Microbiologia de Alimentos

étodos de contagem microbiana
André Fioravante Guerra

Métodos de contagem microbiana
Valença, 1ª Edição, 2016. 28p.
Disponível em:
www.microbiologia-de-alimentos.com
MÉTODOS DÉ CONTAGÉM
çã
MICROBIANA
Todo método de contagem microbiana deve ser validado e
comprovado como eficaz para esta finalidade.
Alguns métodos já são utilizados há muito tempo e a

eficácia deles já é comprovada. Dente estes, pode-se citar:
contagem em placas, contagem pela técnica de tubos
múltiplos, contagem em câmara de Neubauer etc.
Atualmente, com o avanço tecnológico na área da

computação e técnicas moleculares, há muitos métodos
rápidos de contagem microbiana. Todos estes métodos
devem ter sua eficácia comprovada. Para isso, eles devem
equivaler aos métodos convencionais e serem capazes de
gerar resultados seguros.
Há disponível uma diversidade de métodos rápidos de

detecção microbiana. Estes métodos, na maioria das vezes,
são métodos indiretos, mas fornecem resultados precisos
em um curto intervalo de tempo.
A maioria destes métodos são baseados em kits

comerciais. Aos quais os fabricantes informam o
procedimento de uso. Normalmente, são bastante simples
de usar, muitas vezes, nem precisa de um profissional
especializado em microbiologia de alimentos e um
laboratório de microbiologia.
As desvantagens dos métodos rápidos é o custo,

normalmente análises por testes rápidos são bem mais
custosas que pelos métodos convencionais.
Alguns métodos necessitam de equipamentos auxiliares e

softwares computacionais para realização da leitura. Estes
necessitam ser constantemente calibrados e validados
utilizando métodos de referência.
Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

DILUIÇAO DÉ AMOSTRAS
Os alimentos podem conter diferentes quantidades de microrganismos, podendo oscilar

de zero até bilhões. Os métodos de contagem microbianos devem ser capazes de contar
qualquer nível de contaminação.
Para isso, a estratégia utilizada é diluir a amostra, desta forma, a quantidade de

microrganismo também é diluída. Desta forma, em alguma diluição será possível
realizar a contagem.
Normalmente, as diluições são realizadas com fator de diluição 10. Usualmente, os

procedimentos de análise orientam a diluição de 1mL de alíquota em 9 mL de diluente
apropriado.
Para análise de alimento, a primeira diluição deve ser feita transferindo 25g ou mL do
alimento para 225 mL de diluente. Este procedimento é realizado para obter melhor
amostragem dos alimentos.
Outras diluições podem ser realizadas se determinadas previamente pelo laboratório.

Porém, deve-se manter a proporção de 1:9 para manter o fator de diluição de 10 vezes.
Na Tabela 1 está mostrado algumas diluições utilizadas para contagem de
microrganismos em alimentos.
Tabela 1 – Diluições de amostras de alimentos e bebidas

Volume de alíquota (g ou mL) Volume de diluente (mL)
0,1 0,9
1 9
10 90
25 225
50 450
Na Figura 1 está mostrado um sistema de diluição até 10-6 (0,000001g/mL).
Figura 1 – Diluição de amostra.

Entendendo as diluições
Para preparar a diluição 10-1, deve-se transferir 25g ou mL para 225 mL de diluente.
Desta forma, esta é a diluição que contém 0,1g ou mL de amostra em 1 mL de solução.
Por conseguinte, para preparar a diluição 10-2, deve-se transferir 1mL da diluição 10-2
para outro tubo contendo 9 mL de diluente. Ao transferir uma alíquota de 1mL, na
verdade está transferindo 0,1g ou mL de amostra. Esta será diluída mais 10 vezes.
Assim, a diluição 10-2 é a que contém 0,01g ou mL de amostra em 1mL de solução.
Na Tabela 2 está mostrado a quantidade de amostra em cada nível de diluição.
Tabela 2 – quantidade de amostra em cada nível de diluição por mililitro.

Quantidade de amostra
Nível da diluição
por mililitro (g ou mL)
10 -1 0,1
10-2 0.01
10-3 0,001
10-4 0,0001
10-5 0,00001
Preparo das diluições
Para diluição das amostras, utiliza-se solução salina a 0,85% ou água peptonada a 0,1%
estéril. Os solutos adicionados à água de tem objetivo de manter a isotonia entre o
citoplasma celular e o diluente. Desta forma, evita-se a osmose entre estes dois meios.
Alguns alimentos necessitam de outros tipos de diluição. Na Tabela 3, está mostrado

alguns tipos de diluições especiais.

MÉTODOS DIRÉTOS DÉ CONTAGÉM
MICROBIANA
CONTAGEM EM PLACAS
A contagem em placas é o método mais comum de contagem de microrganismos

utilizada nos laboratórios de microbiologia.
Baseia-se na capacidade dos microrganismos se reproduzirem quando estão em meio de

cultura apropriado e na temperatura ótima de crescimento. A multiplicação microbiana,
após período de tempo de 24 a 48 horas, atinge bilhões de bactérias. O acúmulo destas
bactérias em um único loco da placa forma uma colônia visível ao olho humano. O
resultado é expresso como UFC (Unidade Formadora de Colônia) por unidade (peso,
volume, área etc).
Para expressar o resultado, é necessário contar as unidades formadoras de colônias. Em

uma placa de Petri, é possível contar até, aproximadamente, 300 UFC. Os manuais de
análises e as legislações específicas para microbiologia de alimentos estipulam limite
máximo e mínimo de contagem. Normalmente, o limite é entre 25 e 250 UFC, porém
alguns outros limites podem ser utilizados para algumas análises como, 15 - 150 ou 30 –
300 UFC/placa.
O limite máximo de contagem é estipulado devido a dificuldade de contagem de placas

contendo muitas UFC e o limite mínimo, devido a significância estatística do ensaio.
Para obter resultado mais significativo, a inoculação de cada diluição é executada em

duplicata. Portanto, o resultado de cada diluição, é a média da contagem das duas placas.
As formas mais comuns de executar a técnica são em profundidade e superfície. Porém,

algumas variações são bastante úteis, como a inoculação em microgota.
TÉCNICA EM PROFUNDIDADE
Alíquota de 1mL de cada diluição é transferida para placa de Petri vazia e estéril.
Posteriormente, o meio de cultura mantido líquido em banho termostático a 50 – 55°C é
adicionado à placa. A homogeneização é realizada com movimentos suaves em forma de
“8” sobre a bancada. Após solidificação, as placas são incubadas na temperatura ótima
de crescimento microbiano.

Na Figura 2 está mostrado a inoculação em profundidade
Figura 2 – Inoculação em profundidade.
Cálculo e expressão dos resultados – regra de três
1° Passo – encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, será utilizado limite
mínimo de 25 e máximo de 250 UFC. Portanto, a diluição selecionada deve ser a 10-3.
2° Passo – calcular a média das contagens:

45+41
Média = 2
= 43
3° Passo – a diluição 10-3 significa que há 0,001g ou mL de alimento em 1 mL de solução. Portanto, deve-se
fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento.
43 UFC ----------------------- 0,001g ou mL

x UFC ----------------------- 1g ou mL
x = 43000
Resultado = 4,3x104 UFC/g ou mL

Cálculo e expressão dos resultados – fórmula
Alternativamente, pode-se utilizar a seguinte fórmula matemática para calcular o resultado.
1 1
Resultado = média x x
nível de diluição volume da alíquota
Assim,
1 1
Resultado = 43 x −3
x
10 1
Resultado = 43000
Exemplo 1:
<1 UFC -------------------0,1g
Diluição Contagem (UFC)
X ------------------- 1g
10-1 0
-2 0,1x <1
10 0
X <1/0,1
10-3 0
X <10 UFC/g
Exemplo 2: 95 -------------------0,1g
Diluição Contagem (UFC) X ------------------- 1g
10-1 90 100 0,1x = 95
-2
10 6 10 X = 95/0,1
10-3 1 0 X = 950
X = 9,5 x102 UFC/g
Exemplo 3:
Diluição Contagem (UFC) 95 -------------------0,01g
10-1 >250 >250 X ------------------- 1g
10 -2
90 100 0,1x = 95
X = 95/0,01
10-3 6 10
X = 9500
X = 9,5 x103 UFC/g
Exemplo 4:
95 -------------------0,001g
X ------------------- 1g
10-1 >250 >250
-2
0,1x = 95
10 >250 >250 X = 95/0,001
10-3 90 100 X = 95000
X = 9,5 x104 UFC/g
Exemplo 5:
Diluição Contagem (UFC) >250 -------------------0,001g
10-1 >250 >250 X ------------------- 1g
10-2 >250 >250 0,1x >250
-3
10 >250 >250 X >250/0,001
X >250000
X >2,5 x105 UFC/g

TÉCNICA EM SUPERFÍCIE
Alíquota de 0,1mL de cada diluição deve ser transferida para placa de Petri já contendo
meio de cultura sólido. Posteriormente, a alíquota é espalhada sobre o meio com auxílio
de alça espalhadora (bastão tipo hockey ou alça de Drigalsky) até absorção completa da
alíquota pelo meio. Após, as placas são incubadas na temperatura ótima de crescimento
microbiano.
O volume máximo de alíquota que um meio de cultura, quando contido numa placa de
Petri de 9,1cm de diâmetro, consegue absorver é 0,3mL. Normalmente, na inoculação em
superfície, utiliza-se alíquota de 0,1mL. Porém, há casos que necessita inocular 1 mL de
cada diluição, neste caso, pode-se inocular 4 placas com volumes de: 0,3+0,3+0,3+0,1mL
ou 0,25+0,25+0,25+0,25mL.
Na Figura 3 está mostrado a inoculação em superfície
Figura 3 – Inoculação em superfície.

1° Passo – encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, utilizaremos entre 25
e 250. Portanto, selecionaremos a diluição 10-3.

45+41
Média = = 43
2
3° Passo – a diluição 10-3 significa que há 0,0001g ou mL de alimento em 1 mL de solução. Porém, a alíquota
inoculada foi de 0,1mL, então:
1mL ----------------------- 0,001g ou mL

0,1mL --------------------- y
y = 0,0001g ou mL
4° Passo – fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento.
43 UFC ----------------------- 0,0001g ou mL

x UFC ----------------------- 1g ou mL
x = 430000
Pode-se utilizar fórmula matemática para calcular o resultado.
1 1
Assim,
1 1
x
10 0,1
Resultado = 430000

Exemplo 1:
0,1 g -------------------1 mL <1 UFC -------------------0,01g
X ------------------- 0,1 mL
10-1 0 X = 0,01 g de alimento 0,01x = <1
10-2 0 inoculado X <1/0,01
X <100 UFC/g
Exemplo 2:
0,1 g -------------------1 mL 95 UFC -------------------0,01g
X ------------------- 0,1 mL
10-1 90 100 0,01x = 95
X =0,01 g de alimento
10-2 6 10 X = 9500
inoculado
X = 9,5 x 103 UFC/g
Exemplo 3:
0,01 g -------------------1 mL 95 UFC -------------------0,001g
X ------------------- 0,1 mL X ------------------- 1g
10-1 >250 >250
X = 0,001 g de alimento 0,001x = 95
10-2 90 100
inoculado X = 95000
X = 9,5 x 104 UFC/g
Exemplo 4 :
0,01 g -------------------1 mL >250 UFC -----------------0,001g
X ------------------- 0,1 mL X ------------------- 1g
10-1 >250 >250
X = 0,001 g de alimento 0,001x >250
10-2 >250 >250
inoculado X > 250000
X > 2,5 x 105 UFC/g
Exemplo 5 :
0,1 g -------------------1 mL 13 UFC -----------------0,01g
Diluição Contagem (UFC) X ------------------- 0,1 mL X ------------------- 1g
10-1 10 16 X =0,01 g de alimento 0,01x = 13
10-2 0 0 inoculado X = 13/0,01
X = 1,3 x 103 UFC/g est.
Obs- est. significa que o

resultado foi estimado, visto
que a contagem está abaixo
do limite mínimo do ensaio.

TÉCNICA EM MICROGOTA
Alíquota de 0,025ml (25µL) de cada diluição deve ser transferida para placa de Petri já
contendo meio de cultura sólido. Posteriormente, a placa é deixada em repouso sobre
uma superfície plana até absorção da alíquota pelo meio. Após, as placas são incubadas
na temperatura ótima de crescimento microbiano.
A contagem em microgota possui como vantagens a economia de meio de cultura, tempo

e espaço. Porém, é necessário utilizar uma micropipeta calibrada, pois o volume de
inoculação é muito pequeno.
Na Figura 4 está mostrado a inoculação em superfície
Figura 4 – Inoculação em profundidade.

1° Passo – encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, deve-se utilizar limite
mínimo de 10 e máximo de 70. Portanto, deve-se selecionar a diluição 10-3.

45+41
Média = = 43
2
3° Passo – diluição 10-3 significa que há 0,001g ou mL de alimento em 1 mL de solução. Porém, a alíquota
inoculada foi de 0,025mL, então:
1mL ----------------------- 0,001g ou mL

0,025mL --------------------- y
y = 0,000025g ou mL
4° Passo – fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento.
43 UFC ----------------------- 0,000025g ou mL

x UFC ----------------------- 1g ou mL
x = 1720000
Pode-se utilizar fórmula matemática para calcular o resultado.
1 1
Assim,
1 1
x
10 0,025
Resultado = 1720000

Exemplo 1:
0,1 g -------------------1 mL <1 UFC ------------------ 0,0025g
X ---------------- 0,025 mL
10-1 0 X = 0,0025 g de alimento 0,0025x = <1
10-2 0 inoculado X <1/0,0025
X < 400 UFC/g
Exemplo 2:
0,1 g -------------------1 mL 95 UFC -------------------0,0025g
Diluição Contagem (UFC) X ---------------------- 1g
X ------------------- 0,025 mL
10-1 90 100 0,0025x = 95
X =0,0025 g de alimento
10-2 6 10 X = 95/0,0025
inoculado
X = 3,8 x 104 UFC/g
Exemplo 3:
0,01 g -------------------1 mL 95 UFC -------------------0,00025g
X ------------------- 0,025 mL X ----------------------- 1g
10-1 >250 >250
X = 0,00025 g de alimento 0,00025x = 95
10-2 90 100
inoculado X = 95/0,00025
X = 3,8 x 105 UFC/g
Exemplo 4 :
0,01 g -------------------1 mL >250 UFC -----------------0,00025g
X ------------------- 0,025 mL X ------------------- 1g
10-1 >250 >250
X = 0,00025 g de alimento 0,00025x >250
10-2 >250 >250
inoculado X > 250/0,00025
X > 1,0 x 106 UFC/g
Exemplo 5 :
0,1 g -------------------1 mL 2 UFC ----------------- 0,0025g
Diluição Contagem (UFC) X ------------------- 0,025 mL X ------------------- 1g
10-1 1 3 X =0,0025 g de alimento 0,0025x = 2
10-2 0 0 inoculado X = 2/0,0025
X = 8,0 x 102 UFC/g est.
Obs- est. significa que o

resultado foi estimado, visto
que a contagem está abaixo
do limite mínimo do ensaio.

Cálculo e expressão dos resultados – calculador eletrônico
Pode-se utilizar o calculador eletrônico disponibilizado no site: www.microbiologia-de-alimentos.com
Link para download: http://www.microbiologia-de-alimentos.com/software/
1° Passo – preencher a massa e o volume do diluente utilizado para realizar a primeira diluição;
2° Passo – indicar o limite mínimo e máximo do ensaio;
3° Passo – digitar a contagem de cada placa inoculada;
4° Passo – digitar a alíquota inoculada – profundidade (1mL), superfície (0,1mL) e microgota (0,025mL);
4° Passo – assinalar com um “x” a campo da diluição que se encontra dentro do limite da contagem.
No caso de ausência de crescimento nas placas, é necessário assinalar com um “x” o campo: ausência de
crescimento nas placas.
Da mesma forma, se na última diluição inoculada, a contagem ultrapassar o limite máximo de contagem, é
necessário assinalar com um “x” o campo: incontáveis.

Atualmente, o sistema de normatização ISO, estabelece uma nova forma de calcular o
resultado. O cálculo deve ser realizado como média ponderada de duas diluições. Assim,
há maior significância do resultado, pois duas diluições sucessivas são utilizadas o
cálculo.
Cálculo e expressão dos resultados como média ponderada
Utiliza a seguinte fórmula:
∑𝑥
Resultado =
V (n1 + 0,1 n2)d
Em que:
𝑥 - número de colônias em todas as placas selecionadas;
n1 – número de placas selecionadas na primeira diluição;
n2 – número de placas selecionadas na segunda diluição;
V – é o volume de inóculo em cada placa, em mililitros;
d - nível de diluição correspondente à primeira diluição selecionada (a suspensão inicial é uma diluição).
Assim,
Diluição Contagem
(UFC)
10-1 90 100
-2
10 6 10
Então,
𝑥 = 90 +100 + 6 + 10 => ∑ 𝑥 = 206
V = 1mL (profundidade) / 0,1mL (superfície)
n1 = 2
n2 = 2
d = 10-1 => 0,1
Substituindo, considerando inoculação em superfície
206
Resultado = = 9,4𝑥103 UFC/g ou mL
0,1 (2 + 0,1(2))0,1

CONTAGEM EM CÂMARA DE NEUBAUER
A grande vantagem deste método de contagem microbiana é o fato de obter resultado já

no momento da execução da técnica. Ou seja, não é necessário incubação por um período
de 24 – 48 horas, como ocorre nos métodos de contagem em placas.
Por isso, é um método bastante útil para contagem de microrganismos em processos de

fermentação.
Para contagem, utiliza-se uma placa denominada câmara de Neubauer. A contagem é

feita com auxílio de um microscópio óptico utilizando a objetiva de 40 ou 100x.
A câmara é calibrada para conter um volume específico de inóculo de 0,0001mL, por

isso, o resultado pode ser expresso por unidade de volume ou peso de amostra.
Para executar a técnica, é necessário diluir a amostras numa proporção de 1:1 com azul
de metileno ou eritrosina. Após homogeneização, transfere-se uma alíquota para a mesa
da câmara de forma a cobrir toda superfície da leitura. O campo de leitura de uma
câmara de Neubauer está mostrado na Figura 5.
Figura 5 – Campo de leitura de uma câmara de Neubauer
Pode-se observar que a placa é dividida em 9 quadrantes, cada um deles contém 25 sub-
quadrantes. Cada quadrante pode ser separado em 3 tipos. As diferentes divisões dos
quadrantes servem para contar microrganismos de diferentes tamanhos.

Cada aresta do campo de leitura da câmara mede 3mm. Portanto, a área total da placa
mede 9mm2. Com a lamínula, o poço de leitura fica com uma profundidade de 0,1mm.
Portanto, o volume total da placa é de 0,9mm3.
Para contagem microbiana, normalmente seleciona-se apenas 1 dos 9 quadrantes, neste

caso, o volume selecionado para leitura é de 0,1mm3 (0,9mm3/9).
No quadrante selecionado para contagem, contar pelo menos 5 sub-quadrantes (os dos
cantos superiores, os dos cantos inferiores e o quadrado central).
Com os valores obtidos na contagem dos 5 sub-quadrantes, determinar o valor do

quadrado médio, que é a média aritmética dos quadrantes contados.
O valor do quadrante médio deve ser multiplicado por 25, que é o número total de sub-
quadrantes contidos no quadrante de contagem.
O valor obtido está em um volume de 0,1mm3. Convenientemente, este valor deve ser
transformado para cm3, pois 1cm3 equivale a 1mL. Em contrapartida, 1cm3 equivale a
1000mm3. Portanto, o número de células obtido na contagem, está em 0,0001mL. Então,
pode-se assumir que para expressar o resultado em células por mL, pode-se multiplicar
o número de células contadas pelo fator de 10000. Assim, o resultado já estará expresso
em células/mL.
Para obter o resultado final, ainda falta multiplicar o número de células/mL pelo fator de
diluição inicial da amostra (amostra + corante).
Há casos em que é necessário diluir a amostra antes de fazer a mistura com o corante.
Isso ocorre quando o número de células é muito alto. Neste caso, o resultado final deve
ser multiplicado pelo fator de diluição:
1
Fator de diluição =
nível de diluição

Cálculo e expressão dos resultados
1° Passo – encontrar o tipo de quadrante mais adequado para a contagem. Selecionar e contar as células
contidas em, pelo menos, 5 sub-quadrantes
Quad 1 = 50 células
Total = 210 células
2° Passo – calcular o quadrado médio
210
Quad médio = = 42
5
3° Passo – calcular o quadrado total
Quad total = 42 × 25 = 1050
4° Passo – transformar para células/mL
Quad total = 1050 × 10000 = 10500000
5° Passo – corrigir o fator de diluição inicial da amostra
Quad total = 10500000 × 2 = 21000000
Resultado = 2,1x107 células/mL
Cálculo usando o calculador eletrônico

Disponível no site: www.microbiologia-de-alimentos.com
Download link: http://www.microbiologia-de-alimentos.com/software/
Item – Calculador contagem em câmara de Neubauer. Valença, 1ªEd., 2016.exe
1° Passo – preencher o número de sub-quadrantes selecionados para contagem;
2° Passo –anotar a contagem obtida em cada sub-quadrante;
3° Passo –indicar os volumes de amostra e corante utilizado;
4° Passo – assinalar com um “x” a diluição selecionada para a contagem
5° Passo –o resultado será calculado automaticamente.

MÉTODOS INDIRÉTOS DÉ CONTAGÉM
MICROBIANA
TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS
É um método estatístico de contagem microbiana. A unidade de expressão do resultado

é “número mais provável de unidade formadora de colônia por grama ou mililitro”
(NMP/g ou mL).
Há tabelas específicas para análise microbiológica de água que expressa o resultado

como NMP/100 mL.
A tabela de número mais provável para alimentos, estabelece a inoculação de 3 níveis de

diluição em 3 tubos. Por isso, são denominadas tabelas de número mais provável por
grama ou mL, para séries de 3 tubos com inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001g ou mL.
Neste caso, deve-se inocular 3 tubos de cada diluição com 1mL cada.
Para detecção dos tubos positivos, é necessário um meio de diferenciação. Isto pode ser
conseguido com adição de um tubo de Duhran invertido no interior de meio, como
ocorre na análise de coliformes pela técnica de tubos múltiplos.
Na Figura 6 está mostrado a técnica de tubos múltiplos.
Figura 6 – inoculação pela técnica de tubos múltiplos

A técnica de tubos múltiplos é bastante útil para detecção de poucas quantidades de
microrganismos. Esta técnica permite detecção de até 0,3NMP/g ou mL de alimentos.
Este nível de detecção não é possível quando se utiliza o método de contagem em placas.
Para expressar o resultado, é necessário o auxílio de uma tabela de número mais

provável. Na Figura 7 está mostrado uma tabela de número mais provável para
alimentos.
Figura 7 – Tabela de Número mais Provável.

Executando a análise conforme a Figura 7, os limites mínimo e máximo de detecção do
ensaio é <3,0 e >1100NMP/g ou mL, respectivamente. Há como diminuir e aumentar o
limite de detecção do teste.
Para diminuir, é necessário inocular 1mL de diretamente do alimento (alimentos

líquidos) ou 10mL da diluição 10-1 (alimentos sólidos). Neste último caso, é necessário
preparar a primeira série de tubos com dupla concentração e contendo exatamente
10mL. Este procedimento tem como objetivo evitar a diluição da amostra, visto que os
10mL de meio em dupla concentração, será diluído com 10mL de líquido da primeira
diluição. Desta forma, a concentração final será a concentração recomendada pelo
fabricante.
Para aumentar o nível de detecção do teste, basta acrescentar mais tubos de diluição e
diluir mais a amostra.
Na Figura 8 e 9 estão mostrados como proceder para diminuir e aumentar o nível de

detecção do ensaio, respectivamente.
Figura 8 – Técnica de tubos múltiplos com limite de detecção reduzido.

Figura 9 – Técnica de tubos múltiplos com limite de detecção aumentado.
Cálculo e expressão dos resultados - TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL
1 – Anotar o número de tubos positivos em cada diluição;
2 – A quantidade de tubos positivos deve ser arranjados em uma única linha da maior para a menor diluição:
Exemplo:
10-1 10-2 10-3
2 1 0
Neste caso, a combinação de tubos a ser considerada é: 2 1 0
3 – Encontrar a combinação na Tabela de NMP.

Exemplo:
Número Mais Provável por grama ou mL, para séries de 3 tubos com inóculos
de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL e respectivos intervalos de confiança 95%.
Número de Tubos NMP/g ou mL Intervalo de Confiança
Positivos (95%)
-1 -2 -3
10 10 10 Inferior Superior
0 0 0 <3,0 -- 9,5
2 1 0 15 3,7 42
3 3 3 >1100 420 --
4 – Observar se a diluição utilizada para obter a combinação coincide com a diluição da Tabela NMP.
5 – Se coincidir, o NMP expresso na quarta coluna da Tabela NMP já é o resultado. Caso contrário, o resultado
da quarta coluna deve ser multiplicado pela razão (divisão) entre a diluição mais concentrada inoculada e a
primeira diluição da Tabela NMP.
Cálculo e expressão dos resultados - TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL ELETRÔNICA
Disponível no site: www.microbiologia-de-alimentos.com

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Item – Tabela NMP-g ou mL. Série de 3 tubos. Inóculo 0,1; 0,01 e 0,001 g. Valença, 1ª Ed. 2015.exe
Tabela NMP-100 mL - Série de 10 tubos - Inóculo de 10 mL.Valença, 1ª Ed. 2015.exe
Tabela NMP-100 mL - Série de 5 tubos - Inóculo de 10; 1; 0,1 mL.Valença, 1ª Ed. 2015.exe
Tabela NMP-100 mL - Série de 5 tubos - Inóculo de 10 mL.Valença, 1ª Ed. 2015.exe
Neste caso, deve-se digitar a combinação de tubos positivos após teste de confirmação em caldo verde
brilhante ou Escherichia coli, e o resultado é gerado automaticamente. Também é necessário fazer a correção
se a diluição mais concentrada utilizada para gerar o resultado não coincidir com a primeira diluição da Tabela
NMP.
Exemplo:

MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO
É um método indireto de contagem microbiana baseado na propriedade de turvação do

meio de cultura quando há crescimento microbiano.
O nível de turvação do meio de cultura é medido em um espectrofotômetro e expresso

como absorvância ou transmitância.
Para medida do crescimento microbiano, é necessário utilizar um tubo contendo o

mesmo meio de cultura de crescimento, porém sem inóculo. Este tubo será utilizado
para zerar o equipamento e descontar a quantidade de luz que o meio sem crescimento
microbiano absorve. Desta forma, a diferença de luz absorvida entre o tubo com
crescimento e sem crescimento, é a quantidade de crescimento microbiano.
A expressão do resultado pode ser em unidade de absorvância ou transmitância, porém

pode-se expressar o resultado como UFC/g ou mL através da confecção de uma curva de
calibração.
Neste caso, é necessário obter uma quantidade considerável de amostra (normalmente

por centrifugação e eliminação do sobrenadante), seguido de diluição em vários níveis
de forma a contemplar toda faixa de extensão da leitura do espectrofotômetro
(absorvância 0,2 – 0,8). O monocromador do equipamento deve estar ajustado para 620
λ.
Construção da curva de calibração
1° Passo – ativação do inóculo
2° Passo – centrifugação, lavagem do pellet com tampão fosfato pH 7,2 e centrifugação. Este
procedimento deve ser repetido duas vezes e tem como objetivo eliminar interferentes na leitura no
espectrofotômetro;
3° Passo – adicionar quantidade suficiente de tampão ao pellet de modo a conferir absorbância de 0,800 à
600λ;
4° Passo – a partir do tubo ajustado no 3° passo, preparar mais quatro diluições transferindo os
respectivos volumes de alíquota e tampão: 1:1; 1:5; 1:9; 1:99;
5° Passo – ler e anotar a absorvância de todos os tubos no espectrofotômetro ajustado para 600 λ;
6° Passo – fazer a contagem de UFC/g ou mL por alguma técnica de contagem (profundidade, superfície
ou microgota);
7° Passo – plotar um gráfico de dispersão absorvância x UFC/g ou mL. Solicitar regressão linear para
avaliar a melhor equação representativa dos dados experimentais. Avaliar o valor de “R” e “R2”.

Cálculo de UFC/g ou mL de uma amostra
1° Passo – tomar uma amostra e mensurar a absorvância no mesmo comprimento de onda selecionado
para construção da curva de calibração;
2° Passo – se a absorvância estiver no intervalo entre 0,2 e 0,8, este valor já pode ser utilizado para
cálculo de UFC/mL. Caso contrário, deve-se diluir ou concentrar a amostra até conseguir absorvância
nesta faixa de linearidade;
3° Passo –o valor da absorvância é o “y” da equação. O valor de “x” é a quantidade de UFC/g ou mL;
4° Passo – se tiver sido necessário diluir a amostra. O valor de “x” (UFC/g ou mL) ainda deve ser
multiplicado pelo fator de diluição.
Exemplo – curva de calibração de Saccharomyces cerevisiae
Leitura das diluições
Diluições Absorvância (600λ)

leitura ajustada 0.800
1:1 0.635
1:5 0.422
1:9 0.321
1:99 0.186
Contagem das células em câmara de Neubauer
Absorvância
células/mL Log células/mL
600λ
0.800 1200000 6.1
0.635 1000000 6.0
0.422 500000 5.7
0.321 190000 5.3
0.186 120000 5.1
Plotagem do gráfico
1.2
1
Absorvância 600λ
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Log células/mL

Inserir linha de tendência e exibir equação
1.2
1
Absorvância 600λ
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Log células/mL
Problema 1 – descobrir a quantidade de células/mL de um crescimento overnight de Saccharomyces cerevisiae
Absorvância da amostra => 0.532 (suposição)

Este valor é o “y” da função. Para descobrir a quantidade de células/mL basta substituir na equação
𝑦 = 0.5386𝑥 − 2.5578
0.532 = 0.5386𝑥 − 2.5578
0.532 + 2.5578 = 0.5386𝑥
𝑥 = 5.74 log 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿
Resolvendo log de 5.74

𝑥 = 5.4𝑥105 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿
Problema 2 – ajustar um inóculo de Saccharomyces cerevisiae para conter exatamente 2,5x105 células/mL
Este é o valor “x” da equação, substituindo:

Log de 2,5x105 é de 5.40, portanto:
𝑦 = 0.5386𝑥 − 2.5578
𝑦 = 0.5386(5.40) − 2.5578
𝑦 = 0.349
Ajustar a absorvância (600λ) do inóculo para 0.349
Problema 3 – descobrir a quantidade de células/mL de um crescimento overnight de Saccharomyces cerevisiae
Absorvância da amostra => 1.567 (suposição)

Diluir a amostra até a faixa de leitura
Diluindo a amostra na proporção de 1:3

Absorvância da amostra => 0.632
𝑦 = 0.5386𝑥 − 2.5578
0.632 = 0.5386𝑥 − 2.5578
0.632 + 2.5578 = 0.5386𝑥
𝑥 = 5.92 log 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿
Resolvendo log de 5.74

5
𝑥 = 8.4𝑥10 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿 x 4 (fator de diluição)
𝑥 = 3.3𝑥106 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿

BIBLIOGRAFIA
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. 10.ed. Porto
Alegre: Artmed, c2012. xxviii, 934 p., il., color. ISBN 9788536326061 (enc.).
PELCZAR, Michael Joseph; CHAN, E. C. S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia: conceitos e

aplicações. 2.ed. São Paulo: Pearson Education: Makron Books, 1997. 2v., il. (algumas
color.), tabs. Inclui apêndice, glossário e índice. ISBN v.1 9788534601962 (Broch.).
BAM - BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL On Line . U.S. Food and Drug

Administration. Departmente os Health and Human Services, 2001.
NEDER, Rahme Nelly. Microbiologia : manual de laboratório. São Paulo: Nobel, 2004.
[138], il. Bibliografia : p. [138]. ISBN 8521307152 (Broch.).
MADIGAN, Michael T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de Brock. 10.
ed. São Paulo: Prentice Hall, 2004. 608 p., il. Inclui bibliografia e índice. ISBN
9788587918512
KRIEG, N. R. & HOLT, J. G. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th ed. Vol
1,2,3,4 - Willians & Wilkins Inc. N. York. 1984.
DOWNES, F.P. & ITO, K. Compendium of Methods for the Microbiological

Examination of Foods. 4th ed. Washington, D.C.: American Public Health Association
(APHA), 2001.120p.

Microbiologia de Alimentos

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étodos de contagem microbiana

André Fioravante Guerra

Alguns métodos já são utilizados há muito tempo e a

Atualmente, com o avanço tecnológico na área da

Há disponível uma diversidade de métodos rápidos de

A maioria destes métodos são baseados em kits

As desvantagens dos métodos rápidos é o custo,

Alguns métodos necessitam de equipamentos auxiliares e

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

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Para isso, a estratégia utilizada é diluir a amostra, desta forma, a quantidade de

Normalmente, as diluições são realizadas com fator de diluição 10. Usualmente, os

Outras diluições podem ser realizadas se determinadas previamente pelo laboratório.

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Na Figura 1 está mostrado um sistema de diluição até 10-6 (0,000001g/mL).

Figura 1 – Diluição de amostra.

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

Na Tabela 2 está mostrado a quantidade de amostra em cada nível de diluição.

Tabela 2 – quantidade de amostra em cada nível de diluição por mililitro.

Preparo das diluições

Alguns alimentos necessitam de outros tipos de diluição. Na Tabela 3, está mostrado

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

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Baseia-se na capacidade dos microrganismos se reproduzirem quando estão em meio de

Para expressar o resultado, é necessário contar as unidades formadoras de colônias. Em

O limite máximo de contagem é estipulado devido a dificuldade de contagem de placas

Para obter resultado mais significativo, a inoculação de cada diluição é executada em

As formas mais comuns de executar a técnica são em profundidade e superfície. Porém,

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

Figura 2 – Inoculação em profundidade.

Cálculo e expressão dos resultados – regra de três

2° Passo – calcular a média das contagens:

43 UFC ----------------------- 0,001g ou mL

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

Alternativamente, pode-se utilizar a seguinte fórmula matemática para calcular o resultado.

Resultado = 4,3x104 UFC/g ou mL

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

Na Figura 3 está mostrado a inoculação em superfície

Figura 3 – Inoculação em superfície.

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

2° Passo – calcular a média das contagens:

1mL ----------------------- 0,001g ou mL

43 UFC ----------------------- 0,0001g ou mL

Resultado = 4,3x105 UFC/g ou mL

Cálculo e expressão dos resultados – fórmula

Pode-se utilizar fórmula matemática para calcular o resultado.

Resultado = 4,3x105 UFC/g ou mL

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

Obs- est. significa que o

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

A contagem em microgota possui como vantagens a economia de meio de cultura, tempo

Na Figura 4 está mostrado a inoculação em superfície

Figura 4 – Inoculação em profundidade.

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

2° Passo – calcular a média das contagens:

1mL ----------------------- 0,001g ou mL

43 UFC ----------------------- 0,000025g ou mL

Resultado = 1,72x106 UFC/g ou mL

Cálculo e expressão dos resultados – fórmula

Pode-se utilizar fórmula matemática para calcular o resultado.

Resultado = 1,72x106 UFC/g ou mL

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

Obs- est. significa que o