ABSTRAK

Kutu adalah ektoparasit haematophagous obligat dari hewan liar dan

domestik serta manusia, dipertimbangkan berada di dunia kedua
untuk nyamuk sebagai vektor penyakit manusia, tetapi vektor yang
paling penting
patogen penyebab penyakit pada hewan domestik dan liar. Babesia
spp. adalah patogen tick-borne yang menyebabkan penyakit yang
disebut babesiosis di berbagai hewan dan pada manusia. Secara
khusus, Babesia bovis dan Babesia bigemina ditularkan oleh kutu
ternak, Rhipicephalus (Boophilus) annulatus dan Rhipicephalus
microplus, yang dianggap sebagai ektoparasit ternak terpenting
dengan ekonomi besar
dampak pada produksi ternak. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengidentifikasi gen R. annulatus secara berbeda dinyatakan sebagai
respons terhadap infeksi B. bigemina. Analisis fungsional dilakukan
pada yang dipilih gen oleh interferensi RNA di kedua R. annulatus
dan R. microplus ticks. Delapan ratus dipilih secara acak kloning
penindasan hibridisasi-subtraktif disekuensing dan dianalisis. Fungsi
molekuler Penugasan Ontologi Gene menunjukkan bahwa urutan kisi
yang diperoleh dikodekan untuk protein dengan yang berbeda fungsi
seluler. Gen diekspresikan secara berbeda dengan fungsi putatif dalam
interaksi tick-pathogen dipilih untuk validasi hasil SSH dengan real-
time reverse transcription-PCR. Gen penyandi untuk TROSPA,
calreticulin, ricinusin dan serum amyloid A diekspresikan berlebihan
pada B. kutu yang terinfeksi bigemina sementara tingkat protease
inhibitor Kunitz-tipe 5 mRNA turun-diatur dalam kutu yang
terinfeksi. Fungsional
analisis gen yang diekspresikan secara diferensial oleh RNA-mediated
RNAi beruntai ganda menunjukkan bahwa di bawah kondisi dari studi
saat ini yang menjatuhkan TROSPA dan serum amiloid A secara
signifikan berkurang
B. tingkat infeksi bigemina di R. annulatus sementara di R. microplus,
knockdown dari TROSPA, serum amyloid A dan calreticulin juga
mengurangi tingkat infeksi patogen bila dibandingkan dengan kontrol.
Beberapa penelitian
telah menandai antarmuka tick-pathogen pada tingkat molekuler.
Namun, sepengetahuan kami ini laporan pertama studi genomik
fungsional pada R. annulatus yang terinfeksi B. bigemina. Hasil
dilaporkan di sini meningkatkan pemahaman kita tentang peran gen
tick dalam infeksi Babesia / perkalian.
2012 Masyarakat Australia untuk Parasitologi Inc. Diterbitkan oleh
Elsevier Ltd. Semua hak dilindungi undang-undang.
1. Perkenalan
Kutu adalah ektoparasit haematophagous dari liar dan
hewan domestik dan manusia diklasifikasikan dalam subclass Acari,
pesan Parasitiformes, suborder Ixodida. Arthropoda ini
didistribusikan di seluruh dunia dari Arctic ke daerah tropis dan
dipertimbangkan
sama relevannya dengan nyamuk sebagai vektor penyakit manusia,
tetapi vektor yang paling penting dari patogen penyebab penyakit di
hewan domestik dan liar (Kompen, 2005; de la Fuente et al.,
2008a, b).
Patogen tick-borne dari genus Babesia adalah Apicomplexan
parasit bertanggung jawab untuk babesiosis, penyakit yang
mempengaruhi lebar
berbagai hewan dan kadang-kadang manusia. Ekonomi utama
dampak babesiosis adalah pada industri ternak, yang disebabkan oleh
infeksi
dengan Babesia bovis dan Babesia bigemina. Rhipicephalus
(Boophilus)
spp. tick adalah vektor utama mereka dan dianggap sebagai salah satu
ektoparasit ternak yang paling penting karena dampak langsungnya
dan transmisi patogen yang mempengaruhi produksi kulit, daging dan
susu
(Bock et al., 2004).
Kontrol infestasi kutu terutama didasarkan pada penggunaan
dari acaricides. Namun, penerapan acaricides telah terbatas
khasiat dalam mengurangi infestasi kutu dan sering disertai
kerugian serius, termasuk pemilihan resisten acaricide
caplak, kontaminasi lingkungan dan kontaminasi susu
dan produk daging dengan residu acaricide (Graf et al., 2004).
Alternatif untuk perawatan acaricide konvensional telah
dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir sebagaimana diwakili
oleh vaksin tick. Itu
Bm86 menandai antigen vaksin, yang digunakan pertama dan satu-
satunya
vaksin tick kutu yang tersedia secara komersial, mengurangi nomor
tick,
berat badan dan kinerja reproduksi kutu betina yang dihasilkan
dalam pengurangan populasi kutu sapi dari waktu ke waktu (de la
Fuente dan Kocan, 2006, 2007a; Willadsen, 2006).
Pengurangan infestasi kutu telah menjadi tujuan dari vaksin tick
pengembangan. Namun, pengurangan transmisi patogen tick-borne
mewakili tujuan yang sama pentingnya. Studi terbaru menunjukkan
yang menandai vaksin mengurangi infeksi patogen tick ketika
menggunakan antigen yang ditemukan terkait dengan infeksi patogen
/ perkalian,
mengilustrasikan kompleksitas ko-evolusi tick-pathogen
(de la Fuente et al., 2011). Mengembangkan vaksin dengan
menargetkan keduanya
transmisi patogen dan infestasi tick kemungkinan akan menjadi layak
dan strategi produktif (de la Fuente et al., 2006, 2011; Labuda
et al., 2006). Interaksi molekuler pada antarmuka tick-pathogen
memastikan
kelangsungan hidup dan pengembangan kedua patogen dan vektor
kutu.
Sementara penelitian terbaru telah menunjukkan bahwa mencentang
ekspresi gen
dimodifikasi sebagai respons terhadap infeksi patogen (Macaluso et
al.,
2003; Mulenga et al., 2003; Nene et al., 2004; Rudenko dkk.,
2005; de la Fuente et al., 2007b, c; Villar et al., 2010; Zivkovic
et al., 2010a; Mercado-Curiel dkk., 2011), informasi tentang fungsi
tersebut
gen yang diekspresikan secara diferensial terbatas (de la Fuente et al.,
2007b, c, 2008; Kocan et al., 2009; Villar et al., 2010; Zivkovic dkk.,
2010a, b; Mercado-Curiel et al., 2011). Interferensi RNA (RNAi)
memiliki
terbukti menjadi alat yang berguna untuk karakterisasi fungsional
gen yang terlibat dalam interaksi dan pemilihan tick-host-pathogen
dari kandidat mencentang antigen pelindung (de la Fuente et al.,
2007b).
Tujuan dari penelitian ini adalah identifikasi Rhipicephalus
(Boophilus) annulatus gen secara diferensial dinyatakan dalam
Menanggapi infeksi B. bigemina dengan menggunakan penekanan-
subtraktif
hibridisasi (SSH), yang memungkinkan identifikasi langka
dan gen baru yang diekspresikan secara berbeda (Diatchenko et al.,
1996,
1999). Hasil studi SSH divalidasi oleh real-time
reverse transcription (RT) -PCR. Analisis fungsional dilakukan
oleh RNAi pada gen yang dipilih di kedua R. annulatus dan
Rhipicephalus
kutu microplus untuk menentukan peran putatif ini
gen dalam interaksi B. bigemina – tick.
Studi ini merupakan kontribusi mendasar terhadap pemahaman
dari antarmuka pathogen-tick dan kemungkinan akan berkontribusi
untuk pengembangan penghambatan pencemaran pathogen generasi
baru
vaksin yang dirancang untuk mencegah penularan dan mengurangi
paparan host vertebrata terhadap parasit Babesia yang ditularkan
2. Bahan dan metode
2.1. Kutu
Rontok R. annulatus terinfeksi B. yang terinfeksi dan tidak terinfeksi
B.
digunakan untuk pembangunan perpustakaan SSH disediakan oleh
Institut Kedokteran Hewan Kimron, Israel. The Anaplasma- dan
Babesiafree
R. annulatus (Mercedes strain, Texas, USA) dan R. microplus
(Media Joya saring, CENAPA, Meksiko) kutu yang digunakan untuk
eksperimen RNAi
diperoleh dari koloni laboratorium yang dipertahankan di
Universitas Tamaulipas, Meksiko. Awalnya, strain tick ini
dikumpulkan dari ternak yang terinfestasi. Kutu dipertahankan
ternak di fasilitas pemeliharaan kutu di Kimron Veterinary
Institut atau Universitas Tamaulipas. Persetujuan etika hewan
diberikan untuk pekerjaan ini. Larva disimpan di luar inang dalam
inkubator
pada 20–25 C dengan 95% kelembaban relatif dan 12 jam terang: 12
jam gelap
fotoperiode. Sapi dirawat di Israel dan Meksiko di
sesuai dengan standar yang ditentukan dalam Panduan Perawatan dan
Penggunaan Hewan Laboratorium.
2.2. Kutu tidak terinfeksi dan B. bigemina terinfeksi untuk pustaka
SSH
konstruksi
Dua anak sapi Friesian berusia 3–4 bulan, bebas dari babesiosis,
digunakan untuk mendapatkan B. kutu betina R. annulatus terinfeksi
bigemina.
Sebelum menginjak infestasi, anak sapi diuji untuk antibodi terhadap
Babesia
spp. infeksi menggunakan uji immunoflourescence (Shkap et al.,
2005) dan disimpan dalam kondisi ketat tanpa kancing. Satu anak sapi
diinokulasi
i.v. dengan cryopreserved 2 108 B. bigemina (Moledet strain).
Untuk mendapatkan kutu yang terinfeksi, kutu R. annulatus diberi
makan pada yang terinfeksi
betis. Kutu betina dewasa yang dikuliti dikumpulkan dari keduanya
yang terinfeksi
dan anak sapi yang tidak terinfeksi setelah makan dan dipelihara di 28
C
dan kelembaban 80%
2.3. konstruksi perpustakaan cDNA dan SSH Kutu dua kali dibilas
satu per satu dalam air yang distilasi, satu kali dalam 75% (v / v)
etanol dan sekali lagi dalam air. Setiap kutu dibedah dan seluruh
organ internal ditempatkan dalam tabung 2 ml dengan 1 ml Tri
Reagent (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO, USA). Total RNA dan
DNA diisolasi sesuai dengan protokol pabrikan. SEBUAH PCR
dilakukan untuk mendeteksi keberadaan B. bigemina di sampel kutu
menggunakan primer Bbi400F: 50-
AGCTTGCTTTCACAACTCGCC- 30 dan Bbi400R: 50-
TTGGTGCTTTGACCGACGACAT-30 yang memperkuat fragmen
400 bp dalam wilayah yang dilestarikan lima gen paralog rap-1a
(Suarez et al., 2003). Total RNA diisolasi dari sembilan R. annulatus
betina yang membesar terinfeksi B. bigemina dan sembilan kutu yang
tidak terinfeksi. Kualitas RNA diperiksa oleh elektroforesis gel untuk
mengkonfirmasi integritas persiapan RNA. Dua kolam sesuai dengan
yang terinfeksi dan populasi kutu yang tidak terinfeksi dibuat. Poly A
+ RNA diisolasi menggunakan FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit
(Invitrogen) Teknologi kehidupan, Carlsbad, CA, USA). CDNA
disintesis dan perpustakaan SSH dibangun menggunakan PCR-Select
™ cDNA subtraction Kit (Clontech-Takara, Mountain View, CA,
USA). Secara singkat, cDNA beruntai ganda dari kedua kelompok
(terinfeksi dan kutu tidak terinfeksi) dicerna dengan RsaI. Bagian
yang dicerna cDNA diligasi dengan Adaptor 1 dan bagian dengan
Adaptor 2R; sisa cDNA disimpan untuk digunakan sebagai penggerak
dalam hibridisasi. Perpustakaan yang diperkecil ke depan dibuat
dengan hibridisasi adaptor cDNA diligasi dari B. bigemina
menginfeksi kutu sebagai penguji di hadapan tick cDNA yang tidak
terinfeksi sebagai pengemudi. Reaksi ini dirancang untuk
menghasilkan klon yang diregulasi di terinfeksi kutu. CDNA yang
diekspresikan secara diferensial diamplifikasi dengan PCR dengan
Advantage PCR polymerase mix, dikloning menggunakan Kloning
TA TOPO Kit untuk sekuensing (Teknologi kehidupan Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA), berubah menjadi sel One Shot TOP10
(kehidupan Invitrogen Teknologi, Carlsbad, CA, USA) dan disepuh
pada kaldu Lennox (LB) / agar dengan ampisilin (100 lg / ml), X-gal
(5-bromo-4-chloroindolyl- beta D-galactoside) (40 lg / ml) dan IPTG
(isopropyl-betathio galactopyranoside) (0,2 mM). Sel yang berubah
tumbuh, jumlah koloni rekombinan diperkirakan dan kehadirannya
dari sisipan dikonfirmasi oleh PCR menggunakan T3 universal dan
T7 primer. Koloni yang memiliki sisipan yang dikonfirmasi kemudian
diinokulasi ke dalam LB / ampisilin dan ditanam semalam untuk
plasmid Pemurnian DNA
2.4. Analisis urutan dan pencarian basis data
DNA plasmid dimurnikan menggunakan Prep plasmid Illustra
Mini Spin Kit (GE HealthCare, Buckinghamshire, UK) dan 800
klon dari perpustakaan SSH secara acak dipilih dan diurutkan
di Departemen Ilmu Genome, Universitas Washington,
AMERIKA SERIKAT. Perangkat lunak Sistem Anotasi cDNA
(dCAS; Bioinformatika
dan Program Ilmiah IT (BSIP), Kantor Informasi Teknologi
Sistem (OTIS), Institut Nasional Alergi dan Penyakit Menular
(NIAID), Bethesda, MD, USA) (http://exon.niaid.nih.gov)
(Guo et al., 2009) digunakan untuk pembersihan urutan otomatis,
perakitan, peledakan terhadap database urutan non-redundan (nr)
dan basis data dari rangkaian khusus tick (http: //www.ncbi.
nlm.nih.gov dan http://www.vectorbase.org/index.php) dan Gene
Ontologi (GO) tugas fungsi molekuler. Ontologi protein
juga dianalisis menggunakan database referensi protein (http: //
www.proteinlounge.com). Urutan nukleotida disejajarkan
menggunakan program AlignX (Vector NTI Suite V 5.5, InforMax,
Bethesda Utara, MD, USA) dan urutan protein disejajarkan
menggunakan alat pengatur urutan ganda CLUSTAL 2.1 (EMBLEBI;
http://www.ebi.ac.uk/Tools/). Filum dibangun
dengan urutan protein menggunakan metode Neighbor-Joining
(Saitou
dan Nei, 1987). Jarak evolusioner dihitung dengan menggunakan
metode koreksi Poisson (Zuckerkandl dan Pauling, 1965)
dan dinyatakan dalam satuan jumlah substitusi asam amino
per situs (EMBL-EBI; http://www.ebi.ac.uk/Tools/). Urutan
disimpan di GenBank dengan Accession No. JK489362–
JK489457.
2.5. RT-PCR waktu nyata
RNA dari sembilan kutu B. bigemina yang terinfeksi dan sembilan
yang tidak terinfeksi
kutu digunakan untuk analisis RT-PCR real-time. Primer dirancang
berdasarkan urutan yang ditentukan untuk kandidat terpilih
gen yang diekspresikan secara diferensial (Tabel 1) menggunakan
Primer3 v. 0.4.0
(Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA,
AMERIKA SERIKAT). PCR dilakukan menggunakan iScript SYBR
Green RTPCR
Kit (BioRad, Hercules, CA, USA) dalam thermo-cycler BioRad IQ5
mengikuti rekomendasi pabrikan. Tingkat mRNA
dinormalisasi secara terpisah terhadap tingkat mRNA dari dua rumah
tangga
gen, centang b-aktin atau 16S rRNA menggunakan ddCT
(Metode gen CTtackekeeping gen CTtore) (Livak dan Schmittgen,
2001;
Schefe et al., 2006) seperti pada penelitian sebelumnya yang serupa
(Zivkovic et al.,
2010a, b). Dalam semua kasus, rata-rata dari nilai duplikat digunakan
dan data dari kutu yang terinfeksi dan tidak terinfeksi dibandingkan
menggunakan t-test Siswa (P = 0,05).

2.6. Interferensi RNA dalam kutu

RNA double-stranded (ds) gen-spesifik disintesis berdasarkan
pada urutan R. annulatus diidentifikasi dan digunakan untuk
menjatuhkan
ekspresi gen yang dipilih dalam R. annulatus dan R. microplus ticks
disuntik dengan dsRNA. Primer spesifik yang mengandung sekuens
promotor T7
(50-TAATACGACTCACTATAGGGTACT-30) di 50-end
disintesis (Tabel 2) dan MEGAscript RNAi Kit (Ambion,
Austin, TX, USA) digunakan untuk mensintesis dsRNA sesuai
dengan
instruksi manufaktur. DsRNA yang dihasilkan dimurnikan, diukur
dengan spektrometri dan diperiksa pada 0,5X TBE (basis Tris,
Asam borat dan asam Ethylenediaminetetraacetic), 1,2% (w / v)
agarose
gel.
Baru-baru ini R. annulatus dan R. microplus dewasa kutu perempuan
disuntik dengan 0,4 ll dsRNA (1 1011-11012 molekul /
ll) di kuadran kanan bawah permukaan ventral dari kutu
exoskeleton (de la Fuente et al., 2006). Tiga puluh kutu perempuan
per
kelompok disuntik menggunakan jarum suntik Hamilton dengan 2,54
cm, 33
jarum pengukur. Kontrol kutu disuntik dengan sublotin R. microplus
dsRNA (kontrol positif) atau penyangga (10 mM Tris – HCl, pH 7,
1 mM EDTA) saja (kontrol negatif). Kutu diizinkan untuk memberi
makan
dalam delapan patch terpisah (enam kelompok uji dan dua kontrol)
pada a
anak sapi yang secara eksperimen terinfeksi dengan 2 108 B.
bigemina
(Strain lapangan dari Chiapas, Meksiko). Infeksi sapi ditunjukkan
dengan pemeriksaan visual apusan darah dan PCR. Tidak terikat
kutu telah dihapus 2 hari setelah infestasi. Semua terlampir
caplak dihilangkan setelah 7 hari menyusui dan disimpan dalam
kelembapan
ruang selama 4 hari untuk memungkinkan kutu untuk mencerna
makanan darah. Kutu
dibedah dan seluruh organ internal disimpan di RNAlater
(Ambion) untuk total RNA dan ekstraksi DNA seperti yang dijelaskan
sebelumnya
di Bagian 2.3. Gene knockdown dianalisis oleh RT-PCR real-time
menggunakan primer urutan-spesifik (Tabel 1) dengan
membandingkan tingkat mRNA
antara dsRNA-suntik dan kontrol kutu. B. Bigemina
tingkat infeksi ditentukan oleh PCR kuantitatif (qPCR) dari
gen 18S rDNA (GenBank AY603402) menggunakan primer 50-
AATAACAATACAGGGCTTTCGTCT-
30 dan 50-AACGCGAGGCTGAAATACAACT
-30 dan normalisasi terhadap gen tick 16S rDNA menggunakan ddCT
metode (Livak dan Schmittgen, 2001; Schefe et al., 2006). Kutu
mortalitas dievaluasi sebagai rasio kutu mati dengan jumlah total
dari kutu diizinkan untuk memberi makan pada anak sapi. Tingkat
mRNA, B. bigemina
infeksi pada kutu dan berat kutu betina setelah diberi makan
dibandingkan antara dsRNA dan kontrol kutu yang disuntikkan salin
oleh a
Student t-test (P = 0,05). Untuk menganalisis kematian tick, Chi-
square
tes (P = 0,05) digunakan dengan hipotesis nol yang menandai
kematian
tidak tergantung pada gen knock down.
3. Hasil
3.1. Identifikasi kandidat gen yang diekspresikan secara diferensial di
R.
kutu annulatus sebagai respons terhadap infeksi B. bigemina
SSH digunakan untuk mengidentifikasi R. annulatus gen tick secara
berbeda
dinyatakan sebagai tanggapan terhadap infeksi B. bigemina. Delapan
ratus secara acak
klon perpustakaan SSH yang dipilih disekuensing dan dianalisis.
Setelah menghilangkan klon dengan urutan kualitas yang buruk, 752
urutan
(panjang rata-rata ± S.D., 562 ± 297 bp) dirangkai menjadi
96 unigenes (87 contigs dan sembilan singlet) mewakili unik yang
diekspresikan menyatakan
tag urutan (EST). Rata-rata, jumlah urutan
per unigene adalah 8,3, yang menunjukkan keragaman rendah dalam
dataset kami.
Rakitan EST menghasilkan 41 (43%) EST dengan fungsi yang tidak
diketahui
atau tanpa identitas apa pun untuk mengurutkan basis data. Penting
identitas ke gen dengan anotasi fungsional dikonfirmasi untuk
satu (1%) Babesia T2Bo protein hipotetis EST, lima (5%) EST terkait
ke host vertebrata dan 49 (51%) EST dengan kemiripan dengan
centang basis data urutan. Dari 49 EST dengan kesamaan untuk
menandai urutan,
tujuh (14%) berhubungan dengan protease inhibitor. Molekuler
fungsi GO tugas, bersama dengan ontologi protein dan
tersedia basis data tick sequence, menunjukkan bahwa tick yang
didapat
urutan dikodekan untuk protein dengan fungsi molekuler yang
berbeda
seperti struktur sel, pertahanan, transportasi, transduksi sinyal dan
regulasi, sintesis, metabolisme energi dan proses enzimatik. 3.2.
Ekspresi gen diferensial dalam B. annulatus terinfeksi B. bigemina
kutu
Enam belas kandidat berbeda mengekspresikan gen dengan putative
fungsi dalam interaksi tick-pathogen dipilih untuk validasi
hasil SSH oleh RT-PCR real-time menggunakan RNA dari yang tidak
terinfeksi
dan B. kutu yang terinfeksi bigemina (Tabel 3). Dari enam belas
gen dianalisis, lima dikonfirmasi secara diferensial dinyatakan dalam
B. kutu yang terinfeksi bigemina. Gen pengkodean untuk homolog
dari TROSPA,
calreticulin, ricinusin dan serum amyloid A protein
diekspresikan berlebihan pada kutu yang terinfeksi sementara
protease inhibitor tipe-Kunitz
5 (KTPI) tingkat mRNA turun-diatur dalam kutu yang terinfeksi
(Tabel 3).
3.3. Analisis urutan gen tick secara diferensial dinyatakan sebagai
respons
infeksi B. bigemina
Analisis urutan tambahan dilakukan pada R. annulatus
EST dikonfirmasi secara berbeda dinyatakan sebagai tanggapan
terhadap B. bigemina
infeksi. Rhipicephalus annulatus EST68 (Akses GenBank
Tidak. JK489429) analisis urutan menunjukkan bahwa TROSPA
sangat tinggi
gen yang diawetkan dalam kutu, dengan homologi 78% (128/165
asam amino)
antara R. annulatus, Ixodes ricinus, Ixodes scapularis dan Ixodes
persulcatus sekuens protein (Gbr. 2). Untuk calreticulin, R. annulatus
EST21 (JK489382) menunjukkan identitas 99% (226/229 nukleotida)
R. microplus calreticulin precursor (AF420211) 30-end coding region
dengan 97% (73/75 asam amino) homologi ke protein COOH-
terminal
wilayah. The R. annulatus EST84 (JK489445) menunjukkan yang
tertinggi
homologi (97%; 97/100 asam amino) ke I. ricinus ricinusin
(ABB79785) dan pada tingkat yang lebih rendah untuk I. scapularis
microplusin preprotein-
seperti (AAY66716) dan R. microplus microplusin (AAO48942)
(Gbr. 3). The R. annulatus EST81 (JK489442) menunjukkan 46-49%
homologi
ke parkeri Ornithodorus yang sebelumnya dilaporkan (EF633889)
dan I. scapularis (XM_002407273, XM_002416454) serum amyloid
Urutan mirip protein. Empat R. annulatus EST yang berbeda (EST24,
EST25, EST28, EST29, EST42) menunjukkan homologi ke KTPI,
dengan a
maksimum 62% (32/52 asam amino) homologi untuk I. scapularis
serine
inhibitor proteinase (XM_002434100).
3.4. Analisis fungsional dari gen tick yang secara diferensial
dinyatakan dalam
Menanggapi infeksi B. bigemina
Kelima gen dikonfirmasi secara diferensial diekspresikan pada yang
terinfeksi
kutu (TROSPA, calreticulin, ricinusin, serum amyloid A dan
KTPI), bersama dengan satu gen yang tingkat mRNAnya serupa
antara kutu yang terinfeksi dan tidak terinfeksi (protease aspartat) dan
subolesin, sebelumnya terbukti terlibat dalam kekebalan bawaan tick
(Zivkovic dkk., 2010b; de la Fuente et al., 2011), dipilih untuk
studi fungsional menggunakan RNAi yang dimediasi dsRNA di kedua
R. annulatus
dan R. microplus. Pengaruh knockdown gen pada B. bigemina
tingkat infeksi dan kutu berat dan mortalitas dievaluasi
(Tabel 4–6).
Di bawah kondisi yang dilakukan dalam penelitian ini gen
knockdown
setelah dsRNA-mediated RNAi ditunjukkan untuk semua gen di R.
annulatus, sedangkan di R. microplus pembungkaman subolesin dan
Protein protease gen tidak didemonstrasikan (Tabel 4 dan 5).
Knockdown dari TROSPA dan serum amiloid A secara signifikan
berkurang
B. tingkat infeksi bigemina sebesar 83% dan 66%, masing-masing, di
R.
annulatus dibandingkan dengan kutu kontrol (Tabel 4). Di R.
microplus,
Knockdown dari TROSPA dan serum amyloid A juga mengurangi
patogen
tingkat infeksi sebesar 70% dan 86%, masing-masing, sementara
calreticulin
knockdown menghasilkan 73% tingkat infeksi yang lebih rendah
dibandingkan dengan
kontrol (Tabel 5). Subolesin knockdown tidak mempengaruhi B.
bigemina
tingkat infeksi pada R. annulatus ticks (Tabel 4).
Kemungkinan efek knockdown dari gen yang dipilih pada tick weight
dan mortalitas ditentukan dan dianalisis secara statistik. KTPI
knockdown mengurangi berat kutu perempuan di kedua R. annulatus
dan
R. microplus (Tabel 6). Untuk gen lain seperti TROSPA, ricinusin
dan calreticulin, gen knockdown menghasilkan bobot tick yang lebih
rendah
dibandingkan dengan kontrol di salah satu spesies tick saja (Tabel 6).
Pengaruh knockdown subolesin dicirikan pada R. annulatus
hanya dan menghasilkan pengurangan bobot kutu dibandingkan
dengan kontrol (Tabel 6). Tingkat kematian tick tidak terpengaruh
kutu yang disuntik dsRNA dibandingkan dengan kontrol. Untuk
semua gen dan
di kedua spesies tick, R. annulatus dan R. microplus, hipotesis nol
diterima (P> 0,05), menunjukkan bahwa tidak ada yang diteliti
gen memiliki peran dalam kelangsungan hidup kutu.
4. Diskusi
Beberapa penelitian telah menandai antarmuka tick-pathogen
pada tingkat molekuler (Macaluso et al., 2003; Mulenga et al.,
2003; Nene et al., 2004; Rudenko et al., 2005; de la Fuente et al.,
2007b, c; Villar et al., 2010; Zivkovic dkk., 2010a; Mercado-Curiel
et al., 2011). Namun, sepengetahuan kami ini adalah laporan pertama
ekspresi diferensial gen dalam populasi kutu R. annulatus
terinfeksi B. bigemina. Dalam karya ini kami mencirikan R. annulatus
gen secara berbeda dinyatakan sebagai respons terhadap infeksi B.
bigemina
menggunakan SSH dan RT-PCR real-time. Gen dikonfirmasi sebagai
secara diferensial dinyatakan dalam kutu yang terinfeksi secara
fungsional ditandai
menggunakan pendekatan RNAi untuk menganalisis peran mereka
selama patogen
infeksi pada vektor kutu.
Analisis SSH yang digunakan dalam penelitian ini untuk
mengidentifikasi gen secara berbeda
dinyatakan dalam R. annulatus sebagai tanggapan terhadap infeksi B.
bigemina
tidak menghasilkan banyak variasi EST. Hasil ini mirip dengan
yang diperoleh dengan Anaplasma marginale dan mungkin
mencerminkan
co-evolusi tick-pathogen (de la Fuente et al., 2007c; Villar
et al., 2010; Zivkovic dkk., 2010a; Mercado-Curiel et al., 2011).
Seperti yang diharapkan, sebagian besar dari EST yang teridentifikasi
tidak muncul
identitas ke urutan yang diketahui dengan anotasi fungsional. Namun,
menegaskan EST yang diungkapkan secara diferensial dengan fungsi
yang diprediksi
menyarankan bahwa gen ini terlibat dalam infeksi / perkalian patogen
dan centang respons terhadap infeksi.
TROSPA pertama kali dijelaskan pada I. scapularis sebagai reseptor
untuk Borrelia
burgdorferi, menunjukkan potensi besar sebagai antigen vaksin
untuk mengendalikan infeksi bakteri pada kutu (Pal et al., 2004;
Hovius
et al., 2007). Antibodi anti-TROSPA atau penurunan gen berkurang
B. burgdorferi kepatuhan terhadap I. scapularis usus in vivo,
mencegah
penjajahan yang efisien dari vektor dan kemudian mengurangi
transmisi patogen ke host mamalia (Pal et al., 2004).
Di I. scapularis, tingkat mRNA TROSPA meningkat setelah
spirochaete
infeksi dan menurun dalam menanggapi pembengkakan centang,
peristiwa-peristiwa yang secara temporer terkait dengan infeksi B.
burgdorferi dan
transmisi oleh vektor kutu (Pal et al., 2004). Hasil kami
menunjukkan bahwa gen R. annulatus dengan identitas urutan tinggi
untuk
Ixodes spp. TROSPA diekspresikan berlebihan pada B. bigemina-
terinfeksi
ticks dan memainkan peran serupa di kedua R. annulatus dan R.
microplus
dengan mengarah ke infeksi yang lebih rendah yang signifikan setelah
gen knockdown.
Hasil ini menunjukkan kemungkinan bahwa B. bigemina
menggunakan TROSPA
reseptor ortolog untuk infeksi sel kutu dan Rhipicephalus
mendorong penelitian untuk karakterisasi molekul ini di
Babesia – centang interaksi dan pengembangan penghambatan
transmisi
vaksin
Calreticulin, retikulum endoplasma utama yang mengikat kalsium
protein, diekspresikan secara berlebihan pada B. annulatus B. yang
terinfeksi bigemina.
Hasil ini dikuatkan oleh penelitian sebelumnya di mana protein ini
ditunjukkan untuk diregulasi di ovarium dari R. microplus yang
terinfeksi
ticks (Rachinsky et al., 2007). Gene knockdown di bawah kondisi
dilakukan di sini mengurangi infeksi patogen di R. microplus
tetapi tidak dalam R. annulatus kutu. Kemungkinan penggunaan
protein ini di
perkembangan kekebalan protektif terhadap parasit adalah
disarankan sebelumnya (Ferreira et al., 2002). Bovines diimunisasi
dengan protein rekombinan rekombinan R. microplus gagal
diproduksi
serum hyperimmune terhadap molekul ini, menunjukkan rendah
imunogenisitas protein ini yang mungkin bisa dilampaui
dengan menggunakan adjuvant dan konjugasi dengan imunogenik
yang tinggi
protein (Ferreira et al., 2002). Calreticulin ditemukan disekresi
di Amblyomma spp., Dermacentor spp. dan saliva R. mikroplus,
menyarankan peran untuk protein ini selama memberi makan darah
(Jaworski et al., 1995; Ferreira et al., 2002), hasil yang didukung di
sini
setelah gen knockdown di R. annulatus yang mengakibatkan
berkurangnya
tegaskan berat badan. Hasil ini menunjukkan bahwa calreticulin dan
kalsium
metabolisme memiliki peran selama pemberian centang dan mungkin
diperlukan
untuk infeksi Babesia di beberapa spesies tick.
Ricinusin, longicin dan microplusin dicentang peptida antimikroba.
Protein ini termasuk dalam kelompok defensin, a
Mekanisme pertahanan yang dijaga dengan baik adalah salah satu
yang paling penting
komponen kekebalan bawaan tick (Tsuji et al., 2007; Silva
et al., 2009). Longicin telah terbukti menjadi defensin terhadap
Infeksi Babesia gibsoni di Haemaphysalis longicornis (Tsuji et al.,
2007). Ricinusin diinduksi pada R. annulatus sebagai respons
terhadap B.
infeksi bigemina. Meskipun tingkat ricinusin mRNA secara signifikan
lebih tinggi di terinfeksi daripada di kutu yang tidak terinfeksi, di
bawah
kondisi penelitian ini, gen knockdown tidak mempengaruhi patogen
infeksi, sehingga menunjukkan bahwa molekul ini tidak penting untuk
dikendalikan
B. infeksi bigemina pada Rhipicephalus spp. kutu.
Ekspresi serum amiloid A meningkat pada R. annulatus
kutu yang terinfeksi B. bigemina dan knockdown gen mengakibatkan
tingkat infeksi lebih rendah baik pada R. annulatus dan R. microplus
tanpa
mempengaruhi bobot kutu setelah makan. Hasil ini menyarankan itu
serum amyloid A dapat menjadi bagian dari respons tick terhadap
stres yang dihasilkan
oleh infeksi Babesia tetapi pada saat yang sama itu perlu
untuk infeksi patogen / multiplikasi pada Rhipicephalus spp. kutu.
Amyloid A serum terlibat dalam respons inang terhadap cedera
jaringan
dan peradangan, yang dapat meningkatkan konsentrasi mereka
1.000 kali lipat dan memiliki berbagai efek fisiologis termasuk
antiplatelet
aktivitas (Urieli-Shoval et al., 2000). A serum amyloid A
protein putatif baru-baru ini diidentifikasi dalam sialome yang lunak
centang Ornithodoros parkeri (Francischetti et al., 2008) dan di I.
genom scapularis (XM_002416454). Namun, peran untuk protein ini
dalam infeksi dan penggandaan patogen tick belum
dijelaskan sebelumnya
Protease inhibitor tipe-Kunitz paling banyak diwakili
EST dalam dataset kami. KTPI adalah protein sekitar 20 kDa
dengan satu atau dua ikatan disulfida dan satu situs reaktif (Mayor
dan Constabel, 2008). Namun, beberapa protein milik
Keluarga Kunitz tidak bertindak sebagai protease inhibitor atau
mungkin
lektin-seperti aktivitas inhibitor karbohidrat-mengikat atau invertase
(McCoy dan Kortt, 1997; Macedo et al., 2004). Dengan demikian,
menentukan
fungsi yang tepat dari protein jenis-seperti-inhibitor Kunitz (KTI)
tidak bisa
didasarkan hanya pada kesamaan urutan utama, tetapi membutuhkan
tes in vitro untuk konfirmasi. Beberapa KTI terlibat dalam pertahanan
tick
mekanisme terhadap infeksi patogen, mungkin melalui
penghambatan proteinase mikroba (Sasaki dan Tanaka, 2008). Di
Dermacentor variabilis, invasi sel tick oleh Rickettsia montanensis
dibatasi oleh KTPI (Ceraul et al., 2011). Meskipun KTPI adalah
ditemukan diregulasi dalam kasus lain (Rachinsky et al., 2007) di
penelitian ini ketika diinduksi pada B. kutu yang terinfeksi bigemina,
KTPI
tingkat mRNA lebih rendah pada R. annulatus yang terinfeksi
daripada yang tidak terinfeksi
kutu, mungkin menyarankan mekanisme dimana
patogen memanipulasi ekspresi gen untuk meningkatkan infeksi /
perkalian.
Namun, knockdown KTPI tidak mempengaruhi B. bigemina
infeksi pada kutu tetapi efek KTPI lain pada infeksi B. bigemina
tidak dipelajari. Menariknya, KTPI knockdown di R. annulatus
dan R. microplus mengurangi berat badan kutu setelah makan
dibandingkan dengan
kontrol, menunjukkan peran untuk protein ini selama memberi makan
centang.
Subolesin is a candidate tick protective antigen initially discovered
in I. scapularis and conserved in many tick species. Subolesin
plays an important role in the immune response to pathogen infection
through the control of genes involved in innate immunity
(Almazán et al., 2003; Goto et al., 2008; Galindo et al., 2009;
Zivkovic et al., 2010b; de la Fuente et al., 2011). In previous
experiments,
we showed that subolesin knockdown reduced B. bigemina
infection in R. microplus (Merino et al., 2011a). However, herein
subolesin knockdown did not affect B. bigemina infection in R.
annulatus. The discrepancy between these results could be due to
the fact that here adult ticks were injected with dsRNA before
infestation while in the previous experiment dsRNA was injected
into replete females to infest cattle with resulting larvae (Merino
et al., 2011b). As in previous experiments, subolesin knockdown
reduced R. annulatus female tick weight after feeding (Almazán
et al., 2010). The effect of gene knockdown on pathogen infection
could suggest genes necessary for pathogen infection/multiplication
in the tick, or at least in some cases, genes affecting tick
weight after RNAi may reduce the amount of blood ingested by
ticks and thus the number of pathogens ingested during feeding.
RNAi was used in this study to analyse the effect of knockdown
of selected genes on B. bigemina infection in ticks. Gene knockdown
was carried out using R. annulatus sequences in both R. Annulatus
dan R. microplus menandai karena kesamaan yang tinggi antara gen
mereka
urutan. Di R. annulatus tetapi tidak di R. microplus, gen knockdown
berhasil untuk semua gen yang diuji. Meskipun dsRNAmediated
RNAi telah terbukti berfungsi dalam R. annulatus menggunakan
Urutan R. microplus, fenotipe yang dihasilkan tidak sama
antara kedua spesies tick (Almazán et al., 2010). Hasil ini disarankan
bahwa untuk beberapa gen, identitas urutan mungkin tidak cukup
tinggi untuk knockdown gen yang efisien di R. microplus
menggunakan R.
dsRNA yang berasal dari annulatus. Efek off-target RNAi (OTEs)
(Scacheri et al., 2004) tidak dapat dikesampingkan dalam gen
knockdown kami
percobaan, seperti yang dilaporkan sebelumnya di R. microplus (Lew-
Tabor
et al., 2011). Tidak adanya data genomik kutu penuh dan kekurangan
dari jalur tikungan RNAi yang dikonfirmasi dapat meremehkan OTE
dalam
eksperimen tick RNAi saat ini (Lew-Tabor et al., 2011). Meskipun
ini, penggunaan dsRNAs yang panjang sebagai terapi gen knockdown
pada ticks
telah diterima sebagai metode rutin untuk validasi / dukungan
centang fungsi gen (de la Fuente et al., 2007b; Smith et al., 2009;
Merino dkk., 2011b).
Penelitian ini mengidentifikasi gen baru yang terlibat dalam kutu
infeksi / perbanyakan B. bigemina, meningkatkan pemahaman kita
mekanisme molekuler yang terlibat dalam interaksi tick-pathogen.
Hasil yang dilaporkan di sini meningkatkan pemahaman kita tentang
peran gen tick pada infeksi / perkembangbiakan Babesia, yang
dasar untuk pengembangan langkah-langkah pengendalian tick baru.
Beberapa
gen R. annulatus yang ditemukan dalam penelitian ini seperti serum
amiloid A, calreticulin dan TROSPA dapat berkontribusi pada
pengembangan
vaksin baru yang dirancang untuk mengurangi infestasi kutu dan
mencegah atau meminimalkan infeksi patogen pada kutu dan
transmisi
untuk host vertebrata.