Determinación de la concentración de sulfato de cobre pentahidratado

por espectrofotometría (Método adición estándar y Método de

estándar externo)

Daniela Katherine Rivera Suárez1, Laura Marcela FontalvoAdárraga1, Pablo

Andrés ballesteros castro1
1
, Facultad de quimica y farmacia, Universidad del atlántico, Km 7 Vía Puerto,
Barranquilla, Atlántico.
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Abstract.

En esta práctica determinamos la cantidad de cobre presente en una muestra problema.

Utilizando un espectrofotómetro y basándonos en la ley de Beer obtuvimos las
absorbancias de nueve muestras de una concentración determinada y realizamos una
curva de calibración para obtener el coeficiente de absortividad de los analitos presentes
y con el poder calcular la concentración de los mismos pero ahora en una muestra
problema.

Keywords: ley de Beer, sulfato de cobre, espectrofotómetro.

1. INTRODUCTION

La espectroscopia Visible y Ultravioleta se basa en la medición de la intensidad del color

(o de la radiación que se absorbe en UV) a una longitud de onda específica comparándola
con otras soluciones de concentración conocida (soluciones estándar) que tengan la
misma especie absorbente. Para tener esta relación se emplea la Ley de Beer, que
establece que, a mayor concentración, mayor será la absorbancia, es decir que la
absorbancia es directamente proporcional a la concentración. [1]

Los espectros de absorción molecular estarán constituidos por bandas que son la
resultante de la envolvente de las múltiples transiciones que pueden verse involucradas.
La ley de Lambert-Beer tiene ciertas limitaciones y en alguno casos la relación entre A y
C puede dejar de ser lineal y esto se debe a que esta ley solo se cumple si la concentración
de la muestra es baja, si la radiación utilizada es a nivel monocromático, si el único
mecanismo de interacción entre la radiación electromagnética y la muestra absorbente es
el de la absorción y las muestras absorbentes no deben sufrir cambios fotoquímicos. [2]

Los modelos de regresión analizan las variaciones de una variable cuantitativa continua,
la variable dependiente en función de una o más variables, las variables independientes.
Tanto la variable dependiente como la independiente deben ser cuantitativa continua. El
objetivo del análisis de regresión, es predecir los valores de la variable respuesta, en
función de los valores de las variables independientes y para que esta tenga sentido se
debe calcular la precisión en las estimaciones, es decir los intervalos de confianza de los
coeficientes. [3]
Espectrofotometría uv vis: Uno de los métodos de análisis más usados en la química
clínica es la espectrometría, la cual está basada en la absorción de fotones por el
analito. El espectro electromagnético se divide en tres distintas regiones de acuerdo con
la longitud de onda: La región ultra violeta (UV), la región visible (Vis) es la región de
longitudes de onda que puede ver el ojo humano; donde la luz aparece como color y la
región del infrarrojo (IR). El instrumento utilizado para este método de análisis es
el espectrofotómetro, sus componentes básicos son: una fuente de radiación que es
el área general del espectro electromagnético que se usa de acuerdo a las longitudes
de onda. El selector de longitudes de onda hace la separación y selección de longitudes
de onda presentes en la muestra. Un haz de referencia se transmite al detector y el haz de
muestra pasa a través de la misma antes de alcanzar el detector. Si esta muestra interactúa
con una longitud de onda en particular, es absorbida y la intensidad del haz de muestra
disminuye y el detector compara la intensidad de los haces de referencia y demuestra.

Espectro de absorción: Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es

una curva que muestra la cantidad de energía radiante absorbida, absorbancia, por la
sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una
determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad
de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto.

Fig. 1 Espectro de absorción de dos compuestos diferentes.

Ley de Lambert: Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática por un medio
homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al
espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida
disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio
absorbente.

Fig. 2. Ley de Lambert

La siguiente relación matemática da cuenta de esta ley: P / P0 = e–kb

Po: Intensidad de la luz incidente, P: Intensidad de la luz transmitida, b: Espesor del
medio absorbente, k: Constante. Cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la

2
longitud de onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza
del medio.

Ley de Beer: La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye

exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia
absorbente, cuando este haz pasa a través de un medio homogéneo.

Fig. 3. Ley de Beer

La relación matemática que da cuenta de esta ley se muestra a continuación : P / P0 = e-

k’c

Dónde: Po:Intensidad de la luz incidente, P: Intensidad de la luz transmitida, c:

Concentración de la solución, k: Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del
soluto, de la longitud de onda de la luz incidente, de la concentración de la solución, y
frecuentemente, de la naturaleza del medio.

Ley de Lambert-Beer:
Log P0 / P = a b c o A = a b c A = log P0 / P = - log T
Dónde:
a: Absortividad
b: Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)
c: Concentración de la solución, P/Po= T: Transmitancia.

Transmitancia (T): Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por una
muestra y la energía o luz incidente (P0) sobre ella. Tanto la energía radiante incidente
como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.

T = P / P0 = 10-abc ó %T = 100 P/P0

Se acostumbra a considerar la transmitida como la razón de la luz transmitida por la

muestra y la luz transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar puede ser el líquido
(solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco analítico (solución que contiene
todos los componentes de la solución problema menos la sustancia problema) u otra
sustancia elegida arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de este estándar no es
necesariamente 100%, es necesario especificar el estándar con el cual la muestra es
comparada.

Absorbancia(A): Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una

sustancia pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de la
transmitancia. T, transmitancia expresada como fracción decimal %T, transmitancia
expresada como porcentaje.

A = - log T = 2 – log %T, Pero. T = P / P0 = 10-abc

3
Luego A = - log (P / P0) = - log 10-abc
A=abc

Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la concentración, donde
a es una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a depender
de las unidades de b y c. Si la concentración c está expresada en moles por litro y la
longitud de la cubeta b en centímetros, la constante a recibe el nombre de absortividad
molar (ξ). Luego A = ξ b c [4]

Método de adición estándar

El método de adiciones estándar es un método de análisis cuantitativo, que a menudo se
utiliza cuando la muestra de interés tiene varios componentes que resultan en efectos de
matriz, donde los componentes adicionales pueden reducir o aumentar la señal de
absorbancia del analito. Resulta en errores significativos en los resultados del análisis.
Adiciones estándar se usan para eliminar efectos de matriz de una medición, puesto que
se asume que la matriz afecta a todas las soluciones igual. Además, se utiliza para corregir
la química fase separaciones realizadas en el proceso de extracción.
El método se realiza mediante la lectura de la intensidad (en este caso fluorescente)
experimental de la solución desconocida y luego midiendo la intensidad de lo
desconocido con cantidades variables de estándar conocido añadido. Los datos se trazan
como fluorescencia intensidad vs. La cantidad del estándar añadido (lo desconocido, con
ningún estándar añadido, se traza en el eje y). La línea de mínimos cuadrados se cruza
con el eje x en el negativo de la concentración de lo desconocido. [5]

Método estándar externo

Estándar Externo Se construye una curva de calibración con patrones o estándares de
concentración conocida. Se cuantifica la concentración del analito en la muestra por
comparación de la señal obtenida con la de los estándares. Todas las técnicas
instrumentales requieren calibración
S = f(𝐶)𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜
Las Soluciones Patrón o patrones de calibración son soluciones preparadas a partir del
analito a determinar. Solo sirven para realizar calibraciones ya que no se encuentran
presentes los componentes de la matriz que acompañan al analito en las muestras. [6]

2. EXPERIMENTAL

Espectroscopia de absorción molecular UV-VIS: determinación de CuSO4

 Se encendió el espectrofotómetro por medio de un switch que se ubica en la parte

trasera del instrumento analítico.
 Se observó que la pantalla del espectrofotómetro se encontrara encendida.
 Se esperó un lapso de 5 a 10 minutos a que el espectrofotómetro se calentara y se
diera el ajuste del prisma.
 Se hizo la selección de la longitud de onda con la que se trabajó (entre 400 y 1100).
 Se introdujo la muestra ubicando la parte lisa en la dirección de la radiación.
 Se usó una solución de 0.1 M de CuSO4.
 Se cerró el canal donde se ubica la muestra.

4
  Se observó la absorbancia respecto a cada longitud de onda, lo que dio paso para
la realización de 29 lecturas.

Espectrofotometría UV-VIS y regresión lineal simple

 Se abrió el equipo SHIMADZU presente en el computador.

 Se generó un usuario y una contraseña.
 Se esperó a que el sistema de UVProbe ver. 2.70 abriera por completo.
 Se lavó el cuarzo que ingresa a la máquina.
 Se añadió la muestra a analizar.
 Se limpió el cuarzo en la parte exterior para evitar errores al momento de realizar
la espectrofotometría.
 Se corrió el blanco de 1100 a 400 antes de colocar la muestra en la máquina.
 Se colocó el cuarzo dentro de la maquina (tomándolo por el lado esmerilado) una
vez estuviera abierta, observando que se encontrara ubicado de manera correcta y
en dirección a la radiación.
 Se cerró la máquina.
 Se presionó la opción de START para darle inicio a la lectura de la muestra.
 Se abrió una carpeta para guardar los procesos realizados para cada muestra.
 Se presionó la opción de aceptar una vez se haya creado el documento.
 Se comenzó la lectura de la muestra donde se dio inicio a la creación de una curva.
 Se realizó la prueba 2 veces por cada muestra enfocándonos en que estas iban de
mayor a menor concentración.

3. RESULTADOS Y DISCUSION

Disolución madre o patrón de CuSO4 5H2O Para preparar 100 mM a 50 ml

𝑊 = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 × 𝑉(𝐿) × 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛

𝑔
𝑊 = 249,68 × 0,05 𝐿 × 0,1 𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑜𝑙
𝑊 = 1,2484𝑔

A partir de la disolución madre o patrón de CuSO4 5H2O 100 mM preparamos 5

disoluciones estándares que se presentan en la figura 1. Determinamos en el espectro de
absorción de la disolución patrón en el espectrofotómetro UV-VIS en un intervalo de 400-
800 nm y de 1000 a 800nm y de 1000 a 800nm determinamos la longitud máxima donde
ocurre la mayor absorción de la disolución patrón tabla 1.
Al medir la absorbancia de cada disolución estándar a la longitud máxima de la figura 1
dieron los siguientes datos en la tabla 2.

5
 Figura 1 Preparación de las 5 disoluciones

Por la siguiente ecuacion hallamos las concentraciones de la figura 1 haciendo un despeje

𝐶 1 × 𝑉1 = 𝐶 2 × 𝑉2

V1 × C1
C2 =
V2

1ml × 100mM
C2 = = 4mM
25ml
1,5ml × 100mM
C2 = = 8mM
25ml
3ml × 100mM
C2 = = 12mM
25ml
6ml × 100mM
C2 = = 18mM
25ml
Tabla 1. Máxima absorción (disolución patrón)

Solución madre
Máxima absorción 810nm

Tabla 2.Absrovancia de cada disoluciones estándar

Estándares λ810 Tamaño de celda Absorbancia

1 4mM 1 cm 0,029
2 8 mM 1 cm 0,053
3 12 mM 1 cm 0,110
4 18 mM 1 cm 0,190
5 24mM 1 cm 0,252

6
 0.3
y = 0.0117x - 0.0254
0.25

0.2
absorbancia

0.15

0.1

0.05

0
0 5 10 15 20 25 30
concentracion

Figura 2. Curva de calibrado Absorbancia Vs Concentración

En la práctica de espectrofotometría ultravioleta visible se obtuvieron datos de la

absorbancia de muestras con diferentes concentraciones a una misma longitud de onda,
sabemos que la cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentración del soluto,
según la ley de Beer la intensidad de luz disminuye exponencialmente al aumentar
aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente por ende, la muestra que
tenía mayor concentración obtuvo una mayor absorbancia (figura 2)
Los estándares externos se usan para calibrar instrumentos y procedimientos cuando no
hay efectos de interferencia de la matriz de componentes sobre la disolución del analito.
La regresión lineal como método matemático es importante ya representa una relación
entre la absorbancia de la muestra y la concentración de ella permitiendo así determinar
la concentración a partir a ecuación de la recta dada por la pendiente y la ordenada al
origen que se usa en el método de los mínimos cuadrados lineales. Para determinar una
concentración desconocida x a partir de la recta de mínimos cuadrados, se obtiene el valor
de la respuesta del instrumento (Excel gráfica y arroja una ecuación) 𝑦𝑐 para la incógnita
(absorbancia), y la pendiente y la ordenada al origen, se usan para calcular la
concentración desconocida 𝑐𝑥 como se muestra en la ecuación

Tabla 3. Datos de la adición estándar

Estándar Volumen muestra Volumen estándar [ ] estándar mM

(mL)
0 3,0 0 0

1 3,0 1 0,8

2 3,0 2 1,6

7
 3 3,0 3 2,4

4 3,0 4 3,2

5 3,0 5 4,0

Luego de hacer las soluciones se analizó las muestras en el espectrofotómetro

determinando el valor de la absorbancia de dicha muestra.

Tabla 4. Estándar y absorbancia

ESTANDAR ABSORBANCIA
0 0,033
1 0,044
2 0,052
3 0,066
Figura 3, estándar vs concentración

0.07 0.066
y = 0.0107x + 0.0327
0.06
0.052
0.05 0.044

0.04
0.033

0.03

0.02

0.01

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Con la ecuación de la recta podemos hallar la concentración de la muestra desconocida:

𝑦 = 0,0107𝑥 − 0,0327

−𝑏
𝑋=
𝑚
−0,0327
𝑋= = −3,05 = |3,05|
0,0107
3,05𝑚𝑀×25𝑚𝑙
[Muestra problema]= = 29,1𝑚𝑀
3𝑚𝑙

8
El Análisis de Regresión Lineal Múltiple nos permite establecer la relación que se
produce entre una variable dependiente Y y un conjunto de variables independientes (X1,
X2,... XK). El análisis de regresión lineal múltiple, a diferencia del simple, se aproxima
más a situaciones de análisis real puesto que los fenómenos, hechos y procesos sociales,
por definición, son complejos y, en consecuencia, deben ser explicados en la medida de
lo posible por la serie de variables que, directa e indirectamente, participan en su
concreción
En la práctica se obtuvieron datos de la absorbancia de muestras con diferentes
concentraciones a una misma longitud de onda, se sabe que la cantidad de luz absorbida
es proporcional a la concentración del soluto, según la ley de Beer la intensidad de luz
disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la
sustancia absorbente por ende, la muestra que tenía mayor concentración obtuvo una
mayor absorbancia.

4. CONCLUSIONES

REFERENCIAS

[1] F. d. C. Químicas, «Espectrometría,» Universidad Autónoma de Chihuahua, México.

[2] S. G. R. D. P. Q. S. M. Z. Isabel Sierra Alonso, Análisis Instrumental, España:

Netbiblo, 2009.

[3] R. Á. Cáceres, Estadística aplicada a las ciencias de la salud, España: Díaz de Santos,
2007.
[4] Skoog A. D, Holler J. F, Nieman T .A. Principios de Análisis instrumental, 5𝑎 edición,
pp. 11-16 Grupo editorial Mc Graw Hill/ Interamericana de España, Aravaca (Madrid),
2001.
[5] https://www.jove.com/science-education/10201/mtodo-de-adicin-estndar?language=Spanish
[6] https://es.slideshare.net/RoyMarlonVergarayValle/introduccionaa-quimicaanalitica