INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

LABORATORIO DE GENÉTICA MICROBIANA

“Aislamiento y caracterización de DNA”

Grupo: 5QV1 Equipo:6 Sección: 1

Profesores:
Introducción
El DNA es un polímero de nucleótidos que está formado por un par de cadenas
antiparalelas unidas entre si por puentes de hidrogeno, a su vez los nucleótidos
están formados por un grupo fosfato que le confiere la estructura a la
macromolécula, un azúcar y una base nitrogenada que puede ser Adenina,
Guanina Timina o Citosina las cuales interaccionan para unir a las cadenas.
El DNA constituye un pequeño porcentaje del material celular y generalmente se
localiza en una parte definida de la célula. En las células procariotas, el DNA se
localiza en el citoplasma, no está separado del resto de la celular por una
membrana. En las células procariotas y eucariotas, el DNA constituye solo
alrededor del 1% de la masa total de la célula. El objetivo de la purificación de
DNA es separar el polímero de todos los componentes celulares. No existe gran
dificultad en separar el DNA de moléculas pequeñas debido a que el peso
molecular del DNA es bastante alto. Por tanto, los componentes que constituyen
“impurezas mayores” y deben ser removidas son las proteínas y el RNA.
(Surzycki S.,2003)
En los ácidos nucleicos, las bases nucleotídicas son los cromóforos, mientras que
los azúcares y los fosfatos que constituyen el eje catenario, tienen sus transiciones
a energías mayores. Las bases pueden ser protonadas y por lo tanto, los
espectros del DNA y RNA son sensibles al pH. A pH neutro, la absorción máxima
es de 253 nm (guanosina) y 271 nm (citosina), por consecuencia, un polímero de
DNA muestra una amplia y fuerte absorbancia a 260 nm. En DNA’s nativos, las
bases están orientadas al centro hidrofóbico de la doble hélice, por lo tanto, la
absorbancia es considerablemente menor que la de un DNA de cadena sencilla
donde las bases con anillos aromáticos expuestos al solvente. Como el espectro
de absorción para un ácido nucleico es graficado por monómero, podemos
esperar que el espectro de absorción sea el espectro promedio para las bases
ponderadas que lo componen de acuerdo a la composición del polímero y
modificadas por las interacciones. Las interacciones degeneradas dan una división
y una redistribución de la intensidad, pero no un cambio neto en la intensidad. Las
interacciones no degeneradas pueden llevar a un cambio neto en la intensidad en
el que la absorción del DNA por ejemplo en Escherichia coli es casi del 60% del
espectro promedio ponderado para las bases componentes.
La densidad óptica a 260 nm del DNA se incrementa si el DNA es calentado en un
rango de temperaturas específicas. La determinación de la densidad óptica en el
DNA nos permite conocer la estabilidad del DNA en relación con la temperatura,
pH, fuerza iónica. Entre las propiedades del DNA que se han determinado
utilizando esta técnica, se encuentran: i) La estabilidad del DNA se incrementa con
el contenido de G-C. ii) Si aumenta la temperatura al punto de máxima
absorbancia y después disminuye a una temperatura en la cual no se incrementa
la densidad óptica, la densidad óptica cae inmediatamente a su valor original,
indicando que si la separación de las dos cadenas no es completa, la estructura
nativa se regenera. iii) La separación de las cadenas no ocurre sino hasta que se
ha rebasado la región de transición óptica. iv) Si el DNA se calienta a temperaturas
que propicia la separación de cadenas y después se enfría, hay una disminución
de la absorbancia en presencia de una fuerza iónica alta (NaCl 0.1 M), debido a
que los puentes de hidrógeno intra e intercatenarios vuelven a formarse
aleatoriamente; esto quiere decir que cuando el DNA desnaturalizado se
encuentra en un ambiente de alta fuerza iónica, se regenera. v) La
renaturalización del DNA se presenta cuando en un ambiente de alta fuerza iónica
que varía de 0.5 a 1.0 M de NaCl y en una temperatura menor al punto de fusión
(Tm), en pocas horas la densidad óptica vuelve al valor inicial (antes de la
desnaturalización).[ CITATION Are04 \l 2058 ]
Desarrollo

Espectro de absorcion
0.12
0.1
Absorbamcia

0.08
0.06
0.04
0.02
0
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
Longitud de onda (nm)
Resultados
Longitu Absorbanci
d de a
onda
(nm)
200 0.018
210 0.065
220 0.036
230 0.03
240 0.074
250 0.104
260 0.062
270 0.056
280 0.043
290 0.017
300 0.012
Tabla 1. Lecturas de absorbancia
de la muestra obtenida a diferentes
longitudes de onda
 Absorbancias (nm) Concentración (µg/mL) Pureza
260 280 AS260/Ae*b (A) 260/280
(50)
0.062 0.043 2.75 3.1 1.44

Temperatura de desnaturalizacion (Tm)

0.9
0.8
0.7
Absorbancia a 260nm

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
58 63 68 73 78 83 88
Temperatura (ºC)

temperatur Absorbanci
a a a 260nm

60 0.306
65 0.313
68 0.317
70 0.32
72 0.324
74 0.568
75 0.686
76 0.758
78 0.788
80 0.795
84 0.796

Discusión
Conclusión
Referencias
1. Surzycki S., (2003). Human Molecular Biology: Laboratory Manual.
Massachusetts. Blackwell. 1-19 pp.
2. Arenas, S. I., & Sanchez, L. J. (2004). Espectrometria de absorcion. Universidad
Nacional Autonoma de Mexico, Cuernavaca. 30-33 pp.