Práctica N° 7

Química Orgánica II.

Reacciones de caracterización de aminoácidos y proteínas

Objetivo

Reconocer los -L-aminoácios, los péptidos y las proteínas utilizando diferentes

reactivos de caracterización.

Introducción

Los aminoácidos son las unidades fundamentales constituyentes de las

proteínas, los cuales al enlazarse covalentemente entre sí, a través de enlaces
peptídicos, originan las diferentes clases de proteínas fibrosas y globulares. Los
aminoácidos naturales ampliamente distribuidos en las proteínas son 20. Sin
embargo, existen otros presentes en forma libre o haciendo parte de proteínas
en algunos organismos vivos y otros que no forman parte de ningún tipo de
proteína estructural, pero que pueden actuar como antibióticos o como
inhibidores de diferentes procesos bioquímicos o fisiológicos a nivel celular en
otros organismos. Con pocas excepciones, los aminoácidos naturales presentan
al menos un centro quiral y pertenecen a los esteroisómeros de la familia L;
unos son levógiros mientras que otros son dextrógiros. Se les clasifica por la
naturaleza de los grupos sustituyentes (R). La mejor forma de representarlos
es como iones dipolares o Zwitter iones:

Las proteínas son biopolímeros abundantes en los seres vivos y pueden

contribuir con 67 más del 50% del peso en base seca de los mismos. Se
encuentran en todas las células, cumpliendo múltiples funciones. Tanto los
aminoácidos como las proteínas dan reacciones químicas características
mediante los grupos funcionales que están presentes en su estructura tales
como: −NH2, −COOH, −OH, −SH, −R, etc.
Procedimiento

Reacciones de caracterización de aminoácidos y proteínas:

Reacción con la Ninhidrina: Transferir en tres tubos de ensayo 1 mL de

solución de los siguientes aminoácidos: Glicina, Tirosina y Triptófano. Ajustar
el pH a 7 de cada solución. Adicionar a cada tubo 5 gotas de la solución de
ninhidrina y calentar a ebullición por 2 minutos. La formación de una coloración
púrpura o azúl indica que la prueba fue positiva.

Repetir el procedimiento anterior pero utilizando 1 mL de la solución de clara

de huevo diluida y de gelatina. Observar y anotar sus resultados.

Reacción Xantoproteica:

1. Adicionar en 4 tubos de ensayo 0.5 mL de los siguientes aminoácidos:

glicina, tirosina, triptófano y fenilalanina. Suministrar a cada tubo 0.5 mL
de ácido nítrico concentrado. Calentar moderadamente, enfriar y observar
si hay cambio de color. Luego, adicionar NaOH al 40% hasta cuando la
solución sea fuertemente alcalina. El cambio de color de amarillo en medio
ácido a naranja en medio básico constituye un resultado positivo.
2. Repetir el ensayo con 1 mL de solución de clara de huevo diluida y solución
de gelatina.
3. Ponga un mechón de cabello enrollado en un tubo de ensayo pequeño;
agregue 0.5 mL de ácido nítrico concentrado y caliente el tubo. Anote el
color de la mezcla de reacción. Alcalinice la mezcla adicionándole 10 gotas
de NaOH al 40% y anote el cambio de color.

Reacción del Ácido Glioxílico (Hopkins − Cole o Adamkiewicz): En tres

tubos de ensayo diferentes transferir 0.5 mL de solución de uno de los
siguientes aminoácidos: glicina, tirosina y triptófano; añadir a cada uno 1 mL
de ácido acético glacial. Agitar, dejar en reposo por 5 minutos y adicionar
lentamente por las paredes de cada tubo 0.5 mL de H2SO4 concentrado, hasta
observar la formación de 2 fases o capas. La formación de un anillo violeta en
la interfase, indica que la reacción es positiva.

Repetir el procedimiento anterior, transfiriendo en cada tubo de ensayo 1 mL

de la solución de clara de huevo diluida y de la solución de gelatina. Anotar sus
resultados.

Reacción de Sakaguchi Transferir en cuatro tubos de ensayo 1.5 mL de

solución de cada uno de los siguientes aminoácidos: glicina, valina, tirosina y
arginina; adicionar a cada tubo 0.5 mL de una solución de NaOH al 40%,
homogenizar y dejar en reposo por 15 minutos. Después de ese tiempo, añadir
2 gotas de una solución de -Naftol al 0.15%. Agitar fuertemente y añadir 4 ó
5 gotas de agua de bromo. La formación de una coloración roja indica que la
prueba es positiva.

Repetir el procedimiento anterior, pero utilizando 2.5 mL de la solución de

clara de huevo diluida y 2.5 mL de la solución de gelatina en sus respectivos
tubos de ensayo. Escribir sus observaciones.

Prueba del Biuret: Adicionar a 1 mL de la solución de clara de huevo 1 mL de

NaOH al 10%, agitar vigorosamente y posteriormente agregar 5 gotas de una
solución de sulfato cúprico al 2%. Agite y deje reposar la mezcla. Observar el
color de la solución.

Repetir éste procedimiento pero utilizando las soluciones de gelatina y

fenilalanina. La formación de un color azul indica que la hidrólisis no fue
completa o que existe presencia de enlaces peptídicos. Observar y anotar sus
resultados. En la prueba de Biuret, el sulfato cúprico alcalino reacciona con
compuestos que contengan 2 o más enlaces peptídicos presentes en las
moléculas de proteína. Esta reacción no es absolutamente específica para los
enlaces peptídicos puesto que cualquier compuesto que contenga dos grupos
carbonilos unidos por un átomo de nitrógeno o de carbono da resultado
positivo.

Reacción coloreada del formaldehído para proteínas: Agregar a un tubo

de ensayo 2 mL de la solución de clara de huevo diluida y agregar una gota de
una solución diluída de formaldehído. Luego, con precaución y sin agitación,
adicionar por las paredes internas del tubo, ácido sulfúrico concentrado de tal
manera que se forme una capa separada en el fondo del tubo. Anotar sus
observaciones y conclusiones de ésta prueba.

Repetir el ensayo con una solución de gelatina.

Material para la práctica

Material Reactivos
Tubos de ensayo Solución de ninhidrina
Gradilla HNO3 (concentrado)
Pipetas de 1 y 5 mL NaOH 40%
Papel indicador HCl 10%
Beaker de 50 y 150 mL Ácido acético glacial
Erlenmeyer de 50 mL Rociador -Naftol al 0.15%
Pinzas para tubo de ensayo H2SO4 (concentrado)
Agua de bromo
Solución de sulfato cúprico al 2%
Solución de formaldehído
Aminoácidos de referencia
Solución de clara de huevo (1:9)
Solución de gelatina al 0.5%

Soluciones 0.1 M de los siguientes aminoácidos: glicina, tirosina,

triptófano, fenilalanina, valina, arginina.

Clara de huevo diluida (1:5): En un beaker de 150 mL prepare una

suspensión acuosa de albúmina, batiendo la clara de un huevo durante 1 min.
Luego mézclela con cinco veces su volumen de agua, agite vigorosamente y
filtre la mezcla a través de una tela blanca y guarde el filtrado para realizar los
ensayos.

Solución de gelatina al 0.5%: diluir 0.5 g de gelatina en 100 mL de agua,

agitar y disolver la mezcla.
Tabla 1. Formato para presentar los resultados de caracterización de aminoácidos y proteínas.

Prueba realizada
Muestra