INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria

de Ingeniería campus Guanajuato

Laboratorio de Bioconversiones
Profesores:
Dr. Cortés Mendoza Anastasio
IBQ. Luévano Colmenero Guadalupe Hortensia

Practica 6. “Cinética enzimática ”

4BV1
Equipo 2:
Banda Santoyo Vianey Pilar
Cadena Tinajero Citlalli Guadalupe
Nerey Hernández Lizbeth Arisbe
Rea García Susan Daniela

Silao de la Victoria, Gto.; a 27 de Noviembre

Objetivos.

® General.

Realizar la cinética enzimática del enzima α-amilasa libre e inmovilizada previamente

obtenido a partir de los microorganismos Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus
niger; misma que será comparada con la enzima de referencia obtenida de Aspergillus
oryzae.

® Específicos.

1. Determinar la actividad enzimática de cada muestra.

2. Determinar el efecto de los factores de pH, temperatura y concentración

de sustrato sobre la actividad enzimática.

3. Determinar las condiciones óptimas de reacción para cada muestra.

Introducción.

El uso de procesos biotecnológicos para producir químicos se ha vuelto cada vez más
importante. La variedad de productos que se pueden obtener por estos procesos es
muy amplia, desde productos farmacéuticos, especialidades químicas, productos
químicos, alimentos y bebidas, hasta productos agrícolas y ambientales. Los procesos
biológicos utilizan, para realizar las transformaciones necesarias, células vivas o
productos denominados enzimas que ellas utilizan en su metabolismo.

En el mundo de la industria, actualmente, se denomina fermentaciones a las

reacciones biológicas que convierten una materia prima orgánica denominada sustrato
en un producto por la acción catalítica de microorganismos o microbios (levaduras,
bacterias, algas, mohos, etc.) o por acción de enzimas, que no son más que proteínas
de elevado peso molecular (10 4 a 106 g×mol-1), sintetizadas por los propios organismos
vivos.

1. Enzimas.

De acuerdo a McGilvery, R. W () un enzima es una proteína que se combina con

uno o más compuestos de forma que reaccionan específicamente a mucha mayor
velocidad que lo harían sin el enzima.
Los grupos reactivos de un enzima tiene dos misiones. Una es unir los compuestos
particulares en proximidad al sitio en donde tiene lugar la catálisis; el enzima tiene
así especificidad para un cierto número de compuestos. La especificidad se
produce a partir de orientaciones espaciales complementarias entre sustrato y
enzima (McGilvery, R. W, ). La segunda es realizar el mecanismo catalítico, esto
lleva consigo un cambio en la conformación del complejo enzima-sustrato que

1
 debilita los enlaces del sustrato logrando configuraciones más reactivas.
1.1 Especificidad de los enzimas
Los enzimas son altamente específicos tanto en la reacción que catalizan como en la
selección de las sustancias reaccionantes, denominadas sustrato. Un enzima cataliza
normalmente una sola reacción química o un grupo de reacciones estrechamente
relacionadas. En contraposición con las reacciones no catalizadas, en las reacciones
catalizadas por enzimas son raras las reacciones colaterales que conducen a la
formación de productos secundarios.
La existencia de un complejo enzima-sustrato, ES, se infirió a partir de (a) el alto grado
de especificidad exhibido por los enzimas, (b) la forma de la curva de velocidad contra
concentración de sustrato, y (c) el hecho de que los sustratos frecuentemente protege
los enzimas de la inactivación. El alto grado de especificidad incitó a Emil Fischer en
1884 a sugerir la plantilla o la analogía de herradura-llave. Esta relación sume que el
enzima posee una región, llamada sitio activo, que es complementaria en tamaño,
forma y naturaleza química a la molécula de sustrato. La enzima flexible más moderna
o la hipótesis de ajuste inducido de Koshland sugiere que el sitio activo no tiene porque
ser una cavidad geométrica rígida preexistente sino una disposición espacial específica
y precisa de los grupos R de aminoácidos que se induce por contacto con el sustrato.
El sitio activo del enzima ocupa solo una porción muy pequeña de la molécula del
enzima. De hecho, puede haber solo una docena o menos de residuos de aminoácidos
que rodean la bolsa de absorción y, de estos, solo dos o tres pueden participar
realmente en la unión del sustrato y/o la catálisis.

1.1 Enzima α-amilasa.

La α-amilasa es una enzima (EC 3.2.1.1) que cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa-
glucosídicos, de los polisacáridos alfa glucosídicos de alto peso molecular, tales como
el almidón y el glucógeno, liberando glucosa y maltosa (Pugh, M, B.; 2000). Es la
principal amilasa encontrada en humanos y otros mamíferos (Voet, D. y Voet, J. G.;
2005). También se encuentra presente en semillas que contienen almidón como
reserva alimenticia, y es secretada por muchos hongos.

Figura 1. Estructura terciaria de amilasa salival humana

Las α-amilasas contienen varios dominios proteicos diferentes. El dominio catalítico

2
posee una estructura secundaria consistente en ocho barriles alfa/beta encadenados
que contienen el sitio activo, interrumpido por un dominio de unión al calcio formado
por unos 70 aminoácidos que protruye entre la tercer lámina beta y la tercera hélice
alfa, y un dominio carboxi-terminal barril beta con un motivo de clave griega (Abe, A., et
al. 2005). Varias alfa-amilasas contienen un dominio con forma de lámina beta, por lo
general en el extremo C-terminal. Este dominio se encuentra formado por cinco
cadenas antiparalelas en configuración de lámina beta (Kadziola, A. et al. 1998)
(Kadziola, A. et al. 1994). Además, varias alfa-amilasas contienen también un dominio
todo-beta, por lo general en el extremo C-terminal (Machius, M. et al. 1995).
2. Cinética Enzimática.
La cinética enzimática es la rama de la enzimología que trata los factores que
afectan las tasas de reacciones catalizadas por enzimas (Segel, I. H. 1975). Los
factores más importantes son los de la concentración de enzimas, las
concentraciones de ligandos (sustratos, productos, inhibidores y activadores), el
pH, la fuerza iónica y la temperatura. Cuando todos estos factores se analizan
correctamente, es posible aprender mucho sobre la naturaleza de la reacción
catalizada por enzimas. Se pueden determinar ciertas constantes cinéticas y, a
partir de ellas, se pueden deducir las concentraciones intracelulares habituales
de sustratos y productos y la dirección fisiológica de la reacción. La cinética de
una reacción puede indicar la forma en que se regula la actividad de la enzima in
vivo.
Un estudio del efecto de la variación del pH y la temperatura en la constante
cinética puede proporcionar información sobre la identidad de los grupos R de
aminoácidos del sitio activo. Un análisis cinético puede llevar a un modelo para una
reacción catalizada por enzimas y, a la inversa, los principios de cinética enzimática
pueden usarse para escribir la ecuación de velocidad para un modelo atractivo, que
luego puede probarse experimentalmente.

2.1 Actividad enzimática.

En la mayoría de las preparaciones se desconoce la concentración real del enzima
molar. En consecuencia, la cantidad de enzima presente se puede expresar solo en
términos de su actividad. De acuerdo a Segel, I. H. (1975), para estandarizar el informe
de actividades enzimáticas, la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de
Bioquímica definió una unidad estándar como:
“Una unidad internacional (UI) de enzima es la cantidad que cataliza la
formación de 1 μmol de producto por minuto en condiciones definidas.”
La concentración de enzima es una preparación impura se expresa en términos de
unidades/mL.
1.1 Factores que influyen en la determinación de la actividad enzimática.

3
 1.1.1 Temperatura.
En general, la temperatura aumenta la velocidad de la reacción química. Del mismo
modo, la actividad enzimática aumenta con el incremento de temperatura; sin embargo,
llegando a una determinada temperatura aparecen los fenómenos de desnaturalización
de la proteína enzimática, y la enzima se inactiva. La temperatura crítica es
característica de cada enzima y oscila generalmente entre 50 y 60 °C. Por tanto, la
velocidad máxima de las reacciones catalizadas enzimáticamente, se consiguen algo
por debajo de la temperatura crítica de la enzima («óptimo de temperatura») (Díaz,
Fernández & Paredes, 1997).

La temperatura a la cual la desnaturalización llega a ser un factor decisivo varía de una

enzima a otra. Mientras que, en la práctica, para la mayoría de las enzimas, la
inactivación debida al calor puede despreciarse por debajo de los 30°C y empieza a
jugar un papel entre los 35 y 40°C, existen también algunas enzimas que pueden
calentarse a 60°C sin pérdida significativa de actividad. Por ello es aconsejable la
determinación de actividades enzimáticas por debajo de 30 °C (Díaz, Fernández &
Paredes, 1997).

Figura 2. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas.

Es fundamental la correcta termostatización en la determinación de la actividad

enzimática, ya que errores de 1°C en el control de la temperatura de reacción pueden
ocasionar errores de hasta el 10 por 100 en el cálculo de actividad de algunas
enzimas. El control exacto de la temperatura sólo es posible en los sistemas de análisis
cerrados (Díaz, Fernández & Paredes, 1997).

1.1.1 Tampón y pH.

El valor del pH con el que la efectividad de la enzima es máxima se denomina
“pH óptimo” y depende de diversos factores (tipo de tampón, concentración y
tipo de sustrato, presencia de activadores e inhibidores, etc.). Para conseguir
dicho pH se utilizan diversos sistemas tampones. A la hora de elegir el sistema

4
tampón hay que tener en cuenta dos criterios:
a) La fuerza iónica (derivada de su concentración); el tampón ideal será aquel
que nos proporcione máxima capacidad tamponante a la mínima concentración
posible.
b) Naturaleza química de la sustancia tampón, por posible participación en la
reacción. Así, no se debe utilizar tampones fosfato en la determinación de
actividad de fosfatasa alcalina.

Figura 3. Efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas.

1.1.1 Presencia de cofactores.

Las coenzimas son sustancias orgánicas de bajo peso molecular que aumentan
la actividad del enzima y por tanto la sensibilidad del método analítico. Deben
añadirse a los sistemas de reacción en cantidades óptimas para no convertirse
en factores limitativos de la reacción (Díaz, Fernández & Paredes, 1997).
1.1.1 Concentración de sustrato.
Si se mantienen constantes el resto de las variables, la velocidad de las
reacciones enzimáticas aumentará hasta un punto determinado con
concentraciones crecientes de sustrato. En los test de determinación de la
actividad enzimática nos interesa que la velocidad de reacción sea lo más
próxima posible a la velocidad máxima (V max), ya que en este caso la reacción
se convierte en orden cero y la velocidad de reacción es independiente de la
concentración de sustrato y sólo va a depender de la concentración de enzima.
Esto se consigue utilizando concentraciones de sustratos mucho mayores que
la Km de la enzima. Por tanto, el valor de la Km es el parámetro de referencia
para determinar la concentración de substrato idónea en cada test enzimático.
En la práctica, se trabaja con velocidades superiores al 90 por 100 de la Km, y
por tanto la concentración de substrato que se suele emplear es unas 10 veces
la Km del enzima en las condiciones del ensayo (Díaz, Fernández & Paredes,
1997).

5
Eadie-Hofstee
Otra transformación de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene al multiplicar Vmax por ambos
miembros de la ecuación de Lineweaver-Burk y redondeando, así se obtiene la ecuación de Eadie-
Hofstee (Lehninger, 1990).

La representación gráfica se obtiene al graficar V contra V/[S], mediante el cual es posible identificar
rápidamente los parámetros cinéticos Km y Vmax.

Figura 4. Cinética enzimática. Representación de

Eadie-Hofstee. (Lehninger, 1990).

Hanes Woolf
En Enzimología ,un gráfico de Hanes–Woolf plot or Hanes-Wolff Plot es una representación de la
cinetica enzimática en donde la razón de concentración de sustrato inicial [S] y la velocidad de reacción
V es graficado contra la concentración de Sustrato [S]. Esta ecuación se deduce también de la ecuación
de Michaelis Menten de la siguiente manera :

6
Figura 5. Cinética enzimática. Representación de Hanes Woolf ().

INHIBICIÓN.
La actividad de muchos enzimas puede inhibirse por la unión de moléculas pequeñas e iones. esta
forma de inhibición enzimática constituye el principal mecanismo de control de los sistemas biológicos.

La inhibición puede ser de distintos tipos:

1. Reversible:
● a) Competitiva
● b) No competitiva
● c) Incompetitiva

2. Irreversible.

a) Competitiva: El inhibidor compite por el centro activo con el sustrato.La constante de disociación para
el inhibidor viene dada por:

La inhibición es más potente cuanto más pequeño sea el valor de Ki , Según Stryer: “la característica
fundamental de la inhibición competitiva es que esta puede ser superada a concentraciones
suficientemente elevadas de sustrato” (Stryer,2003).

7
 Figura 6. Cinética de un inhibidor competitivo.

El efecto de un inhibidor competitivo consiste en aumentar el valor aparente KM, es decir, para obtener la
misma velocidad de reacción se necesita más cantidad de sustrato. por lo tanto se deduce un nuevo
valor de KM, llamado KapM numéricamente igual a:

donde [I] es la concentración del inhibidor y Ki es la constante de disociación para el complejo enzima-
inhibidor, el enzima tendrá la misma V max en presencia de un inhibidor competitivo, como en su ausencia.
Para que un enzima sea completamente funcional , todos los centro activos deben estar ocupados por el
sustrato, lo cual sucede a una concentración suficientemente alta.

● b) No Competitiva: La unión del inhibidor no afecta la unión del sustrato; por ende, es factible la
formación de complejos EI como EIS. si bien, el complejo inhibidor de enzima aún puede unirse
a sustrato, su eficiencia para transformar en producto reflejada por V min, está disminuida . Los
inhibidores no competitivos unen enzimas en sitios distintos del sitio de unión a sustrato y por lo
general muestran poca o ninguna semejanza estructural con el sustrato.
Para la inhibición no competitiva simple, E y EI poseen afinidad idéntica por el sustrato, y el
complejo EIS genera producto a un índice insignificante. La inhibición no competitiva más
compleja ocurre cuando la unión del inhibidor afecta la afinidad aparente de la enzima por el
sustrato
La inhibición no competitiva más complejo ocurre cuando la unión del inhibidor afecta la afinidad
aparente de la enzima por el sustrato(Murray,2012).

8
 Figura 7. Gráfico de Lineweaver-burk con inhibición no competitiva simple (Murray,2012).

● Inhibiciòn in-competitiva
Un inhibidor in-competitivo también se fija en un lugar distinto al del sustrato, pero
requiere que la enzima esté unida previamente al sustrato en forma de ES. El inhibidor
in-competitivo mantiene al sustrato en el centro activo, lo que se traduce en un aumento
aparente de la afinidad de la enzima por el sustrato, explicando la disminución que
experimenta la KM. La inhibición in-competitiva no puede superarse mediante la adición
de más cantidad de sustrato (Garrido,2006).

Actividad específica enzimática.

Se define a la actividad específica de una preparacion enzimatica como el número de micromoles de
producto formado por minuto por miligramo de proteína o por miligramo de enzima, si se tiene una
preparación purificada, en condiciones óptimas de pH, temperatura, fuerza iónica y concentración de
sustrato o sustratos (Arriaga,1990).

U ≡ µmol S/min ≡ µmol P/min

Actividad enzimática= [m(Abs/min)*V ensayo (mL)*F/ ε (M-1 cm-1)*b(cm)*Enzima (mL)]*v

Donde:
m= Pendiente de la recta
ε= Coeficiente de extinción molar (cm2 /µmol)
b= Distancia de la celda (1 cm)
V = volumen total del ensayo (volumen final en la celda)
F= Factor de dilución
Enz= volumen de la enzima (mL)

METODOLOGÍA
I. Determinación de las velocidades iniciales.
Preparar por Realizar tiempo Pasado el tiempo Aplicar
duplicado tubos de reacción a de reacción poner metodología
temperatura el tubo en hielo
de 1.5 mL, ver para ensayo de
ambiente para detenerla
tabla 1 DNS.

9
I. Determinación del efecto del pH sobre la reacción enzimática.
Preparar por Dejar Pasado el tiempo Aplicar
duplicado tubos reaccionar 15 de reacción poner metodología
minutos a el tubo en hielo
de 1.5 mL, ver para ensayo de
temperatura para detenerla
tabla 2. DNS.
ambiente

I. Determinación del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

Preparar por Incubar los Pasado el tiempo Aplicar
duplicado tubos tubos a de reacción poner metodología
diferentes el tubo en hielo
de 1.5 mL, ver para ensayo de
concentracione para detenerla
tabla 4. DNS.
s por 15
minutos

10
 I. Determinación del efecto de la concentración de sustrato sobre la
velocidad de las reacciones enzimáticas.

Resultados.
I. Determinación de las velocidades iniciales

Para determinar las velocidades iniciales se incubaron las muestras a temperatura

ambiente por diferentes tiempos utilizando almidón como sustrato, con una
concentración de 10 mg/mL y un buffer de acetatos de pH 5. La enzima analizada fue
α-amilasa obtenida de tres microorganismos diferentes: S. cerevisiae, A. niger y A.
oryzae, los dos primeros microorganismos se incubaron en el laboratorio y se extrajo la
enzima; la tercer muestra fue una enzima comercial prevista por el laboratorio. Pasado
el tiempo de incubación se realizó la metodología para DNS para medir sus
absorbancias y obtener concentraciones de azúcares reductores. Los resultados fueron
los siguientes:

Tabla. Absorbancias y concentraciones de azúcares reductores para obtener

velocidades iniciales de la enzima inmovilizada de alfa amilasa.

Enzima alfa Tiempo Absorbancia Absorbancia Promedio de Concentración de azúcares

amilasa de: (min) 1 2 Absorbancias reductores (g/L)

11
Saccharomyce 5 -0.004 0.003 -0.0005 0.0294
s cerevisiae
10 0.007 -0.006 0.0005 0.0316

15 0.001 -0.009 -0.004 0.0129

20 -0.005 -0.004 -0.0045 0.0206

25 0.005 0.01 0.0075 0.0469

Aspergillus 5 -0.147 -0.145 -0.146 -0.2897

niger
10 0.006 -0.007 -0.0005 0.0294

15 -0.008 -0.01 -0.009 0.0107

20 0.16 0.002 0.081 0.2081

25 0.009 0.012 0.0105 0.0535

Enzima 5 0.019 0.025 0.022 0.0787

comercial
10 0.03 -0.007 0.0115 0.0557

15 -0.002 0.001 -0.0005 0.0294

20 0.002 0.047 0.0245 0.0842

25 0.03 0.046 0.038 0.1138

De acuerdo a los datos anteriores se procedió a graficar las concentraciones obtenidas

de azúcares reductores con respecto al tiempo de incubación, para poder visualizar
mejor el tiempo óptimo de incubación.

Figura 8 . Comportamiento de la concentración de azúcares reductores obtenidos enzima inmóvil

amilasa de distintos microorganismo a diferentes tiempos de incubación.

12
Esta forma se conoce que los tiempos óptimos de incubación para enzima amilasa
inmóvil son:
● En S. cerevisiae: 25 min.
● En A. niger: 20 min.
● En la enzima comercial (A. oryzae): 20 min.

Posteriormente se realizó el mismo procedimiento, en esta ocasión utilizando la enzima

libre amilasa de S. cerevisiae, A. niger y A.oryzae.

Tabla. Absorbancias y concentraciones de azúcares reductores para obtener

velocidades iniciales de la enzima libre de alfa amilasa.

Enzima alfa amilasa de: Tiempo (min) Concentración de azúcares reductores (g/L)

Saccharomyces cerevisiae 5 0.08092

10 0.07105

15 0.03377

20 0.04254

25 0.11272

Aspergillus niger 5 0.01184

10 0.05241

15 0.04912

20 0.06447

25 0.06009

Enzima comercial 5 0.05022

10 0.05132

15 0.00526

20 0.05680

25 0.02610

13
La siguiente gráfica muestra las concentraciones con respecto al

tiempo de la enzima amilasa de los microorganismos analizados.

Figura 9. Comportamiento de la concentración de azúcares reductores obtenidos enzima amilasa libre

de distintos microorganismo a diferentes tiempos de incubación.

Esta forma se conoce que los tiempos óptimos de incubación para enzima amilasa libre
son:
● En S. cerevisiae: 25 min.
● En A. niger: 20 min.
● En la enzima comercial (A. oryzae): 20 min.

Posteriormente se realizó un ensayo de pH, para encontrar el óptimo de cada enzima,

usando las mismas cantidades que indica la metodología, con un tiempo de incubación
de 15 min. Los resultados se muestran las siguientes tablas.

Tabla. Absorbancias y concentraciones de azúcares reductores para obtener el pH óptimo de la enzima

inmovilizada de alfa amilasa.

Enzima alfa pH Absorbancia Absorbancia Promedio de Concentración de

amilasa de: 1 2 Absorbancias azúcares reductores
(g/L)

Saccharomyce 3 0.016 0.016 0.0160 0.0656

s cerevisiae
4 0.007 0.009 0.0080 0.0480

5 -0.001 0.004 0.0015 0.0338

14
 6 -0.008 -0.006 -0.0070 0.0151

7 0.006 0.003 0.0045 0.0404

8 0.004 0.003 0.0035 0.0382

Aspergillus 3 0.007 -0.004 0.0015 0.0338

niger
4 0.015 0.009 0.0120 0.0568

5 0.003 0.062 0.0325 0.1018

6 0.009 0.006 0.0075 0.0469

7 0.003 0.001 0.0020 0.0349

8 0.016 0.025 0.0205 0.0754

Enzima 3 -0.014 0.029 0.0075 0.0469

comercial
4 0.002 0.021 0.0115 0.0557

5 -0.004 0.004 0.0000 0.0305

6 -0.012 -0.011 -0.0115 0.0053

7 0.001 0.022 0.0115 0.0557

8 0.009 0.014 0.0115 0.0557

Graficando la concentración de acuerdo al pH usado para cada ensayo se visualiza lo

siguiente:

Figura 10 . Comportamiento de la concentración de azúcares reductores obtenidos enzima inmóvil

amilasa de distintos microorganismo a diferente pH de incubación.

15
Esta forma se conoce que el pH óptimo de incubación para enzima amilasa inmóvil es:
● En S. cerevisiae: 3
● En A. niger: 5
● En la enzima comercial (A. oryzae): 8

El mismo ensayo se realizó, pero ahora con la enzima amilasa libre, los resultados de
concentraciones de azúcares reductores obtenidos se muestran en la siguiente tabla.

Tabla. Absorbancias y concentraciones de azúcares reductores para obtener el pH óptimo de la

enzima libre de alfa amilasa.

Enzima alfa pH Absorbancia 1 Absorbancia 2 Promedio de Concentración de

amilasa de: Absorbancias azúcares
reductores (g/L)

Saccharomyce 3 0.069 0.08 0.0745 0.1939

s cerevisiae
4 0.079 0.086 0.0825 0.2114

5 0.01 0.015 0.0125 0.0579

6 -0.001 0.001 0.0000 0.0305

7 0.004 0.002 0.0030 0.0371

8 0.015 0.013 0.0140 0.0612

Aspergillus 3 0.003 0.006 0.0045 0.0404

niger
4 0.008 -0.003 0.0025 0.0360

5 -0.001 0.002 0.0005 0.0316

6 0.008 0.015 0.0115 0.0557

7 -0.016 0.013 -0.0015 0.0272

8 0.008 0.017 0.0125 0.0579

Enzima 3 0.004 0.002 0.0030 0.0371

comercial
4 0.004 -0.006 -0.0010 0.0283

5 0.013 0.001 0.0070 0.0458

6 -0.008 -0.002 -0.0050 0.0195

7 0.002 -0.001 0.0005 0.0316

8 0.006 0.009 0.0075 0.0469

16
El gráfico para las concentraciones de azúcares reductores de acuerdo al pH de la
enzima amilasa se observa de la siguiente forma:

Figura 11 . Comportamiento de la concentración de azúcares reductores obtenidos enzima libre amilasa

de distintos microorganismo a diferente pH de incubación.

Esta forma se conoce que el pH óptimo de incubación para enzima amilasa libre son:
● En S. cerevisiae: 4
● En A. niger: 8
● En la enzima comercial (A. oryzae): 8

Además se realizó se realizó un ensayo de temperatura para conocer la temperatura

óptima de la enzima amilasa tanto libre como inmóvil, la siguiente tabla muestra los
resultados obtenidos en el ensayo de temperatura para la enzima inmóvil.

Tabla. Absorbancias y concentraciones de azúcares reductores para obtener la temperatura óptima de la

enzima inmovilizada de alfa amilasa.

Enzima alfa T (ºC) Absorbancia Absorbancia 2 Promedio de Concentración de

amilasa de: 1 Absorbancias azúcares reductores
(g/L)

Saccharomyc 10 -0.004 -0.009 -0.0065 0.0162

es cerevisiae
20 -0.008 0.018 0.005 0.0414

30 0.002 0.001 0.0015 0.0338

40 0.006 0.01 0.008 0.0480

50 0.015 0.006 0.0105 0.0535

60 0.016 0.008 0.012 0.0568

17
Aspergillus 10 -0.004 0.016 0.006 0.0436
niger
20 0.027 0.021 0.024 0.0831

30 -0.01 -0.014 -0.012 0.0042

40 -0.001 0.003 0.001 0.0327

50 0.004 0.003 0.0035 0.0382

60 -0.008 0.008 0.000 0.0305

Enzima 10 -0.014 -0.004 -0.009 0.0107

comercial
20 0.01 0.013 0.0115 0.0557

30 0.001 -0.001 0.000 0.0305

40 -0.011 0.001 -0.005 0.0195

50 -0.004 -0.004 -0.004 0.0217

60 -0.034 0.011 -0.0115 0.0053

Graficando los resultados anteriores de concentración con respecta a la temperatura se

observa de la siguiente manera:

Figura 12. Comportamiento de la concentración de azúcares reductores obtenidos enzima inmóvil

amilasa de distintos microorganismo a diferentes temperaturas de incubación.

Esta forma se conoce que las temperaturas óptimas de incubación para enzima
amilasa inmóvil son:
● En S. cerevisiae: 60 °C
● En A. niger: 20 °C
● En la enzima comercial (A. oryzae): 20 °C

18
En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos en el ensayo de temperatura
para la enzima libre de alfa amilasa.

Tabla. Absorbancias y concentraciones de azúcares reductores para obtener la temperatura

óptima de la enzima libre de alfa amilasa.

Enzima alfa T (ºC) Absorbancia Absorbancia Promedio de Concentración

amilasa de: 1 2 Absorbancias de azúcares
reductores (g/L)

Saccharomyce 10 0.007 0.013 0.0100 0.0524

s cerevisiae
20 0.003 0.011 0.0070 0.0458

30 0.01 0.025 0.0175 0.0689

40 0.021 0.023 0.0220 0.0787

50 0.029 0.012 0.0205 0.0754

60 0.028 0.013 0.0205 0.0754

Aspergillus 10 0.025 0.005 0.0150 0.0634

niger
20 0.05 0.023 0.0365 0.1105

30 0.002 -0.006 -0.0020 0.0261

40 0.023 0.014 0.0185 0.0711

50 0.019 0.017 0.0180 0.0700

60 0.008 0.008 0.0080 0.0480

Enzima 10 -0.016 -0.016 -0.0160 -0.0046

comercial
20 0.012 0.019 0.0155 0.0645

30 0.015 0.017 0.0160 0.0656

40 0.004 0.01 0.0070 0.0458

50 0.002 0.005 0.0035 0.0382

60 0.027 0.014 0.0205 0.0754

De acuerdo a los resultados anteriores se construye la siguiente gráfica para visualizar

las concentraciones de azúcares reductores obtenidas por el método de DNS en la
enzima amilasa libre.

19
 Figura 13. Comportamiento de la concentración de azúcares reductores obtenidos enzima libre amilasa
de distintos microorganismo a diferentes temperaturas de incubación.

Esta forma se conoce que los tiempos óptimos de incubación para enzima amilasa
inmóvil son:
● En S. cerevisiae: 40 °C
● En A. niger: 20 °C
● En la enzima comercial (A. oryzae): 60 °C

Por último usando las condiciones óptimas de temperatura y pH, obtenidas en los
ensayos anteriores se llevó a cabo un último ensayo, en el que se varió la
concentración de sustrato usado tanto para la enzima inmóvil como la libre. La
siguiente tabla muestra las concentraciones de azúcares reductores obtenidos para en
ensayo con la enzima inmóvil.

Tabla. Absorbancias y concentraciones de azúcares reductores para determinar la velocidad de

reacción de la enzima inmovilizada de alfa amilasa.
Enzima α-amilasa Concentración de Absorbancia 1 Absorbancia Promedio de Concentración
sustrato (mg/ml) 2 absorbancias (g/L)

0.1 0.040 0.015 0.0275 0.0908

Saccharomyces
cerevisiae 0.5 0.020 0.007 0.0135 0.0601

1.0 0.009 0.013 0.0110 0.0546

2.0 -0.054 -0.041 -0.0475 -0.0737

3.0 0.071 0.004 0.0375 0.1127

4.0 0.094 0.090 0.0920 0.2322

20
 5.0 0.053 0.032 0.0425 0.1237

Aspergillus 0.1 0.008 0.007 0.0075 0.0469

niger
0.5 0.014 -0.016 -0.0010 0.0283

1.0 -0.001 0.002 0.0005 0.0316

2.0 -0.001 -0.001 -0.0010 0.0283

3.0 0.037 0.006 0.0215 0.0776

4.0 0.011 0.001 0.0060 0.0436

5.0 0.053 0.077 0.0650 0.1730

Enzima 0.1 0.006 -0.001 0.0025 0.0360

comercial
0.5 0.006 -0.011 -0.0025 0.0250

1.0 -0.007 0.001 -0.0030 0.0239

2.0 -0.044 -0.032 -0.0380 -0.0529

3.0 -0.050 -0.030 -0.0400 -0.0572

4.0 -0.026 -0.003 -0.0145 -0.0013

5.0 0.031 0.028 0.0295 0.0952

Se realizó el mismo procedimiento para la enzima libre, usando los parámetros óptimos
de temperatura y ph para cada enzima y diferentes concentraciones de sustrato, los
resultados se muestran en la siguiente tabla.

Tabla. Absorbancias y concentraciones de azúcares reductores para determinar la velocidad de

reacción de la enzima libre de alfa amilasa.
Enzima α- Concentració Absorbancia Absorbancia Promedio de Concentración
amilasa n de sustrato 1 2 absorbancias (g/L)
(mg/ml)

0.1 0.001 0.009 0.0050 0.0414

Saccharomyces
cerevisiae 0.5 0.010 0.002 0.0060 0.0436

1.0 0.007 0.007 0.0070 0.0458

2.0 0.015 0.010 0.0125 0.0579

3.0 -0.066 -0.065 -0.0655 -0.1132

21
 4.0 0.001 0.001 0.0010 0.0327

5.0 0.012 0.022 0.0170 0.0678

Aspergillus 0.1 0.003 0.010 0.0065 0.0447
niger
0.5 0.008 0.006 0.0070 0.0458

1.0 0.014 0.020 0.0170 0.0678

2.0 0.010 0.017 0.0135 0.0601

3.0 0.010 0.010 0.0100 0.0524

4.0 0.023 -0.002 0.0105 0.0535

5.0 0.005 0.050 0.0275 0.0908

Enzima 0.1 0.005 -0.009 -0.0020 0.0261
comercial
0.5 0.003 -0.001 0.0010 0.0327

1.0 0.034 0.002 0.0180 0.0700

2.0 0.033 0.021 0.0270 0.0897

3.0 -0.001 0.025 0.0120 0.0568

4.0 0.009 -0.004 0.0025 0.0360

5.0 0.017 -0.001 0.0080 0.0480

● LINEALIZACIÓN Y PARÁMETROS CINÉTICOS

Para obtener los parámetros cinéticos Vmax y Km, se utilizó el modelo de linealización de
Lineweaver-Burk. Para ello, el primer paso fue organizar los datos, por lo que se
construyó la siguiente tabla:

Tabla X. Concentraciones sustrato inicial y final ,teniendo en cuenta los volúmenes

utilizados y empleando la ecuación C1V1=C2V2.
Enzima de: [S] V de S V final (mL) [S] final [P] (mg/mL)
(mg/mL) añadido (mg/mL)
(mL) E. inmóvil E. libre

S. 0.1 0.2 1 0.02 0.0908 0.0414

cerevisiae
0.15 0.2 1 0.03 0.0601 0.0436

22
 1 0.2 1 0.2 0.0546 0.0458

2 0.2 1 0.4 0.0737 0.0579

3 0.2 1 0.6 0.1127 0.1132

4 0.2 1 0.8 0.2322 0.0327

5 0.2 1 1 0.1237 0.0678

A. niger 0.1 0.2 1 0.02 0.0469 0.0447

0.15 0.2 1 0.03 0.0283 0.0458

1 0.2 1 0.2 0.0316 0.0678

2 0.2 1 0.4 0.0283 0.0601

3 0.2 1 0.6 0.0776 0.0524

4 0.2 1 0.8 0.0436 0.0535

5 0.2 1 1 0.173 0.0908

A. oryzae 0.1 0.2 1 0.02 0.036 0.0261

0.15 0.2 1 0.03 0.025 0.0327

1 0.2 1 0.2 0.0239 0.07

2 0.2 1 0.4 0.0529 0.0897

3 0.2 1 0.6 0.0572 0.0568

4 0.2 1 0.8 0.0013 0.036

5 0.2 1 1 0.0952 0.048

donde [S] es la concentración de sustrato utilizada para la reacción, “V de S” se refiere

al volumen de sustrato empleado para dicha reacción, con estos datos y el volumen
final de incubación se obtuvo la concentración final de sustrato resultante en el tubo
eppendorf donde se llevó a cabo la reacción ([S] final) en mg/mL. Además, se
consideró las concentraciones de azúcares reductores obtenidos tanto para la enzima
inmóvil como para la enzima libre, estos datos se indican en las columnas
denominadas [P] (mg/mL).

Posteriormente se procedió a calcular las velocidades iniciales de la reacción, para ello

se consideró la concentración de producto, el tiempo de reacción (15 min.), el factor de
dilución (en este caso fue 10, ya que se tomaron 100 μL para diluirlos hasta 1000 μL y
poder leer su absorbancia), además del volumen final de la muestra (1 mL), por lo que

23
Vo queda expresado como:
[S] X 10 X 1 mL
Vo=
15 min
con unidades de mg/min, por lo que se dividió entre el peso molecular (0.180156
mg/µmo) y así poder tenerlo en unidades de (µmol/min). Además se consideró la
concentración final de sustrato en unidades de µmol/mL.

Tabla X. Velocidades iniciales de la enzima a-amilasa calculadas a distintas concentraciones de

sustrato.
a-amilasa Vo (mg/min) Vo (µmol/min) [S] final
de (µmol/mL)

E. inmóvil E. libre E. inmóvil E. libre

S. 0.06053333 0.0276 0.33600509 0.15320056 0.1110149

cerevisiae
0.04006667 0.02906667 0.22239985 0.16134165 0.16652235

0.0364 0.03053333 0.20204711 0.16948274 1.11014898

0.04913333 0.0386 0.2727266 0.21425875 2.22029796

0.07513333 0.07546667 0.41704597 0.41889622 3.33044695

0.1548 0.0218 0.85925531 0.12100624 4.44059593

0.08246667 0.0452 0.45775143 0.25089367 5.55074491

A. niger 0.03126667 0.0298 0.17355329 0.1654122 0.1110149

0.01886667 0.03053333 0.10472405 0.16948274 0.16652235

0.02106667 0.0452 0.11693569 0.25089367 1.11014898

0.01886667 0.04006667 0.10472405 0.22239985 2.22029796

0.05173333 0.03493333 0.28715854 0.19390602 3.33044695

0.02906667 0.03566667 0.16134165 0.19797657 4.44059593

0.11533333 0.06053333 0.64018591 0.33600509 5.55074491

A. oryzae 0.024 0.0174 0.13321788 0.09658296 0.1110149

0.01666667 0.0218 0.09251242 0.12100624 0.16652235

0.01593333 0.04666667 0.08844187 0.25903476 1.11014898

0.03526667 0.0598 0.19575627 0.33193455 2.22029796

0.03813333 0.03786667 0.21166841 0.21018821 3.33044695

24
 0.00086667 0.024 0.00481065 0.13321788 4.44059593

0.06346667 0.032 0.35228728 0.17762384 5.55074491

Una vez conociendo estos datos se procedió a linealizarlos, de acuerdo al modelo de

Lineweaver- Burk, obteniendo los siguientes resultados.

Tabla X. Parámetros usados en la linealización de Lineweaver- Burk

1/[S] (mL/µmol) 1/Vo (min/(µmol)

E. inmóvil E. libre

9.0078 2.97614537 6.5273913

6.0052 4.49640599 6.19802752

0.90078 4.94934066 5.90030568

0.45039 3.66667571 4.66725389

0.30026 2.39781721 2.38722615

0.225195 1.16379845 8.2640367

0.180156 2.18459175 3.98575221

9.0078 5.76191898 6.04550336

6.0052 9.54890459 5.90030568

0.90078 8.55170886 3.98575221

0.45039 9.54890459 4.49640599

0.30026 3.48239691 5.1571374

0.225195 6.19802752 5.0511028

0.180156 1.56204624 2.97614537

9.0078 7.5065 10.3537931

6.0052 10.80936 8.2640367

0.90078 11.3068619 3.86048571

0.45039 5.10839319 3.01264214

0.30026 4.72437063 4.75764085

25
 0.225195 207.872308 7.5065

0.180156 2.83859244 5.629875

En la siguiente gráfica se puede observar la linealización por Lineweaver-Burk de la

enzima amilasa de S. cerevisiae, se puede inferir que no existe una buena linealización
ya que presenta una R, ya que para ambos casos en muy baja.

Figura 14. Cinética enzimática de la enzima α-amilasa de S. cerevisiae. Linealización por Lineweaver-
Burk.

En el siguiente caso, al igual que el anterior no presenta una buena linealización ya que su
coeficiente de determinación es extremadamente bajo. Además, puede observarse que los
valores inversos de la enzima inmóvil son mayores a los de la enzima libre.

26
 Figura 15. Cinética enzimática de la enzima α-amilasa de A. niger. Linealización por Lineweaver-Burk.

Figura 16. Cinética enzimática de la enzima α-amilasa de A. oryzae. Linealización por Lineweaver-Burk.

De acuerdo al modelos de Lineweaver-Burk

Análogamente, de acuerdo a la ecuación de la recta y=Bx +A, se sabe que

27
 1
y=
Vo
1
x=
[S ]
Km
B=
Vmax
1
A=
Vmax

1
Así, Vmax= y Km=B∗Vmax
A

De esta forma se obtienen los siguientes resultados mostrados en la tabla X.

Tabla X. Parámetros cinéticos obtenidos por la linealización de Lineweaver-Burk de la enzima

α-amilasa.
Enzima obtenida de: Vmax [μmol/min] Km [μmol/mL]

Enzima libre Enzima inmóvil Enzima libre Enzima inmóvil

S. cerevisiae 0.201357 0.349223 0.0373518 0.0366335

A. niger 0.2342304 0.1694915 0.0511559 0.0333051

A. oryzae 0.211211 0.020424 0.126747 0.1107553

De acuerdo a la tabla anterior se puede observar que las valores tanto de Vmax como
de Km son mayores en el caso de la enzima libre (a excepción de la Vmax de S.
cerevisiae).

● ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Los parámetros Km y Vmax cambian de una enzima a otra, proporcionan poca información
respecto al número, velocidad o pasos que se llevan a cabo durante la reacción química entre
la enzima y el sustrato. Según Lehninger, 2006, por lo que se determinó la actividad específica
de cada enzima, para determinar cuál es la más efectiva.
Por lo que se utilizó la fórmula siguiente:

Donde:
m= Pendiente de la recta

28
ε= Coeficiente de extinción molar (cm2 /µmol)
b= Distancia de la celda (1 cm)
V = volumen total del ensayo (volumen final en la celda)
F= Factor de dilución
Enz= volumen de la enzima (mL)

De la Ley de Lambert-Beer:
A =ε I C (µmol/ml)

Donde:
ε= Coeficiente de extinción (cm2 /µmol)
A= Absorbancia
C= Concentración
I= Longitud de la celda (cm)

Discusión.

Efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de la enzima

Conclusión.
Se realizó la cinética enzimática de la enzima alfa-amilasa libre e inmovilizada obtenida
a partir de Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger y Aspergillus oryzae (enzima
comercial proporcionada por el laboratorio). Se realizó la cuantificación de azúcares

29
reductores totales por el método de DNS, y asi determinar determinar el efecto de
diferentes factores como la temperatura, el pH y la concentración de sustrato en la
velocidad de las reacciones enzimáticas. A partir de las condiciones óptimas
encontradas se obtuvo la actividad enzimática de la enzima alfa amilasa.
A partir de los resultados obtenidos se realizó una comparación en cada paso de la
enzima libre e inmovilizada para determinar cual de estas presenta mayor actividad.

Anexos.
● Cálculos para preparar 25 mL de buffer 0.2 M de acetatos a
diferentes pH.
○ pH 3
Ácido ácetico [ C2H4O2 ] pka= 4.76 ρ= 1.05 g/ml PM=60.05 g/mol
Acetato de sodio [NaC2H3O2] PM=136.08 g/mol

0.2 M=[ C2H4O2 ]+ [NaC2H3O2]

[NaC 2 H 3O 2]
pH=pka+ log
[C 2 H 4 O 2]
[NaC 2 H 3O 2]
3=4.76+ log
[C 2 H 4 O 2]
[NaC 2 H 3O 2]
=0.0174
[C 2 H 4 O 2]
[NaC2H3O2]=0.0174[ C2H4O2 ]
0.2 M=[ C2H4O2 ]+0.0174[ C2H4O2 ]
0.2 M=1.0174 [ C2H4O2 ]
[ C2H4O2 ]=0.1966 mol/L(0.025L)(60.05 g/mol)(1 mL/1.05g)=0.2811 mL
136.08 g
[NaC2H3O2]= (0.03 mol /L)(0.025 L)(
1 mol
) =0.01156 g

○ pH 4
[NaC 2 H 3O 2]
4=4.76+ log
[C 2 H 4 O 2]
[NaC 2 H 3O 2]
=0.1738
[C 2 H 4 O 2]

30
[NaC2H3O2]=0.1738[ C2H4O2 ]
0.2 M=[ C2H4O2 ]+0.1738[ C2H4O2 ]
0.2 M=1.1738 [ C2H4O2 ]
[ C2H4O2 ]=0.1704 mol/L(0.025L)(60.05 g/mol)(1 mL/1.05g)=0.2436 mL
136.08 g
[NaC2H3O2]= (0.0296 mol /L)(0.025 L)(
1 mol
) =0.1007 g
○ pH 5
[NaC 2 H 3O 2]
5=4.76+ log
[C 2 H 4 O 2]
[NaC 2 H 3O 2]
=1.7378
[C 2 H 4 O 2]
[NaC2H3O2]=1.7378[ C2H4O2 ]
0.2 M=[ C2H4O2 ]+1.7378[ C2H4O2 ]
0.2 M=2.7378 [ C2H4O2 ]
[ C2H4O2 ]=0.0731 mol/L(0.025L)(60.05 g/mol)(1 mL/1.05g)=0.1044 mL
136.08 g
[NaC2H3O2]= (0.1270 mol /L)(0.025 L)(
1 mol
) =0.4320 g
○ pH 6
[NaC 2 H 3O 2]
6=4.76+ log
[C 2 H 4 O 2]
[NaC 2 H 3O 2]
=17.378
[C 2 H 4 O 2]
[NaC2H3O2]=17.378[ C2H4O2 ]
0.2 M=[ C2H4O2 ]+17.378[ C2H4O2 ]
0.2 M=18.378 [ C2H4O2 ]
[ C2H4O2 ]=0.0109 mol/L(0.025L)(60.05 g/mol)(1 mL/1.05g)=0.1560 mL
136.08 g
[NaC2H3O2]= (0.1894 mol / L)(0.025 L)(
1mol
) =0.6433 g
○ pH 7
[NaC 2 H 3O 2]
7=4.76+ log
[C 2 H 4 O 2]
[NaC 2 H 3O 2]
=173.78
[C 2 H 4 O 2]
[NaC2H3O2]=173.78[ C2H4O2 ]
0.2 M=[ C2H4O2 ]+173.78[ C2H4O2 ]
0.2 M=174.78 [ C2H4O2 ]
[ C2H4O2 ]=(0.00115) mol/L(0.025L)(60.05 g/mol)(1 mL/1.05g)=0.00163 mL
−3 136.08 g
[NaC2H3O2]= (3.4 x 10 mol / L)(0.025 L)(
1mol
) =0.6765 g

○ pH 8

31
 [NaC 2 H 3O 2]
8=4.76+ log
[C 2 H 4 O 2]
[NaC 2 H 3O 2]
=1737.8008
[C 2 H 4 O 2]
[NaC2H3O2]=1737.8008[ C2H4O2 ]
0.2 M=[ C2H4O2 ]+1737.8008[ C2H4O2 ]
0.2 M=1738.8008 [ C2H4O2 ]
[ C2H4O2 ]=1.15 x 10−4 mol /L )(0.025L)(60.05 g/mol)(1 mL/1.05g)= 1.64 x 10−4 mL
¿
136.08 g
[NaC2H3O2]= (0.1998 mol /L)(0.025 L)( 1 mol ) =0.6797g

Cuestionario Pre-laboratorio
1. Define enzima.
Las enzimas son proteínas que participan en lograr cambios y transformaciones de otras
substancias. Por ejemplo hay una enzima que transforma el colesterol y lo convierte en la
hormona estrógeno. (Suárez, F. 2006).

2. Define actividad enzimática

Actividad que realizan las enzimas, la sustancia sobre la cual actúa una enzima se llama
sustrato.
Los sustratos son específicos para cada enzima:
La sacarosa es el sustrato de la sacarasa que actúa rompiéndola en sus componentes.
Las enzimas actúan de acuerdo con la siguiente secuencia: La enzima (E) y el sustrato
(S) se combinan para formar un complejo intermedio enzima sustrato (E-S), el cual se
descompone formando un producto y regenerando la enzima. (Martínez, J. 2014)

32
3. Enlista los tipos de enzimas de acuerdo a su actividad.

Tipo de enzimas Actividad

Hidrolasas Catalizan reacciones de hidrólisis. Rompen las biomoléculas

con moléculas de agua. A este tipo pertenecen las enzimas
digestivas.

Isomerasas
Catalizan las reacciones en las cuales un isómero se
transforma en otro, es decir, reacciones de isomerización.

Ligasas Catalizan la unión de moléculas.

Liasas Catalizan las reacciones de adición de enlaces o eliminación,

para producir dobles enlaces.

Oxidorreductasas Catalizan reacciones de óxido-reducción. Facilitan la

transferencia de electrones de una molécula a otra. Ejemplo; la
glucosa, oxidasa cataliza la oxidación de glucosa a ácido
glucónico.

Tansferasas Catalizan la transferencia de un grupo de una sustancia a otra.

Ejemplo: la transmetilasa es una enzima que cataliza la
transferencia de un grupo metilo de una molécula a otra.
(Martínez, J. 2014)
4. Menciona tres bioprocesos de producción de enzimas
● Fermentación sumergida
● Biosíntesis de las enzimas pectolíticas a partir de hongos Aspergillus niger y Aspergillus
foetidus.
● Fermentación en estado sólido

5. ¿Cuál es la importancia de la determinación de actividad enzimática?

Las aplicaciones de la determinación de actividad enzimática abarcan grandes campos uno de
ellos es la salud.
Importancia clínica: alteración de la actividad enzimática asocia a un proceso patológico
(Escuela de Tecnología Médica Universidad de Chile. 2007).

Cuestionario post-laboratorio
1. ¿Cómo afecta la temperatura la cinética de una enzima?
Incremento de la velocidad con la temperatura: En general, la velocidad de la reacción
se incrementa con la temperatura hasta que un punto máximo es alcanzado. Este incremento

33
se debe a que aumenta el número de moléculas ricas en energía que pueden pasar la barrera
energética de estado de transición, para formar a los productos.
Decremento de la velocidad con la temperatura: la elevación excesiva de la temperatura
del medio que contiene a las enzimas, resulta en un decremento de la velocidad como
resultado de la desnaturalización, es decir, la pérdida de la estructura tridimensional de las
enzimas.

Figura 1. Dependencia de la actividad enzimática con la temperatura

(Vazquez, E. 2003)

2. ¿Cómo altera el pH lo valores de Km y Vmax?

Sabiendo que las enzimas son proteínas, cualquier cambio brusco de pH puede alterar el
carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las
propiedades catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalización
de la enzima y en consecuencia su inactivación. La fosfatasa ácida es más activa a pH 5,0,
mientras que la fosfatasa alcalina lo es a pH 9,0. Muchas enzimas tienen máxima actividad
cerca de la neutralidad en un rango de pH de 6 a 8.
El pH per se no afecta la actividad enzimática, sino la concentración de protones. Los protones
además de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar también en la
reacción como substrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta
directamente la velocidad de la reacción.

Figura 2. Efecto del pH en los valores de Km y Vmax (Vazquez, E. 2003)

3. ¿Porqué se realiza la linealización de la ecuación de Michaelis-Menten?

Para explicar la mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas. En este modelo leia
enzima se combina reversiblemente con su substrato para formar el complejo enzima-sustrato
(ES) que subsecuentemente se rompe para formar el producto, hecho que regenera a la
enzima. El modelo para una molécula de sustrato se muestra a continuación(Vázquez, E.
2003).

34
4. ¿De qué dependen los valores de las constantes cinéticas en una reacción
enzimática?
En el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos
casos extremos:
● A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S]. Como los
términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante,
kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reacción es
un proceso cinético de primer orden.
● A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k 3 [ET]. La velocidad de
reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es
un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k 3 como [ET] son constantes, y nos
permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (V max): Vmax = k3
[ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se
encuentra unido al sustrato.(Vazquez, E. 2003)

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