico binocular, balanza analítica.
Métodos y técnicas
Diseño experimental: Diseño clásico
Los grupos de Rattus rattus var albinus testigo y experimentales, fueron inyectados vía
intramuscular con suero fisiológico (grupo T), suspensión de antígenos de Leishmania
braziliensis en solución salina fisiológica (grupo A), saponinas en solución salina fisiológica
(grupo B) y saponinas - suspensión de fracciones antigénicas solución salina fisiológica
(grupo C). Se tomaron muestras de sangre periférica (cola) de los especímenes de cada grupo,
a las 48 y 192 horas.
4
Preparación de los antígenos de Leishmania braziliensis
El cultivo de Leishmania braziliensis se realizó en frascos Roux con medio BHI agar
enriquecidos con sangre total de conejo, con penicilina 100 UI/mL, estreptomicina 100
UI/mL, solución salina fisiológica. Se sembró e incubó por 15 días a 20º C, se cosechó con
solución salina fisiológica estéril, se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm. Se desechó el
sobrenadante, se resuspendió el precipitado en solución salina fenolada 0,25% y nuevamente
se centrifugó. Se eliminó el sobrenadante y se agregó solución salina fisiológica fenolada; se
esterilizó a 121º C por 15 minutos a 15 atmósferas de presión y se conservó a -20º C.
Ensayo inflamatorio
Un estudio comparativo en ratas se llevó a cabo para investigar las reacciones locales y los
cambios hematológicos después de la inyección de una dosis intramuscular de
sapindussaponina (19,59 mg), y de vacuna de L. braziliensis – sapindussaponina (19,59 mg –
0,25 mL suspensión). Los efectos fueron comparados con los causados por suero fisiológico y
por la vacuna de L. braziliensis (0,25 mL suspensión). Grupos de cinco ratas machos fueron
inyectados en el músculo del muslo izquierdo con 0.25 mL de la solución de prueba a 0 días.
A las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre periférica (cola) de los especímenes de
cada grupo. Se preparó los frotis y se realizó el conteo de glóbulos blancos con microscopio
óptico con lente de inmersión.
Análisis estadístico
Se realizó el ANOVA (Walpole et al., 1999) con las prueba de MSD y Dunnett para
determinar si existe o no diferencia significativa entre las respuestas grupo experimental y
testigo, mediante el software (Pérez, 2001) SPSS v 16.
III. RESULTADOS
5
TABLA 1. FORMULA LEUCOCITARIA EN Rattus rattus var albinus
PORCENTAJE DE CÉLULAS
6
TABLA 2. FORMULA LEUCOCITARIA Rattus rattus var albinus
Análisis de varianza ANOVA de un factor
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
1
neu Between Groups 794,000 7 113,429 113,429 0,000
Within Groups 32,000 32 1,000
Total 826,000 39
1
eos Between Groups 56,800 7 8,114 10,143 0,000
Within Groups 25,600 32 0,800
Total 82,400 39
1
bas Between Groups 3,200 7 0,457 4,571 0,001
Within Groups 3,200 32 0,100
Total 6,400 39
1
lin Between Groups 805,575 7 115,082 67,695 0,000
Within Groups 54,400 32 1,700
Total 859,975 39
1
mon Between Groups 33,575 7 4,796 13,704 0,000
Within Groups 11,200 32 0,350
Total 44,775 39
1; neu, neutrófio; eos, eosinófilo; bas, basófilo; lin, linfocito; mon, monocito
IV. DISCUSIÓN
La hipótesis de trabajo planteaba que las saponinas de Sapindus saponaria L. actuando como
adyuvantes en el músculo estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la acumulación y
activación de células accesorias en la zona de depósito; potenciando las respuestas celular y
humoral para los antígenos de Leishmania braziliensis. Se pasó entonces a tomar las muestras
de sangre para evaluar los cambios hematológicos mediante el conteo de células blancas
(fórmula leucocitaria).
Luego de la inyección de saponinas y saponinas asociadas a fracciones antigénicas de L.
braziliensis, el porcentaje de neutrófilos se incrementa a las 48 horas y disminuye muy poco a
las 192 horas; las pruebas estadísticas indican con 95% de seguridad que tal variación es
significativa. No hay variación estadísticamente significativa por inyección de las fracciones
antigénicas de L. braziliensis.
Se conoce que en los seres humanos (Rodríguez et al., 1993), un aumento del porcentaje de
neutrófilos puede deberse a inflamaciones y ciertas enfermedades infecciosas agudas.
A las 48 horas hay una disminución estadísticamente significativa de eosinófilos en los
grupos que recibieron saponinas y saponinas más fracciones antigénicas de L. braziliensis;
esta condición se mantiene a las 192 horas.
Cuando la persona tiene ciertas reacciones alérgicas, infecciones u otras afecciones médicas
(Gersten et al., n.d.), los eosinófilos se vuelven activos. Estas células conforman solamente un
7
pequeño porcentaje del número total de células blancas, pero son una parte importante de la
respuesta inmunitaria del cuerpo, pues liberan histamina y otras sustancias químicas que
actúan sobre los vasos sanguíneos cuando la respuesta inmunitaria es activada.
A las 192 horas se registra una disminución estadísticamente significativa de basófilos en los
grupos que recibieron saponinas y saponinas asociadas a fracciones antigénicas de L.
braziliensis.
Los basófilos conforman solamente un pequeño porcentaje del número total de células
blancas (Dugdale et al. n.d.); pero son una parte importante de la respuesta inmunitaria del
cuerpo, pues liberan histamina y otras sustancias químicas que actúan sobre los vasos
sanguíneos cuando la respuesta inmunitaria es activada. El basófilo es una célula
preponderantemente sanguínea (Bordés, n.d.), acude a los tejidos durante el proceso
inflamatorio y supone un refuerzo en la liberación de mediadores ya que se activa por los
mismos mecanismos que el mastocito y libera mediadores equivalentes a los de esta célula.
El porcentaje de linfocitos disminuye a las 48 horas en los grupos que recibieron saponinas y
saponinas asociadas a fracciones antigénicas de L. braziliensis. A las 192 horas la diferencia
no es estadísticamente significativa.
A las 48 horas los grupos que recibieron saponinas y la combinación saponinas – antígenos de
L. braziliensis experimenta una disminución estadísticamente significativa en el porcentaje de
monocitos; pero a las 192 horas el porcentaje tiende a su valor normal. Los monocitos
colaboran con otros glóbulos blancos en la eliminación de tejidos muertos o dañados, en la
destrucción de células cancerosas y en la regulación de la inmunidad contra las sustancias
extrañas. Al igual que otros glóbulos blancos, los monocitos se originan en la médula ósea y
luego entran en el flujo sanguíneo. En unas horas, emigran a los tejidos donde se convierten
en macrófagos, y constituyen las células defensivas (fagocitos) del sistema inmunitario.
Estos hechos pueden ser explicados en parte por la dinámica del proceso inflamatorio
presentado por Bordés (n.d.). La inflamación es un proceso tisular constituido por una serie de
fenómenos moleculares, celulares y vasculares de finalidad defensiva frente a agresiones
físicas, químicas o biológicas. Los aspectos básicos que se destacan en el proceso
inflamatorio son en primer lugar, la focalización de la respuesta, que tiende a circunscribir la
zona de lucha contra el agente agresor. En segundo lugar, la respuesta inflamatoria es
inmediata, de urgencia y por tanto, preponderantemente inespecífica, aunque puede favorecer
el desarrollo posterior de una respuesta específica. En tercer lugar, el foco inflamatorio atrae a
las células inmunes de los tejidos cercanos. Las alteraciones vasculares van a permitir,
además, la llegada desde la sangre de moléculas inmunes.
Esquemáticamente la inflamación tiene cinco etapas:
1. Liberación de mediadores. Son moléculas, la mayor parte de ellas, de estructura elemental
que son liberadas o sintetizadas por el mastocito bajo la actuación de determinados
estímulos.
2. Efecto de los mediadores. Una vez liberadas, estas moléculas producen alteraciones
vasculares y efectos quimiotácticos que favorecen la llegada de moléculas y células
inmunes al foco inflamatorio.
3. Llegada de moléculas y células inmunes al foco inflamatorio. Proceden en su mayor parte
de la sangre, pero también de las zonas circundantes al foco.
4. Regulación del proceso inflamatorio. Como la mayor parte de las respuestas inmunes, el
fenómeno inflamatorio también integra una serie de mecanismos inhibidores tendentes a
finalizar o equilibrar el proceso.
5. Reparación. Fase constituida por fenómenos que van a determinar la reparación total o
parcial de los tejidos dañados por el agente agresor o por la propia respuesta inflamatoria.
8
Es muy importante la Fase tardía. Llegada de células
1. Basófilo. Contribuye, junto con el mastocito, a la liberación de mediadores.
9
5. Eosinófilo. Esta célula, atraída por el ECF-A, acude al foco inflamatorio donde libera una
serie de enzimas que degradan determinados mediadores potenciadores de la inflamación.
La histaminasa actúa sobre la histamina, la arilsulfatasa sobre los leucotrienos y la
fosfolipasa sobre el PAF.
V. CONCLUSIONES
10
12. PÉREZ, C. 2001. Técnicas Estadísticas con SPSS. Pearson Educación, S.A. Madrid.
13. Pizano, N. 2009. Guías Colombianas para el Diagnóstico y el Manejo de los Desórdenes
Crónicos de las Venas. ( http://www.asovascular.com/media/guias/Guias-Colombianas-
para-el-Diagnostico-y-el-Manejo-de-los-Desordenes-Cronicos-de-las-Venas.pdf,
Consultado el 8 de Julio, 2013)
14. Rodríguez, J. et al. 1993. Manual de Clases Prácticas de Fisiología Animal.
(http://books.google.com.pe/books?id=lY2b0gxFz28C&pg=PA93&lpg=PA93&dq=For
mula+leucocitaria+en+ratas&source=bl&ots=vpKDKCb5JR&sig=Ua35CE6YHA4nKP
kNUo1HpH3wUmk&hl=es-
419&sa=X&ei=RPrhUeDNENbK4AO5kYDoCg&ved=0CDQQ6AEwAg#v=onepage&
q=Formula%20leucocitaria%20en%20ratas&f=false, Consultado el 13 de julio, 2013)
15. Rosso, P. 2002. Construyendo puentes hacia un Chile más próspero, justo y
solidario. (http://repositorio.uc.cl/xmlui/handle/123456789/35?show=full, Consultado el 11
de junio, 2013)
16. TLC Perú – EEUU. Anexo 2.3 - Lista Arancelaria de la República del Perú.
(http://www.acuerdoscomerciales.gob.pe/images/stories/eeuu/espanol/Lista_Arancelaria
_PERU.pdf, Consultado el 11 de junio, 2013)
17. TPD Colombia-USA. Anexo 2.3 Lista Arancelaria de Colombia.
(http://www.sice.oas.org/TPD/AND_USA/COL_USA/Draft_text_050806_s/Lista%20d
e%20Desgravacion%20de%20Colombia%20(industria%20y%20textiles)%20con%20C
ategorias.pdf, Consultado el 11 de junio, 2013)
18. TSUZUKI, J. et al. 2007. Antifungal activity of the extracts and saponins from
Sapindus saponaria L. (http://www.scielo.br/pdf/aabc/v79n4/a02v79n4.pdf, Consultado
el 16 de junio, 2013)
19. WALPOLE, R. et al. 1999. Probabilidad y Estadística para Ingenieros. Prentice -
Hall Hispanoamericana, S.A. México D.F.
VºBº _____________________________
Dr. Ramón Piminchumo Carranza
11