Triploides naturales en las zonas de contacto entre diploide/tetraploide
Odontophrynus cordobae y O. americanus (Anura, Odontophrynidae)
Resumen. La poliploidización juega un papel importante en la especiación y evolución de los anuros. Sin embargo, algunos triploides estables y algunos individuos triploides aislados han sido reportados. Aquí, reportamos el descubrimiento de la presencia natural de triploides en zonas de contacto entre el diploide Odontophrynus cordobae y el tetraploide O. americanus del centro de Argentina, y proponemos valores del área de eritrocitos para la distinción de los niveles de ploidía. Un total de 101 personas de tres zonas de contacto y la ploidía de cada espécimen se identificó por el recuento medio de cromosomas y el tamaño de los eritrocitos. Veintitrés se identificaron especímenes triploides adultos (machos: n = 21; hembras: n = 2) de dos sitios de contacto (porcentaje de individuos por nivel de ploidía: sitio S2, 2n = 40,6%, 3n = 12,5%, 4n = 46,9%; sitio S3: 2n = 44,7%, 3n = 40,4%, 4n = 14,9%). Los valores límite de la zona nuclear de eritrocitos utilizados para distinguir entre los diferentes niveles de ploidía fueron de 23,62 μm2 (probabilidad de ser asignado a un nivel de ploidía respectivo = 94,78%) para la separación de diploides y triploides y 27,67 μm2 (98,62%) para triploides y tetraploides. El alto número de triploides adultos que ocurren en más de un sitio de contacto entre O. cordobae y O.americanus indica que no es un evento aislado. Sin embargo, se necesitan más estudios para proporcionar una hipótesis sobre el origen y evaluar el posible mantenimiento de triploides en sintopía con O. cordobae y O. americanus. INTRODUCIÓN Mientras que la poliploidía es generalmente más rara en los animales que en las plantas; se ha reportado en varias invertebrados y organismos vertebrados (véase Gregory y Mable, 2005). En particular, la poliploidía juega un papel importante en la especiación y la evolución en anuros (Bogart, 1980) con cerca de 50 especies de poliploides descritas en múltiples familias, incluidas las especies de reproducción bisexual con varios niveles de ploidía (Mable, Alexander y Taylor, 2011; Evans, Pyron y Wiens, 2012). Sin embargo, pocas especies de triploides estables o poblaciones y algunos individuos triploides aislados han sido reportados en anuros (Evans, Pyrony Wiens, 2012). Consecuentemente, las ocurrencias de nuevos casos de poliploidía natural, así como la coexistencia y el potencial reproductivo de interacciones con otras especies con diferentes niveles de ploidía son particularmente interesantes en ecología y perspectiva de evolución (Petit, Bretagnolle y Felber, 1999). El Tetraploide Odontophrynus americanus (Duméril y Bibron, 1841) fue el primer registro de un poliploide natural (4n =44 cromosomas) encontrados en una especie de vertebrado bisexual (Beçak, Beçak y Rabello,1966). Más tarde, Las poblaciones del diploide morfológicamente críptico fue también detectado (2n = 22) (Beçak, Beçak y Vizotto, 1970). Actualmente, las poblaciones de tetraploide y diploide O. americanus está muy extendida en Brasil, Paraguay, Uruguay y Argentina (Barrio y Pistol de Rubel,1972; Martino y Sinsch 2002; Rosset et al. 2006). En Argentina, donde las poblaciones tetraploides están ampliamente distribuidas (Martino y Sinsch, 2002) las poblaciones diploides de O. americanus fueron reportadas sólo en tres puntos distantes geográficamente: noreste, noroeste y el centro de Argentina (fig. 1A; Beçak, Beçak y Vizotto, 1970; Barrio y Pistol de Rubel,1972; Bogart y Wasserman, 1972; Martinoy Sinsch, 2002; Rosset et al., 2006). Mientras el status taxonómico de la mayoría de las poblaciones diploides sigue sin resolverse, las poblaciones diploides del centro de Argentina fueron revisados por Martino y Sinsch (2002) y usando datos morfológicos, etológicos y los caracteres moleculares, fueron finalmente descritas como una nueva especie, Odontophrynus cordobae (Martino y Sinsch, 2002). En el centro-sur parte de la provincia de Córdoba, tetraploide O. americanus y O. cordobae diploide se presentan como un mosaico de poblaciones que coexisten en sintopía a través de los límites de distribución de ambas especies, representando hasta ahora el único contacto conocido entre estas dos especies (fig. 1B;Martino y Sinsch, 2002; Grenat et al., 2009;Grenat, Valetti y Martino, 2013). Porque estas especies son morfológicamente indistinguible, numerosas poblaciones a lo largo del rango de distribución de O. americanus y O.cordobeses han sido estudiados citogenéticamente y la mayoría muestran un cariotipo conservador con pequeñas variaciones en la morfología de algunos grupos de cromosomas, específicamente en O. cordobae (Beçak, Beçak y Rabello, 1966; Barrio y Pistol de Rubel, 1972; Ruiz, 1980; Schmid et al. al., 1985; Roset et al., 2006; Salas y Martino, 2007). La ubicación de las constricciones secundarias varía entre cariotipos diploides y tetraploides se encuentra principalmente en los cromosomas de grupos cuatro y 11, respectivamente (Roset et al..,2006). Hasta la fecha, sólo se ha registrado un caso único de triploidía que surge potencialmente por autopoliploidía en una población diploide de O. americanus de noreste de Argentina (Rosset et al.al., 2006). La mayoría de las poblaciones que habitan el área de contacto entre O. cordobae y O. americanus fueron visitado en varias ocasiones y nuevos análisis citogenéticos y eritrométricos se realizaron. (Barale et al., 1981; Martino y Sinsch,2002; Grenat, Salas y Martino, 2009, 2012;Otero et al., 2013). Aquí, reportamos la primera evidencia por la presencia de muchos triploides naturales individuales en dos localidades que se han originado en la autopoliploidía de O.cordobae o hibridación con O. americanus en el centro de Argentina. En ambas localidades, los especímenes de triploide se presentan en sintopía con el diploide O. cordobae y tetraploide O. americanus. Además, porque estas especies y el novedoso reporte de los triploides son morfológicamente crípticos, nosotros desarrollamos un método basado en el tamaño nuclear de los eritrocitos, para la distinción de los niveles de ploidía.(Grenat, Salas y Martino, 2009; Otero et al..,2013) que no requiere sacrificios, ni cariotipos individuales. MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio y muestreo: Odontophrynus cordobae y O. americanus se reproducen durante meses australes de primavera-verano (septiembre-marzo) y la actividad reproductiva diaria tiene lugar principalmente entre 2000 y las 500 horas. Muestreos anteriores que cubrían un área, cerca de 45.000 km2 por nuestro grupo de investigación produjeron 30 poblaciones de O. cordobae y O. americanus a través del centro sur Córdoba, Argentina (fig. 1B; Martino y Sinsch, 2002, 2009; Grenat, Salas y Martino, 2012; Grenat, Valetti y Martino, 2013). En particular, los límites de distribución de las especies, y, en consecuencia, el área de contacto potencial entre estas especies fueron identificadas (fig. 1B, rectángulo gris: NW coordenadas de la esquina: 32°31S, 64°62W; coordenadas de la esquina SE:32°46S, 64°16W). Esta área se caracteriza principalmente por un paisaje agrícola, que está fragmentado por caminos rurales y profundos barrancos vegetados con un típica detrítica red de drenaje. Al oeste, el área de estudio es limitada. por el piedemonte del extremo sur de la Sierra de Comechingones. Aquí se distribuyen O. americanus y O. cordobae como un mosaico de poblaciones y coexisten en algunos criaderos (Grenat, Salas y Martino, 2009; Grenat, Valetti e Martino, 2013). Entre 2006 y 2015, hemos identificado tres sitios de reproducción sintópicos distanciados entre sí entre sí entre 8 y 10 km y recogió 101 individuos (S1, n = 22; S2, n = 32; S3,n = 47) que fueron analizados para el nivel de ploidía. Dos sitios corresponden a estanques artificiales semipermanentes relacionados con la agricultura de cerdos y el resto del sitio estaba ubicado en una depresión de inundación de un campo agrícola. CARIOTIPADO Se analizó la ploidía de los individuos mediante citogenética y la eritrometría (Grenat, Salas y Martino, 2009;Grenat y otros, 2009; Otero y otros, 2013). Realizamos pruebas citogenéticas analiza 49 de 101 especímenes sintópicos. En algunos casos, el cariotipo no dio como resultado una metafase satisfactoria. Por lo tanto, se obtuvieron spreads exitosos de 42 individuos (S1: n = 7; S2: n = 27; S3: n = 8). Cada individuo fue inyectado intraperitonealmente con 0.2 ml (por cada 10 g de peso) de una solución de colchicina al 0,03%. 8-12 horas antes de la eutanasia en tricaina metansulfonato MS-222). Las preparaciones cromosómicas fueron obtenidas a partir de epitelio intestinal macerado a partir de Schmid (1978). La tinción se realizó con Giemsa diluido al 10%. en tampón- fosfato (pH 6,8) durante 10 minutos. Las metafases fueron examinadas usando el microscopio Axiophot (Carl Zeiss) en Ampliación de 1000× con Canon Powershot G6 Digital Cámara y ZoomBrowser EX. La ploidía de los individuos se determinó contando los cromosomas de la metafase. El cariotipo de individuos triploides se organizaron utilizando el método programa Adobe® Photoshop™ CS2. Se obtuvieron muestras de sangre de 101 individuos por angulosis punción venosa inmediatamente después de ser recolectada (Nöller, 1959; Martino y Sinsch, 2002) y frotis de la sangre fresca se secaba al aire libre. Porque los jóvenes podrían tener valores de área de eritrocitos significativamente más bajos, entonces, analizamos sólo animales adultos según la recomendación de Grenat (2009). Asumimos que todos los individuos son adultos porque los machos fueron capturados emitiendo su llamado de y las hembras fueron encontradas en ampollas. Individuos que no se utilizaron para el análisis citogenético fueron regresados a sus respectivos sitios de recolección. Las fotografías de las células sanguíneas se obtuvieron utilizando un microscopio Axiophot (Carl Zeiss) con aumento de 1000× con una cámara digital Canon Powershot G6 y ZoomBrowser EX, y guardado en archivos TIFF. Medimos Longitud (L) y anchura (W) de 40 eritrocitos elegidos aleatoriamente. y sus respectivos núcleos para todos los individuos (Grenat et al., 2009) utilizando el software ImageJ. Área celular y nuclear se calcularon asumiendo una forma elipsoidal (L×W×π/4).Las diferencias en las mediciones celulares entre los niveles de ploidía fueron probado con ANOVA. Después de Grenat, Salas y Martino (2009) y Otero(2013), usamos distribuciones de probabilidad para calcular el valor límite del área del eritrocito y la probabilidad a la que, por debajo o por encima de ese valor, pertenece un individuo a uno u otro nivel de ploidía. Porque Otero et al.(2013) demostraron una mayor precisión utilizando áreas nucleares en lugar de áreas celulares para clasificar a los individuos de Odontophrynus dentro de un determinado nivel de ploidía, usamos sólo eritrocitos nucleares en este análisis. Para estimar los valores límite utilizó individuos previamente cariotipados, en los que la ploidía fue confirmada por medio del recuento de cromosomas. Además, probamos la eficacia de los rangos obtenidos para el diploide y células tetraploides utilizando el modelo propuesto por Otero et al. (2013) basado en el tamaño nuclear de los eritrocitos del cariotipo alopáticoindividuos de O. cordobae y O. americanus. No se encontró superposición de las áreas nucleares eritrocitarias entre diploide, triploide y tetraploide. Sobre la base de estos resultados, clasificamos al resto de los individuos sintópicos. RESULTADOS Análisis citogenético El análisis citogenético detectó tres niveles DE PLOÍDIAS en la muestra: 2n = 22, 3n = 33 y 4n = 44 cromosomas (fig. 2). Individuos triploides fueron descubiertos en dos sitios (S2 y S3), coexistiendo con diploides y tetraploides (S2: 2n = 10, 3n = 3, 4n = 14; S3: 2n = 3.)3n = 4, 4n = 1), mientras que en el sitio restante sólo se encontraron dos niveles de ploidía (S1: 2n = 2, 4n = 5). Los cariotipos estudiados de individuos triploides mostraba la misma estructura básica que el diploide Odontophrynus cordobae y tetraploide O. americanus, con tres grupos principales de cromosomas que se distinguen: tres grandes (trillizos 1-3), cuatro medianas (4-7) y cuatro pequeñas (4-7) (8-11) conjuntos de elementos (fig. 3). Seis trillizos de metacéntrico y cinco trillizos de cromosomas submetacéntricos fueron observados: Grupos 1-2, 5, 7 y 10-11 son metacéntricos; los grupos 3-4, 6 y 8-9 son submetacéntricos (fig. 3). Constricciones secundarias no se observaron en ninguno de los triploides cariotipos. Identificación del nivel de ploidía por medios área nuclear de eritrocitos: Valores medios y rangos de áreas nucleares de eritrocitos de individuos cariotipados incluyeron en la estimación de valores limite:: O. cordobae (n = 15): 20.73 μm2 (15.62- 22.54 μm2); especímenes triploides (n =7): 25.34 μm2 (24.07-26.66 μm2); O. americanus (n = 20): 32,69 μm2 (29,64-38,21 μm2). Diferencias significativas en las áreas nucleares entre niveles de ploidía se encontraron: (ANOVA, F2,39 =165.44;p < 0.0001). El límite del modelo obtenido para separar individuos diploides y triploides que usan áreas nucleares de 23.62 μm2 (probabilidad de que se le asigne a un nivel de ploidía respectivo = 94,78%) mientras que el límite para distinguir entre individuos triploide y triploide fue de 27,67 μm2 (98,62%); (fig 4) Los individuos no cariotipados fueron clasificados sobre la base de estos valores límite. Valores medios y rangos para individuos no cariotipados fueron: diploide O. cordobae (n = 24): 19,48 μm2 (15.85-22.43 μm2); especímenes triploides (n =16): 25.05 μm2 (24-26.25 μm2); tetraploide O. americanus (n = 19): 32.08 μm2 (28.39-) 37,05 μm2). No se encontraron diferencias significativas dentro de cada nivel de ploidía en la zona nuclear entre los individuos incluidos en el análisis de valores límite y los demás individuos: O. cordobae (ANOVA, F1,37 = 2,65; P = 0,119); triploide (ANOVA, F1,21 = 0,72; P = 0,4054); O. americanus (ANOVA, F1,37 =0.14; P = 0.7065) (fig. 4). En todos los casos, ambos valores máximos de rango de los individuos más bajos de la ploidía (O. cordobae) y zonas nucleares mínimas de mayor y zonas nucleares mínimas de individuos de alta ploidía (O. americanus) no superó el límite calculado para un valor correcto de identificación de los niveles de ploidía (fig. 5). Basado en el análisis de funciones discriminantes (DFA) en individuos cariotipados (n = 42) brindaron dos funciones discriminantes. La función 1 fue altamente significativo (varianza explicada= 95.5%;Wilks') lambda = 0,0634504; correlación canónica = 0,0634504 0,9525; p < 0,0001) y estaba fuertemente relacionado con anchura nuclear (coeficiente normalizado = 1,5 mm) 0,5905) y longitud (coeficiente normalizado = 0,5905) y longitud (coeficiente normalizado = 0,5905). 0.5323). Las funciones obtenidas correctamente clasificadas 100% de los individuos a los respectivos nivel de ploidía. Luego, usamos estas funciones para clasificar a los individuos no cariotipados (n = 59). Todos los individuos (100%) fueron reclasificados dentro del mismo grupo al que pertenecían anteriormente, asignados utilizando los valores límite de las zonas nucleares (fig. 6). La media de Célula eritrocitaria y área nuclear para cada nivel de ploidía y lugar de muestreo, teniendo en cuenta todas las personas, se muestran en el cuadro 1. Celular superficie (F2,76 = 63,69), longitud (F2,76 = F2,76) 48,28) y la anchura (F2,76 = 49,26) también mostró diferencias muy significativas entre los niveles de ploidía (ANOVA, P < 0,0001). El área de la célula no está correlacionado con SVL (O. cordobae: r = -0,009; P < 0,9554/especímenes triploides: r = 0,024; P < 0,9118/O. americanus: r = −0.128;P <0.4355). Después de la clasificación de la ploidía y considerando todos los individuos recolectados en los tres sitios,nuestros resultados muestran la presencia de triploides en los sitios S2 y S3. Todos los individuos triploides eran machos excepto dos hembras recogidas en el sitio S3. El porcentaje de individuos por cada nivel de ploidía en el sitio fue S1: 2n = 22,7% (n = 5), 4n = 77,3%. (17); S2: 2n = 40,6% (13), 3n = 12,5% (4),4n = 46,9% (15), y en el emplazamiento S3: 2n = 44,7%.(21), 3n = 40,4% (19), 4n = 14,9% (7). DISCUSIÓN Los análisis citogenéticos y eritrométricos en individuos de las zonas de contacto entre el diploide O.cordobés y tetraploide O. americanus revelaron tres niveles de ploidía. Importantemente, en dos sintópicos descubrimos un número de individuos triploides. La triploidía es rara en poblaciones naturales de anuranos porque los eventos de poliploidización son generado principalmente por dos vías, desde una (autopoliploidía) o de eventos interespecificos de hibridación (alopoliploidía; Bogart y Bi, 2013). Un individuo autopoliploide puede ser el resultado de la fecundación de un gameto diploide no reducido o alternativamente de la fecundación de un óvulo haploide por más de un espermatozoide (Otto y Whitton, 2000; Choleva y Janko,2013). En los anuros, los autotriploides espontáneos ya han sido reportados para poblaciones diploides de los géneros Lithobates (Richards y Nace,1977; Wiley y Braswell, 1986), Leiopelma(Green, Kezer y Nussbaum, 1984), Eupsophus(Formas, 1994), Bufotes (Odierna et 2004; Borkin et al., 2007; Fakharzadeh et al. al., 2015), Holoaden (Campos et al., 2012), Strauchbufo (Litvinchuk et al., 2012), Xenopus (Schmid, Evans y Bogart, 2015), Pelophylax (Litvinchuk, Skorinov y Rosanov, 2015), y Bombina (Litvinchuk y Rosanov, 2016). Sin embargo, en todos los casos sólo uno o muy pocos los especímenes triploides en poblaciones diploides sugieren que la triploidía en estas especies es una condición inusual. En el género Odontophrynus, Rosset y otros (2006), identificaron mediante citogenética un individuo triploide natural en una población diploide de O. americanus de la provincia de Misiones, Argentina. Asumieron que podría haber surgido por autotriploidía pero agrega que la existencia de poblaciones de diploides y tetraploides simétricos en la zona no permite descartar un posible híbrido origen. Sin embargo, los nuevos registros de especímenes triploides en esta área no han sido reportados. El origen triploide por hibridación es menos frecuente. Las poblaciones alotriploides naturales solo se conocen de los géneros Pelophylax y Bufotes. El complejo Pelophylax esculentus se compone de dos especies parentales, P. lessonae (genoma LL) y P. ridibundus (RR), y sus híbridos naturales P. esculentus (LR). Hibridogenética los linajes incluyen diploide (RL) también como híbridos triploides, con una dosis doble de P. ridibundus o P. lessonae genoma (RRL, RLL), que a menudo forman poblaciones totalmente híbridas (véase Graf and Polls Pelaz, 1989; Christiansen, 2009). En el segundo caso, el complejo de Bufotes viridis representa el único sistema anuran descrito con tres niveles de ploidía que se reproducen bisexualmente (2n, 3n, 4n), todos ellos en Asia Central (Stöck et al., 2002, 2005). En este complejo de especies, triploide B. baturae, potencialmente originario de la hibridación entre diploides B. shaartusiensis y B. latastii (Betto-Colliard et al.., 2015; Ficetola y Stöck, 2016), se compone exclusivamente de todas las poblaciones de triploides que se reproducen bisexualmente por un mecanismo llamado "preecualización meiosis híbrida" (Stöck et al., 2002). No obstante, los alotriploides procedentes de hibridación natural entre parientes cercanos incluyen un número bajo de híbridos encontrados (Bufotes, Stöck y otros, 2010; Phyllomedusa, Haddad, Pombal y Batistic, 1994; Hyla, Gerhardt et al., 1994). En el género Odontophrynus se ha reportado una hibridación natural entre tetraploide O. americanus y los cultripes diploides de O. de Brasil. (Ruiz, Bonaldo y Beçak, 1980). Además, se obtuvieron híbridos triploides artificiales por el apareamiento de hembras 4n O. americanus con 2n machos de O. americanus, O. y O. carvalhoi (Beçak, Beçak and de Langlada, 1968; Beçak y Beçak, 1970). Estos ejemplos muestran que el aislamiento reproductivo en el género podría basarse en la premaduración y no resulta de una viabilidad reducida de híbridos. En este contexto, el actual descubrimiento de la naturaleza de triploides del género Odontophrynus representa un hallazgo extraordinario por varias razones. En primer lugar, la aparición de la triploidía y la tetraploidía ejemplifica el alto nivel de genómica plasticidad en este grupo de especies. Segundo, el alto número de individuos triploides encontrados demuestra su alta viabilidad. Además, la relación edad-tamaño en O. cordobae y O. americanus (Martino y Sinsch, 2002) sugiere que todos los individuos triploides (gama SVL= ) eran adultos de al menos dos o tres años de edad. Este es un punto importante porque los Poliploides con números impares de cromosomas exhiben baja viabilidad y fertilidad (Esposo, 2004; Choleva y Janko, 2013). Publicidad de machos triploides en los dos sitios y se observaron hembras triploides en ampollos en el sitio S3, pero actualmente no tenemos evidencia de la fertilidad de los individuos 3n. La aparición de triploides en más de un sitio demuestra que el proceso que conduce a su origen no es un hecho aislado y raro. Además, no podemos descartar la presencia de triploides en el sitio S1 debido al bajo número de individuos recolectados y analizados por citogenética. Para el sitio S3, el número individuos cariotipicos es igualmente bajo, pero aún así el porcentaje de individuos triploides encontrados fue alto. En ambos casos, el análisis del tamaño de los eritrocitos mostraron resultados similares para toda la muestra, en el cual, no se identificó ningún triploide en el sitio S1 y un alto porcentaje de triploides fueron que se encuentra en el sitio S3. La eritrometría, contrariamente a la citogenética, es un método que no requiere sacrificar a los individuos y ha demostrado ser un potente herramienta con un alto nivel de precisión para resolver el problema de distinguir a los individuos vivos con diferentes niveles de ploidía (George y Lennartz, 1980; Grenat et al., 2009; Otero et al., 2013; nuestro estudio). En este momento, sólo podemos especular sobre el origen triploide y la interacción entre individuos sintópicos con diferentes niveles de ploidía. La ocurrencia de individuos triploides exclusivamente en zonas de contacto, pero no en poblaciones diploides puras de O. cordobae (Grenat et al., 2009; Grenat, Salas y Martino, 2009, 2012; Grenat y Martino, 2013; Grenat, Valetti y Martino,2013) sería coherente con la hipótesis de origen híbrido. La distribución desigual de poblaciones de diploides y tetraploides en el área de estudio y la disponibilidad de reproducción potencial pueden aumentar la posibilidad de hibridación. Aunque la ubicación de constricciones secundarias (CC) en diferentes cromosomas (4 y 11) podrían haber evidenciado un posible origen híbrido, los SCs no fueron observados en cualquiera de los cariotipos triploides. En consecuencia, estudios adicionales usando tinción de plata(Ruiz, Soma y Beçak, 1981) podrían revelar la localización de organizadores nucleolares (NOR) asociado a constricciones secundarias en cariotipos triploides. Alternativamente, los triploides en poblaciones mixtas con especies diploides y tetraploides podrían actuar como intermediarios en el establecimiento de auto o alotetraploides al proporcionar una via adicional de la formación de poliploides (Ramsey y Schemske, 1998; Husband, 2004; Barker et al.., 2016). En este proceso, se pueden producir tetraploides en dos pasos, a través de un "puente triploide",un proceso que implica la producción de gametos no reducidos en dos generaciones sucesivas (Ramsey y Schemske, 1998; Barker et al.al., 2016). Sin embargo, este proceso es principalmente conocido en plantas con muy pocos casos detectados en los animales. Un ejemplo en Amphibia podría ser el Bufo pewzowi alotetraploide Bufo para el cual un potencial aumento a través de un alotriploide intermedio no puede descartarse (Stöck et al., 2010). En resumen, nuestros resultados no permiten una distinción entre un origen auto y alopoliploide de Odontophrynus triploids. Se necesitan más análisis moleculares (alozimas y marcadores basados en el ADN) y citogenéticos, para proporcionar un hipótesis fiable sobre el origen de los triploides. Además, el hallazgo de que se ha producido tripliodes naturales sólo en poblaciones mixtas de Odontophrynus plantea muchas preguntas sobre las interacciones entre los diferentes niveles de ploidía, estrategias de reproducción, aptitud, dispersión y características ecológicas de los triploides que deben tenerse en cuenta a diferentes escalas espaciales y temporales.