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FOTOCOLORIMETRÍA Y CURVA DE CALIBRACIÓN

Objetivos

1. Analizar los principios básicos de la fotocolorimetría


2. Determinar el espectro de absorción de un compuesto coloreado
3. Seleccionar la longitud de onda óptima o de máxima absorción
4. Realizar la curva de calibración para una solución de proteína
5. Calcular concentraciones desconocidas de muestras de proteínas

Aspectos teóricos

La fotocolorimetría sirve para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el curso
de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática. La técnica consiste en medir la
intensidad de luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solución coloreada de uno o varios
compuestos. La absorción máxima ocurre a una longitud de onda () característica para cada
compuesto y la intensidad de la energía absorbida a esa longitud de onda, varía proporcionalmente
con la concentración del compuesto en una solución. Aunque pareciera estar restringido a
sustancias coloreadas, también puede extenderse a compuestos incoloros si se hacen reaccionar
con una especie que genere un producto coloreado.

Absorción de energía por sustancias coloreadas

Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite radiación electromagnética en la región


visible del espectro, es decir, entre 400 y 800 nm (). El color que se observa es una combinación
de las longitudes de onda no absorbidas o transmitidas por la sustancia.

Espectro electromagnético

Cuando una molécula absorbe radiación ultravioleta (U.V) o visible se excitan los electrones de
valencia que ocupan orbitales moleculares: sigma () o simples, pi () o dobles y triples y eta () o

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electrones no enlazados. Al absorber un fotón de energía, el electrón puede ocupar un orbital
superior denominado “orbital antienlazante, (*)” generándose una de las siguientes transiciones:

Estas transiciones requieren diferente cantidad de energía y por lo tanto diferente longitud de onda.
El contenido energético de una radiación es inversamente proporcional a su longitud de onda:

E = h = hc/

Donde: E = cantidad de energía

 = frecuencia de la radiación

h = constante de Planck

c = velocidad de la luz en el vacío

 = longitud de onda de la radiación

Las transiciones señaladas, que son las que normalmente pueden ocurrir en los compuestos
orgánicos, tienen el siguiente orden de acuerdo con su energía o longitud de onda:

La transición que ocurre más fácilmente (menor diferencia de energía) es la  - *, y la que mas
difícilmente ocurre es la  - *. Las transiciones  - * son las que frecuentemente ocurren en
compuestos saturados y son poco útiles para fines analíticos debido a que requieren mucha energía.
Las transiciones  - * son las características de los compuestos insaturados (alquenos, alquinos,
cetonas, aldehídos, ácidos carboxílicos, aromáticos), sobre todo cuando tienen dobles enlaces
conjugados. Cuando esto ocurre, la transición es más fácil (menos energía) y la longitud de onda va
aumentando, hasta llegar a la región visible del espectro (400 -800 nm), que es donde absorben las
sustancias coloreadas.

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Las transiciones  - * y  - * ocurren en las moléculas que tienen pares de electrones libres y
aunque son relativamente poco energéticas, su probabilidad es baja; por ello son poco útiles en el
campo analítico.

En los iones y complejos coloreados de los metales de transición (Co, Ni, Cu, Cr, Fe, Zn, etc.), las
moléculas que se acomplejan al ion metálico dividen a los orbitales “d” del ion en dos grupos: de alta
y baja energía, lo que permite que los electrones de los orbitales “d” de baja energía se promueven
a orbitales “d” de alta energía cuando la molécula absorbe radiación visibles.

Espectro de absorción

Para saber con precisión la energía (o la ) de la transición (o transiciones) que ha ocurrido en una
molécula cuando se irradia con luz U.V. o visible, se debe hacer una gráfica que relacione la
intensidad de energía que se va absorbiendo a medida que se hace un barrido por la región del
espectro que nos interesa (U.V., visible o ambos). Esta gráfica se llama espectro de absorción, y
a partir de ella se puede deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor
intensidad la energía, es decir, donde ocurre la transición electrónica. El conocimiento de la  de
máxima absorción facilita la detección de la sustancia ya sea para determinar su concentración o
para seguirle la huella en experimentos de tipo cinético.

Energía absorbida y concentración (ley de Beer)

La intensidad de la energía absorbida por una especie depende del número de moléculas que sufren
la transición electrónica a la  seleccionada, y ese número de moléculas depende a su vez de la
concentración de la especie y de la longitud de la celda que la contiene:

A  c x l donde: A = absorción (intensidad de la energía absorbida)

c = concentración de la muestra en mol/L

l = longitud de la celda en cm.

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Esta expresión se vuelve una igualdad cuando se introduce una constante de proporcionalidad “”:

A =  x c x l (ley de Beer-Lambert)

 Se denomina coeficiente de extinción molar o absortividad molar, con unidades M-1cm-1. Es una
constante para cada especie que absorba energía en la región U.V.-visible, y su valor indica la
probabilidad de que la transición electrónica ocurra.

Aplicación de la ley de Beer-Lambert

La aplicación más importante es la determinación de concentraciones desconocidas de soluciones


de sustancias que absorben en la región U.V.-visible. Como una primera aproximación y suponiendo
concentraciones cercanas a la de una muestra patrón, la ecuación de Beer-Lambert se puede usar
para calcular la concentración de una muestra problema (igual sustancia que el patrón), midiendo la
absorbancia de la muestra patrón (Apat.) y de la muestra problema (Aprob.). Si las condiciones de las
dos mediciones son iguales (temperatura, sustancia, aparato), se cumple que:

A/C =  x l = constante

La expresión se puede aplicar tanto a la muestra patrón como a la muestra problema, así:

Apat/Cpat = Aprob/Cprob luego Cprob = Cpat x Aprob/Apat

Para determinaciones más precisas de concentraciones desconocidas y para minimizar al máximo


las desviaciones de la ley de Beer-Lambert, se acostumbra preparar una curva de calibración, a partir
de una serie de soluciones patrón, cuyas concentraciones sean próximas a las de las muestras
problema. Tanto a las soluciones patrón como a las muestras problema se les mide la absorbancia;
con los datos de las soluciones patrón se construye la curva de calibración (A vs. C). Las
absorbancias de las muestras problema se llevan a la curva y se deducen de ahí sus
concentraciones.

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Cuantificación de proteínas

Las proteínas se pueden cuantificar por diversos métodos con base en sus propiedades, por ejemplo,
los patrones de absorción de las radiaciones electromagnéticas de los grupos aromáticos, la
reactividad del enlace peptídico o su contenido de nitrógeno, entre otras. En la reacción de Biuret las
sustancias que contengan dos ó más enlaces peptídicos, interaccionan con sales de cobre en
soluciones alcalinas, formando un complejo púrpura-violeta, como muestra la siguiente figura. Dicho
complejo se cuantifica espectroscópicamente utilizando como base una curva patrón de proteína.

H H
O

N N N
O O O
C C C
2 2+ 2+
Cu
+ Cu + 2 H2O
CH CH CH
R R R
N N N
O

Cadena peptídica H H
Complejo color violeta

Espectrofotómetros

Los espectrofotómetros permiten determinar la absorbancia de la luz en numerosas sustancias


orgánicas. Estos equipos fueron diseñados para medir directamente la intensidad de luz que es
absorbida y/o transmitida por un compuesto en una solución. A continuación se muestran los
componentes básicos de estos equipos:

En el espectrofotómetro la luz de una fuente continua (lámpara de tungsteno para el visible y lámpara
de deuterio para el ultravioleta), pasa a través de un monocromador que selecciona una banda
estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Las longitudes seleccionadas atraviesan la
muestra contenida en una cubeta de vidrio o cuarzo de espesor definido (l). Finalmente, se mide la
potencia radiante de la luz que sale.

Materiales:

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 Fotocolorímetro  Beaker
 Celdas del fotocolorímetro  Frasco lavador
 Tubos de ensayo grandes

Sustancias:

 Reactivo de Biuret  Muestras problema: caseína,


 Solución patrón de gelatina (C = 8 mg/mL) suero sanguíneo, gelatina (sin
 Solución salina al 0.9% sabor)

Sección experimental

A- MANEJO DEL FOTOCOLORÍMETRO.

Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo las
recomendaciones anotadas a continuación:

a. Seleccione la longitud de onda.


b. Ajuste el cero en transmitancia.
c. Coloque la celda o tubo que contiene la solución blanco, la cual se prepara mezclando 2
mL de solución salina, 2 mL de reactivo de Biuret y 2 mL de agua destilada.
d. Coloque el 100% de transmitancia.
e. Retire el tubo que contiene la solución blanco.
f. Coloque el tubo que contiene la solución problema.
g. Lea la absorbancia o transmitancia.

B- DETERMINAR EL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE UN COMPUESTO.

a. Coloque la longitud de onda en el instrumento en 420 nm.

b. Prepare dos celdas o tubos con suficiente solución (aproximadamente hasta los ¾),
utilizando en una, agua destilada y en la otra una solución de gelatina coloreada con el
reactivo de Biuret.

c. Observe que los tubos con las soluciones no tengan burbujas, límpielos externamente
con un papel o tela adecuada.

d. Calibre el instrumento siguiendo las recomendaciones anteriores.

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e. Coloque el tubo con la solución problema y anote la absorbancia indicada en el
instrumento.

f. Repita los pasos anteriores pero aumentando la longitud de onda de 20 en 20 nm


(continúe tomando lecturas hasta alcanzar una longitud de onda de 620 nm).

g. Recoja los datos en la siguiente tabla:

 (nm) Absorbancia  (nm) Absorbancia

420 540

440 560

460 580

480 600

500 620

520

h. Dibuje una gráfica de absorbancia vs. longitud de onda. La curva obtenida corresponde
al espectro para la estructura del complejo proteínico formado por el reactivo de Biuret.
Observe que se presentará una longitud de onda en la cual habrá una mayor absorción.
Esta longitud de onda debe ser una constante, la cual será tenida en cuenta para
posteriores análisis de proteína.

C. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA SOLUCIONES DE GELATINA

a. Rotule 9 tubos de ensayo y llénelos con las soluciones que se indica en la tabla siguiente:

TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7 8

Solución Patrón 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,2


(mL)

Solución Problema 0,5 1,0

Solución Salina 2,0 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 0,8 1,5 1,0

Absorbancia

Concentración

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b. Agregue en cada tubo 4 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y deje en reposo durante 15
minutos.

c. Coloque en el fotocolorímetro la longitud de onda de máxima absorbancia obtenida en la


experiencia sobre el espectro de absorción (numeral B), mida la absorbancia para cada uno
de los tubos y anótelas en la tabla anterior.

d. Calcule la concentración de proteína en cada uno de los tubos, aplicando la fórmula de


dilución (C1 x V1 = C2 x V2) y tabule los resultados de la absorbancia y concentración.

e. Grafique los resultados absorbancia y concentración tabulados en d, la línea resultante


corresponde a la curva de calibración.

f. Del gráfico, determine la concentración de las muestras problema.

g. Calcule las concentraciones de las muestras problema utilizando la ecuación de Beer-


Lambert y compárelas con las obtenidas del gráfico.

Todos los desechos se adicionan a residuos con metales

Preguntas

1. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir?

2. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloreadas?

3. ¿Cuál es el objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas?

4.- ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante?

5. ¿Por qué no se le puede tomar un espectro de absorción a la albúmina sola?

6. ¿Por qué razón se eligió una sola longitud de onda para hacer todas las mediciones de la curva
de absorción?

7. ¿Qué significado tiene la pendiente de la gráfica?

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CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Objetivos

1. Separar en una muestra de suero sanguíneo, las globulinas de las proteínas totales.

2. Calcular la concentración de proteínas totales, globulinas y albúminas en una muestra de


suero sanguíneo.

Aspectos teóricos

Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en las células ya que son fundamentales
en todos los aspectos de la estructura y función celular, constituyen el 50% ó más de su peso seco.
Existen muchas clases de proteínas, especializadas en funciones biológicas tan diferentes como el
transporte y almacenamiento de moléculas pequeñas, la organización estructural de las células y los
tejidos, la contracción muscular, la respuesta inmunitaria, la coagulación de la sangre y la catálisis
de cientos de reacciones metabólicas. Además la información genética es expresada en su mayor
parte por las proteínas. La estructura de las proteínas, así como su relación con su función biológica
y actividad constituyen problemas centrales de la bioquímica actual.

Clasificación de las proteínas

a. Según su composición

Las proteínas se clasifican en dos tipos importantes. Las proteínas simples, que solo producen
aminoácidos cuando se hidrolizan; las proteínas conjugadas, producen otros compuestos además
de los aminoácidos como carbohidratos, grasas o ácidos nucleicos.

b. Según su forma tridimensional

Las proteínas se clasifican según su forma tridimensional en: las proteínas fibrosas, consisten en
cadenas de polipéptidos, arreglados lado a lado en largos filamentos. Debido a que estas proteínas
son correosas e insolubles en agua, en la naturaleza sirven para construir materiales estructurales
como tendones, pezuñas, cuernos y músculos. Las proteínas globulares, en cambio suelen estar
enrolladas en forma semiesférica y compacta. Estas proteínas son por lo general solubles en agua
y se mueven dentro de las células. La mayor parte de los varios millares de enzimas conocidas son
proteínas globulares. Otros ejemplos, son la insulina y la hemoglobina.

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c. Según su solubilidad

Según este parámetro, las proteínas reciben algunos de los siguientes nombres:

 Albúminas, cuando son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas diluidas.


 Globulinas, solubles en soluciones salinas diluidas pero poco solubles en agua. Se
precipitan en soluciones semisaturadas de sulfato de amonio.
 Prolaminas, solubles en etanol entre 70 y 80% e insolubles en agua.
 Histonas, solubles en soluciones salinas.
 Glutelinas, insolubles en agua, etanol y soluciones salinas, pero solubles en soluciones
ácidas y básicas diluidas.

Proteínas del suero sanguíneo

La sangre es el tejido líquido que circula dentro de los vasos sanguíneos, compuesto casi en la mitad
de su volumen por células como los glóbulos rojos o eritrocitos, glóbulos blancos o leucocitos,
plaquetas o trombocitos y por el plasma, que es la porción no celular y que es el líquido que mantiene
a las células en suspensión.

Cuando la sangre se coagula, aparece un líquido remanente que se llama suero, y que se diferencia
del plasma porque ya no contiene los factores de coagulación como la proteína fibrinógeno.

Aunque el plasma sanguíneo contiene una compleja mezcla de sustancias solubilizadas, sus
proteínas representan el 75% de ellas, y una concentración que oscila entre 6 y 8 g por cada 100 mL
de suero. Las principales proteínas del suero sanguíneo son:

 Albúmina: con una concentración de 3 a 4.5 gr por 100 mL de suero, es el mayor


contribuyente a la presión osmótica intravascular. Su función principal es la de transportar
ácidos grasos y medicamentos. Los ácidos grasos los llevan desde los adipositos, donde se
generan por hidrólisis de los triacilglicéridos, hasta los tejidos que los requieren para su
oxidación.

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Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a
las infecciones. Es un conjunto heterogéneo de proteínas que alcanzan una concentración
en la sangre entre 3 y 3.5 gr por 100 mL, y que a veces se designan como: ,  y -globulinas.

Métodos para aislar y purificas proteínas

Para preparar extractos proteínicos a partir del medio celular se han desarrollado técnicas basadas
en las diferencias que presentan las proteínas en cuanto a tamaño, carga, masa, solubilidad y
afinidad por otras moléculas. Estás técnicas son: la centrifugación, la electroforesis, la cromatografía,
la diálisis, ultrafijación y diferencias en la solubilidad en diferentes medios.

En esta práctica se usan las técnicas de centrifugación y fotocolorimetría para separar y definir la
concentración de albúmina y globulinas en el suero sanguíneo. El empleo del reactivo de biuret en
soluciones con concentraciones diferentes de proteínas, permitirá medir la absorbancia para cada
concentración. La determinación precisa de éstas se podrá deducir del dato de absorbancia de una
solución patrón (con concentración conocida) de proteína, de la siguiente manera:

Cprob = Cpat x Aprob/Apat

Donde: Apat. Y Cpat. = son la absorbancia y concentración de la solución patrón, respectivamente.

Aprob. Y Cprob. = son la absorbancia y la concentración de la muestra problema,


respectivamente.

Materiales:

 Fotocolorímetro  Beaker
 Celdas del fotocolorímetro  Frasco lavador
 Tubos de ensayo grandes  Centrífuga

Reactivos:

 Solución acuosa de NaCl al 0.9%  Solución de biuret


 Solución saturada de (NH4)2SO4 (750 gr en  Muestra de suero sanguíneo
1 L de agua) humano
 Solución patrón de albúmina o gelatina (0.45
gr en 100 mL de solución salina)

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Sección Experimental

A. Separación de las globulinas del suero.

a. Coloque en un tubo de centrífuga 1 mL de suero sanguíneo y 4 mL de agua destilada.

b. Agregue a la solución anterior 5 mL de solución saturada de sulfato de amonio, gota a gota


y agitando suave pero constantemente.

c. Deje reposar durante 15 minutos la solución obtenida en b. Luego centrifugue a 3500 r.p.m,
por espacio de 15 minutos. El precipitado obtenido corresponde a las globulinas.

d. Separe el líquido sobrenadante de las globulinas y disuelva este precipitado en 5 mL de una


solución salina. Conserve esta solución para determinar el porcentaje de globulinas.

B. Preparación de la solución de proteínas totales.

a. Mida 1 mL de suero sanguíneo en una probeta y dilúyalo hasta completar 20 mL agregándole


solución salina.

C. Medición de la absorbancia en las soluciones que contienen proteínas.

a. Disponga de 4 tubos de ensayo y prepare en cada uno de ellos las soluciones, como se
indica en la siguiente tabla:

TUBOS BLANCO PATRÓN GLOBULINAS PROTEÍNAS ABSORBANCIA


(mL) (mL) (mL) TOTALES
(mL)

Solución 1,0
salina

Solución 1,0
patrón

Solución de 1,0
globulinas

Suero diluido 1,0


1:20

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Solución de 4,0 4,0 4,0 4,0
Biuret

b. Agite cada tubo y déjelo reposar 30 minutos.

c. Lleve cada uno de los tubos al fotocolorímetro, fijado en una longitud de onda  de 540  
nm. Luego de una previa calibración con el blanco, anote los resultados de absorbancia
registrados en el instrumento.
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos con metales 1

Resultados

a. Dilución del patrón:

Calcule la concentración final de la solución patrón de proteínas aplicando la fórmula:

Cf = CiVi/Vf

b. Concentración de proteínas totales en el suero:

Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón con las de proteínas totales y
calcule el porcentaje de estas últimas:

(%) sln patrón x Absorbancia (proteínas totales)


(%) proteínas totales =
Absorbancia (sln patrón)

Sin embargo, esta concentración corresponde a 1 mL de solución de suero sanguíneo, el cual fue
diluido primero 20 veces y luego 5 veces de manera que el resultado final debe ser:

20 x 5 x (%) proteínas totales

c. Concentración de las globulinas:

Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón y de albúmina obtenida con el
porcentaje de la solución patrón y calcule el porcentaje de la solución de globulinas:

(%) sln patrón x Absorbancia (sln globulinas)


(%) globulinas =
Absorbancia (sln patrón)

1 Los residuos de suero sanguíneo se depositan en un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio

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Sin embargo esta concentración corresponde a la solución de globulinas preparada según la tabla
5-1, la cual fue obtenida por dilución 1:5:5. En esta forma la solución original del suero sanguíneo
debe tener una concentración 25 veces mayor, o sea:

5 x (%) sln globulinas x5

La dilución con Debido a la dilución


5 mL de solución 1.0 + 4.0 según la tabla
salina

d. Concentración de albúmina de suero:

El porcentaje de albúmina se determina restando de las proteínas totales el resultado de las


globulinas:

(%) Albúmina = % Proteína Total - % Globulinas

Preguntas

1. Compare los porcentajes hallados para las globulinas y la albúmina, con los reportados como
normales para el suero. ¿Existen diferencias? ¿Por qué?

2. Consulte la función de las sales de sulfato de amonio y cloruro de sodio en el procedimiento


de separación de globulinas.

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TIROSINASA I: Efecto de la concentración de enzima, del pH y de la Temperatura
sobre la Actividad Enzimática

Objetivos

3. Extraer el enzima tirosinasa del banano


4. Determinar la actividad de la tirosinasa utilizando como sustrato el L-metildopa.
5. Comparar los resultados de actividad de la tirosinasa a diferentes concentraciones
6. Determinar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimática.
7. Deducir el pH y la temperatura óptima para la enzima tirosinasa.

Aspectos teóricos

Catálisis enzimática.

Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentan las velocidades de las reacciones
bioquímicas. Estas son altamente específicas, esto significa que una enzima solo actúa en
determinadas moléculas, denominadas sustratos mientras dejan el resto del sistema sin afectar. Se
ha calculado que una célula viva puede contener en promedio alrededor de 3000 enzimas diferentes,
cada una de las cuales cataliza una reacción específica en la que un sustrato se convierte en los
productos adecuados. La catálisis enzimática es homogénea porque el sustrato y la enzima están
presentes en disolución acuosa.

Una enzima es una molécula grande de una proteína que contiene uno o más sitios activos, donde
se llevan a cabo las interacciones con los sustratos. Estos sitios, en forma estructural, son
complementarios de las moléculas de un sustrato específico, como se muestra en la siguiente figura:

Pardeamiento enzimático

La coloración café oscuro que se va formando en la superficie de algunas frutas y vegetales cuando
se cortan, se denomina pardeamiento, y se debe a la acción de la enzima tirosinasa, que es una
monofenoloxidasa, sobre el aminoácido tirosina, que en presencia de oxígeno, se convirte
secuencialmente en dopa, dopaquinona y dopacromo (café oscuro), hasta terminar en melanina un
pigmento muy oscuro.

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COOH HO COOH O COOH
Tirosinasa Tirosinasa
O2 NH2 O2 NH2
NH2
HO HO O
DOPA Dopaquinona
Tirosina

N O
O CO2 O

COOH
O
O N N
O
O H Dopacromo H

O N

H
Melanina

En esta práctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de varias fuentes vegetales (banano,
manzana y papa), y ponerla a reaccionar con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el
compuesto L-metildopacromo, que es de color café oscuro y se puede seguir
fotocolorimétricamente a una  de 420 nm, donde presenta su máxima absorción.

CH3 O
Tirosinasa CH3
HO COOH
COOH
O2
O N
NH2
HO
L-metildopacromo H
L-metildopa (incolora) (café oscuro)

La medida de la absorbancia a través del tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reacción
en términos de la cantidad de L-metildopacromo que se va formando, o la de L-metildopa que
va reaccionando:

Absorb./t = velocidad = + d [L-matildopacromo]/dt = - d[L-metildopa]/dt

Obtención del extracto enzimático

Se conoce como extracto enzimático a una fracción de material animal, vegetal o microbiano,
que contiene una mezcla de sustancias y se caracteriza por presentar actividad de una o varias
enzimas

La preparación de un extracto enzimático se inicia con la adición de una solución amortiguadora


al material seleccionado, para garantizar la conservación de la actividad de la enzima objeto de
la extracción. Luego, se tritura en un mortero, se filtra y centrifuga para separar los residuos poco
solubles.

Medida de la actividad enzimática

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Las velocidades de varias reacciones enzimáticas se pueden usar para comparar la eficiencia
de las enzimas involucradas cuando se expresan en términos de la cantidad usada de éstas.
Ello significa que:

Actividad Enzimática = Velocidad de la reacción/Cantidad de enzima

Si se conoce con precisión la concentración molar de la enzima usada, la expresión anterior se


llamará actividad molar de la enzima:

Actividad molar = Veloc./[E] = d[S]/dt x [E] = sustrato/enzima x t

Donde  son moles

Este valor representa las moles de soluto transformadas en producto por un mol de enzima en
la unidad de tiempo. Esto recibe el nombre de actividad molar de la enzima.

Si no se conoce las cantidades exactas de las enzimas empleadas, se puede usar como factor
de comparación el volumen de los extractos enzimáticos preparados en condiciones similares;
no se podrá hablar de actividad molar, sino simplemente de actividad enzimática:

Actividad enzimática = reacción/vol. extracto enzimático

= d[s]/dt x mLextracto = [s]sustrato/mLextracto x t

De donde [s]sustrato/t se puede determinar indirectamente de la pendiente de un gráfico de


Absorbancia vs tiempo, ya que la concentración de sustrato está relacionada con la absorbancia
mediante la ecuación de Beer-Lambert.

Variables que afectan la actividad enzimática

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Las enzimas son macromoléculas proteínicas cuya actividad catalizadora se ve influenciada por
factores como: concentración del sustrato o de la enzima, cofactores, inhibidores y efectores, la
temperatura y el pH.

Para visualizar las condiciones para el óptimo funcionamiento de una enzima, se tendrá que proceder
a la evaluación de su actividad catalítica, ya sea midiendo la velocidad inicial de la reacción
enzimática en función de uno de los parámetros mencionados anteriormente, o determinando la
presencia o ausencia de un sustrato o de un producto de la reacción, a medida que se varía uno de
los parámetros.

Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción

La evaluación del efecto de la concentración de la enzima se hizo en la región de la curva hiperbólica


de Vi vs [S], donde la cinética es de orden cero con respecto al sustrato. Ahí, la enzima se encuentra
completamente saturada y habrá sustrato en exceso. Al adicionar más cantidad de enzima, se
encontró un aumento lineal en la velocidad de reacción, proporcional a la cantidad de enzima
agregada.

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

La mayoría de las enzimas poseen un pH al cual su actividad es máxima; por encima o por debajo
de ese pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en función del pH
de muchas enzimas son acampanados, pueden cambiar considerablemente de forma, como se
muestra en la figura siguiente:

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Del gráfico podemos observar que existe un pH (o un rango de pHs) en el cual la actividad de la
enzima es máxima:

 Para la tripsina, que hidroliza péptidos en el intestino, el pH óptimo está alrededor de 8.


 Para la colinesterasas, se encuentran principalmente en la sangre y en el higado y catalizan
la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina, trabaja en un rango de pH entre 7.5 y 10.
 Para la pepsina, que funciona en el estómago, el pH óptimo estará cercano a 2.5.
 La papaína, que es una peptidasa aislada de la papaya, trabaja bien en un rango de pH entre
5 y 9.

La relación entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende principalmente del


comportamiento ácido-base de la enzima y del sustrato. La forma de la curva de actividad-pH varía
con la concentración del sustrato, ya que el valor de KM de muchas enzimas varía con el pH. Las
mencionadas curvas son mucho más significativas si la enzima se mantiene saturada con el sustrato
en todos los valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cinética enzimática, el
pH se mantiene constante al pH óptimo.

El pH óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular normal,


el cual puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de su curva de pH-
actividad. Este hecho sugiere que la relación pH-actividad de una enzima puede constituir un factor
en el control intracelular de su actividad.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Al igual que ocurre con la mayoría de reacciones químicas, la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas se incrementa en con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable
y permanece totalmente activa. La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica,
aproximadamente, por cada 10 ºC de aumento de la temperatura.

Aunque las reacciones catalizadas por las enzimas parecen, con frecuencia, poseer una temperatura
óptima, como muestra la figura siguiente, el pico que se observa al representar la actividad catalítica
frente a la temperatura se produce porque las enzimas se desnaturalizan por la acción del calor y se
inactivan cuando la elevación de la temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura
óptima es, por lo tanto, la resultante de dos procesos:

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 El incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura, y,
 El incremento en la velocidad de desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar una
temperatura crítica.

Aunque la mayoría de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60 ºC, algunas


de ellas son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas superiores; como, las
de bacterias termofílicas que habitan en las termas de agua que siguen activas a temperaturas
superiores a los 85 ºC.

Materiales:

 Fotocolorímetro  Baño de hielo


 Celdas del fotocolorímetro  Beaker
 Tubos de ensayo grandes  Frasco lavador
 Mortero  Centrífuga
 Silica gel  Lienzo
 Baño maría  Tubos de ensayo grande
 Baño de agua hirviendo  Pipeta

Reactivos:

 Solución buffer de citrato pH = 3.0  Fuente de tirosinasa: banano


 Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 5.0,  Hielo picado
7.2
 Solución buffer 0.1 M de borato pH= 9.0 y
10.0
 Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH
= 7.2

20
Sección Experimental

Nota: esta práctica está dividida en cuatro partes, se recomienda que la parte A y B la realice todo
el grupo, y la C y D se distribuya en dos equipos y al final se compartan los resultados.

A. Extracción de la enzima

a. Coloque 10 g de la fruta en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer de fosfato


0,1M (pH=7,2).

b. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta
sólida.

c. Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.

d. La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

e. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta
solución como extracto diluido 10 veces. Rotule esta solución como extracto enzimático.

B. Medida de la actividad enzimática

a. En un tubo de ensayo prepare una solución blanco mezclando:

 1 mL del extracto enzimático


 3 mL de buffer pH = 7.2
 1 mL de agua destilada.

b. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, a  = 420 nm.

c. Mezcle en otro tubo de ensayo:

 1 mL de extracto enzimático
 3 mL de buffer pH = 7.2
 1 mL de solución de L-metildopa

21
d. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo en el
fotocolorímetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.

e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolorímetro cada 20 segundos durante 3


minutos.

f. Repita los pasos c hasta e en otros 3 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de solución
de extracto enzimático de la siguiente manera:

 Adicione a cada tubo, respectivamente, 1.5, 2.0 y 2.5 mL de extracto.


 Complete cada tubo hasta 4 mL con buffer pH = 7.2
 Agregue a cada tubo, a penas vaya a leer en el fotocolorímetro, 1 mL de la solución
de L-metildopa.

g. Anote los resultados en la siguiente tabla:

Tabla 1: Efecto de la concentración sobre la actividad enzimática

Tiempo (seg)/Tubo 1 2 3 4

Absorbancia

0.0

20

40

60

80

100

120

C. Medida de la actividad enzimática con cambio de la temperatura

22
a. En un tubo de ensayo adicione 1.0 mL de extracto de enzima y 3.0 mL de solución de buffer
pH = 7.2

b. Introduzca el tubo en un baño maría a 37oC durante 5 minutos

c. Cuando el tubo se haya enfriado, agréguele 1 mL de L-metildopa, agite y mida la absorbancia


igual que en el caso anterior.

d. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

Tabla 2: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Tiempo (seg) Absorbancia 2 oC Absorbancia 37 oC Absorbancia 95 oC

20

40

60

80

100

120

e. Repita el procedimiento anterior pero utilice primero un baño de hielo a 2oC y después en un
baño de agua hirviendo a 95 oC. Tabule sus resultados en la tabla anterior.

D. Efecto del pH sobre la actividad de enzimática:

a. Marque 8 tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos lo que muestra la siguiente
tabla:

Tubo B1 A1 B2 A2 B3 A3 B4 A4

23
Buffer pH 3.0 4 3

Buffer pH 5.0 4 3

Buffer pH 9.0 4 3

Buffer pH 10.0 4 3

Extracto 1 1 1 1 1 1 1 1

b. Calibre el fotocolorímetro con la solución B1 a  = 420 nm

c. Adicione al tubo A1 1 mL de L-metildopa y agite.

d. Lea y anote la absorbancia de la solución A1 durante 3 minutos

e. Repita los pasos b hasta d para los otros tubos

f. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

Tabla 3: Efecto del pH sobre la actividad enzimática

Tiempo (min)/Tubo A1 A2 A3 A4

Absorbancia

0.0

20

40

60

80

100

120

24
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos no halogenados

Resultados

a. Con los resultados en la tabla 1, haga los gráficos correspondientes de Absorbancia vs


tiempo y de ellos, calcule las pendientes de las curvas y multiplique estos valores por
los factores de dilución así:

 Tubo 1: m1 x 10/1.0 = A.E1


 Tubo 2: m2 x 10/1.5 = A.E2
 Tubo 3: m3 x 10/2.0 = A.E3
 Tubo 4: m4 x 10/2.5 = A.E4

Donde m es la pendiente de la curva y A.E es la actividad enzimática:

Absorvancia

A2

A2 - A1
m=
t2 - t1
A1

t1 t2 tiempo

b. Analice la actividad enzimática de los tubos 1-4, ¿cuál es la explicación?

c. Con los resultados en la tablas 2 y 3, haga los gráficos correspondientes de Absorbancia


vs tiempo y de ellos, calcule las pendientes de las curvas. La actividad enzimática con
variación de la temperatura y del pH se calcula igual que el tubo 1.

d. Analice la actividad enzimática del tubo 1 en la primera parte con los obtenidos con
cambio de la temperatura (haga el grafico de actividad enzimática vs temperatura) ¿cuál
es la explicación?

Nota 1: para el cálculo de las pendientes utilice como último valor el punto máximo de absorción y
los valores anteriores a este.

25
Nota 2: tome como valor de temperatura para el tubo 1, 25 oC.

e. Analice la actividad enzimática del tubo 1 en la primera parte con los obtenidos con cambio del pH
(haga el grafico actividad enzimática vs pH) ¿cuál es la explicación?

Nota 3: tome los valores de pH de las soluciones buffer utilizadas y asuma que no hay un cambio
significativo en el valor de pH cuando se preparan las soluciones.

Preguntas
1. Cuando se trabaja con manzana el extracto no es recomendable diluirlo ¿Por qué?

2. ¿Cuál es la función de la tirosinasa en los animales superiores?

3. ¿Qué se podrá recomendar (y que no se podrá recomendar), para evitar el pardeamiento de las
frutas y las papas cortadas?

Referencia

Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical
Education, 54, 4, 1977, p: 257.

26
TIROSINASA II: Determinación de la constante Michaelis-Menten y la velocidad máxima

Objetivos

1. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentración del sustrato (L-metidopa).


2. Determinar el valor de KM para la tirosinasa mediante el método de la curva hiperbólica de
Michaelis–Menten, las ecuaciones de LineWeaver–Burk y Eadie-Hofstee.

Aspectos teóricos

Cinética química

La cinética química es el estudio de las velocidades de las reacciones químicas y de los


factores que influyen en ella. La velocidad de la reacción es una medida de la rapidez con que se
forman los productos a partir de los reactantes o la velocidad con la que desaparecen los reactantes.

Las reacciones químicas pueden clasificarse sobre una base cinética por el orden de reacción, entre
estas tenemos: reacciones de orden cero, de primer orden, de segundo orden y de tercer orden,
según como resulte influida la velocidad de la reacción por la concentración de los reaccionantes
bajo un conjunto de condiciones determinado como son la temperatura y la adición de catalizadores.

Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad directamente proporcional
a la concentración de un reaccionante. El ejemplo más sencillo es cuando la velocidad de la reacción:

A B
es directamente proporcional a la concentración de A. En este caso la velocidad de la reacción en
cualquier tiempo t, viene dada por la ecuación:

-d [A] / dt = k [A]

en la que [A] es la concentración molar de A y -d [A] / dt es la velocidad a que disminuye la


concentración de A. La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad,
la cual, tiene dimensiones del recíproco del tiempo, s-1. La forma integrada de esta ecuación es:
[A0] kt
ln [A] = (- k) (t) + ln [A]0 ó log =
[A] 2.303

y = m x + b

donde ln es el logaritmo natural, [A]0 y [A] son las concentraciones de A a los tiempos t = 0 y t = t,
respectivamente. Debe aclararse que t = 0 no corresponde al principio del experimento; puede
seleccionarse cualquier tiempo para empezar a medir el cambio en la concentración de A. Por lo

27
tanto, una gráfica de ln [A] contra t es una línea recta con una pendiente –k. Este análisis gráfico
permite calcular la constante de velocidad k, como se muestra en la figura siguiente:

Para una reacción de primer orden, el tiempo de vida media viene dado por la siguiente expresión:
t ½ = 0.693 / k

la anterior ecuación indica que la vida media de una reacción de primer orden es independiente de
la concentración inicial del reactivo.

Una reacción de segundo orden es una reacción cuya velocidad depende de la concentración de
uno de los reactivos, elevada a la segunda potencia o de la concentración de dos reactivos
diferentes, cada uno elevado a la primera potencia. El caso más sencillo comprende solo una clase
de molécula como reactivo:

2A C

la ecuación de velocidad de segundo orden es:

- d [A] / dt = k [A]2

La constante de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen unidades de 1/ M x s.

Por medio del cálculo, se puede obtener la siguiente expresión para la ecuación anterior:

1 1
= + kt
[A] [A]0

por lo tanto, una gráfica de 1/[A] contra t, es una línea recta con una pendiente k, como se observa
en la siguiente figura.

1/[A]
k

28
Otro tipo de reacción de segundo orden es:

A + B C

y la ley de velocidad está dada por: - d [A] / dt , - d [B] / dt ó d [C] / dt

velocidad = k [A] [B]

la reacción es de primer orden respecto de A y de primer orden respecto de B, por lo que tiene un
orden global de 2.

El tiempo de vida media viene dado por: t ½ = 1 / k [A]0

Observe que la vida media de una reacción de segundo orden es inversamente proporcional a la
concentración inicial del reactivo. Las mediciones de la vida media a diferentes concentraciones
iniciales es una forma de distinguir entre una reacción de primer orden y una de segundo orden.

Las reacciones de tercer orden, que son relativamente escasas, son aquellas cuya velocidad es
proporcional al producto de tres términos de concentración. Algunas reacciones químicas son
independientes de la concentración de cualquier reactivo; son llamadas reacciones de orden cero.
En este caso, la velocidad depende de la concentración del catalizador o de algún otro factor distinto
a la concentración de las especies moleculares que experimentan la reacción.

Cinética enzimática: Ecuación de Michaelis-Menten

Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las
reacciones catalizadas por los enzimas, pero éstas muestran también un rasgo característico, que
no se observa en las reacciones no enzimáticas: la saturación con el sustrato. En la figura siguiente
vemos el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por un
enzima.

29
A una concentración baja de sustrato, la velocidad inicial o de la reacción es casi
proporcional a la concentración del sustrato y la reacción, por tanto, es aproximadamente de primer
orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentración de sustrato aumenta, la
velocidad inicial de la reacción disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la
concentración de sustrato; en esta zona el orden de reacción es mixto.

Con un aumento posterior de la concentración del sustrato, la velocidad de la reacción llega a ser
esencialmente independiente de la concentración de sustrato y se aproxima asintóticamente a una
velocidad constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reacción es esencialmente
de orden cero con respecto al sustrato, y se dice que el enzima se halla saturado con su sustrato.
Todos los enzimas muestran el efecto de saturación pero varían ampliamente con respecto a la
concentración de sustrato que se necesita para que se manifieste la saturación.

El efecto de saturación condujo a algunos investigadores a formular la hipótesis de que el enzima y


el sustrato reaccionan reversiblemente para formar un complejo, como etapa esencial en la reacción
catalizada.

L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron una teoría general acerca de la acción y cinética de los
enzimas. Esta teoría que es fundamental para el análisis cualitativo de todos los aspectos de la
cinética e inhibición de los enzimas, se ha desarrollado para el caso sencillo de una reacción en la
que sólo hay un sustrato.

La teoría de Michaelis-Menten supone que el enzima E se combina en primer lugar con el sustrato
S para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuación este último se divide en una segunda
etapa, para formar enzima libre y el producto P:
k1
E + S ES
k-1

k2
ES E + P

La ecuación de Michaelis-Menten es la ecuación de velocidad para las reacciones catalizadas por


enzimas que sólo actúan sobre un sustrato, y se formula como sigue:

30
vo = Vmax [S]
KM + [S]

De donde: o = velocidad inicial

Vmax = velocidad máxima (Vmax = kcat x [Etotal])

[S] = concentración del sustrato

KM = constante de Michaelis-Menten

De la ecuación de Michaelis-Menten se deriva una relación numérica en el caso especial en que la


velocidad inicial de la reacción sea exactamente la mitad de la velocidad máxima; es decir, cuando
0 = ½ Vmax entonces KM = [S] (ver figura anterior).

La constante de Michaelis-Menten de un enzima constituye una característica útil e importante, que


es fundamental no sólo para la descripción matemática de la cinética enzimática, sino también para
la determinación cuantitativa de la actividad enzimática en los tejidos y el análisis de algunos
mecanismos de regulación enzimática.

Transformaciones de la ecuación de Michaelis-Menten

La ecuación de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que


son más útiles para la expresión de los datos experimentales. Una de las transformaciones más
corrientes se obtiene tomando los recíprocos de ambos miembros de la ecuación de Michaelis-
Menten:

1 KM 1
= + 1
v0 Vmáx [S] Vmáx

La ecuación anterior es la ecuación de Lineweaver-Burk. Cuando 1/0 se representa frente a 1/[S],


se obtiene una línea recta. La pendiente de la recta es KM/Vmax, y la intersección sobre el eje 1/0 es
1/Vmax; la intersección sobre el eje 1/[S] es -1/KM, como muestra la figura siguiente:

31
Tal representación doble recíproca tiene la ventaja de que permite una determinación mucho más
exacta del valor de Vmax, ya que en la representación sencilla de 0 frente a [S] sólo se obtiene su
valor aproximado, sin embargo, presente la desventaja de tener que extrapolar para encontrar el
valor de KM.

Otra transformación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene al multiplicar esta por Vmáx,
y de un posterior reagrupamiento se obtiene la siguiente ecuación:

v0 = -KM v0
+ Vmáx
[S]

La representación de 0 frente a 0/[S], llamada representación de Eadie-Hofstee, da los valores de


Vmáx y de KM de una forma sencilla, como muestra la figura siguiente:

Materiales:

 Fotocolorímetro  Beaker
 Celdas del fotocolorímetro  Frasco lavador
 Tubos de ensayo grandes  Centrífuga
 Mortero  Lienzo
 Sílica gel

Sustancias:

 Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2  Fuente de tirosinasa (banano)


 Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0  Hielo picado
 Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH
= 6.0

32
Sección experimental

1. Extracción de la enzima

a. Coloque 10 g de banano en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer fosfato 0,1M


(pH=7,2).

b. Adicione unos 3 g de sílica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida.

c. Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 rpm.

d. La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

e. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta
solución como extracto diluido 10 veces.

2. Medida de la actividad enzimática

a. Prepare una solución blanco mezclando:

 1.0 mL del extracto enzimático


 3.0 mL de buffer pH = 6.0
 1 mL de agua destilada.

b. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, a  = 420 nm.

c. Mezcle en otro tubo de ensayo:

 1.0 mL de extracto de enzima


 3.5 mL de buffer pH = 6.0
 0.5 mL de solución de L-metildopa

d. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metidopa), agite, colóquelo en el


fotocolorímetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.

e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolorímetro cada 20 segundos durante 5


minutos.

33
f. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato
de la siguiente manera:

 Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimático.


 Agregue a cada tubo, respectivamente, apenas vaya a leer en el fotocolorímetro,
1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 mL de la solución de L-metildopa.
 Complete cada tubo hasta 5 mL con buffer pH = 6.0

g. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6

Absorbancia

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

Todos los desechos se adicionan a residuos no peligrosos

Resultados

a. Con los resultados haga los gráficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y


de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la
velocidad inicial (Vi), para cada concentración de sustrato [S].

b. Calcule la nueva concentración de sustrato aplicando la fórmula general de dilución:

[S]f = v1 [S]i
v2

34
Donde: [S]f = concentración final del sustrato

[S]i = concentración inicial del sustrato (0.03M)

v2 = volumen final de la solución (5 mL)

v1 = volumen adicionado de sustrato

c. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla:

Tubo [S]f Vi 1/[S] 1/Vi Vi/[S]

d. Haga una gráfica de Vi vs [S] y de 1/Vi vs 1/[S] y de esta determine los valores de
KM y Vmax.

e. Realice también una gráfica de Vi vs Vi/[S] y de esta determine los valores de KM y


Vmax.

f. Compare los valores obtenidos por los tres métodos y determine cuál es el más
apropiado, explique.

g. Generalmente los enzimas que tienen estructura cuaternaria, presentan el


fenómeno de unión cooperativa y por tanto presentan alosterismo, investigue cómo
se puede determinar si un enzima es alostérica y cómo son las gráficas de la cinética
enzimática de estas

35
TIROSINASA III: Efecto de un inhibidor sobre la constante Michaelis-Menten y la velocidad
máxima

Objetivos

1. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentración del sustrato (L-metidopa)


en presencia de NaCN como inhibidor.
2. Determinar el valor de KM para la tirosinasa mediante el método de la curva hiperbólica
de Michaelis–Menten y la ecuación de los inversos o de LineWeaver–Burk en presencia
de un inhibidor.
3. Determinar el tipo del inhibidor y su constante.

Aspectos teóricos

Inhibición de los enzimas

Los enzimas catalizan todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los
inhibidores enzimáticos se encuentren entre los agentes farmacéuticos más importantes. Por
ejemplo, la aspirina (ácido acetilsalicílico) inhibe el enzima que cataliza el primer paso de la síntesis
de prostaglandinas.

El estudio de los inhibidores enzimáticos ha proporcionado información sobre mecanismos


enzimáticos y ha ayudado a definir algunas rutas metabólicas. Hay dos amplias clases de inhibidores
enzimáticos: reversibles e irreversibles.

Un tipo de inhibición reversible común es el que se denomina competitivo, como muestra la siguiente
figura:

Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo del enzima pero la reacción no
tiene lugar cuando se ha fijado el inhibidor (I). Mientras el inhibidor ocupa el sitio activo impide la
fijación del sustrato. Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen
al sustrato y que se combinan con el enzima formando el complejo EI. Debido a que el inhibidor se
une de manera reversible al enzima, se puede cambiar el sentido de la competición en favor del
sustrato añadiendo más de este.

36
Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor
por lo que la reacción muestra una Vmáx normal. No obstante, la [S] a la cual Vo = ½ Vmáx, la KM,
aumenta en presencia del inhibidor. Este efecto sobre la Vmáx es diagnóstico de inhibición
competitiva, y se pone de manifiesto fácilmente en una gráfica de LineWeaver–Burk. La constante
de equilibrio para la fijación del inhibidor, KI, puede obtenerse a partir de la misma gráfica.

La inhibición competitiva se utiliza en terapéutica para pacientes que han ingerido metanol, un
componente del los licores adulterados y disolvente que se utiliza como anticongelante. El metanol
se convierte en formaldehído por acción de la enzima alcohol deshidrogenada. El formaldehído
lesiona muchos tejidos, siendo la ceguera un resultado frecuente debido a que los ojos son
especialmente sensibles al mismo. El etanol compite de manera efectiva con el metanol como
sustrato de la alcohol deshidrogenasa. La terapia para el envenenamiento por metanol es la infusión
intravenosa de etanol, la cual hace que la formación de formaldehído sea suficientemente lenta para
que la mayor parte del metanol se pueda excretar inocuamente por la orina.

Otras dos clases de inhibición reversible, la no competitiva y la incompetitiva, que a menudo se


definen aplicados a enzimas con un solo sustrato pero que en la práctica sólo se observan con
enzimas que actúan con dos o más sustratos. Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio
distinto del que se fija el sustrato, como se muestra en la siguiente figura:

37
La fijación del inhibidor no bloquea la fijación del sustrato (y viceversa). El enzima se inactiva cuando
se ha fijado el inhibidor tanto si el sustrato está presente como si no lo está. El inhibidor disminuye
de manera efectiva la concentración del enzima activo por lo que decrece la Vmax. Frecuentemente
el efecto sobre KM es nulo

En la inhibición no competitiva, representaciones similares de los datos de velocidad dan la familia


de líneas que se muestran en la figura siguiente, que tienen una intersección común en el eje de
1/[S]. Esto indica que KM para el sustrato no es alterada por el inhibidor no competitivo mientras que
Vmax disminuye.

Un inhibidor acompetitivo o incompetitivo también fe fija en un sitio distinto al del sustrato. No


obstante, un inhibidor acompetitivo sólo se fija al complejo ES (el inhibidor no competitivo se fija al
enzima libre o al complejo ES).

Inhibición Acompetitiva

En la inhibición acompetitiva, representaciones similares de los datos de velocidad dan la familia de


líneas paralelas que se muestran en la figura siguiente, que tienen intersecciones diferentes tanto
en el eje 1/[S] como en el eje 1/Vo. Esto indica que tanto KM como Vmáx son alteradas por el inhibidor
acompetitivo.

38
Los inhibidores irreversibles son los que se combinan con un grupo del enzima que es esencial para
su actividad o lo destruyen. Es frecuente la formación de un enlace covalente entre un inhibidor
irreversible y una enzima.

En la siguiente tabla se resumen los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de
Lineweaver-Burk, 1/V0 frente a 1/[S].

Materiales:

 Fotocolorímetro  Beaker
 Celdas del fotocolorímetro  Frasco lavador

39
 Tubos de ensayo grandes  Centrífuga
 Mortero  Lienzo
 Sílica gel

Sustancias:

 Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2  Fuente de tirosinasa (banano,


 Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0 manzana y papa)
 Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH  Hielo picado
= 6.0

Sección experimental

1. Extracción de la enzima

a. Coloque 10 g de banano en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer de fosfato


0,1M (pH=7,2).

b. Adicione unos 3 g de sílica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida.

c. Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.

d. La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

e. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta
solución como extracto diluido 10 veces.

2. Medida de la actividad enzimática

a. Prepare una solución blanco mezclando:

 1.0 mL del extracto enzimático


 3.0 mL de buffer pH = 6.0
 4 gotas (0.2 mL) de solución de NaCN
 1.8 mL de agua destilada.

b. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, a  = 420 nm.

c. Mezcle en otro tubo de ensayo:

40
 1.0 mL de extracto de enzima
 4 gotas de solución de NaCN
 3.3 mL de buffer pH = 6.0
 0.5 mL de solución de L-metildopa

d. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metidopa), agite, colóquelo en el


fotocolorímetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.

e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolorímetro cada 30 segundos durante 5


minutos.

f. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato
de la siguiente manera:

 Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimático.


 4 gotas de solución de NaCN

 Agregue a cada tubo, respectivamente, apenas vaya a leer en el fotocolorímetro,


1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 mL de la solución de L-metildopa.
 Complete cada tubo hasta 5 mL con buffer pH = 6.0

g. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6

Absorbancia

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

Todos los desechos se adicionan a residuos inorgánicos cianurados, 5a

41
Resultados

a. Con los resultados haga los gráficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y


de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la
velocidad inicial (Vi), para cada concentración de sustrato [S].

b. Calcule la nueva concentración de sustrato aplicando la fórmula general de dilución:

[S]f = v1 [S]i
v2

Donde: [S]f = concentración final del sustrato

[S]i = concentración inicial del sustrato (0.03M)

v2 = volumen final de la solución (5 mL)

v1 = volumen adicionado de sustrato

c. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla:

Tubo [S]f Vi 1/[S] 1/Vi

d. Haga una gráfica de Vi vs [S] y de 1/Vi vs 1/[S] y de estas determine los valores de
KM y Vmax.

42
e. Compare los valores obtenidos por ambos métodos y con los obtenidos en ausencia
de inhibidor (Tirosinasa II); determine el tipo de inhibidor.

f. Calcule el valor de KI dependiendo del tipo de inhibidor, utilizando las ecuaciones


correspondientes (ver gráficos y tabla en los aspectos teóricos).

g. Se considera que el fluoroacetato es un sustrato suicida en el ciclo de Krebs,


explique qué tipo de inhibidor es y cuál es su acción biológica en dicho ciclo

h. Explique los efectos nocivos del metanol que causan la ceguera

43
UREASA I y II
Objetivos

1. Extraer la ureasa a partir de leguminosas tales como la soya, frijol o garbanzo


2. Determinar el pH óptimo de la ureasa al hidrolizar una solución de urea
3. Analizar el efecto producido por los iones Ag+, Hg+ o Cu2+ sobre la actividad
de la ureasa
4. Investigar el efecto de la concentración de sustrato en la actividad de la
ureasa
Reactivos

1- 16 g de Soya por c/4 estudiantes remojada un día antes


2- NaCL 0.9% 500 ml
3- Urea 0.25M 1 L
4- Buffer fosfato 0.1M pH 5.0 Preparer 200 ml
5- Buffer fosfato 0.1M pH 6.0 Preparer 200 ml
6- Buffer fosfato 0.1M pH 7.2. Preparer 500 ml
7- Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Preparer 200 ml
8- HgCL2 al 1.0% preparer 20ml
9- HCL 0.05N

Materiales

1- Mortero
2- Trozo de Tela
3- Baño María
4- Probeta 10 ml
5- Tubos de ensayo
6- Erlemeyers
7- Soporte universal
8- Pinza mariposa
9-
Procedimiento

1. Obtención de la ureasa
Colocar en un mortero FRIO: 5 g de soya en grano remojada desde el día
anterior
2. Agregar 20 ml de NaCl 0.9% y triturar
3. Luego filtre la suspensión con el trozo de tela y deposite el fluido resultante
en una probeta
4. Complete hasta 25 ml de volumen final con NaCl 0.9%
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5. Llene un tubo Falcon de 15 ml y centrifuge por 5 min a 2500 rpm
6. Decante el sobrenadante (liquido) en un tubo limpio (Solución de ureasa)
Ureasa I
Determinar el pH óptimo de la Ureasa
Preparación de los tubos Blanco
1. Adicione las siguientes cantidades

Solución/TUBO 1 2 3 4

Urea 0.25M 5 5 5 5

Buffer pH 5.0 (ml) 4.5

Buffer pH 6.0 (ml) 4.5

Buffer pH 7.2 (ml) 4.5

Buffer pH 8.0 (ml) 4.5

2. Coloque los tubos en un baño a 50ºC


3. Después de 5 min, adicione a cada tubo 0.5 ml de solución de NaCl 0.9% y
deje en el baño 25 min mas
4. Tome 4 Erlemeyers y adicione a cada uno 4 gotas de HgCl2 y transfiera el
contenido del tubo 1 al Erlemeyer 1 y así sucesivamente.
5. Agregué a los Erlemeyers 3 gotas de indicador de Tashiro y titule con HCL
0.05N
6. Anote los resultados en la tabla 1.

El indicador de Tashiro torna las solución verde, durante la titulación de obtiene un


color violeta.
Los valores de titulación deben ser pequeños
Reacción de la Ureasa en la catálisis de la Urea

(NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3


Los residuos de titulación se depositan con los residuos de
metales.
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Preparación de los tubos problema
1. Agregar las siguientes cantidades

Solución/TUBO 1 2 3 4

Urea 0.25M 5 5 5 5

Buffer pH 5.0 (ml) 4.5

Buffer pH 6.0 (ml) 4.5

Buffer pH 7.2 (ml) 4.5

Buffer pH 8.0 (ml) 4.5

1. Coloque los tubos en un baño a 50ºC


2. Después de 5 min, adicione a cada tubo 0.5 ml de solución de UREASA y
deje en el baño 25 min mas
3. Tome 4 Erlemeyers y adicione a cada uno 4 gotas de HgCl2 y transfiera el
contenido del tubo 1 al Erlemeyer 1 y así sucesivamente.
4. Agregué a los Erlemeyers 3 gotas de indicador de Tashiro y titule con HCL
0.05N
5. Realice una gráfica de µmol de urea hidrolizada en los diferentes pH y de allí
determine el pH óptimo
6. Anote los resultados en la tabla 1.
Tabla 1. Determinación de la µmoles de Urea hidrolizadas por la Ureasa

Blanco HCl Problema Titulación Corregida Urea µmol


(ml) HCl (ml) Problema - Blanco

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UREASA II

Analizar el efecto de la concentración de sustrato con respecto a la velocidad de


reacción enzimática

1- Agregué a 8 tubos de ensayo los siguientes volúmenes

Solución/Tubo Blanco 1 2 3 4 5 6 7

Urea 0.25 M 5 1.0 1.5 2.0 3.0 6.0 8.0 9.5


(ml)

Buffer pH 7.2 5 8.5 8.0 7.5 6.5 3.5 1.5 -


(ml)

1. Coloque los tubos en un baño a 50ºC


2. Después de 5 min, adicione a cada tubo desde el tubo 1 hasta el tubo 6 el
volumen de 0.5 ml de solución de UREASA y deje en el baño 25 min mas
3. Tome 8 Erlemeyers y adicione a cada uno 4 gotas de HgCl2 y transfiera el
contenido del tubo 1 al Erlemeyer 1 y así sucesivamente. Recuerde que hay
un tubo blanco
4. Agregué a los Erlemeyers 3 gotas de indicador de Tashiro y titule con HCL
0.05N
5. Realice una gráfica de µmol de urea hidrolizada con las diferentes
concentraciones

Tabla 2. Efecto de la concentración de sustrato en la actividad de la ureasa

TUBO Blanco HCl Problema Titulación Urea µmol


(ml) HCl (ml) Corregida
Problema - Blanco
1
2
3
4
5
6

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7

Los residuos de titulación se depositan con los residuos de


metales.

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