CRIOPRESERVACIÓN DE CEPAS

T.L.C. HERRERA GONZÁLEZ ENRIQUE

MAYO - 2019
 Enrique Herrera González

CRIOPRESERVACIÓN DE CEPAS

Numerosas instituciones nacionales e internacionales incluyendo algunas

Universidades mantienen colecciones de microorganismos (Cepario), ya sea
con fines docentes, investigación o para disponer de cepas patrones útiles en
el aseguramiento de la calidad de múltiples procesos de análisis. En la
actualidad, para la conservación de estos cultivos por largos períodos de
tiempo se emplean:

Liofilización y la criopreservación, como métodos de elección que aseguran

la viabilidad, pureza y estabilidad de las cepas.

El InDRE, distribuye colecciones bacterianas para ser empleadas en distintas

pruebas como controles de calidad a los LESP
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HISTORIA Y EVOLUCION DE LAS TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN

1677 van Leewenhoek (Holanda): animalículos en agua y cerveza

1830 Cagniard-Latour (Francia): alcohol es producido por bacterias
1860 Pasteur (Francia): fermentación = microorganismos. Emplea como
medios sólidos, papa y melón
1870 O. Brefeld emplea gelatina para solidificar los medios. Describe el cultivo
de P. Glaucum (cultivo monospórico  micelio  conidios)
1881 Loeffler caldo nutritivo, Koch le incorpora agar (Mrs. Hesse)
1890 Hansen desarrolla la técnica del cultivo puro con levaduras
1900 Cultivos puros de bacterias y levaduras de mantienen en medios sólidos
a base de caldo nutritivo y extracto de malta y se propagan periódicamente. Se
requiere conservación a largo plazo para preservar las características de los
cultivos
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HISTORIA Y EVOLUCION DE LAS TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN

1907 Will preserva levaduras en 10 % sacarosa durante 8 años, pero hay pérdida de
actividad
1909-1911 Shackel; Hammer: primeros métodos de liofilización para bacterias y virus,
empleo de suero y leche como protectores
1914 Lumiere y Cherrotier conserva cultivos de Gonococcus bajo una capa de
parafina líquida, el método es perfeccionado por Morton y Pulski (1938)
1945-1950 La producción industrial de antibióticos estimula el desarrollo de nuevas
técnicas. Liofilización, crio-preservación, adsorción en suelo, etc; permite el
mantenimiento de cultivos por 10 o 20 años.
1950 Se descubre el efecto crioprotector de varios compuestos: glicerol,
dimetilsulfóxido, sacarosa
1958 Sakane desarrolla la técnica para el secado desde el estado líquido (L-drying )
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HISTORIA Y EVOLUCIÓN DE LAS COLECCIONES DE MICROORGANISMOS

1890 Frantisek Kral (En Praga) genera la primera colección de bacterias y hongos en
Praga. Cepas de Mycobacterium (Koch). Cierra en 1911. Se pierden las cepas.
1906 Se publica el primer catálogo de cepas de hongos de la International Botany
Association (Holland). Es el antecesor del CBS (Central Bureau voor Schimmelcultures)
1911 Colección de bacterias en el National History Museum of New York City. Es el
antecesor del ATCC (American Type Culture Collection)
1925 se funda La ATCC. Sin vínculos directos con la Universidad, es de carácter
comercial (Manassas,USA).
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HISTORIA Y EVOLUCIÓN DE LAS COLECCIONES DE MICROORGANISMOS

1960 Se funda La CECT (La Colección Española de Cultivos Tipo) en el Instituto

Jaime Ferrán de Microbiología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas
(CSIC) por el Prof. J.R. Villanueva,
1944 Takeda Chemical Industries, Ltd. funda el Institute for Aerial Fermentation para
aislar, conservar y distribuir microorganismos, es el antecesor del Institute for
Fermentation (IFO, Osaka)
A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional denominada World
Federation for Culture Collection.
(En Europa a su vez estan agrupadas en la “European Culture Colletion Organization
(ECCO) que se fundó en 1982.
2003 23 instituciones internacionales autorizadas para recibir material biológico con
una patente de aplicación (Tratado de Budapest 1991)
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En un laboratorio de bacteriología, donde se realizan cultivos y aislamiento de cepas

bacterianas, hay que pensar en mantener las colecciones (cepario) durante largos
períodos (años) y no solo de algunos meses, por lo tanto se utilizan métodos que
nos ahorran trabajo y disminuyen los riesgos.
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LA CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS

 Método de elección o de conservación a largo plazo

-Conservación por congelación
-Conservación por liofilización

 Métodos Alternativos
-Conservación por transferencia periódica
-Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril
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LA CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS

 Métodos Restringidos
-Desecación en papel de filtro
-Desecación en suelos, arena, sílica gel, etc.
-Desecación en bolitas de alginato
-Desecación en sal gorda para halo-bacterias
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MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

Congelación
 Al bajar la temperatura hasta el punto de congelación o por
debajo de éste se reduce el metabolismo bacteriano
drásticamente hasta el caso de prácticamente anularlo;
por ejemplo con nitrógeno líquido con el cual se alcanza
una temperatura de -196°C.
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MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

Liofilización:
 Es un método de conservación a largo plazo.
 Se basa en la detención del metabolismo celular por
falta de agua: congelación y sublimación
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Los tres objetivos que hay que debemos alcanzar

para conservar correctamente las cepas congeladas
en los laboratorios de bacteriología son:

a) Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que

se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservación;
b) Que durante el tiempo de conservación
sobrevivan al menos el 70-80% de las células,
c) y por último, que estas células permanezcan
genéticamente estables
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PROBLEMAS QUE DEBEMOS DE CONSIDERAR AL

MOMENTO DE CONGELAR

La formación de cristales de hielo (pueden romper las células),

para evitar esto se deben utilizar:
 suspensiones que contengan el mínimo de sales posibles
 agentes crioprotectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfóxido
(DMSO al 10%) que neutralizan el efecto de las sales.
 Algunos investigadores recomiendan una disminución gradual
de temperatura (1°C/min) hasta -20°C para luego enfriar
rápidamente. Así mismo al momento de sacar un vial del
ultracongelador la descongelación del mismo debe ser rápida.
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Una Velocidad de Congelación de 1 a 10 º C/min

minimiza el efecto de la concentración de los solutos
durante la nucleación.
• Congelación paulatina evita la Ruptura celular!!!
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CONGELACIÓN CON N2 LÍQUIDO

Ventajas
 Se puede usar por períodos largos o cortos de tiempo.
 Se utiliza N2 líquido a -196˚C.
 Elmicroorganismo se cultiva al empezar la fase
estacionaria (muestra más resistencia a daños por
congelación y descongelación).
 Se utiliza un crio-protector.
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CRIOPROTECTORES OBJETIVOS:
• Glicerol 10%
*Minimizar daños durante la
• Dimetil-sulfóxido congelación.
• Ácido glutámico *Limitar la formación de hielo
(tasa de congelación)
• Glucosa *Vitrificación del agua
• Sacarosa
• Dextranos CARACTERISTICAS:
• Meso inositol
*No tóxico para la célula.
• Suero de conejo *Penetrar fácilmente en la membrana
• Lactosa celular.
*Unirse a los electrolitos o a las
• Leche descremada moléculas de agua.
• Extracto de malta
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FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VIABILIDAD Y ESTABILIDAD DE LAS CEPAS

TEMPERATURAS DE ALMACENAMIENTO
 -196°C: nitrógeno líquido. Se utiliza para la conservación de bacterias, virus
y líneas celulares. Existen varios problemas prácticos: el nitrógeno se
evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se deben
utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estén bien
cerrados para evitar la entrada del nitrógeno.
 -30°C: congelador de frigoríficos.
 -70°C: nieve carbónica (CO2 sólido) o de ultra-congeladores
Es el método más utilizado en los laboratorios de bacteriología.

ALTA DENSIDAD CELULAR:

 Usar entre 108 a 109 células/ml: Lisis de parte del inóculo.

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RECUPERACIÓN POST-CONGELACIÓN

• STREESS!! Una vez recuperadas nunca utilizar estos microorganismos

inmediatamente en pruebas fisiológicas, realizar 1 o 2 pases previos.

• Transferir a medios adecuados (caldos o medios agarizados).

• Tiempo de incubación: puede disminuir la velocidad de crecimiento.

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CRIOPRESERVACIÓN

Ventajas:
 Viabilidad 7 a 10 años
 No se detectaron cambios genéticos
 Apto para una gran variedad de microorganismos.
 Simple, pre‐tratamiento mínimo.
Desventajas:
 Equipamiento y mantenimiento $$$.
 Criotubos, racks para criotubos, etc.
 Monitoreo de la Temperatura.
 Suministro constante de energía eléctrica (ultracongelador).
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CONTROLES DE CALIDAD:

Realizarlo antes y después de la preservación.

 De viabilidad y pureza
 De estabilidad de caracteres relevantes.
 Requerimientos para el crecimiento.
 Métodos de preservación.
 Frecuencia de controles de mantenimiento (1 control al año)
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METODOLOGÍA EMPLEADA EN LA LA CONGELACIÓN

 Obtener el crecimiento del cultivo hasta lograr la máxima densidad celular (

al inicio de la fase estacionaria).
 Resuspender el cultivo en solución salina fisiológica, rotulados.
 Adicionar a esta suspensión el caldo preservante adicionado con un agente
crio- protector de elección, homogeneizar.
 Alicuotar la suspensión en viales o crio tubos, perfectamente rotulados.
 Congelar los cultivos en viales cerrados herméticamente, se recomienda
congelación lenta, 1°C por minuto hasta -30°C antes de pasarlos a nitrógeno
líquido.
 Sumergirlos en el nitrógeno líquido, con lo cual se logra una congelación
rápida (-196°C).
 Almacenar inmediatamente en un ultracongelador a -70 ºC.
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REQUERIMIENTOS PARA CONGELAR

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POR SU ATENCIÓN GRACIAS