Practica 1

12/09/2018
Practico 2

Extracción y purificación de ADN genómico

La extracción de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios

de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En el caso del ADN, la
extracción consiste en su aislamiento y purificación basándose en las características fisicoquímicas
de la molécula.
El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) es un método
adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y está
especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de
otro modo, alterarían la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado
con frecuencia en genética molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validación
para detectar OGMs.

Principios del método del CTAB: homogenización, lisis, extracción y precipitación:

- Homogeneización mecánica: incluye el uso de Nitrógeno líquido, este procedimiento consiste en

macerar la muestra con nitrógeno líquido, en un mortero de porcelana, hasta obtener un polvo
muy fino. El nitrógeno líquido, congela de inmediato la muestra y evita que se formen cristales en
el interior de la célula que rompen la estructura celular e inicie el proceso de degradación.

- Lisis de la membrana celular: La primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la

membrana celular y nuclear, las células vegetales pueden lisarse con el detergente CTAB (con
previa ruptura mecánica en mortero). Dado que la composición de los lípidos y del detergente es
similar, el CTAB captura los lípidos que integran la membrana celular y nuclear liberándose el ADN
genómico.

- Extracción: En esta etapa es especialmente importante eliminar los polisacáridos y los

compuestos fenólicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones enzimáticas. En concentraciones
hiposalinas los contaminantes de los complejos de ácidos nucleicos no precipitan y pueden
eliminarse extrayendo la solución acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las
proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa suele constituir la
fase superior. Si es preciso, la extracción con cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto
de eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa.

- Precipitación: La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración.

Se basa en la deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente
etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación.
Practica 1
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Objetivos

1. Realizar la extracción y purificación de ADN genómico mediante el método CTAB

2. Visualizar la calidad del ADN extraído
3. Comprender la función de cada uno de los reactivos utilizados para la extracción y
purificación del ADN genómico

Metodología (Método CTAB por Doyle et al. (1990))

1.- Pesar 0,4‐0,5 g. de material vegetal, triturar en mortero con nitrógeno líquido y agregar 0,1 g.
de polivinilpirrolidona (PVPP).

2.- Mezclar 5 ml de Buffer CTAB con β‐Mercaptoetanol al 2%. Vórtex. Agregar a mortero

3.- Transferir el contenido del mortero a 5 tubos eppendorf de 1,5 mL (700 μl a cada tubo)

4.- Incubar 30 min. a 65° C, mezclando periódicamente.

5.- Añadir igual volumen de Cloroformo/Alcohol Isoamílico 24:1 (700 μl). Agitar vigorosamente y
centrifugar a 13000 rpm por 10 min a temperatura ambiente.

6.- Recuperar el sobrenadante y añadir igual volumen de isopropanol (‐20° C). Homogenizar por
inversión a ‐80° C por 30 min. (o 2 hrs. a ‐20° C o a 4°C toda la noche).

7.- Centrifugar a 13000 rpm por 10 min. Eliminar sobrenadante sin perder el pellet.

8.- Resuspender el pellet en 100 μL de agua estéril, y agregar 1 μL de RNAsa (10 mg/ml). Incubar a
37° C durante 15 min.

9.- Agregar un volumen de cloroformo/alcohol isoamílico 24:1 (100 μl). Centrifugar a 13000 rpm
por 10 min.

10. Recuperar el sobrenadante y agregar 2,5 volumenes de etanol puro (-20° C). Precipitar a -80° C
durante 30 min. y centrifugar a 13000 rpm por 10 min.

11.- Resuspender el pellet obtenido en agua estéril (50-100 μl, según la cantidad final de pellet
obtenido).

12.- Visualizar calidad de DNA extraído en gel de agarosa al 1% con buffer TAE y teñido con
RedGel.

Comentarios
1. La molienda se realiza en morteros de porcelana, previa esterilización de éstos, los
que son mantenidos a ‐20° C.
2. Previamente el agua debe estar a 65° C y se resuspende suavemente el pellet.
Ref.: Doyle, J. J., Doyle, J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. 12:12‐15
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