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Objetivos
Aspectos teóricos
La fotocolorimetría sirve para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el curso
de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática. La técnica consiste en medir la
intensidad de luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solución coloreada de uno o varios
compuestos. La absorción máxima ocurre a una longitud de onda () característica para cada
compuesto y la intensidad de la energía absorbida a esa longitud de onda, varía proporcionalmente
con la concentración del compuesto en una solución. Aunque pareciera estar restringido a
sustancias coloreadas, también puede extenderse a compuestos incoloros si se hacen reaccionar
con una especie que genere un producto coloreado.
Espectro electromagnético
Cuando una molécula absorbe radiación ultravioleta (U.V) o visible se excitan los electrones de
valencia que ocupan orbitales moleculares: sigma () o simples, pi () o dobles y triples y eta () o
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electrones no enlazados. Al absorber un fotón de energía, el electrón puede ocupar un orbital
superior denominado “orbital antienlazante, (*)” generándose una de las siguientes transiciones:
Estas transiciones requieren diferente cantidad de energía y por lo tanto diferente longitud de onda.
El contenido energético de una radiación es inversamente proporcional a su longitud de onda:
E = h = hc/
= frecuencia de la radiación
h = constante de Planck
Las transiciones señaladas, que son las que normalmente pueden ocurrir en los compuestos
orgánicos, tienen el siguiente orden de acuerdo con su energía o longitud de onda:
La transición que ocurre más fácilmente (menor diferencia de energía) es la - *, y la que mas
difícilmente ocurre es la - *. Las transiciones - * son las que frecuentemente ocurren en
compuestos saturados y son poco útiles para fines analíticos debido a que requieren mucha energía.
Las transiciones - * son las características de los compuestos insaturados (alquenos, alquinos,
cetonas, aldehídos, ácidos carboxílicos, aromáticos), sobre todo cuando tienen dobles enlaces
conjugados. Cuando esto ocurre, la transición es más fácil (menos energía) y la longitud de onda va
aumentando, hasta llegar a la región visible del espectro (400 -800 nm), que es donde absorben las
sustancias coloreadas.
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Las transiciones - * y - * ocurren en las moléculas que tienen pares de electrones libres y
aunque son relativamente poco energéticas, su probabilidad es baja; por ello son poco útiles en el
campo analítico.
En los iones y complejos coloreados de los metales de transición (Co, Ni, Cu, Cr, Fe, Zn, etc.), las
moléculas que se acomplejan al ion metálico dividen a los orbitales “d” del ion en dos grupos: de alta
y baja energía, lo que permite que los electrones de los orbitales “d” de baja energía se promueven
a orbitales “d” de alta energía cuando la molécula absorbe radiación visibles.
Espectro de absorción
Para saber con precisión la energía (o la ) de la transición (o transiciones) que ha ocurrido en una
molécula cuando se irradia con luz U.V. o visible, se debe hacer una gráfica que relacione la
intensidad de energía que se va absorbiendo a medida que se hace un barrido por la región del
espectro que nos interesa (U.V., visible o ambos). Esta gráfica se llama espectro de absorción, y
a partir de ella se puede deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor
intensidad la energía, es decir, donde ocurre la transición electrónica. El conocimiento de la de
máxima absorción facilita la detección de la sustancia ya sea para determinar su concentración o
para seguirle la huella en experimentos de tipo cinético.
La intensidad de la energía absorbida por una especie depende del número de moléculas que sufren
la transición electrónica a la seleccionada, y ese número de moléculas depende a su vez de la
concentración de la especie y de la longitud de la celda que la contiene:
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Esta expresión se vuelve una igualdad cuando se introduce una constante de proporcionalidad “”:
A = x c x l (ley de Beer-Lambert)
Se denomina coeficiente de extinción molar o absortividad molar, con unidades M-1cm-1. Es una
constante para cada especie que absorba energía en la región U.V.-visible, y su valor indica la
probabilidad de que la transición electrónica ocurra.
A/C = x l = constante
La expresión se puede aplicar tanto a la muestra patrón como a la muestra problema, así:
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Cuantificación de proteínas
Las proteínas se pueden cuantificar por diversos métodos con base en sus propiedades, por ejemplo,
los patrones de absorción de las radiaciones electromagnéticas de los grupos aromáticos, la
reactividad del enlace peptídico o su contenido de nitrógeno, entre otras. En la reacción de Biuret las
sustancias que contengan dos ó más enlaces peptídicos, interaccionan con sales de cobre en
soluciones alcalinas, formando un complejo púrpura-violeta, como muestra la siguiente figura. Dicho
complejo se cuantifica espectroscópicamente utilizando como base una curva patrón de proteína.
H H
O
N N N
O O O
C C C
2 2+ 2+
Cu
+ Cu + 2 H2O
CH CH CH
R R R
N N N
O
Cadena peptídica H H
Complejo color violeta
Espectrofotómetros
En el espectrofotómetro la luz de una fuente continua (lámpara de tungsteno para el visible y lámpara
de deuterio para el ultravioleta), pasa a través de un monocromador que selecciona una banda
estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Las longitudes seleccionadas atraviesan la
muestra contenida en una cubeta de vidrio o cuarzo de espesor definido (l). Finalmente, se mide la
potencia radiante de la luz que sale.
Materiales:
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Fotocolorímetro Beaker
Celdas del fotocolorímetro Frasco lavador
Tubos de ensayo grandes
Sustancias:
Sección experimental
Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo las
recomendaciones anotadas a continuación:
b. Prepare dos celdas o tubos con suficiente solución (aproximadamente hasta los ¾),
utilizando en una, agua destilada y en la otra una solución de gelatina coloreada con el
reactivo de Biuret.
c. Observe que los tubos con las soluciones no tengan burbujas, límpielos externamente
con un papel o tela adecuada.
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e. Coloque el tubo con la solución problema y anote la absorbancia indicada en el
instrumento.
420 540
440 560
460 580
480 600
500 620
520
h. Dibuje una gráfica de absorbancia vs. longitud de onda. La curva obtenida corresponde
al espectro para la estructura del complejo proteínico formado por el reactivo de Biuret.
Observe que se presentará una longitud de onda en la cual habrá una mayor absorción.
Esta longitud de onda debe ser una constante, la cual será tenida en cuenta para
posteriores análisis de proteína.
a. Rotule 9 tubos de ensayo y llénelos con las soluciones que se indica en la tabla siguiente:
TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7 8
Solución Salina 2,0 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 0,8 1,5 1,0
Absorbancia
Concentración
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b. Agregue en cada tubo 4 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y deje en reposo durante 15
minutos.
Preguntas
6. ¿Por qué razón se eligió una sola longitud de onda para hacer todas las mediciones de la curva
de absorción?
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CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Objetivos
1. Separar en una muestra de suero sanguíneo, las globulinas de las proteínas totales.
Aspectos teóricos
Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en las células ya que son fundamentales
en todos los aspectos de la estructura y función celular, constituyen el 50% ó más de su peso seco.
Existen muchas clases de proteínas, especializadas en funciones biológicas tan diferentes como el
transporte y almacenamiento de moléculas pequeñas, la organización estructural de las células y los
tejidos, la contracción muscular, la respuesta inmunitaria, la coagulación de la sangre y la catálisis
de cientos de reacciones metabólicas. Además la información genética es expresada en su mayor
parte por las proteínas. La estructura de las proteínas, así como su relación con su función biológica
y actividad constituyen problemas centrales de la bioquímica actual.
a. Según su composición
Las proteínas se clasifican en dos tipos importantes. Las proteínas simples, que solo producen
aminoácidos cuando se hidrolizan; las proteínas conjugadas, producen otros compuestos además
de los aminoácidos como carbohidratos, grasas o ácidos nucleicos.
Las proteínas se clasifican según su forma tridimensional en: las proteínas fibrosas, consisten en
cadenas de polipéptidos, arreglados lado a lado en largos filamentos. Debido a que estas proteínas
son correosas e insolubles en agua, en la naturaleza sirven para construir materiales estructurales
como tendones, pezuñas, cuernos y músculos. Las proteínas globulares, en cambio suelen estar
enrolladas en forma semiesférica y compacta. Estas proteínas son por lo general solubles en agua
y se mueven dentro de las células. La mayor parte de los varios millares de enzimas conocidas son
proteínas globulares. Otros ejemplos, son la insulina y la hemoglobina.
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c. Según su solubilidad
Según este parámetro, las proteínas reciben algunos de los siguientes nombres:
La sangre es el tejido líquido que circula dentro de los vasos sanguíneos, compuesto casi en la mitad
de su volumen por células como los glóbulos rojos o eritrocitos, glóbulos blancos o leucocitos,
plaquetas o trombocitos y por el plasma, que es la porción no celular y que es el líquido que mantiene
a las células en suspensión.
Cuando la sangre se coagula, aparece un líquido remanente que se llama suero, y que se diferencia
del plasma porque ya no contiene los factores de coagulación como la proteína fibrinógeno.
Aunque el plasma sanguíneo contiene una compleja mezcla de sustancias solubilizadas, sus
proteínas representan el 75% de ellas, y una concentración que oscila entre 6 y 8 g por cada 100 mL
de suero. Las principales proteínas del suero sanguíneo son:
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Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a
las infecciones. Es un conjunto heterogéneo de proteínas que alcanzan una concentración
en la sangre entre 3 y 3.5 gr por 100 mL, y que a veces se designan como: , y -globulinas.
Para preparar extractos proteínicos a partir del medio celular se han desarrollado técnicas basadas
en las diferencias que presentan las proteínas en cuanto a tamaño, carga, masa, solubilidad y
afinidad por otras moléculas. Estás técnicas son: la centrifugación, la electroforesis, la cromatografía,
la diálisis, ultrafijación y diferencias en la solubilidad en diferentes medios.
En esta práctica se usan las técnicas de centrifugación y fotocolorimetría para separar y definir la
concentración de albúmina y globulinas en el suero sanguíneo. El empleo del reactivo de biuret en
soluciones con concentraciones diferentes de proteínas, permitirá medir la absorbancia para cada
concentración. La determinación precisa de éstas se podrá deducir del dato de absorbancia de una
solución patrón (con concentración conocida) de proteína, de la siguiente manera:
Materiales:
Fotocolorímetro Beaker
Celdas del fotocolorímetro Frasco lavador
Tubos de ensayo grandes Centrífuga
Reactivos:
11
Sección Experimental
c. Deje reposar durante 15 minutos la solución obtenida en b. Luego centrifugue a 3500 r.p.m,
por espacio de 15 minutos. El precipitado obtenido corresponde a las globulinas.
a. Disponga de 4 tubos de ensayo y prepare en cada uno de ellos las soluciones, como se
indica en la siguiente tabla:
Solución 1,0
salina
Solución 1,0
patrón
Solución de 1,0
globulinas
12
Solución de 4,0 4,0 4,0 4,0
Biuret
c. Lleve cada uno de los tubos al fotocolorímetro, fijado en una longitud de onda de 540
nm. Luego de una previa calibración con el blanco, anote los resultados de absorbancia
registrados en el instrumento.
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos con metales 1
Resultados
Cf = CiVi/Vf
Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón con las de proteínas totales y
calcule el porcentaje de estas últimas:
Sin embargo, esta concentración corresponde a 1 mL de solución de suero sanguíneo, el cual fue
diluido primero 20 veces y luego 5 veces de manera que el resultado final debe ser:
Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón y de albúmina obtenida con el
porcentaje de la solución patrón y calcule el porcentaje de la solución de globulinas:
1 Los residuos de suero sanguíneo se depositan en un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio
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Sin embargo esta concentración corresponde a la solución de globulinas preparada según la tabla
5-1, la cual fue obtenida por dilución 1:5:5. En esta forma la solución original del suero sanguíneo
debe tener una concentración 25 veces mayor, o sea:
Preguntas
1. Compare los porcentajes hallados para las globulinas y la albúmina, con los reportados como
normales para el suero. ¿Existen diferencias? ¿Por qué?
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TIROSINASA I: Efecto de la concentración de enzima, del pH y de la Temperatura
sobre la Actividad Enzimática
Objetivos
Aspectos teóricos
Catálisis enzimática.
Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentan las velocidades de las reacciones
bioquímicas. Estas son altamente específicas, esto significa que una enzima solo actúa en
determinadas moléculas, denominadas sustratos mientras dejan el resto del sistema sin afectar. Se
ha calculado que una célula viva puede contener en promedio alrededor de 3000 enzimas diferentes,
cada una de las cuales cataliza una reacción específica en la que un sustrato se convierte en los
productos adecuados. La catálisis enzimática es homogénea porque el sustrato y la enzima están
presentes en disolución acuosa.
Una enzima es una molécula grande de una proteína que contiene uno o más sitios activos, donde
se llevan a cabo las interacciones con los sustratos. Estos sitios, en forma estructural, son
complementarios de las moléculas de un sustrato específico, como se muestra en la siguiente figura:
Pardeamiento enzimático
La coloración café oscuro que se va formando en la superficie de algunas frutas y vegetales cuando
se cortan, se denomina pardeamiento, y se debe a la acción de la enzima tirosinasa, que es una
monofenoloxidasa, sobre el aminoácido tirosina, que en presencia de oxígeno, se convirte
secuencialmente en dopa, dopaquinona y dopacromo (café oscuro), hasta terminar en melanina un
pigmento muy oscuro.
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COOH HO COOH O COOH
Tirosinasa Tirosinasa
O2 NH2 O2 NH2
NH2
HO HO O
DOPA Dopaquinona
Tirosina
N O
O CO2 O
COOH
O
O N N
O
O H Dopacromo H
O N
H
Melanina
En esta práctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de varias fuentes vegetales (banano,
manzana y papa), y ponerla a reaccionar con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el
compuesto L-metildopacromo, que es de color café oscuro y se puede seguir
fotocolorimétricamente a una de 420 nm, donde presenta su máxima absorción.
CH3 O
Tirosinasa CH3
HO COOH
COOH
O2
O N
NH2
HO
L-metildopacromo H
L-metildopa (incolora) (café oscuro)
La medida de la absorbancia a través del tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reacción
en términos de la cantidad de L-metildopacromo que se va formando, o la de L-metildopa que
va reaccionando:
Se conoce como extracto enzimático a una fracción de material animal, vegetal o microbiano,
que contiene una mezcla de sustancias y se caracteriza por presentar actividad de una o varias
enzimas
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Las velocidades de varias reacciones enzimáticas se pueden usar para comparar la eficiencia
de las enzimas involucradas cuando se expresan en términos de la cantidad usada de éstas.
Ello significa que:
Este valor representa las moles de soluto transformadas en producto por un mol de enzima en
la unidad de tiempo. Esto recibe el nombre de actividad molar de la enzima.
Si no se conoce las cantidades exactas de las enzimas empleadas, se puede usar como factor
de comparación el volumen de los extractos enzimáticos preparados en condiciones similares;
no se podrá hablar de actividad molar, sino simplemente de actividad enzimática:
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Las enzimas son macromoléculas proteínicas cuya actividad catalizadora se ve influenciada por
factores como: concentración del sustrato o de la enzima, cofactores, inhibidores y efectores, la
temperatura y el pH.
Para visualizar las condiciones para el óptimo funcionamiento de una enzima, se tendrá que proceder
a la evaluación de su actividad catalítica, ya sea midiendo la velocidad inicial de la reacción
enzimática en función de uno de los parámetros mencionados anteriormente, o determinando la
presencia o ausencia de un sustrato o de un producto de la reacción, a medida que se varía uno de
los parámetros.
La mayoría de las enzimas poseen un pH al cual su actividad es máxima; por encima o por debajo
de ese pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en función del pH
de muchas enzimas son acampanados, pueden cambiar considerablemente de forma, como se
muestra en la figura siguiente:
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Del gráfico podemos observar que existe un pH (o un rango de pHs) en el cual la actividad de la
enzima es máxima:
Al igual que ocurre con la mayoría de reacciones químicas, la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas se incrementa en con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable
y permanece totalmente activa. La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica,
aproximadamente, por cada 10 ºC de aumento de la temperatura.
Aunque las reacciones catalizadas por las enzimas parecen, con frecuencia, poseer una temperatura
óptima, como muestra la figura siguiente, el pico que se observa al representar la actividad catalítica
frente a la temperatura se produce porque las enzimas se desnaturalizan por la acción del calor y se
inactivan cuando la elevación de la temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura
óptima es, por lo tanto, la resultante de dos procesos:
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El incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura, y,
El incremento en la velocidad de desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar una
temperatura crítica.
Materiales:
Reactivos:
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Sección Experimental
Nota: esta práctica está dividida en cuatro partes, se recomienda que la parte A y B la realice todo
el grupo, y la C y D se distribuya en dos equipos y al final se compartan los resultados.
A. Extracción de la enzima
b. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta
sólida.
e. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta
solución como extracto diluido 10 veces. Rotule esta solución como extracto enzimático.
1 mL de extracto enzimático
3 mL de buffer pH = 7.2
1 mL de solución de L-metildopa
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d. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo en el
fotocolorímetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.
f. Repita los pasos c hasta e en otros 3 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de solución
de extracto enzimático de la siguiente manera:
Tiempo (seg)/Tubo 1 2 3 4
Absorbancia
0.0
20
40
60
80
100
120
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a. En un tubo de ensayo adicione 1.0 mL de extracto de enzima y 3.0 mL de solución de buffer
pH = 7.2
20
40
60
80
100
120
e. Repita el procedimiento anterior pero utilice primero un baño de hielo a 2oC y después en un
baño de agua hirviendo a 95 oC. Tabule sus resultados en la tabla anterior.
a. Marque 8 tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos lo que muestra la siguiente
tabla:
Tubo B1 A1 B2 A2 B3 A3 B4 A4
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Buffer pH 3.0 4 3
Buffer pH 5.0 4 3
Buffer pH 9.0 4 3
Buffer pH 10.0 4 3
Extracto 1 1 1 1 1 1 1 1
Tiempo (min)/Tubo A1 A2 A3 A4
Absorbancia
0.0
20
40
60
80
100
120
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Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos no halogenados
Resultados
Absorvancia
A2
A2 - A1
m=
t2 - t1
A1
t1 t2 tiempo
d. Analice la actividad enzimática del tubo 1 en la primera parte con los obtenidos con
cambio de la temperatura (haga el grafico de actividad enzimática vs temperatura) ¿cuál
es la explicación?
Nota 1: para el cálculo de las pendientes utilice como último valor el punto máximo de absorción y
los valores anteriores a este.
25
Nota 2: tome como valor de temperatura para el tubo 1, 25 oC.
e. Analice la actividad enzimática del tubo 1 en la primera parte con los obtenidos con cambio del pH
(haga el grafico actividad enzimática vs pH) ¿cuál es la explicación?
Nota 3: tome los valores de pH de las soluciones buffer utilizadas y asuma que no hay un cambio
significativo en el valor de pH cuando se preparan las soluciones.
Preguntas
1. Cuando se trabaja con manzana el extracto no es recomendable diluirlo ¿Por qué?
3. ¿Qué se podrá recomendar (y que no se podrá recomendar), para evitar el pardeamiento de las
frutas y las papas cortadas?
Referencia
Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical
Education, 54, 4, 1977, p: 257.
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TIROSINASA II: Determinación de la constante Michaelis-Menten y la velocidad máxima
Objetivos
Aspectos teóricos
Cinética química
Las reacciones químicas pueden clasificarse sobre una base cinética por el orden de reacción, entre
estas tenemos: reacciones de orden cero, de primer orden, de segundo orden y de tercer orden,
según como resulte influida la velocidad de la reacción por la concentración de los reaccionantes
bajo un conjunto de condiciones determinado como son la temperatura y la adición de catalizadores.
Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad directamente proporcional
a la concentración de un reaccionante. El ejemplo más sencillo es cuando la velocidad de la reacción:
A B
es directamente proporcional a la concentración de A. En este caso la velocidad de la reacción en
cualquier tiempo t, viene dada por la ecuación:
-d [A] / dt = k [A]
y = m x + b
donde ln es el logaritmo natural, [A]0 y [A] son las concentraciones de A a los tiempos t = 0 y t = t,
respectivamente. Debe aclararse que t = 0 no corresponde al principio del experimento; puede
seleccionarse cualquier tiempo para empezar a medir el cambio en la concentración de A. Por lo
27
tanto, una gráfica de ln [A] contra t es una línea recta con una pendiente –k. Este análisis gráfico
permite calcular la constante de velocidad k, como se muestra en la figura siguiente:
Para una reacción de primer orden, el tiempo de vida media viene dado por la siguiente expresión:
t ½ = 0.693 / k
la anterior ecuación indica que la vida media de una reacción de primer orden es independiente de
la concentración inicial del reactivo.
Una reacción de segundo orden es una reacción cuya velocidad depende de la concentración de
uno de los reactivos, elevada a la segunda potencia o de la concentración de dos reactivos
diferentes, cada uno elevado a la primera potencia. El caso más sencillo comprende solo una clase
de molécula como reactivo:
2A C
- d [A] / dt = k [A]2
Por medio del cálculo, se puede obtener la siguiente expresión para la ecuación anterior:
1 1
= + kt
[A] [A]0
por lo tanto, una gráfica de 1/[A] contra t, es una línea recta con una pendiente k, como se observa
en la siguiente figura.
1/[A]
k
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Otro tipo de reacción de segundo orden es:
A + B C
la reacción es de primer orden respecto de A y de primer orden respecto de B, por lo que tiene un
orden global de 2.
Observe que la vida media de una reacción de segundo orden es inversamente proporcional a la
concentración inicial del reactivo. Las mediciones de la vida media a diferentes concentraciones
iniciales es una forma de distinguir entre una reacción de primer orden y una de segundo orden.
Las reacciones de tercer orden, que son relativamente escasas, son aquellas cuya velocidad es
proporcional al producto de tres términos de concentración. Algunas reacciones químicas son
independientes de la concentración de cualquier reactivo; son llamadas reacciones de orden cero.
En este caso, la velocidad depende de la concentración del catalizador o de algún otro factor distinto
a la concentración de las especies moleculares que experimentan la reacción.
Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las
reacciones catalizadas por los enzimas, pero éstas muestran también un rasgo característico, que
no se observa en las reacciones no enzimáticas: la saturación con el sustrato. En la figura siguiente
vemos el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por un
enzima.
29
A una concentración baja de sustrato, la velocidad inicial o de la reacción es casi
proporcional a la concentración del sustrato y la reacción, por tanto, es aproximadamente de primer
orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentración de sustrato aumenta, la
velocidad inicial de la reacción disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la
concentración de sustrato; en esta zona el orden de reacción es mixto.
Con un aumento posterior de la concentración del sustrato, la velocidad de la reacción llega a ser
esencialmente independiente de la concentración de sustrato y se aproxima asintóticamente a una
velocidad constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reacción es esencialmente
de orden cero con respecto al sustrato, y se dice que el enzima se halla saturado con su sustrato.
Todos los enzimas muestran el efecto de saturación pero varían ampliamente con respecto a la
concentración de sustrato que se necesita para que se manifieste la saturación.
L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron una teoría general acerca de la acción y cinética de los
enzimas. Esta teoría que es fundamental para el análisis cualitativo de todos los aspectos de la
cinética e inhibición de los enzimas, se ha desarrollado para el caso sencillo de una reacción en la
que sólo hay un sustrato.
La teoría de Michaelis-Menten supone que el enzima E se combina en primer lugar con el sustrato
S para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuación este último se divide en una segunda
etapa, para formar enzima libre y el producto P:
k1
E + S ES
k-1
k2
ES E + P
30
vo = Vmax [S]
KM + [S]
KM = constante de Michaelis-Menten
1 KM 1
= + 1
v0 Vmáx [S] Vmáx
31
Tal representación doble recíproca tiene la ventaja de que permite una determinación mucho más
exacta del valor de Vmax, ya que en la representación sencilla de 0 frente a [S] sólo se obtiene su
valor aproximado, sin embargo, presente la desventaja de tener que extrapolar para encontrar el
valor de KM.
Otra transformación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene al multiplicar esta por Vmáx,
y de un posterior reagrupamiento se obtiene la siguiente ecuación:
v0 = -KM v0
+ Vmáx
[S]
Materiales:
Fotocolorímetro Beaker
Celdas del fotocolorímetro Frasco lavador
Tubos de ensayo grandes Centrífuga
Mortero Lienzo
Sílica gel
Sustancias:
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Sección experimental
1. Extracción de la enzima
b. Adicione unos 3 g de sílica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida.
e. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta
solución como extracto diluido 10 veces.
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f. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato
de la siguiente manera:
t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Resultados
[S]f = v1 [S]i
v2
34
Donde: [S]f = concentración final del sustrato
d. Haga una gráfica de Vi vs [S] y de 1/Vi vs 1/[S] y de esta determine los valores de
KM y Vmax.
f. Compare los valores obtenidos por los tres métodos y determine cuál es el más
apropiado, explique.
35
TIROSINASA III: Efecto de un inhibidor sobre la constante Michaelis-Menten y la velocidad
máxima
Objetivos
Aspectos teóricos
Los enzimas catalizan todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los
inhibidores enzimáticos se encuentren entre los agentes farmacéuticos más importantes. Por
ejemplo, la aspirina (ácido acetilsalicílico) inhibe el enzima que cataliza el primer paso de la síntesis
de prostaglandinas.
Un tipo de inhibición reversible común es el que se denomina competitivo, como muestra la siguiente
figura:
Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo del enzima pero la reacción no
tiene lugar cuando se ha fijado el inhibidor (I). Mientras el inhibidor ocupa el sitio activo impide la
fijación del sustrato. Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen
al sustrato y que se combinan con el enzima formando el complejo EI. Debido a que el inhibidor se
une de manera reversible al enzima, se puede cambiar el sentido de la competición en favor del
sustrato añadiendo más de este.
36
Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor
por lo que la reacción muestra una Vmáx normal. No obstante, la [S] a la cual Vo = ½ Vmáx, la KM,
aumenta en presencia del inhibidor. Este efecto sobre la Vmáx es diagnóstico de inhibición
competitiva, y se pone de manifiesto fácilmente en una gráfica de LineWeaver–Burk. La constante
de equilibrio para la fijación del inhibidor, KI, puede obtenerse a partir de la misma gráfica.
La inhibición competitiva se utiliza en terapéutica para pacientes que han ingerido metanol, un
componente del los licores adulterados y disolvente que se utiliza como anticongelante. El metanol
se convierte en formaldehído por acción de la enzima alcohol deshidrogenada. El formaldehído
lesiona muchos tejidos, siendo la ceguera un resultado frecuente debido a que los ojos son
especialmente sensibles al mismo. El etanol compite de manera efectiva con el metanol como
sustrato de la alcohol deshidrogenasa. La terapia para el envenenamiento por metanol es la infusión
intravenosa de etanol, la cual hace que la formación de formaldehído sea suficientemente lenta para
que la mayor parte del metanol se pueda excretar inocuamente por la orina.
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La fijación del inhibidor no bloquea la fijación del sustrato (y viceversa). El enzima se inactiva cuando
se ha fijado el inhibidor tanto si el sustrato está presente como si no lo está. El inhibidor disminuye
de manera efectiva la concentración del enzima activo por lo que decrece la Vmax. Frecuentemente
el efecto sobre KM es nulo
Inhibición Acompetitiva
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Los inhibidores irreversibles son los que se combinan con un grupo del enzima que es esencial para
su actividad o lo destruyen. Es frecuente la formación de un enlace covalente entre un inhibidor
irreversible y una enzima.
En la siguiente tabla se resumen los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de
Lineweaver-Burk, 1/V0 frente a 1/[S].
Materiales:
Fotocolorímetro Beaker
Celdas del fotocolorímetro Frasco lavador
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Tubos de ensayo grandes Centrífuga
Mortero Lienzo
Sílica gel
Sustancias:
Sección experimental
1. Extracción de la enzima
b. Adicione unos 3 g de sílica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida.
e. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta
solución como extracto diluido 10 veces.
40
1.0 mL de extracto de enzima
4 gotas de solución de NaCN
3.3 mL de buffer pH = 6.0
0.5 mL de solución de L-metildopa
f. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato
de la siguiente manera:
t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
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Resultados
[S]f = v1 [S]i
v2
d. Haga una gráfica de Vi vs [S] y de 1/Vi vs 1/[S] y de estas determine los valores de
KM y Vmax.
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e. Compare los valores obtenidos por ambos métodos y con los obtenidos en ausencia
de inhibidor (Tirosinasa II); determine el tipo de inhibidor.
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UREASA I y II
Objetivos
Materiales
1- Mortero
2- Trozo de Tela
3- Baño María
4- Probeta 10 ml
5- Tubos de ensayo
6- Erlemeyers
7- Soporte universal
8- Pinza mariposa
9-
Procedimiento
1. Obtención de la ureasa
Colocar en un mortero FRIO: 5 g de soya en grano remojada desde el día
anterior
2. Agregar 20 ml de NaCl 0.9% y triturar
3. Luego filtre la suspensión con el trozo de tela y deposite el fluido resultante
en una probeta
4. Complete hasta 25 ml de volumen final con NaCl 0.9%
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5. Llene un tubo Falcon de 15 ml y centrifuge por 5 min a 2500 rpm
6. Decante el sobrenadante (liquido) en un tubo limpio (Solución de ureasa)
Ureasa I
Determinar el pH óptimo de la Ureasa
Preparación de los tubos Blanco
1. Adicione las siguientes cantidades
Solución/TUBO 1 2 3 4
Urea 0.25M 5 5 5 5
Solución/TUBO 1 2 3 4
Urea 0.25M 5 5 5 5
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UREASA II
Solución/Tubo Blanco 1 2 3 4 5 6 7
47
7
48