Bioquímica, Lic. en Ciencias Naturales www. usco. edu.

co
Informe de práctica de laboratorio No. 2

Informe Práctica de Laboratorio: Titulación Ácido – Base con

Bureta Digital.
Anzola González Jerson Stiven1, Cárdenas Castaño Juliana2,
Fuquene Medina Diego Alexander3.
Estudiante del curso de Bioquímica. Programa de Licenciatura en Ciencias
Naturales: Química, Física y Biología. Universidad Surcolombiana. Neiva,
Huila, Colombia.
1
Correo electrónico: u20162150994@usco.edu.co
2
Correo electrónico u 20161146844@usco.edu.co
3
Correo electrónico: u20162150441@usco.edu.co
Actividad entregada: 13 de mayo de 2019.

Resumen
El objetivo de este laboratorio consistió en demostrar algunas propiedades
químicas de los aminoácidos, mediante reacciones cualitativas propias del
grupo amino, para ello, se inició preparando los 9 aminoácidos: Alanina,
Metionina, Glicina, Threonina, Prolina, Asparagina, Cistina, Arginina Base y
Triptófano en un balón aforado de 50 mL con agua o etanol dependiendo de
su polaridad previamente consultada para así someterlos a distintas pruebas
y de esta manera observar cada reacción descrita en la guía con el fin de
apreciar la característica principal de los aminoácidos la cual es que contiene
un grupo amina y un grupo carboxilo enlazados al mismo carbono; a pesar
de lo anterior, los resultados no fueron los esperados. Posteriormente, se hace
lo mismo para las 3 proteínas: Gelatina, Albumina y Caseína obteniendo
resultados satisfactorios en sus pruebas.

Palabras claves: Aminoácido, Proteína, Biuret, Xantoproteica

Introducción
AMINOACIDOS: Los aminoácidos son moléculas orgánicas con un grupo amino (-NH2) y un grupo
carboxilo (-COOH), estos además de proporcionar las unidades monómero a partir de las cuales se
sintetizan las cadenas polipeptídicas largas de proteínas, los L-aminoácidos y sus derivados participan
em funciones celulares tan diversas como la transmisión nerviosa y la biosíntesis de porfirinas, purinas,
pirimidinas y urea. (Murray , Botham, Kennelly, & Weil, 2010)
COMPORTAMIENTO ACIDO-BASE: Los grupos amino y los ácidos carboxílicos de los
aminoácidos se ionizan fácilmente. El valor de pK de los ácidos carboxílicos se encuentran en un
pequeño rango alrededor de 2,2, mientras que los valores de pK de los grupos a-amino son cercanos
a 9,4. A pH fisiológico los grupos amino están protonados y los ácidos carboxílicos forman su base
conjugada. Un aminoácido puede entonces actuar como ácido y base, (Voet, 2009). En disoluciones
acuosas con un pH neutro, se presentan las dos formas isoméricas existentes de los aminoácidos como
iones dipolares denominados zwitteriones, en donde el grupo amino se encuentra protonado y el

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grupo carboxilo está desprotonado y además su grado de disociación cambia de acuerdo al pH

circundante. (Narvaez, 2018)

REACCIÓN XANTOPROTEICA: Los compuestos que presentan bencenos sustituidos, al

reaccionar con el ácido nítrico concentrado forman compuestos nitrados de color amarillo, el cual se
intensifica en medio alcalino. Esta formación es debida a un compuesto aromático, cuando las
proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas
proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de tirosina.
Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro. (Gil Campo,
Hurtado, & Escalante , 2014)
La reacción Xantoproteica es una prueba cualitativa que se realiza para identificar grupos laterales R
en los aminoácidos de las proteínas en una solución. La reacción ocurre una vez se nitra el anillo
aromático con ácido nítrico concentrado para generar un precipitado blanco, que luego, al calentar
forma una coloración amarilla, que posteriormente se alcaliniza, para esta reacción se usó hidróxido
de sodio y presenta una coloración naranja gracias a la formación de sales. Esta prueba da positivo
para la tirosina, fenilalanina, triptófano, albúmina, entre otros.
- -
O OH NH2 O OH NH2
OH NH2
+ Na OH
N O + H2O +
+ H2O
O
+ HNO 3 O O
N O

OH - +
OH O Na

Compuesto amarillo Compuesto naranja

Figura N°1 formula estructural de la reacción Xantoproteica (Quiñoñes & Sierra , 2015)

REACCIÓN DE MILLON: El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las

sales de Mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la
tirosina y las proteínas que la contienen. Millón es específica para el grupo fenólico, por lo tanto, la
dan positiva todas las sustancias que poseen esta función, como la Tirosina y todas las proteínas que
contengan Tirosina. La reacción es debida a la presencia del grupo hidroxifenílico (-C6H4OH) en la
molécula proteica. Cualquier compuesto fenólico no sustituido en la posición 3,5, como la tirosina,
fenol y timol, dan positiva la reacción. El primer paso de la reacción de Millón consiste en la nitración
del anillo fenólico de la Tirosina, por el ácido Nítrico del reactivo. La Tirosina nitrada forma complejos
con los iones Mercurioso Hg(I) y Mercúrico Hg (II) del reactivo produciendo un precipitado rojo o
una solución roja, ambos resultados positivos.

Figura N°2 formula estructural de la reacción de Millón. (Gil Campo, Hurtado, & Escalante , 2014)

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Algunas proteínas pueden formar el precipitado rojo desde el inicio, mientras que otras primero
forman un precipitado blanco, que se debe calentar para dar el color rojo indicativo de la presencia de
Tirosina. Cualquier sustancia con un grupo fenólico dará positiva la reacción de Millón y puede
interferir con la detección de Tirosina. Al colocar reactivo de millón en la solución problema, se debe
tener en cuenta la coloración adquirida de la misma para identificar el AA correspondiente. · Rojo –
Tirosina, Incoloro – Fenilalanina. (Gil Campo, Hurtado, & Escalante , 2014).
REACCIÓN DEL ACIDO GLIOXILICO O REACCIÓN DE HOPKINS COLE: La prueba de
Hopkins-Cole es específica para el triptófano, el único aminoácido que contiene un grupo de indol.
El anillo de indol reacciona con el ácido glioxílico en presencia de un ácido fuerte como el ácido
sulfúrico, para formar un producto cíclico color violeta. El reactivo Hopkins-Cole solo reacciona con
proteínas que contienen triptófano. La solución de proteína se hidroliza mediante el ácido sulfúrico
concentrado en la interfaz de la solución. Una vez que el triptófano está libre, reacciona con el ácido
glioxílico para formar el producto de color violeta (en forma de anillo) (2,9).

Figura N° 3 formula estructural de la reacción del ácido Glioxílico (Uscamayta Gonzalez, 2017)
REACCIÓN DE PAULY:
Esta prueba es específica para detectar grupos imidazoles, fenoles y aminas de ciertos aminoácidos.
En esta prueba el ácido sulfanilico disuelto en ácido clorhídrico se mezcla con el nitrito de sodio se
produce Acido nitroso, el cual reacciona con la sal produciendo sal de diazonio. En la segunda etapa
de esta prueba se le incorpora un compuesto fenólico, imidazol o amina y un ácido o base débil para
que la sal de diazonio se asocie con el compuesto generando un compuesto de color rojo. (Castro
Calderón & Medina, 2015).
REACCIÓN DE EHRLICH: El reactivo de Ehrlich (p- dimetillamino- Benzaldehído), reacciona con
compuestos orgánicos tales como el indol, aminas aromáticas y compuestos ureicos para originar
soluciones coloreadas. También resulta positiva para la histidina y la tirosina aminoácidos que no
pertenecen a un mismo grupo químico. En la figura 6 se puede observar cómo es la reacción con este
reactivo.

Figura N°4 fórmula estructural de la reacción de Ehrlich (Castro Calderón & Medina, 2015).
La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminoácidos
se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanilico y nitrito de Sodio por formación de
sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina
libres o formando péptidos y proteínas.

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REACCIÓN DEL NITROPRUSIATO: Los aminoácidos que contienen Azufre al mezclarse con
NH4OH desprenden el Azufre en forma de Sulfuro de Sodio el cual al combinarse con el Nitroprusiato
de Sodio forman un complejo de color carmesí.
Los grupos tioles reaccionan con Nitroprusiato de Sodio (Na, Fe (CN)5 NO) en presencia de un exceso
de Amoniaco para dar un color rojo.

Figura N°5 formula estructural de la reacción del nitroprusiato.(Castro Calderón & Medina, 2015).
REACCIÓN DE SAKAGUCHI: Esta reacción es específica para el aminoácido Arginina, el cual
posee en la estructura del radical el grupo guanidina; este en presencia de Alfa- Naftol se oxida con
Hipoclorito alcalino perdiendo a su vez un grupo amino. La arginina se oxida al combinarse Alfa-
Naftol, forma una sustancia de color rojo que se intensifica con el tiempo.
Es positiva para el aminoácido que contiene el grupo guanidina en la Arginina. El grupo guanidina
presente en el aminoácido reacciona con α-naftol e hipobromito alcalino para dar un complejo de
color rojo (7,8).

Figura N°6 formula estructural de la reacción de Sakaguchi (Uscamayta Gonzalez, 2017).

REACCIÓN CON EL HNO3:
El ácido nitroso reacciona con el grupo amino de los aminoácidos formando los ácidos hidroxilados
correspondientes, liberando nitrógeno gaseoso.

Figura N°7 formula estructural de la reacción con el acido nitroso. (Castro Calderón & Medina, 2015)
Esta es la reacción que se utiliza para determinar el nitrógeno del grupo amino, se conoce como
procedimiento de Von Slyke y sirve para estimar los grupos aminos libres de los péptidos y las
proteínas midiendo la cantidad de nitrógeno liberado.
REACCIÓN DE SORENSEN: El método de Sorensen, también llamado índice proteico; sirve para
determinar nitrógeno amínico en muestras líquidas o extractos. La finalidad es poder determinar la

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concentración de amoníaco o grupos aminos libres de aminoácidos, péptidos y proteínas. Es útil para
dosar aminoácidos libres, el grado de hidrólisis de una proteína, o amonio después de la destrucción
de materia orgánica.
Este método se fundamenta en la titulación de Sorensen, en la cual los grupos amino de los
aminoácidos constituyentes de las proteínas (-NH2), son bloqueados con formaldehído neutralizado,
para luego titular los grupos carboxilo (-COOH) con una solución de álcalis valorada.

Figura N°8 formula estructural de la reacción de Sorensen (Gonzales, 2014)

REACCIÓN DE BIURET PARA ENLACES PEPTÍDICOS: Los enlaces peptídicos de las proteínas
son estructuralmente similares a los de Biuret y reaccionan de la misma manera. La reacción
del Biuret es una reacción general que se produce con las proteínas que presentan al menos dos enlaces
peptídicos o dos grupos amida consecutivos como es el caso de la albumina. Estos grupos son capaces
de reducir el Cu2+ a Cu+, igual que hacen las moléculas del Biuret formando Cu+ un complejo con las
proteínas en medio alcalino, que produce una coloración azul con máximo de absorción de radiación
electromagnética de 330nm y a 345nm. Aunque en este método las medidas de absorción de luz a la
menor longitud de onda de absorción (330nm) proporcionan mayor sensibilidad (ya que el coeficiente
de extinción molar es mayor), a dicha longitud de onda es también más fácil que se presenten
interferencias debidas a la presencia de otros compuestos.

O C C O O C C O
NH HN NH HN
R HC CH R R HC CH R
NaOH +
C O O C
+ CuSO 4 C O Cu O C
HN NH HN NH
CH R R HC CH R R HC

2 cadenas de proteína
Figura N°9 Cadena de proteínas con Biuret (Quiñoñes & Sierra , 2015)

PRECIPITACIÓN POR METALES PESADOS:

Las proteínas precipitan de sus soluciones por algunos tipos de metales pesados como cloruro de
mercurio, nitrato de plata, sulfato de cobre, etc. El ion del metal pesado muy probablemente se
combina con la forma aniónica de la proteína. La proteína en el lado alcalino de su punto isoeléctrico,
existe como ion negativo, y así, al combinarse con el ion del metal o catión formara lo que podríamos
llamar “proteinato, por ejemplo" proteinato de mercurio, proteinato de plata, etc. (Quiñoñes & Sierra
, 2015)

PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS POR REACTIVOS ACIDICOS:

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Los reactivos llamados “reactivos alcaloidales, que son ciertos ácidos como el pícrico, el fosfotungsico,
el tánico, el metafosfórico, etc. Estos precipitan la proteína al combinarse el radical acido del reactivo,
con la forma catiónica de la proteína que predomina en el lado acido de su punto isoeléctrico. $e forma
entonces un precipitado que podríamos llamar, por ejemplo" tannato de proteína, fostotungstato de
proteína, tricloroacetato de proteína. La mayoría de las globulinas animales se precipitan con sulfato
de amino a 50% de saturación. Las albuminas se precipitan con soluciones de sulfato de amonio al
100% de saturación. (Quiñoñes & Sierra , 2015)

REACCIÓN DE FOLIN-LOWRY:
El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A
la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la
intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de
Lambert-Beer A= ε.l.c
Este método consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de
nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.
Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los
residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se
mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.
2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos
de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como
catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido
fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un
complejo de color azul intenso.

Figura N°10 Reacción entre la proteína y los reactivos, (Quiñoñes & Sierra , 2015)

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Materiales y métodos
La práctica se dividió en dos sesiones, en la primera se tomó 9 aminoácidos: Alanina, Metionina,
Glicina, Threonina, Prolina, Asparagina, Cistina, Arginina Base y Triptófano, los cuales se prepararon
en un balón aforado de 50 mL con agua o etanol según su polaridad, para ello se realizó los cálculos
peso-volumen para conocer la cantidad de gramos que se debían macear de cada aminoácido para así
someterlos a 9 pruebas. En la prueba Xantoproteica se trasvasó 0.5 mL de cada solución de los
aminoácidos a tubos de ensayo, se agregó 0.5mL de ácido nítrico concentrado a cada uno, luego se
dejó enfriar; seguidamente se agregó suficiente NaOH 10 M hasta alcanzar una alcalinidad elevada
para cambiar el color amarillo inicial hasta anaranjado brillante. En la prueba de Millon se trasvasó 0.5
mL de cada solución de aminoácido a tubos de ensayo, se agregó 0.5mL de fenol y 5 gotas del reactivo
de Millón, luego se llevó a un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, y se adicionaron 5 gotas de
solución de NaNO2. En la prueba del ácido glioxílico se trasvasó 2 mL de cada solución de aminoácido
a tubos de ensayo, se agregó 2 mL de ácido glioxílico o en su defecto de CH3COOH, y después se
agregó 2 mL de H2SO4. En la prueba de Pauly se vierten 2 mL de las mismas soluciones a tubos de
ensayo, se agregó 1mL de solución de ácido sulfanilico y 1mL de solución de NaNO2, se enfrió en un
baño de hielo durante 4 minutos, luego se alcalinizó con 2 mL de Na2CO3. En la prueba de Ehrlich
se trasvasó 0.5 mL de cada solución a tubos de ensayo, y se añadió 2 mL del reactivo de Ehrlich. En
la prueba de nitroprusiato se vertieron 2 mL de aminoácidos a tubos de ensayo, y se adicionó 0.5 mL
de solución de nitroprusiato a cada uno y se añadió 0.5 mL de amoníaco concentrado. En la prueba
de Sakaguchi se agregó 0.5 mL de solución de NaOH 10M a cada uno y se añadió 3 gotas de solución
de alfa-naftol a 1 mL de la solución de aminoácidos. En la prueba de HNO2 se adicionó 0.5 mL de
HNO2 concentrado a tubos de ensayo con las soluciones problema. Por último, en la prueba de
Sorensen se vertió 1 mL de cada aminoácido a tubos de ensayo, se agregó 0.5 mL de formaldehído a
cada uno calentándolos en baño de agua a 80º C durante 3 minutos. En la segunda sesión se trabajó
con 3 proteínas, Gelatina, Albumina y Caseína, en la prueba de Biuret se empleó 1ml de cada solución
de las proteínas anteriormente mencionadas a tubos de ensayo y se agregó 3 gotas de CuSO4 y 1ml de
NaOH 10M. En la prueba de precipitación por metales pesados se adicionó 2ml de las soluciones
problema a tubos de ensayo y se agregó 3 gotas de las soluciones de CuSO4, Pb(NO3) 2 y Hg(NO3) 2
y 1 mL de NaOH 10M. En la prueba de precipitación de proteínas por reactivos acídicos se trasvasó
2 mL de cada solución de proteínas a tubos de ensayo, se añadió 5 gotas de solución de los reactivos
acídicos disponibles, se agregó algunas gotas de NaOH 1 M. Por último, para la prueba de Folin-
Lowry se vertió 1 mL de cada solución en tubos de ensayo, se añadió 5 mL de la solución alcalina, se
agitó vigorosamente para dejarlo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se agregó
0.5 mL de reactivo de Folin-Cicateau rápidamente a cada una de las pruebas anteriormente
mencionadas observando cómo reaccionaban.

Resultados y discusión
A continuación se evidencian los resultados obtenidos del mismo modo que los datos mínimos para
llevar a cabo la práctica y con los cuales se logró obtener estos, en esta práctica de laboratorio
correspondiente a la Titulación Ácido-Base con Bureta Digital; en la tabla No.1 Resultados Titulación
se encuentran plasmados los resultados adquiridos en los cuales se detallan la cantidad en mL de
Hidróxido de Sodio agregados a la alícuota de Ácido Clorhídrico y la variabilidad del pH en la luego
de la reacción de esta.

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ml de NaOH pH H+

0ml 0,54 0,29

1ml 0,67 0,21

2ml 0,82 0,15

3ml 1 0,1

4ml 1,22 0,06

5ml 1,58 0,026

6ml 11,8 0,00625

Tabla No. 1 resultados Titulación

Con base en los datos obtenidos se realizó la siguiente grafica teniendo en cuenta las concentraciones

pH-ml
14

12

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7

Grafica No. 1 titulación Niveles de pH y NaOH

Según los cálculos y los datos plasmados en la tabla No. 1 resultados titulación y la tabla No.2 cálculos
para la titulación se puede asegurar que la práctica se llevó de una manera correcta en todo su trayecto,
se cumplió con el objetivo de la práctica hallando la cantidad necesaria de reactivo básico para una
muestra problema acida y de esa misma manera hallar su concentración inicial, tal como lo plantea
(Chem, 2004), “una titulación volumétrica se basa en la medición de la cantidad de un reactivo de
concentración conocida, que se consume por el analito.”, de esta misma manera se puede decir que el
punto de equivalencia es prácticamente cercano ya que según (Chem, 2004), “Durante la titulación

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el punto en el cual la cantidad de titulante añadido es estequiométricamente equivalente a la

cantidad de analito en la muestra se define como el punto de equivalencia.”, ya que en la práctica
se utilizó 13,785ml del analato para que reaccionara el analito, para poder apreciar que el punto de
equivalencia estaba en esta cantidad se empleó la fenolftaleína que actúa como indicador tal como nos
lo dice (UPO, 2014), “La fenolftaleína emplea una disociación y se ve acompañada por cambios en la
estructura interna del indicador la cual ocasiona un cambio de color.” . Además de esto esta práctica
se puede considerar también un éxito ya que al hallar el porcentaje de error de los pH, práctico y teórico
se obtuvo un resultado del 12,03% y esto en temas de porcentajes se considera un éxito total.

Conclusiones y recomendaciones
Una de las falencias que lograron identificar durante el desarrollo de la práctica es el alto nivel de
contaminación de los reactivos con los cuales se realizan las prácticas, del mismo modo cabe destacar,

Anexos
Ecuación 1: Cálculos preparación soluciones madre.

 250ml NaOH al 0,5 M

0,5 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑁𝑎𝑂𝐻 39,997 𝑔𝑟 𝑁𝑎𝑂𝐻 100

100𝑚𝑙𝑥 𝑥 𝑥 = 2,040𝑔 𝑑𝑒 𝑁𝑎𝑂𝐻
1,000 𝑀𝐿 𝑆𝑙𝑛 1 𝑚𝑜𝑙 98

Volumen analato [M] Volumen M SD (+/-)

(NaOH) (mL) del (Promedio)
analito (mL)
(HCl)
(mL)

13,992 0,5 10 13,785 0,29274221

13,578

Tabla No. 2 caculos para la Titulación

 Cálculo para hallar concentración

V1C1=V2C2

13,785ml * 0,5 = 10ml * C2

13,785ml ∗ 0,5 M
C2= = 0,69M HCl
10𝑚𝑙

 Luego se halló los moles que utilizo cada reactivo al momento de finalizar la titulación

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0,69 M
10ml*1000𝑚𝑙=00,0069 moles HCl

0,5 M
13,785ml*1000𝑚𝑙=00,0069 moles NaOH

 Ahora se halló la concentración [H+]

Volumen total=23,785

Volumen total=0,023785L
0,0069 Mol
[H+]= = 0,29 M HCl inicial
0,023685𝐿

 Se halló pH
pH= - Log (0,29)

pH= 0,54

 Se calculo el %error
0,54−0,475
%error = ∗ 100= 12,03%
0,54

Referencias
Chem, W. (17 de Noviembre de 2004). Titulacion Acido Base. Recuperado el 12 de Mayo de 2019, de
LABORATORIO DE QUIMICA ANALITICA:
https://www.academia.edu/36574432/Titulacion_Acido_Base

Delfos, A. (13 de Marzo de 2017). Titulacion Volumetrica. Recuperado el 12 de Mayo de 2019, de

https://es.scribd.com/document/130839837/uni-2

Narvaez, L. (2018). MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Universidad Surcolombiana,

Facultad de Educación . Neiva: Universidad Surcolombiana. Recuperado el 12 de Mayo de 2019,
de
file:///C:/Users/SERVIDOR/Downloads/Manual%20de%20Gu%C3%ADas%20de%20Bioqu%C3%A
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Padrón, Y. (21 de Noviembre de 2017). IQuimicas. Recuperado el 12 de Mayo de 2019, de Bureta digital /
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http://recursostic.educacion.es/newton/web/materiales_didacticos/acidosbases/valoracion_1.h
tml

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UPO. (Mayo de 2014). Universidad Pablo de Olavide - Técnicas Avanzadas en Química. Recuperado el 12
de Mayo de 2019, de DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS Y BASES:
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/TAQ/curso0405/TAQP3_0405.pdf

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