RT-PCR reacciones, requiere más tiempo, método
¿QUE ES?
La RT-PCR se trata de una amplificación de
RNA (especialmente mRNA de células
asequibles) a través de la síntesis previa de su
cDNA, que después de amplifica por PCR.
Historia
• 1970- descubrimiento de la transcriptasa
inversa por Howard Temin, David
Maltimore & Renato Dulbecco. (Premio
nobel de fisiología o medicina, 1975)
• 1983- Descubrimiento de la PCR por el
Dr Kary Mullis (Premio nobel de
Quimica,1993)
Aplicaciones
• Diagnóstico de enfermedades
inmunológicas; Determinar carga vírica;
contaminantes en la sangre, comida u otro
tipo de muestras
• Determinar La Expresión génica en
distintas muestras.
• Aplicaciones clínicas como el
diagnóstico de tumores (ejemplo;
liposarcoma mixoide), respuesta a
medicamentos oncológicos, perfil de
citocina en la respuesta inmune.
• validación de RNAi, validación de
micromatrices y detección de patógenos.
Requerimientos de diseño de un ensayo de
RT-PCR
• RT-qPCR de one-step (menos variación
experimental, menos riesgo de
contaminación, adecuado para la
amplificación, método rápido y simple)
vs. Two-step (ADNc estable, puede
almacenarse durante largos períodos de
tiempo y usarse para múltiples
más complejo)
• ARN total vs. ARNm: El ARNm puede
proporcionar un poco más de
sensibilidad, pero el ARN total se usa a
menudo porque tiene importantes
ventajas sobre el ARNm como material
de partida. Primero, se requieren menos
pasos de purificación, lo que garantiza
una recuperación más cuantitativa de la
plantilla
• Primers para la transcripción inversa:
cebadores oligo (dT), Random primers o
Sequence Specific Primers). A menudo,
se utiliza una mezcla de oligo (dT) y
cebadores aleatorios. Estos cebadores se
complementan con la cadena de ARNm
de la plantilla y proporcionan a las
enzimas transcriptasas inversas un punto
de partida para la síntesis.
• Enzima: Trancriptasa inversa con
actividad ARNasa H.
• ADN polimerasa
• Buffer + dNTPs
• Termociclador (PCR)
Metodología
SINTESIS PREVIA DEL ADNc
1. Plantilla de ARNm poliadeninado. Antes
de iniciar la transcripción inversa, la
platilla de ARN debe aislarse de la
muestra analizar.
2. Cebado para la transcripción inversa.
Para generar ADNc utilizando la enzima
transcriptasa inversa (RT), un cebador se
 une al ARN plantilla. Los Primers pueden
ser; Primers específicos de genes,
Random Primers y Oligo-dT. En este
ejemplo se utilizan Oligo-dT para iniciar
la síntesis de ADNc a partir de ARNm.
para obtener un producto de PCR
detectable, el cual se puede visualizar en
un gel de agarosa teñido con bromuro de
etidio después de la electroforesis(D).

3. (A) la transcriptasa inversa comienza

(desde el primers) a sintetizar la primera
hebra de ADNc. (Retrotranscripción) (B)
la RT agrega bases de nucleótidos
complementarios a la cadena de ARNm
creando una cadena de ADNc.

PRINCIPIO DEL MÉTODO DE PCR

1. Desnaturalización del ADNc de doble

cadena: Temperatura entre 68-97°C
(debe ser superior a la Tm) entre 30-120s
(por ejemplo; protocolo para PRRS
4. Eliminación de la plantilla de ARNm
95°C/15s).
mediante la actividad ARNasa H. y el
2. Hibridación o Templado: especifica de la
ADNc ahora se puede usar para la
hebra sencilla con un oligonucleótido, se
amplificación por PCR.
lleva a cabo un enfriamiento rápido por
debajo de la Tm, de 37.-65°C entre 10-
120s (por ejemplo; protocolo para PRRS
60°C/120s).
3. Replicación de la hebra sencilla por una
INICIO DE LA PCR
ADN pol. a partir del primer (elongación
o extensión del cebador, o
5. En la reacción de PCR, el primer de
polimerización). Temperaturas entre 72-
oligonucleótidos, se hibrida con la
75°C durante 1-3min.(por ejemplo;
plantilla de ADNc (A). la taq polimerasa
protocolo para PRRS 72°C/7min)
agrega nucleótidos complementarios a
Duración total de 2 horas, generalmente se
partir del sitio de reconocimiento del
hacen de 20-40 ciclos de 1.5-5min de
primer (B). el producto resultante es un
duración cada uno.
ADNc de doble cadena (C). el proceso de
protocolo para PRRS (virus del síndrome
tres etapas de desnaturalización,
respiratorio y reproductivo porcino)-40 ciclos
templado del primer y extensión se repite