Lab de Principios de Bioquimica

UNIVERSIDAD
NACIONAL DE COLOMBIA

LABORATORIO DE PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA

2017010

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

FACULTAD DE CIENCIAS

SEDE BOGOTÁ

GUÍAS DE LABORATORIO

Agosto, 2018

2
CONTENIDO

PRÁCTICA NOMBRE PÁGINA

0 Normas de trabajo en el Laboratorio 4

1 Extracción y cuantificación de ácido ascórbico 9

2 Estudio de la actividad enzimática de la catalasa 18

Determinación de proteínas mediante los métodos
3 30
de Biuret y Kjeldahl

4 Fraccionamiento de tejidos I: Carbohidratos y ADN 42

5 Fraccionamiento de tejidos II: Lípidos 53

6 Fraccionamiento de tejidos III: Proteínas 62

7.1 Purificación de la favina I: Extracción de Proteínas 70

7.2 Purificación de la favina II: Cromatografía de Afinidad 76

7.3 Purificación de la favina III: Electroforesis 82

- ANEXO 1: PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO 89

3
PRÁCTICA 0

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

OBJETIVOS

1. Aplicar el concepto de Seguridad en el Laboratorio.
2. Reconocer señales y símbolos relacionados con la Seguridad en el Laboratorio.
3. Conocer las normas generales de Seguridad en el Laboratorio.

INTRODUCCIÓN

El trabajo en el Laboratorio de Bioquímica es una labor segura, siempre y cuando se
cumplan todas las normas exigidas para el desarrollo del mismo. La seguridad de los
experimentadores depende de un conjunto de protocolos de trabajo que contempla el
conocimiento de los riesgos potenciales, las normas de prevención y las acciones a
ejecutar en caso de ocurrir un accidente.

El trabajo en el Laboratorio de Bioquímica no es peligroso, pero existe la posibilidad
de accidentes debido al manejo inadecuado de sustancias químicas y de fluidos
biológicos potencialmente infecciosos. Por tal razón, es indispensable la preparación
previa de las prácticas de laboratorio, mediante la elaboración de pre-informes que
incluyen las Fichas de Manejo de las sustancias a utilizar.

ETIQUETADO DE REACTIVOS QUÍMICOS

Las etiquetas de los reactivos químicos identifican la sustancia e incluyen información
general, constituyéndose como la primera fuente de información de seguridad para su
manejo. Internacionalmente, se utiliza un sistema codificado de colores que informa
los riesgos y la severidad de los mismos del siguiente modo:

4
Adicionalmente, las etiquetas de los reactivos químicos contienen información en
forma de símbolos que indican, entre otros aspectos:

Sustancias Sustancias Sustancias
inflamables explosivas corrosivas

Sustancias Sustancias Sustancias nocivas
tóxicas radiactivas para la salud

NORMAS DE SEGURIDAD

La seguridad, como prevención, se define por una serie de barreras como:

Primarias: Localizadas alrededor del origen del riesgo.
Ejemplo: realizar la práctica adecuadamente.

Secundarias: Localizadas alrededor del practicante.
Ejemplo: llevar el pelo recogido, las uñas cortas, utilizar pipeteadores, etc.

Terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio.
Ejemplo: no sacar ningún material tóxico del laboratorio.

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NORMAS SOBRE EL MANEJO DE REACTIVOS QUÍMICOS

• Verificar el grado de peligrosidad • Leer cuidadosamente la etiqueta
de la sustancia a trabajar de identificación del reactivo

• Verificar que se esté usando la • No manipular los frascos de los
sustancia adecuada reactivos por el cuello del envase

• Mantener los frascos cerrados y en • Al diluir ácidos fuertes, añadir
el sitio dispuesto para tal fin lentamente el ácido al agua,
nunca al contrario
• No transportar los reactivos • Evitar el contacto con piel, ojos,
comunes al puesto de trabajo, sus mucosas y la ingestión accidental
compañeros también los utilizarán de los reactivos

NORMAS SOBRE EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

• No comer, beber, fumar, almacenar alimentos ó aplicar cosméticos
• Portar guantes, gafas y bata blanca de laboratorio
• Usar máscara antigás cuando sea necesario
• Lavar y secar las manos antes y después de realizar la práctica
• Realizar todos los procedimientos técnicos en la forma indicada
• Limpiar superficies de mesones antes y después de realizar la práctica
• No pipetear con la boca, usar pipeteadores o pipetas automáticas
• No pipetear varias sustancias con el mismo instrumento
• No mezclar sustancias sin conocimiento de su comportamiento
• No trabajar con equipos eléctricos si se presentan derrames sobre ellos
• Usar campanas de extracción cuando se generen gases tóxicos o irritantes
• Emplear escobilla (churrusco) para el lavado de material
• Limpiar y secar el puesto de trabajo al finalizar la práctica

MANIPULACIÓN DE MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO

En el desarrollo de las prácticas, se empleará material de vidrio que debe manipularse
cuidadosamente para evitar su quiebre, potenciales heridas y gastos económicos.
Adicionalmente, los equipos como balanzas, centrífugas, micropipetas, agitadores,
espectrofotómetros y destiladores, entre otros, se utilizarán bajo la supervisión de los
docentes siguiendo las debidas precauciones e instrucciones de operación.
6
PREPARACIÓN Y EVALUACIÓN DE LAS PRÁCTICAS

Quizzes: evaluaciones cortas, orales o escritas, que se realizan antes de iniciar la
práctica correspondiente. Pretenden evaluar el grado de preparación del estudiante
para realizar la práctica.

Pre-Informes: escritos individuales elaborados siempre a mano que presentan los
siguientes ítems:

Introducción: componente teórico relacionado con el tema de la práctica.
Objetivo general y específicos: metas que se alcanzarán desarrollando la práctica.
Metodología: diagrama de flujo que indica el procedimiento experimental a ejecutar.
Tablas y gráficas: utilizadas para consignar los datos adquiridos en la práctica.
Fichas de manejo: información de los reactivos químicos a utilizar en la práctica.
Bibliografía: soporta de la información presentada en el pre-informe.

El pre-informe será requisito indispensable para ingresar al laboratorio.

Datos de la práctica: al finalizar la práctica, cada grupo debe entregar una tabla de
los datos obtenidos durante la misma, la cual es necesaria para poder entregar el
informe en la siguiente sesión.

La no entrega de la tabla de datos, indica la no obtención de resultados necesarios
para realizar el informe.

Informe de la práctica: escritos por grupo de trabajo elaborados siempre a mano que
presentan datos, resultados, análisis, discusión y conclusiones de la práctica. Se
entregan a la semana siguiente de la realización de las prácticas. Adicionalmente,
incluirá el desarrollo del cuestionario correspondiente a cada práctica.

El informe será requisito indispensable para ingresar a las evaluaciones parciales del
laboratorio.

Evaluaciones parciales de las prácticas: sesiones que se realizarán en el mismo
horario de laboratorio, en las cuales se evaluarán los contenidos desarrollados en las
prácticas. Se realizarán dos (2) evaluaciones durante el semestre; éstas pueden ser
orales y/o escritas y se realizarán de forma individual o por grupos de trabajo.

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CUESTIONARIO

1. ¿Qué son las claves internacionales R-S? Explique su funcionamiento y
mencione tres ejemplos.

2. ¿Cuáles son los riesgos biológicos más frecuentes que se pueden presentar en
un laboratorio de Bioquímica?

3. ¿Qué son las cifras significativas y cuáles son las reglas básicas para su manejo?
Mencione algunos ejemplos.

4. ¿Dónde se localizan los siguientes elementos del Laboratorio de Bioquímica
330? Realice un esquema (plano) indicando la ubicación de:

Almacén de reactivos Máquina de hielo
Balanzas Nevera
Botiquín Potenciómetro
Cabinas de extracción Recipientes de desechos
Casilleros Salidas de emergencia
Centrífugas Puesto de trabajo
Extintores Termostatos
Lava ojos

5. ¿En cuál recipiente de desechos se deben descartar los siguientes reactivos?
Para ello, describa qué sustancias se pueden desechar en cada uno de los
recipientes. Indique la composición de los reactivos marcados con asterisco (*).

Acetona Ninhidrina
Ácido nítrico Nitroanilina
Ácido molíbdico *Reactivo de Benedict
Cloroformo *Reactivo de Biuret
Cloruro de sodio *Reactivo de Lugol
Hidróxido de amonio *Reactivo de Millon
Permanganato de potasio *Reactivo de Molisch

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PRÁCTICA 1

EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO

OBJETIVO

Aplicar un método simple para extraer y cuantificar el contenido de ácido ascórbico o
vitamina C en frutas y/o verduras.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Algunos siglos atrás, hacia el año 1300, durante extensos viajes en altamar, se
registraban numerosas muertes en las tripulaciones marítimas. La causa, un déficit
vitamínico (avitaminosis o hipovitaminosis) de ácido ascórbico o vitamina C, que
conllevaba al desarrollo de una condición patológica denominada escorbuto.

Esta enfermedad se caracteriza por una degeneración del tejido conectivo, el cual está
constituido principalmente por fibras de colágeno. Debido a que la vitamina C es
requerida para la hidroxilación de residuos de prolina y lisina del colágeno, su déficit
genera fibras inestables cuyos síntomas principales incluyen hemorragias, pérdida de
dientes, cicatrización insuficiente, fatiga e infecciones respiratorias.

En términos químicos, la vitamina C o ácido ascórbico, es una cetolactona de seis
carbonos (C6H8O6) que se oxida con facilidad al ambiente. La mayoría de animales
sintetizan vitamina C a partir de glucosa en una ruta bioquímica de cuatro reacciones
catalizadas enzimáticamente. Sin embargo, algunos mamíferos como los gorilas, los
murciélagos de la fruta y los humanos, han perdido la última enzima de la ruta de
síntesis de ácido ascórbico, que cataliza la conversión de L-gluconolactona en ácido L-
ascórbico, razón por la cual debe obtenerse de la dieta.

Como su nombre lo indica, el ácido ascórbico, al ser un ácido libera protones (H+)
disminuyendo el pH de una solución. Esta propiedad favorece que el ácido ascórbico
participe en reacciones REDOX como agente reductor (cede electrones a otras
moléculas reduciéndolas a expensas de su oxidación), lo cual es relevante desde el
punto de vista bioquímico. Al reaccionar con especies reactivas de oxígeno, la
vitamina C evita la oxidación de otras moléculas esenciales para la célula como los
fosfolípidos de las membranas biológicas y el ácido ribonucleico (ARN). Por lo tanto, la
vitamina C es un anti-oxidante vital para los seres vivos.
9
La oxidación del ácido ascórbico genera ácido dehidroascórbico, como se ilustra en la
siguiente figura:

Ácido ascórbico Ácido dehidroascórbico

El oxígeno, los iones metálicos, el pH, la luz y la temperatura son algunos de los
factores que conducen a la oxidación de la vitamina C. Adicionalmente, diversas
enzimas utilizan dicha vitamina como agente reductor en las reacciones que catalizan.

Las frutas cítricas, guayabas, tomates, fresas, verduras verdes y papas, son fuentes
ricas de vitamina C. Los jugos de naranja y limón presentan una concentración de
ácido ascórbico aproximada de 0.5 mg/mL (2.8 mM). En vegetales puede presentarse
en forma libre (ácido ascórbico) o en forma combinada (ascorbígeno). Esta forma no
es detectada por los métodos corrientes de análisis a menos que se hidrolice a ácido
ascórbico, hirviendo el material con solución de ácido oxálico.

El fundamento del método que se aplicará en la presente práctica de laboratorio, se
basa en la cuantificación espectrofotométrica del complejo de color rojo violeta que
resulta al final de las reacciones, permitiendo la determinación del ácido ascórbico.

ESPECTROFOTOMETRÍA

Espectrofotometría es el sistema de análisis basado en las medidas de la intensidad de
la luz que pasa a través de una solución utilizando diferentes longitudes de onda (λ), la
cual se define como la distancia entre dos picos cuando la luz recorre un camino en
forma ondulatoria.

Numerosas sustancias químicas absorben luz de la región visible o ultravioleta del
espectro electromagnético. Esta propiedad es aprovechada para determinar la
concentración de dichas sustancias. Para esto, se hace pasar un rayo de luz de longitud
de onda específica, a través de una solución de la sustancia a cuantificar.
10
La cantidad de luz absorbida por dicha solución depende de tres factores: el tipo de
sustancia, su concentración y la distancia que debe recorrer el haz luminoso dentro de
la solución. En los análisis espectrofotométricos se utilizan como fuente de luz,
lámparas de tungsteno y de deuterio, para la región visible y ultravioleta (UV),
respectivamente. La longitud de onda de máxima absorbancia, la cual depende de la
sustancia a analizar, se selecciona con un monocromador.

La luz de intensidad inicial (Io) se pasa a través de una celda o cuveta que contiene la
solución de interés, la cual absorbe una parte de la luz incidente. La intensidad de la
luz transmitida se denomina I y es menor a Io. La absorbancia (A) de la solución se
define como Log10 Io/I y su relación con el tipo de sustancia, su concentración y la
distancia que debe recorrer el haz de luz, se explican con las siguientes leyes:

Ley de Lambert: relaciona la intensidad de la luz trasmitida y el espesor de la celda o
camino recorrido por la radiación luminosa. La expresión matemática es:

e = Base de logaritmos naturales
I = Io e-K1.L L = Distancia que debe recorrer el haz luminoso dentro de la celda (cm)
K1 = Constante característica de la sustancia coloreada

Ley de Beer: relaciona la intensidad de la luz trasmitida con la concentración de la
sustancia coloreada dentro de la solución. La expresión matemática es:

C = Concentración de la solución coloreada (M)
I = Io e-K2.C
K2 = Constante de la sustancia coloreada

Las dos leyes pueden combinarse en una, conocida como Ley de Lambert-Beer, cuya
expresión matemática es: I = Io e-K.C.L

Despejando y convirtiendo a logaritmo decimal: Log10 Io/I = 0.4343 K.C.L

Como se mencionó anteriormente, Log10 Io/I es igual a la absorbancia (A), mientras
que el valor 0.4343 K corresponde al coeficiente de extinción óptica específico de la
sustancia analizada (ε), cuyas unidades son [M-1 . cm-1]. Reemplazando en la ecuación:

A = ε.C.L LEY DE LAMBERT-BEER

11
Enzymes 103
A. Principle of spectrophotometry

Monochroma-
Monochroma-
White light
Luz blanca Luz monocromática
tic light, Luz monocromática
tic light,
de intensidad I
intensity 0o de intensidad I
intensity

Absorbancia
Absorption
Fuente de luz
Light source Monocromador
Monochromator Detector
Detector Registrador
Instrument
Light
Absorción Sample solution,
Solución de
absorption
de luz concentration
muestra c

Absorption A = –log
ABSORBANCIA A = Log
I = ε . c . d Beer Lambert
10 Io/I = ε.C.L LEY DE LAMBERT-BEER
I0 law

B.Funcionamiento básico de un espectrofotómetro. Figura adaptada del Color Atlas of Biochemistry.
Assay of lactate dehydrogenase activity

v ∆A ∆A ∆c
Por su parte, la transmitancia (T) de la luz no absorbida se define como:
2.0 ε =
∆c
; ∆t · ε = ∆t = ; v ≈ Activity
Lactate
Pyruvate 0.1 mM
T = I/Io NAD each
1.5 NADH
Absorption
A menudo, la transmitancia se expresa como porcentaje:

Addition 3 nkat
Absorption (340 nm)
1.0
%T = (I/I o) x 100 of LDH 2 nkat
NADH

Despejando y ordenando la ecuación:
0.5 Lactate; NAD 1 nkat
Lactate
∆A
Io/I = 100 / %T NAD Pyruvate
0 0
Aplicando logaritmo decimal: ∆t

1. 240 280 320 360 400 2. Time
Wavelength (nm)
Log10 Io/I = log 100 – log %T
C. Enzymatic determination of glucose
Dado que Log10 OI2o/I = A, entonces la relación matemática entre transmitancia y
absorbancia es: Glucose-containing
sample solution

Glucose Glucono-
Glucose oxidase lactone
A = 2 – Log10 %T 1.1.3.4 [FAD]
Absorption (440 nm)

Enzymes
2 H2O H 2O 2 Colorless
precursor
∆A
[Green dye]∞ = —
∆A
ε
Green Peroxidase Colorless [Green dye]∞ = [Glucose]0
dye 1.11.1.7 precursor
[Heme]
0 10 20
Time (min) 12
1. Reaction 2. Procedure
REACTIVOS

• Ácido oxálico 0.15% (P/V)
• Agua destilada
• Etanol absoluto
• 2 Frutas cítricas o verduras (Deben traerlas los estudiantes)
• NaOH 10% (P/V)
• 2-nitro anilina 0.16% (P/V) en ácido acético glacial:HCl 10% (V/V) (9:1)
• Nitrito de sodio 0.08 % (P/V), recién preparado
• Patrón de vitamina C 0.2 mg/mL, recién preparado

Nota: evitar la exposición del patrón de vitamina C a la atmósfera, debido a que es un
compuesto fácilmente oxidable.

PROCEDIMIENTO

1. Registrar el peso de las muestras, exprimirlas y medir el volumen total del
zumo.

2. Tomar 1 mL de zumo y agregar 4 mL de ácido oxálico 0.15% (P/V), mezclar y
filtrar si es necesario (emplear 2 capas de gasa y un embudo para tal fin).
Cuando trabaja con frutas no exprimibles o verduras, pesar 1 g de las mismas y
macerar con 4 mL de ácido oxálico 0.15% (P/V). Estas preparaciones
constituyen las muestras (M).

Nota: cuando las muestras M de las frutas y/o verduras presentan coloración, debe
preparar un tubo Blanco Problema con todos los reactivos (incluyendo la muestra)
excepto NaOH. Al realizar los cálculos, el valor de absorbancia de este Blanco
Problema se debe descontar del valor de absorbancia de las muestras.

3. En 12 tubos de ensayo CORRECTAMENTE marcados, agregar los siguientes
reactivos:

FRUTA 2
REACTIVOS BLANCO PATRONES FRUTA 1
BLANCO O VERDURA
(mL) PROBLEMA
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2 M3 M4
2-Nitroanilina 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Nitrito de sodio 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

13
4. Agitar y observar decoloración. Si no se produce decoloración, agregar 0.1 mL
adicionales de nitrito de sodio y restar del volumen de agua. Luego, adicionar:

FRUTA 2
BLANCO O VERDURA
(mL) PROBLEMA
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2 M3 M4
Etanol absoluto 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Patrón vit. C
- - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - - - -
0.2 mg/mL
Ácido oxálico
0.6 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 - 0.3 - 0.3 -
0.15% (P/V)
Muestra - 0.3 - - - - - - 0.3 0.6 0.3 0.6

5. Mezclar y dejar en reposo 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, adicionar:

FRUTA 2
BLANCO O VERDURA
(mL) PROBLEMA
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2 M3 M4
NaOH
0,6 - 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
10% (P/V)
Agua destilada 2.6 2.9 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6

6. Mezclar bien el contenido de cada tubo y leer en el espectrofotómetro a 540nm.

RESULTADOS

1. Completar las siguientes tablas de datos:

TABLA 1. Datos de las muestras analizadas.
MUESTRA PESO (g) VOLUMEN DE ZUMO (mL)

TABLA 2. Datos registrados a partir de análisis espectrofotométricos.
FRUTA 2
BLANCO PATRONES FRUTA 1
BLANCO O VERDURA
PROBLEMA
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2 M3 M4
Absorbancia

inicial 540 nm
Absorbancia
- -
corregida 540 nm
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2. Realizar los cálculos correspondientes para determinar el contenido de ácido
ascórbico en los patrones y completar la siguiente tabla:

TABLA 3. Concentración de vitamina C en los patrones.
P1 P2 P3 P4 P5 P6
Concentración (mg/mL)

3. Construir una curva de calibración graficando: Absorbancia 540 nm VS
Concentración de ácido ascórbico (mg/mL) de los patrones. Determinar la
ecuación de la recta resultante y el valor del coeficiente de regresión (R2).

4. Calcular la concentración de vitamina C en las muestras M, interpolando en la
curva de calibración su absorbancia corregida y usando la ecuación de la recta
obtenida.

5. Teniendo en cuenta las diluciones realizadas a lo largo del protocolo,
determinar el contenido total (en mg) de ácido ascórbico en las muestras M y
en las frutas analizadas.

6. Realizar los cálculos correspondientes para determinar el porcentaje (P/P) de
ácido ascórbico en las frutas analizadas y comparar los resultados con reportes
de literatura.

CUESTIONARIO

1. Escriba las reacciones químicas de las diferentes pruebas realizadas.

2. ¿Cuál es la función del ácido oxálico en la práctica?

3. ¿Por qué se realiza el análisis en el espectrofotómetro a 540 nm?

4. ¿Qué función realizan las muestras BLANCO en la práctica?

5. ¿Qué sucedería si se cuantifica el ácido ascórbico de un zumo de fruta en
diferentes tiempos después de haberse obtenido (inmediatamente, 1 y 10
horas después)? ¿Por qué se presenta este fenómeno?

6. ¿Qué sucedería si la extracción de la vitamina C se realiza a partir de vegetales
cocidos? Explique.

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REFERENCIAS

Frankenburg FR. Vitamin discoveries and disasters. History, science and
controversies. ABC-CLIO. 2009. Santa Barbara, California, USA. Capítulo 5

Koolman J, Roehm KH. Color Atlas of Biochemistry. 2nd edition. Georg Thieme
Verlag. 2005. Stuttgart, Germany. Página 103

Tsao CS, Packer L, Fuchs J. An overview of ascorbic acid chemistry and
biochemistry. J Fac Pharm. 2009; 38(3): 233–55

16
EXTRACCIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO
Pesar una
fruta cítrica
Extraer el zumo y
medir su volumen
Filtrar el zumo a través de 2 capas

de gasa utilizando un embudo
Mezclar: 1 mL de zumo +
4 mL de ácido oxálico 0,15% (P/V)
M1 M2
Agitar y MARCAR:
“Muestra Problema (M) 1, 2, 3, etc…”

CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO
MUESTRAS
BLANCOS PATRONES
Naranja Limón
ORDEN MARCAR TUBOS B1 B2 1 2 3 4 5 6 M1 M2 M3 M4
ADICIONAR LOS SIGUIENTES

REACTIVOS (mL)
2-nitro anilina 0.16% (P/V): 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
HCl 10% (V/V) (9:1)
Nitrito de sodio 0.08 % (P/V) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
AGITAR HASTA OBSERVAR DECOLORACIÓN
Etanol Absoluto 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Solución de vitamina C 0.2 mg/mL - - 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - - - -
Solución de ácido oxálico 0.15% (P/V) 0,6 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 - 0,3 - 0,3 -
Muestra Problema - 0,3 - - - - - - 0,3 0,6 0,3 0,6
MEZCLAR E INCUBAR 5 MINUTOS A

TEMPERATURA AMBIENTE
NaOH 10% (P/V) 0,6 - 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
H2O 2,6 2,9 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6
1 2 3 4 5 6 M1 M2 M3 M4
B1 B2
AGITAR Y MEDIR ABSORBANCIA A 540 nm
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PRÁCTICA 2

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA

OBJETIVO

Evidenciar la actividad enzimática de la catalasa y evaluar el efecto del pH, la
concentración de enzima, la concentración de sustrato y la presencia de inhibidores.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los organismos que viven bajo condiciones aeróbicas dependen del oxígeno
molecular para obtener energía química en forma de ATP, mediante procesos
bioquímicos como la fosforilación oxidativa. Uno de los sub-productos de dicho
proceso es el peróxido de hidrógeno (H2O2), un agente oxidante fuerte que afecta
estructuras celulares y biomoléculas esenciales para la célula.
La catalasa (código enzimático 1.11.1.6) es una enzima que protege a las células de los
efectos tóxicos del H2O2, siendo una de las enzimas más eficientes de la naturaleza. Se
ha calculado que una única molécula de esta proteína cataliza la conversión de hasta
4x107 (40 millones) moléculas de H2O2 por segundo. La catalasa se encuentra en
organismos procariotas y eucariotas, en éstos últimos se localiza, mayoritariamente,
en organelos denominados peroxisomas. Sin embargo, también se ha reportado en
mitocondrias y citoplasma.

De acuerdo con la base de datos BRENDA (https://www.brenda-enzymes.org) y
dependiendo del organismo, la catalasa exhibe rangos amplios de peso molecular y
punto isoeléctrico. Estructuralmente, la catalasa presenta un grupo prostético
(molécula orgánica unida de manera covalente que contribuye con la función
enzimática) denominado grupo hemo. La catalasa, los citocromos, la hemoglobina, la
mioglobina y las peroxidasas, constituyen el grupo de las hemo-proteínas.

La catalasa es altamente específica y cataliza la siguiente reacción:

catalasa
2H2O2 2H2O + O2

18
En la descomposición enzimática del H202, éste se une al grupo hemo de la catalasa y
se descompone en agua y oxígeno atómico. El átomo de oxígeno se enlaza con el
átomo de hierro presente en el grupo hemo y desde allí es transferido hacia una
segunda molécula de H2O2, formando una nueva molécula de agua y oxígeno
molecular. La energía de activación de la reacción catalizada por la catalasa es tan solo
de 23 kJ/mol, lo cual, en comparación con la reacción no catalizada, conlleva a un
factor de aceleración de 1.3 x 109 veces.
En términos de estructura cuaternaria, se han reportado oligómeros de dos, cuatro y

seis subunidades (dímeros, tetrámeros y hexámeros, respectivamente) para la
mayoría de catalasas. Sin embargo, la catalasa del hongo Neurospora crassa funciona
en estado monomérico. En todos los casos, cada subunidad contiene un grupo hemo,
como se indica para la catalasa humana de la siguiente figura:

Catalasa humana, código 1DGB en el Banco de
Grupo hemo
Datos de Proteínas (PDB)

En cuanto a los parámetros cinéticos de la catalasa y dependiendo del organismo, la
constante de Michaelis-Menten varía entre 0.025–1722 mM, mientras que su pH y
temperatura óptima de reacción comprenden rangos entre 4–10.5 y 15–90ºC,
respectivamente.

Diversos compuestos químicos han sido reportados como inhibidores de las catalasas,
como óxido nítrico (NO), metanol (CH3OH), ditiotreitol (DTT) y el ion cianuro (CN-),
entre otros. En el caso particular del NaCN, su mecanismo de inhibición es irreversible,
uniéndose y bloqueando el grupo hemo. Adicionalmente, inhibe el complejo
enzimático citocromo c oxidasa de la cadena transportadora de electrones, afectando
la síntesis de ATP. Por tal razón, el NaCN es un compuesto tóxico que debe ser
manipulado con precaución.

La actividad enzimática de la catalasa tanto en extractos proteicos como en
preparaciones puras, se mide de diversas formas. En la presente práctica, se verificará
19
mediante la titulación del H2O2 no catalizado (residual) con permanganato de potasio
(KMnO4), después de detener la reacción con ácido sulfúrico.

La reacción de titulación es la siguiente:

2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 2MnSO4 + 5O2 + 8H2O + K2SO4

REACTIVOS

• Amortiguador fosfatos 20 mM, pH 4, 5, 6, 7 y 8
• 2 habichuelas frescas (Deben traerlas los estudiantes)
• H2SO4 6 N
• KMnO4 5 mM
• NaCN 0.05 nM
• Solución de H2O2 50 mM, recién preparada en amortiguador fosfatos pH 7

PROCEDIMIENTO

Nota: para el desarrollo de la práctica se debe tener en cuenta el siguiente aspecto:
los experimentos se realizarán a 4ºC (baño de hielo), por lo tanto los reactivos y los
tubos que se utilizarán deben encontrarse a esta temperatura. Esta condición es
necesaria debido a la alta velocidad de reacción de la enzima.

Preparación del extracto enzimático de catalasa:

1. En un mortero colocar 5 g de habichuela bien lavada y picada en trozos
pequeños. Adicionar 10 mL de agua destilada fría y macerar hasta obtener un
extracto coloreado uniforme.

2. Transferir el extracto a un tubo Falcon y centrifugar a 6000 rpm por 5 minutos.
Obtener el sobrenadante y completar con agua destilada fría a 20 mL. Agitar
suavemente y conservar a 4ºC.

Esta muestra constituye el Extracto Enzimático que contiene la catalasa a estudiar.

20
A. Estudio del efecto del pH sobre la actividad enzimática:

1. En el baño de hielo colocar 6 tubos de ensayo rotulados. Luego, adicionar:

TUBOS
REACTIVOS (mL) T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 7
Amortiguador del pH correspondiente 10 10 10 10 10 10
H202 50 mM 2 2 2 2 2 2
Extracto Enzimático 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -

2. Agitar los tubos e incubar por 5 minutos en el baño de hielo. Luego, adicionar:

TUBOS
REACTIVO (mL) T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 7
H2SO4 6 N 2 2 2 2 2 2,5

3. Transferir el contenido de cada tubo a un erlenmeyer (utilice uno para cada
tubo) y titular el H202 remanente con KMnO4. El punto final de la titulación se
alcanza cuando aparece un color rosado claro permanente.

B. Estudio del efecto de la concentración de enzima:


TUBOS
REACTIVOS (mL)
T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
Amortiguador de pH 7 10 9,5 9 8,5 8 10,5
H202 50 mM 2 2 2 2 2 2
Extracto Enzimático 0,5 1 1,5 2 2,5 -


TUBOS
REACTIVO (mL)
H2SO4 6 N 2 2 2 2 2 2

21
C. Estudio del efecto de la concentración de sustrato:


TUBOS
REACTIVOS (mL)
Amortiguador de pH 7 11,5 11 10,5 10 9,5 10
H202 50 mM 0,5 1 1,5 2 2,5 2,5
Extracto Enzimático 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -


TUBOS
REACTIVO (mL)
H2SO4 6 N 2 2 2 2 2 2


D. Estudio del efecto del inhibidor NaCN sobre la actividad enzimática:


TUBOS
REACTIVOS (mL)
Amortiguador de pH 7 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 10,5
H202 50 mM 2 2 2 2 2 2
NaCN (μL, adicionar con micropipeta) - 50 100 150 200 200
Extracto Enzimático 1 1 1 1 1 -


TUBOS
REACTIVOS (mL)
H2SO4 6 N 2 2 2 2 2 2

22

RESULTADOS

1. Con los datos obtenidos para cada uno de los efectos desarrollados durante la
práctica (Efectos A-D), construya y complete la siguiente tabla:

Nota: utilizar la titulación de los tubos control para determinar las micromoles
iniciales de H202 que se adicionaron en cada efecto.

TABLA 1. Datos y resultados obtenidos en el estudio de la actividad enzimática de la catalasa.
μmoles de H2O2
mL KMnO4 μmoles de H2O2 μmoles de H2O2 μmoles de H2O2
TUBO descompuestas/min*
gastados iniciales residuales descompuestas
mL enzima
1
2
3
4
5
CONTROL - - -

2. Construir una gráfica de Actividad enzimática VS pH.

3. Construir una gráfica de Velocidad de reacción (µmoles de H2O2
descompuestas/min) VS Concentración de enzima (volumen de extracto).

4. Construir una gráfica de Actividad enzimática VS Concentración de sustrato.

5. Construir una gráfica de barras de Actividad enzimática VS Cantidad de
inhibidor.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué indica cada uno de los números del código enzimático de la catalasa?

2. En la práctica se estudiaron algunos factores que afectan la actividad
enzimática de la catalasa. ¿Qué otros factores tendrían que evaluar para
completar el estudio cinético de la enzima? Explique.
23

3. ¿Cuáles diferencias existen entre la acción de la catalasa y la peroxidasa?
Construir un cuadro comparativo.

4. ¿Cuál es la función del H2SO4 durante la práctica? ¿Por qué no se aplica
simultáneamente con los demás reactivos? ¿Se podría sustituir el H2SO4 por
hidróxido de sodio (NaOH)? Justifique su respuesta.

REFERENCIAS

Koolman J, Roehm KH. Color Atlas of Biochemistry. 2nd edition. Georg Thieme
Verlag. 2005. Stuttgart, Germany. Página 24

Nelson DL, Cox, MM. Lehninger. Principles of Biochemistry. 6th edition. W.H.
Freeman & Company. 2014. New York, USA. Capítulo 6

Putnam CD, Arvai AS, Bourne Y, Tainer JA. Active and Inhibited Human Catalase
Structures: Ligand and NADPH Binding and Catalytic Mechanism. J Mol Biol. 2000;
296: 295-309
24
EXTRACCIÓN DE LA CATALASA
Pesar 5 g de habichuela
fresca
Macerar en frío con 10 mL

de agua destilada
Centrifugar el extracto coloreado a

6000 rpm por 5 minutos
Tomar el sobrenadante y adicionar

agua destilada hasta volumen de 20 mL
Marcar como Conservar

“Extracto Enzimático” en hielo
25
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DE LA CATALASA
•  Amortiguador de fosfatos pH 4, 5, 6, 7, 8
•  H2O2 50 mM en amortiguador de pH 7
REACTIVOS •  Extracto Enzimático
•  H2SO4 6N
•  KMnO4 5 mM
Control (-)
pH pH pH pH pH pH
4 5 6 7 8 7
10 mL de
amortiguador
H2O2 (mL) 2 2 2 2 2 2
Extracto Enzimático (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
Agitar e incubar la reacción sobre hielo durante 5 minutos
H2SO4 (mL) 2 2 2 2 2 2,5
Para cada uno de los 6 tubos, realizar el siguiente procedimiento :
1. Transferir 2. Titular 3. Punto Uinal
Medir volumen
KMnO4 de KMnO4
gastado
26
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA
•  Amortiguador de fosfatos pH 7
•  H2SO4 6N
•  KMnO4 5 mM
Control (-)
10 9,5 9 8,5 8 10,5

mL mL mL mL mL mL
Amortiguador
pH 7
H2O2 (mL) 2 2 2 2 2 2
Extracto Enzimático (mL) 0,5 1 1,5 2 2,5 -
H2SO4 (mL) 2 2 2 2 2 2
1. Transferir 2. Titular 3. Punto Vinal
Medir volumen
KMnO4 de KMnO4
gastado
27
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE
LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA
•  H2SO4 6N
•  KMnO4 5 mM
Control (-)
11,5 11 10,5 10 9,5 10

Amortiguador
pH 7 (mL)
H2O2 (mL) 0,5 1 1,5 2 2,5 2,5

Extracto Enzimático (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
H2SO4 (mL) 2 2 2 2 2 2
1. Transferir 2. Titular 3. Punto Xinal
Medir volumen
KMnO4 de KMnO4
gastado
28
EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA DE LA CATALASA
•  H2SO4 6N
•  KMnO4 5 mM
•  NaCN 0,05 nM
Control (-)
9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 10,5

Amortiguador
pH 7 (mL)
H2O2 (mL) 2 2 2 2 2 2
NaCN (μL, utilizar micropipeta) - 50 100 150 200 200
Extracto Enzimático (mL) 1 1 1 1 1 -
H2SO4 (mL) 2 2 2 2 2 2
1. Transferir 2. Titular 3. Punto final
Medir volumen
KMnO4 de KMnO4
gastado
29
PRÁCTICA 3

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE LOS MÉTODOS DE
BIURET Y KJELDAHL

OBJETIVO

Comparar dos métodos de cuantificación de proteínas (Biuret y Kjeldahl) desde el
punto de vista de sensibilidad y rapidez.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Las proteínas son las biomoléculas más abundantes y estructuralmente diversas del
mundo natural. Todas se componen de aminoácidos y tienen diferentes funciones,
incluyendo: catálisis, control metabólico, defensa inmunológica, sostén y transporte,
entre muchos otros. En diferentes especies, una misma proteína presenta variaciones
estructurales, a pesar de desempeñar una función semejante.

Los aminoácidos de las proteínas se caracterizan por la presencia de cuatro grupos
químicos distintos (excepto la glicina) unidos covalentemente a un mismo átomo de
carbono, conocido como carbono α (alfa). Los cuatro grupos son: 1) grupo amino. 2)
grupo carboxilo. 3) átomo de hidrógeno. 4) cadena lateral denominada grupo R, la
cual, según sus características químicas, es utilizada para la clasificación de los
aminoácidos.

A través de sus grupos amino (-NH2) y carboxilo (-COOH), los aminoácidos reaccionan
entre si, estableciendo un enlace covalente denominado enlace peptídico. La unión de
varios aminoácidos conduce a la formación de oligopéptidos (2-10), polipéptidos (11-
100) y proteínas (más de 100 aminoácidos). Los extremos de la molécula resultante
que contienen los grupos amino y carboxilo intactos, correspondientes al primer y
último residuo de aminoácido de la cadena, se denominan extremos N y C terminal,
respectivamente.

Las proteínas pueden plegarse de diferente manera, estableciendo los siguientes
niveles de organización:

Estructura primaria: secuencia de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos,
generando una cadena polipeptídica.

30
Estructura secundaria: conformación local que asume la cadena polipeptídica
logrando su estructura más estable. Puede ser en forma de hélices α, hojas β y giros β.

Estructura terciaria: se define como la disposición de todos los átomos de una
proteína en el espacio. Surge cuando las estructuras secundarias se pliegan entre si,
generando una estructura tridimensional compleja de orden superior. En la estructura
resultante, los aminoácidos hidrofóbicos se ubican hacia el interior de la proteína,
alejándose del agua del medio, mientras que los aminoácidos hidrofílicos se ubican
hacia la periferia de la proteína.

Estructura cuaternaria: asociación de dos o más cadenas polipeptídicas, cada una con
su propia estructura terciaria definida. Se establecen homo-oligómeros y hetero-
oligómeros, cuando las cadenas son iguales o diferentes entre sí, respectivamente.

INTERACCIONES ESTABILIZADORAS DE LAS ESTRUCTURAS PROTEICAS
Estructura Estructura Estructura Estructura
primaria secundaria terciaria cuaternaria
Puentes disulfuro
Enlace peptídico
Puentes de hidrógeno, Puentes salinos, Interacciones hidrofóbicas
Aminoácidos Hoja β Hélice α Hojas β

Polipéptido 1
Hélices α
Polipéptido 2

La mayoría de interacciones que estabilizan las proteínas son no covalentes, por lo
tanto, el calentamiento de las mismas conduce a su ruptura y a la pérdida de las
estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas. En este caso las
proteínas experimentan el fenómeno de desnaturalización. Otros factores que pueden
desnaturalizar proteínas incluyen: valores extremos de pH, solventes orgánicos y
detergentes.

Por otra parte, el estado nativo de una proteína, aquel en el cual éstas son
funcionalmente activas, se mantiene cuando las interacciones que estabilizan sus
estructuras se conservan.
31
SOLUBILIDAD Y PRECIPITACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

La solubilidad de las proteínas depende de factores intrínsecos e extrínsecos. El
principal factor intrínseco que influye en la solubilidad de las proteínas corresponde
al tipo de aminoácidos presentes en la superficie de las mismas. Por su parte, los
factores extrínsecos incluyen el pH, la temperatura, la presencia de solventes
orgánicos y la fuerza iónica de la solución.

Las proteínas son electrolitos multivalentes y se comportan de manera similar a los
iones simples, cumpliendo la teoría de Debye-Hückel. En este sentido, bajas
concentraciones de sal en el solvente estabilizan los grupos cargados de las proteínas,
aumentando su solubilidad (solubilidad por salado o “Salting in”). El fenómeno
contrario (precipitación por salado o “Salting out”) se observa a altas fuerzas iónicas,
como resultado de la competencia entre la proteína y los iones de la sal por las
moléculas de agua de solvatación.

La solubilidad de la mayoría de las proteínas, a una fuerza iónica constante, presenta
un mínimo en su punto isoeléctrico, dado que a este valor de pH las repulsiones
electrostáticas entre las moléculas de soluto son mínimas. Los solventes orgánicos
como la acetona, el isopropanol y el cloroformo son buenos precipitantes, debido a
que presentan una baja constante dieléctrica.

Según su solubilidad, las proteínas se clasifican en los siguientes grupos:

GRUPO SOLUBLES EN INSOLUBLES EN EJEMPLOS
Agua
Soluciones de sulfato de
Soluciones diluidas de Lactalbúmina
amonio (NH4)2SO4
Albúminas sales como el NaCl
saturadas al 80 % P/V
Ovoalbúmina
Soluciones ácidas y Seroalbúmina
Coagulan por calor
básicas diluidas
Soluciones diluidas de Agua y soluciones de Ovoglobulina
sales como el NaCl (NH4)2SO4 saturadas al Seroglobulina
Globulinas Soluciones ácidas y 50 % P/V Legumina (globulina
básicas diluidas Coagulan por calor de semilla)
Alcohol 60-80% (V/V) Gliadina del trigo
Agua y etanol absoluto
Prolaminas Soluciones ácidas y
No coagulan por calor
Hordeína de la avena
básicas diluidas Zeína del maíz
Solventes neutros,
Soluciones ácidas y soluciones salinas y Glutelina del trigo
Glutelinas básicas diluidas alcohólicas Orizeína del arroz
Coagulan por calor
Agua y soluciones ácidas y Colágeno
Escleroproteínas - básicas diluidas, salinas y
alcohólicas, resistentes a
Elastina
Fibroina
las enzimas proteolíticas Queratina
32
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Existen diversos métodos para determinar el contenido proteico de una muestra.
Entre éstos se incluyen: análisis por densitometría, espectrofotometría visible de
complejos coloreados, espectrofotometría UV para detección de aminoácidos
aromáticos o determinación del contenido total de nitrógeno en la muestra. La
elección de un método en particular depende de factores como la naturaleza (líquida o
sólida) y cantidad de muestra, la rapidez, la exactitud y sensibilidad deseados.

En la presente práctica se cuantificará el contenido proteico de una muestra, mediante
los métodos de Biuret y Kjeldahl.

Método de Biuret: técnica apropiada para la cuantificación de muestras en solución.
Se basa en el tratamiento de éstas con sulfato de cobre en solución alcalina (reactivo
de Biuret), generando un color lila característico, cuando los compuestos analizados
presentan más de dos enlaces peptídicos.

El color generado se debe al complejo de coordinación que se establece entre el átomo
de cobre de la solución con cuatro átomos de nitrógeno provenientes de los enlaces
peptídicos, como se indica en la siguiente figura:

R O R O R O
C C C C C C
H N H N H N
H H H
Cu2+
H H H
N N
H
H N
H
C C C C C C
O R O R O R

Los espectros de absorción de los complejos de cobre formados por diferentes
proteínas son similares, por esta razón es posible utilizar cualquier proteína como
patrón de coloración. La concentración mínima requerida de muestra es 1-20 mg/mL.
Compuestos como glicerol, amoniaco y TRIS, causan interferencia.

Método de Kjeldahl: técnica útil para la cuantificación de muestras en solución o
sólidas. El método se diseñó para determinar el contenido de nitrógeno total
(nitrógeno proteico y nitrógeno no proteico) en una muestra proteica, siendo el
método de análisis de proteínas más usado en la actualidad.
33
El contenido de proteína verdadera puede determinarse mediante una extracción de
ésta, precipitándola con ácido tricloroacético 10% (V/V) y cuantificando el nitrógeno
no proteico que permanece en el sobrenadante. La diferencia entre el nitrógeno total y
el nitrógeno no proteico, corresponde a la proteína verdadera.

Las reacciones que ocurren durante el proceso son:

Digestión:
Catalizador
N (orgánico) + 3H2SO4 Calor
NH4HSO4 + CO2 + SO2 + SO3

Destilación por arrastre de vapor:
NH4HSO4 + NaOH NH4OH + NaHSO4

Absorción:
Indicador Tashiro
NH4OH + H3BO3 NH4H2BO3 + H2O

Titulación:
Indicador Tashiro
NH4H2BO3 + HCL NH4Cl + H3BO3

Los porcentajes de nitrógeno total (% Nt) y de proteína bruta se calculan a partir del
volumen de ácido clorhídrico (de concentración conocida) gastado en la titulación, de
acuerdo con las siguientes fórmulas:

(Vm - Vb) x NHCl x 14 x 100
% Nt =
Peso de muestra digerida (mg)

% Proteína bruta = % Nt x 100
16
Nt = Nitrógeno total
Vm = Volumen de HCl gastado en la titulación de la muestra
Vb = Volumen de HCl gastado en la titulación del blanco
NHCl = Normalidad del HCl

La multiplicación del % Nt por (100/16), se basa en el hecho de que el contenido promedio de
nitrógeno en las proteínas es 16%.

34
El método es reproducible y requiere el tratamiento de muestras con una
concentración de proteína mayor a 3 mg/mL ó 3 mg/g, para muestras líquidas y
sólidas, respectivamente. No se aconseja la implementación de éste método para la
determinación de numerosas muestras, debido a que es dispendioso y demorado.

REACTIVOS

• Ácido bórico 4% (P/V)
• H2SO4 concentrado
• Harina vegetal
• HCl 0.01N valorado
• Indicador de Tashiro
• Mezcla catalizadora (25 g K2SO4, 6,25 g CuSO4, 1,89 g KMnO4 y 0,125 g selenio)
• NaCl 1% (P/V)
• NaOH 50% (P/V)
• Patrón de proteína (albúmina de huevo o caseína) 5mg/mL
• Reactivo de Biuret

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de la muestra

Pesar 2 gramos de harina vegetal y disponerla en un tubo Falcon de 15 mL. Adicionar
10 ml de NaCl 1% (P/V), agitar durante 10 minutos empleando Vortex, centrifugar a
3500 rpm por 5 minutos, transferir el sobrenadante en un matraz aforado de 25 mL y
completar volumen con NaCl 1% (P/V). Descartar el residuo.

Esta muestra constituye el Extracto Proteico que contiene las albúminas y globulinas a
cuantificar.

2. Cuantificación mediante el método de Kjeldahl

a. Digestión: tomar dos matraces Kjeldahl para digestión y adicionar en uno de
ellos 2 mL del Extracto Proteico y en el otro 2 mL de agua destilada (éste será el
blanco del procedimiento y lo realizará un único grupo). A cada matraz,
adicionar en el siguiente orden:

• 100 mg de mezcla catalizadora
• 30 gotas de H2SO4 concentrado
35
Colocar los matraces en el digestor, aumentado la temperatura gradualmente
hasta que la solución tome una coloración verde esmeralda. Enfriar los balones
durante 5 minutos.

b. Destilación y absorción: bajo la supervisión del profesor, realizar el siguiente
procedimiento en el destilador:

Transferir los productos de la digestión al embudo del destilador, lavar el
matraz de digestión dos veces con 1 mL de agua destilada recuperando el
remanente de muestra y transferir estos lavados al embudo. Dejar pasar la
muestra suavemente hacia el dedal de reacción.

Adicionar 10 mL de ácido bórico 4% (P/V) y 2 gotas de indicador Tashiro en un
erlenmeyer de 125 mL (la solución se torna rojiza). Sobre esta solución se
recogerá el destilado.

Agregar, gota a gota, 5 mL de NaOH 50% (P/V) desde el embudo del destilador
hacia el dedal de reacción, dejando un remanente de la solución en el embudo,
la cual actuará como sello que evitará la pérdida de vapores.

Observar el cambio de coloración de la solución utilizada para recibir el
destilado a medida que transcurre el proceso (la solución se tornará azul) y
continuar la destilación por 5 minutos adicionales.

c. Titulación: utilizar HCl 0,01N para titular la solución contenida en el
erlenmeyer, hasta obtener la coloración inicial (solución rojiza).

3. Cuantificación mediante el método de Biuret

a. En 8 tubos de ensayo CORRECTAMENTE marcados, agregar los siguientes
reactivos:

PATRONES MUESTRAS
REACTIVOS (mL) BLANCO
P1 P2 P3 P4 P5 M1 M2
Patrón de proteína 5mg/mL - 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 - -
Extracto Proteico - - - - - - 0,5 1
NaCl 1% (P/V) 2 1,7 1,4 1,1 0,8 0,5 1,5 1
Reactivo de Biuret 3 3 3 3 3 3 3 3

36
b. Mezclar el contenido de cada tubo, incubar por 10 minutos a 37°C y leer en el
espectrofotómetro a 540nm.

RESULTADOS

1. Con respecto a la cuantificación mediante el método de Kjeldahl:

a. Calcular el porcentaje de nitrógeno total en el Extracto Proteico.

b. Calcular el porcentaje de proteína bruta presente en la muestra analizada.

2. Con respecto a la cuantificación mediante el método de Biuret:

a. Construir una curva de calibración graficando: Absorbancia 540 nm VS
Concentración de proteína (mg/mL). Determinar la ecuación de la recta
resultante y el valor del coeficiente de regresión (R2).

b. Calcular la concentración de proteína en las muestras M, interpolando en la
curva de calibración su absorbancia corregida y usando la ecuación de la
recta obtenida.

c. Teniendo en cuenta las diluciones realizadas a lo largo del protocolo,
determinar el contenido total (en mg) de proteína en el Extracto Proteico.

d. Realizar los cálculos correspondientes para determinar el porcentaje (P/P)
de proteína en la harina vegetal.

3. Resumir los resultados obtenidos completando la siguiente tabla:

RESUMEN DE RESULTADOS
MÉTODO % Proteína Bruta % Proteína (P/P)
Biuret -
Kjeldahl -
Valor reportado en la literatura*
* Indicar las referencias bibliográficas

4. Analizar los resultados obtenidos por los dos métodos, incluyendo ventajas y
desventajas observadas en la aplicación de los mismos, de acuerdo a los
objetivos de la práctica.

37
CUESTIONARIO

1. Al preparar el Extracto Proteico, por error se utilizó agua en lugar de NaCl 1%
(P/V). ¿Qué se obtuvo en el sobrenadante? ¿Qué proteínas quedaron en el
precipitado? Explique.

2. Al leer la absorbancia a 540 nm de los tubos que contienen el Extracto Proteico,
se obtuvieron valores que sobrepasan aquellos utilizados para construir la
curva de calibración en el método de Biuret. ¿Qué estrategias aplicaría en esta
situación? Mencione y explique al menos dos estrategias.

3. ¿Cuál es la diferencia entre proteína bruta y proteína verdadera? Explique.

4. ¿Cuál es la función de la mezcla catalizadora usada en el método de Kjeldahl?

5. ¿Qué es y cómo funciona el indicador de Tashiro?

6. ¿Cuáles son los métodos oficiales de análisis de proteínas en alimentos?

REFERENCIAS

Garret RH, Grisham, CM. Biochemistry. 4th edition. Brooks/Cole, Cengage Learning.
2010. Boston, MA, USA. Capítulos 4-6

López Rico E, Anzola Velasco C. Guías de Laboratorio de Bioquímica para la
Carrera de Química. 2ª edición. Colección Notas de Clase. Universidad Nacional de
Colombia. 2013. Bogotá, Colombia. Práctica 7 (Página 147)
Pase CN, et al. Protein Structure, Stability and Solubility in Water and Other
Solvents. Phil Trans R Soc Lond. 2014; 359: 1225-1235
38
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS DEL FRIJOL
Pesar 2 g de
harina de frijol
Adicionar 10 mL de
NaCl 1% (P/V)
Agitar en Vortex por 10 minutos y centrifugar

a 3500 rpm por 5 minutos
Tomar el sobrenadante y completar volumen

de 25 mL con NaCl 1% (P/V)
Marcar como Método de Biuret

“Extracto Proteico”
Método de Kjeldahl

39
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE KJELDAHL
•  Extracto Proteico
•  NaOH 50% (P/V)
•  Mezcla catalizadora
REACTIVOS •  Ácido bórico 4% (P/V)
•  HCl 0,01 N
•  Indicador de Tashiro
•  H2SO4 concentrado
1. DIGESTIÓN Realizar en cabina de extracción

debido a la emisión de gases tóxicos
100 mg de mezcla catalizadora

2 mL de Extracto Proteico
30 gotas de H2SO4 concentrado
BALÓN DE INCUBAR SOBRE INCUBAR HASTA

DIGESTIÓN HORNILLA 45 MINUTOS DECOLORAR Y ENFRIAR
2. DESTILACIÓN Y ABSORCIÓN
DESTILAR Y
TRANSFERIR AL ADICIONAR ABSORBER EL DETENER DESTILACIÓN 5 MIN
DESTILADOR NaOH 50% (P/V) DESTILADO DESPUÉS DE VIRAJE A AZUL
10 mL ácido
bórico + 2
gotas
indicador de
Tashiro
3. TITULACIÓN HCl Punto

0,01N @inal
Medir volumen
gastado de HCl
40
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE
EL MÉTODO DE BIURET
•  Extracto Proteico
•  NaCl 1% (P/V)
REACTIVOS
•  Reactivo de Biuret
•  Patrón de albúmina o caseína 5 mg/mL
PATRONES MUESTRAS
B 1 2 3 4 5 M1 M2
MARCAR
TUBOS
Patrón de proteína 5 mg/mL (mL) - 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 - -
Extracto Proteico (mL) - - - - - - 0,5 1,0
NaCl 1% (P/V) (mL) 2,0 1,7 1,4 1,1 0,8 0,5 1,5 1,0
Reactivo de Biuret (mL) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
Agitar e incubar durante 10 minutos a 37ºC
B 1 2 3 4 5 M1 M2
Leer absorbancia a 540 nm
41
PRÁCTICA 4

FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES CONSTITUYENTES:
CARBOHIDRATOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS

OBJETIVO

Comprobar la presencia de carbohidratos y ácidos nucleicos en tubérculos y levaduras,
respectivamente, utilizando reacciones específicas en cada caso.

FUNDAMENTO TEÓRICO

1. Carbohidratos:
Los constituyentes de los seres vivos son las biomoléculas. A ellas pertenecen los
carbohidratos, los ácidos nucleicos, los lípidos y las proteínas. Los carbohidratos son
las biomoléculas más abundantes del planeta Tierra, debido a que están presentes en
los tejidos de sostén de diversos organismos. La quitina del exoesqueleto de los
insectos y los crustáceos, junto con la celulosa de la pared celular de las plantas, son
ejemplos representativos.

Además de su papel estructural, los carbohidratos desempeñan otras funciones al ser
fuente rápida de energía (glucosa), participar en procesos que se realizan en la
superficie de la célula (reconocimiento inmune), ser precursores de otras
biomoléculas (bases nitrogenadas, aminoácidos) y participar en numerosas rutas
metabólicas.

Los organismos fotosintéticos (algas y plantas) mediante el proceso de la fotosíntesis
convierten el dióxido de carbono en glucosa, la cual se polimeriza formando almidón y
celulosa.

Los carbohidratos se clasifican en simples y complejos. Los primeros, conocidos como
monosacáridos, presentan una única unidad monomérica. Los monosacáridos son
aldehídos polihidroxilados (aldosas) o cetonas polihidroxiladas (cetosas). Según el
número de átomos de carbono que posean pueden ser triosas, tetrosas, pentosas,
hexosas, etc. Por su parte, los carbohidratos complejos presentan más de una unidad
monomérica. A ellos pertenecen los disacáridos (lactosa, maltosa, sacarosa, etc.) y
polisacáridos (glucógeno, almidón, mureina, quitina, etc.).
42
Según sus propiedades químicas, los carbohidratos pueden ser diferenciados
mediante reacciones químicas específicas. Algunas de estas reacciones, las cuales se
realizarán en la práctica, incluyen:

Prueba de Lugol:
Los polisacáridos como el almidón (compuesto de amilosa y amilopectina), el
glucógeno y los dextranos, forman compuestos coloreados característicos cuando se
combinan con el yodo molecular presente en el reactivo de Lugol. La formación de
complejos de absorción entre el yodo y las cadenas helicoidales de los polisacáridos,
compuestas de al menos 8 monosacáridos, explica el desarrollo de la coloración.

Los polisacáridos que establecen estructuras helicoidales a lo largo de toda su
molécula, como la amilosa, generan coloración azul intensa. Aquellos polisacáridos
ramificados como la amilopectina, producen coloración azul menos intensa. Por su
parte, los polisacáridos altamente ramificados con segmentos cortos de ramificación,
como el glucógeno, generan coloración parda o rojiza.

Reacción de Molisch:
Los carbohidratos, tanto simples como complejos, al ser tratados con α-naftol y ácido
sulfúrico concentrado, producen coloración violeta. Dicha reacción, denominada en
honor del botánico austríaco Hans Molisch, se basa en la deshidratación de los
carbohidratos por acción del ácido sulfúrico, produciendo derivados furfurales que se
condensan con el α-naftol, resultando en la coloración violeta característica. Al ser una
reacción cualitativa, no permite determinar la cantidad de carbohidratos presentes en
las muestras analizadas.

Reacción de Benedict:
Los azúcares reductores (aquellos que presentan el grupo OH libre en su carbono
anomérico) al tratarlos con soluciones cúpricas en medio alcalino suave (citrato de
sodio-carbonato de sodio) reducen el ión cúprico (Cu2+) de color azul a ión cuproso
(Cu+), el cual precipita como óxido de cobre (Cu2O) de color naranja-ladrillo. El medio
alcalino favorece la forma lineal del azúcar, permitiendo que su grupo aldehído
reaccione con el ion cúprico.

2. Ácidos Nucleicos:
Los ácidos nucleicos son biomoléculas poliméricas compuestas de nucleótidos. Las
funciones de los ácidos nucleicos incluyen el almacenamiento, transmisión y
utilización de la información genética, esencial para el funcionamiento de todos los
seres vivos. El ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN), son los
dos grupos en los que se clasifican estas biomoléculas.
43
Un nucleótido individual consta de tres partes: una base nitrogenada derivada de la
pirimidina o de la purina, una pentosa y un grupo fosfato. Las pentosas presentes en el
ADN y ARN se denominan desoxirribosa y ribosa, respectivamente.

El grupo fosfato del carbono 5’ de la pentosa de un nucleótido puede reaccionar con el
grupo OH del carbono 3’ de la pentosa de otro nucleótido, estableciendo un enlace
fosfodiéster. El dinucleótido resultante tendrá un grupo fosfato libre en el carbono 5’
de uno de los extremos y un grupo OH libre en el carbono 3’ del otro extremo. El
dinucleótido en cuestión podrá extenderse mediante la adición de nuevos nucleótidos
al grupo OH libre del carbono de la pentosa. Por esta razón los ácidos nucleicos
polimerizan en dirección 5’ - 3’.

La estructura tridimensional que asume el ADN y el ARN se explica por el principio de
complementariedad entre pares de bases, a través de puentes de hidrógeno. En el ADN
la adenina siempre se complementará con la timina (A=T), mientras que la guanina
siempre se complementará con la citosina (GΞC). En el ARN los pares de bases que se
pueden complementar serán GΞC y A=U (uracilo). La complementariedad de bases se
presenta entre cadenas de polinucleótidos distintas, como sucede en el ADN, o entre
la misma cadena, como puede ocurrir en el ARN.

Las dos cadenas complementarias y antiparalelas del ADN exhiben la misma longitud
y establecen estructuras semejantes a una escalera. Los grupos fosfato y los azúcares
se organizan hacia el exterior de la estructura, mientras que las bases nitrogenadas se
disponen hacia el interior de la misma. La estructura resultante gira en forma de
hélice dextrógira, razón por la que ésta se designa como doble hélice de ADN.

La presencia de ácidos nucleicos puede verificarse por medio de algunas pruebas
sencillas, las cuales se realizarán en la práctica:

Medidas espectrofotométricas:
Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos son capaces de absorber luz UV. Por
esta razón es posible cuantificar ADN y ARN en un espectrofotómetro de manera
precisa, rápida y no destructiva. Las bases nitrogenadas de los nucleótidos presentan
un máximo de absorción a 260 nm, mientras que las proteínas, debido a la presencia
de aminoácidos aromáticos, absorben a 280 nm. La relación de absorbancias a 260 y
280 nm es una medida de la pureza del ADN e indica lo siguiente:

A260/A280 1.8-2 ADN puro
A260/A280 < 1.8 Contaminación con proteínas o sustancias aromáticas
A260/A280 > 2 Contaminación con ARN
44
Efecto Hipercrómico:
La desnaturalización térmica del ADN puede evaluarse por medición de su absorción a
260 nm, la cual aumenta debido a la separación de las dos cadenas de polinucleótidos
por ruptura de los puentes de hidrógeno, exponiendo las bases nitrogenadas a la
interacción con la radiación incidente. Este fenómeno se denomina Efecto
Hipercrómico. Cuando el sistema se enfría rápidamente, las cadenas permanecen
separadas. Por el contrario, cuando la temperatura desciende lentamente, las cadenas
se re-asocian estableciendo de nuevo la doble hélice.

Reacción de Fiske-Subbarow (prueba para fosfatos):
Los grupos fosfato de los ácidos nucleicos en presencia de ácido molíbdico generan
fosfomolibdatos, los cuales son reducidos por el ácido ascórbico, produciendo
complejos de óxido de molibdeno de color azul.

REACTIVOS

• Acetato de potasio 5 M
• Acido ascórbico 1 mg/mL, recién preparado
• Acido molíbdico 20 mM
• Acido sulfúrico (H2SO4) concentrado
• Buffer de extracción: Tris 100 mM, EDTA 50 mM, NaCl 500 mM, pH 8.0
• Dodecil sulfato de sodio (SDS) 20% (P/V)
• HCl concentrado (37%)
• Isopropanol
• Patrón de almidón 2% (P/V)
• Patrón de glucosa 2% (P/V)
• Reactivo de Lugol
• Reactivo de Molisch, recién preparado
• Reactivo de Benedict
• Solución de citrato de sodio 1.5 mM-NaCl 15 mM

PROCEDIMIENTO

1. Obtención de carbohidratos:

Pelar y licuar una papa mediana con 200 mL de agua destilada. Proceder rápidamente
para evitar reacciones de oscurecimiento. Filtrar el licuado a través de 2 capas de gasa
o papel filtro para eliminar el residuo sólido del tejido. Decantar 10 mL del filtrado
45
durante 15 minutos, empleando un tubo Falcon de 50 mL. Eliminar el sobrenadante y
resuspender el precipitado (almidón) en 5 mL de agua destilada. Marcar como M1.

2. Obtención de ácidos nucleicos:

Pesar 0.5 g de levadura y macerar en un mortero previamente enfriado hasta obtener
un polvo homogéneo. Adicionar 8 mL de buffer de extracción frío y macerar de nuevo.
Trasvasar la suspensión a un tubo Falcon de 15 mL y adicionar 0.5 mL de SDS 20%
(P/V), mezclar con agitación vigorosa por 2 minutos e incubar a 65ºC por 10 minutos.
Adicionar 3 mL de acetato de potasio 5 M , agitar e incubar en baño de hielo por 10
minutos. Centrifugar a 4500 rpm por 10 minutos. Medir 0.3 mL del sobrenadante
obtenido y adicionarlo a un tubo de ensayo que contiene 3 mL de isopropanol. Incubar
la mezcla en baño de hielo por 15 minutos y centrifugar a 4500 rpm por 10 minutos.
Resuspender el precipitado en 6 mL de solución de citrato de sodio 1.5 mM - NaCl 15
mM y filtrar si observa partículas en suspensión. Marcar como Solución A.

PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS

1. Prueba de Lugol (Muestras a analizar: M1, patrones de glucosa y almidón):
colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo y adicionar 1
gota del reactivo de Lugol. Observar las coloraciones generadas.

2. Prueba de Lugol ácida (Muestras a analizar: M1, patrones de glucosa y
almidón): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo,
adicionar 10 gotas de HCl concentrado e incubar en baño maría durante 15
minutos. Enfriar y agregar 1 gota del reactivo de Lugol. Observar las
coloraciones generadas.

3. Prueba de Molisch (Muestras a analizar: M1, patrones de glucosa y almidón):
colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo, agregar 2 gotas
del reactivo de Molish, mezclar y agregar cuidadosamente 1 mL (20 gotas) de
H2SO4 concentrado, manteniendo los tubos inclinados. No agitar. Observar el
color del anillo formado en la interfase.

4. Prueba de Benedict (Muestras a analizar: M1, patrones de glucosa y almidón):
colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo, agregar 10
gotas del reactivo de Benedict e incubar en baño maría durante 2 minutos.
Observar las coloraciones generadas y continuar incubando por 10 minutos
adicionales. Observar de nuevo los resultados finales.

46
PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. Medidas espectrofotométricas (Muestra a analizar: Solución A): registrar la
absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm. Emplear la solución de citrato de
sodio 1.5 mM - NaCl 15 mM como blanco.

2. Efecto Hipercrómico (Muestra a analizar: Solución A): adicionar 3 mL de la
muestra en un tubo de ensayo e incubar en el termostato a 80ºC durante 10
minutos. Registrar inmediatamente la absorbancia de la muestra a 260 nm.
Emplear la solución de citrato de sodio 1.5 mM - NaCl 15 mM como blanco.
Comparar los resultados obtenidos con aquellos de la prueba 1 (Medidas
espectrofotométricas).

3. Prueba para fosfatos (Muestra a analizar: Solución A): adicionar 1 mL de la
muestra en un tubo de ensayo y agregar 10 gotas de ácido molíbdico. Agitar y
dejar en reposo por 3 minutos. Adicionar 10 gotas de ácido ascórbico, mezclar
e incubar en baño maría por 5 minutos. Observar la coloración generada.

RESULTADOS

1. Explicar la función que ejercen los reactivos o los solventes empleados para la
separación y obtención de la muestra M1 y la Solución A.

2. Completar la siguiente tabla de datos para el reconocimiento de carbohidratos
y concluir si las pruebas son positivas o negativas:

Datos obtenidos para el análisis de carbohidratos.
Coloraciones Cambios Resultado
Prueba Muestras
(indicar fotos) físicos (+ o -)
M1
Lugol Patrón de glucosa
Patrón de almidón
M1
Lugol ácida Patrón de glucosa
Patrón de almidón
M1
Molisch Patrón de glucosa
Patrón de almidón
M1
Benedict Patrón de glucosa
Patrón de almidón
47
3. Completar la siguiente tabla de datos de las medidas espectrofotométricas de
la Solución A y explicar si el ADN está contaminado con proteínas:

Datos obtenidos para las medidas espectrofotométricas de ácidos nucleicos.
Absorbancia Absorbancia
Muestra A260/A280
260 nm 280 nm
Solución A

4. Calcular la cantidad de ADN obtenido (μg/mL), teniendo en cuenta que 1
unidad de absorbancia a 260 nm equivale a una solución de 50 μg/mL de ADN
de doble cadena usando una cubeta de cuarzo de 1 cm.

5. Completar la siguiente tabla de datos para el Efecto Hipercrómico, comparar
los valores de absorbancia a 260 nm antes y después del calentamiento y
explicar dichos resultados:

Datos obtenidos para el Efecto Hipercrómico.
Absorbancia Absorbancia
Muestra
260 nm 280 nm
Solución A antes de calentar
Solución A después de calentar -

6. Indicar los resultados obtenidos en la prueba para fosfatos realizada a la
Solución A.

CUESTIONARIO


2. ¿Qué se requiere para que un carbohidrato tenga poder reductor? Explique.

3. ¿Por qué la sacarosa da prueba negativa con el reactivo de Benedict?

4. ¿Qué características químicas y estructurales presentan las proteínas asociadas
al ADN?

5. Defina temperatura de fusión (Tm) para el ADN y explique cómo se determina.

6. ¿Qué función cumple el EDTA, el SDS, el acetato de potasio y el isopropanol en
la extracción del ADN?
48
REFERENCIAS

Roche. Lab FAQs. Find a Quick Solution. 4th Edition. Roche Diagnostics GmbH. 2011.
Mannheim, Germany. Capítulo 1 (Página 8)
Sadava D, Hillis DM, Heller HC, Berenbaum MY. Life. The Science of Biology. 10th
edition. Sinauer Associates, Inc. 2014. MA, USA. Capítulos 3 y 4

49
EXTRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS
Pelar y licuar una papa mediana con
200 mL de agua destilada
Filtrar y eliminar el residuo

sólido
Decantar el Filtrado por

15 minutos
Eliminar el sobrenadante y resuspender

el precipitado en 5 mL de agua destilada
Marcar como
“M1”
50
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Macerar 0,5 g de levadura en

mortero pre-enfriado
Adicionar 8 mL de buffer de extracción frío

y macerar de nuevo
Trasvasar a tubo Falcon, adicionar 0,5 mL

de SDS 20% (P/V) y agitar por 2 minutos
Incubar a 65ºC por 10 minutos
Adicionar 3 mL de acetato de potasio 5 M y agitar
Incubar en baño de hielo por 10 minutos

y centrifugar a 4500 rpm por 10 minutos
Adicionar 0,3 mL del sobrenadante a un

tubo conteniendo 3 mL de isopropanol
Incubar en baño de hielo por 15 minutos

y centrifugar a 4500 rpm por 10 minutos
Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado

en 6 mL de citrato de sodio 1.5 mM-NaCl 15 mM
Marcar como
“Solución A”
51
PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS
Muestra M1 Patrón almidón Patrón glucosa
0,5 0,5 0,5

mL mL mL
Prueba de Prueba de Prueba de Prueba de

Lugol Lugol ácida Molish Benedict
Adicionar 1 gota Adicionar 1 mL de HCl 37% Adicionar 2 gotas Adicionar 10 gotas
del reactivo de e incubar en baño maría del reactivo de del reactivo de
Lugol y agitar por 15 minutos Molish y mezclar Benedict
Observar Enfriar y adicionar Adicionar con cuidado Incubar en baño

coloración 1 gota del reactivo de y sin agitar 20 gotas maría por 5
Lugol y agitar de H2SO4 concentrado minutos y observar
coloración
Observar Observar
coloración coloración Incubar en baño maría
10 minutos adicionales y
observar coloración
PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
SOLUCIÓN A
2 3 1
mL mL mL
Medidas Efecto Prueba para

espectrofotométricas Hipercrómico fosfatos
Medir absorbancia Incubar en termostato a Adicionar 10 gotas
a 260 y 280 nm 80ºC por 10 minutos de ácido molíbdico
Utilizar como Medir absorbancia Mezclar y dejar

blanco la solución a 260 nm reposar por 3 minutos
de citrato de
sodio-NaCl
Adicionar 10 gotas de
ácido ascórbico,
incubar en baño maría
por 5 minutos y
observar coloración

52
PRÁCTICA 5

LÍPIDOS

OBJETIVO

Analizar cualitativamente la presencia de lípidos en la yema de huevo, utilizando
reacciones específicas.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los lípidos son biomoléculas orgánicas insolubles en agua que pueden extraerse de
células y tejidos con solventes no polares como benceno, cloroformo y éter, entre otros.
Existen diferentes clases de lípidos cuyas propiedades dependen de la naturaleza
hidrocarbonada de uno de los componentes de su estructura.

Los lípidos desempeñan diversas funciones como: reserva energética (generan 9.4
Kcal/g de grasa), soporte estructural (presentes en la bicapa lipídica de las membranas
celulares), regulación (hormonas esteroidales), comunicación celular (eicosanoides) y
aislamiento térmico (ceras).

Los lípidos pueden clasificarse de diferentes formas, basándose una de ellas en la
estructura de sus esqueletos, como se indica a continuación:

LÍPIDOS
COMPLEJOS SIMPLES
Acilgliceroles Fosfoglicéridos Es9ingolípidos Ceras Terpenos Esteroides Eicosanoides
Cerebrósidos Esteroides Leucotrienos
Ácidos
Gangliósidos Prostaglandinas
biliares
Hormonas
esteroideas Tromboxanos
53
Lípidos complejos:
Contienen en su estructura ácidos grasos; incluyen los acilgliceroles, fosfoglicéridos,
esfingolípidos y ceras. Todos éstos se diferencian en la estructura de los esqueletos a los
cuales los ácidos grasos se unen covalentemente. Estas moléculas también se denominan
lípidos saponificables, debido a que su hidrólisis alcalina produce jabones.

Acilgliceroles
Ésteres de ácidos grasos del glicerol, siendo los triglicéridos los más abundantes y los
principales componentes de almacenamiento en células animales y vegetales. Pueden
ser hidrolizados por enzimas, ácidos y álcalis, en este último caso, generando jabones.
Fosfoglicéridos
Componentes principales de las membranas celulares, su estructura contiene glicerol,
dos ácidos grasos, un grupo fosfato y un grupo polar esterificado al ácido fosfórico.
Esfingolípidos
Componentes principales de las membranas celulares cerebrales, contienen en su
estructura un esqueleto de esfingosina, un ácido graso y una cabeza polar. Algunos
contienen un monosacárido unido a la esfingosina (cerebrósidos) o varios
monosacáridos (gangliósidos).
Ceras
Ésteres de ácidos grasos con alcoholes monohidroxílicos, siendo ambas moléculas de
elevado peso molecular. Actúan como protectores y aislantes térmicos en tejidos.

Lípidos simples:
Se caracterizan por no contener ácidos grasos esterificados y por lo tanto, por ser no
saponificables. A este grupo pertenecen:

Terpenos
Se componen de unidades de isopreno y se encuentran en aceites esenciales,
carotenoides y el caucho natural, entre otros.
Esteroides
Se caracterizan por presentar en su estructura varios anillos esteroidales, a ellos
pertenece el colesterol (tejidos animales), precursor de las sales biliares y de las
hormonas esteroidales (estrógenos y andrógenos), los micosteroles (esteroles de
hongos) y los fitosteroles (esteroles de plantas).
Eicosanoides
Compuestos derivados del ácido araquidónico (ácido graso esencial). A este grupo
pertenecen los leucotrienos, prostagandinas y tromboxanos, involucrados en
diversos procesos fisiológicos como la inflamación, la coagulación, la presión
sanguínea y la contracción de músculos lisos.
54
Para su estudio cualitativo y de acuerdo con sus propiedades químicas, los lípidos
pueden ser diferenciados mediante reacciones químicas específicas. Algunas de éstas
reacciones, las cuales se realizarán en la práctica, incluyen:

Prueba para fosfatos (Reacción de Fiske-Subbarow):
Los fosfolípidos por acción del NaOH se hidrolizan, produciendo fosfatos inorgánicos,
que reaccionan con el ácido molíbdico generando fosfomolibdatos. Estos compuestos
se reducen por acción de agentes reductores como el ácido ascórbico, produciendo
complejos de óxido de molibdeno de color azul.

Prueba de Salkowski:
En presencia de ácido sulfúrico concentrado, el colesterol disuelto en cloroformo se
condensa para formar moléculas de bi-esterol. Dichas moléculas presentan un color
rojo característico. Los componentes de la mezcla se separan en dos capas, la de
cloroformo de color rojo y la de ácido sulfúrico de color blancuzco.

Saponificación:
La hidrólisis alcalina de los acilgliceroles (grasas y aceites) con hidróxido de sodio o
potasio, produce glicerol y ácidos grasos libres. Estos últimos se combinan con los
iones sodio o potasio del hidróxido, generando las sales sódicas o potásicas de los
ácidos grasos correspondientes. Estas sales se conocen como jabones. Cuando el
hidrolizado se somete a la acción del éter, los jabones precipitan mientras que los
lípidos no saponificables permanece en el sobrenadante de la mezcla.

REACTIVOS

• 1 Huevo (lo deben traer los estudiantes)
• Acetona
• Ácido ascórbico 1 mg/mL, recién preparado
• Ácido molíbdico 20 mM
• Acido sulfúrico (H2SO4) concentrado
• Agua destilada
• Cloroformo
• Etanol:éter (relación 2:1)
• Éter etílico
• NaOH 15% (P/V), recién preparado
• Patrón de colesterol 1 mg/mL y de lecitina 5 mg/mL

55
PROCEDIMIENTO

Obtención de lípidos:

Separar la yema de un huevo. Retirar la membrana que recubre la yema y tomar 1 mL
de la misma utilizando un GOTERO PLÁSTICO y colocarlo en un tubo Falcon.
Adicionar 5 mL de agua destilada y agitar suavemente. Centrifugar a 3000 rpm por 5
minutos. Separar el sobrenadante del precipitado.

Sobrenadante: marcar como M1 y almacenar a -20ºC para pruebas posteriores
(Práctica 6). Esta muestra contiene sustancias hidrosolubles como carbohidratos,
proteínas y vitaminas.

Precipitado: disolver completamente en 5 mL de etanol:éter (2:1) y adicionar 2 mL
de acetona. Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos. Separar y marcar el sobrenadante
como M2. Disolver el precipitado en 2 mL de etanol:éter (2:1) y marcar como M3.

PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO

1. Prueba de Salkowski (Muestras a analizar: M2, patrón de colesterol): colocar
1 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo COMPLETAMENTE
SECOS y adicionar 1 mL de cloroformo. Agregar LENTAMENTE Y POR LAS
PAREDES DEL TUBO 1 mL (20 gotas) de ácido sulfúrico concentrado. Mezclar
suavemente y dejar en reposo 5 minutos. Observar las coloraciones generadas.

2. Saponificación (Muestras a analizar: M2, M3, patrón de lecitina): en tres tubos
de ensayo colocar 1 mL de cada una de las muestras y adicionar 3 mL de NaOH
15% (P/V). Cubrir la boca del tubo con papel de aluminio perforado y poner en
reflujo en baño maría por 20 minutos. Enfriar, agregar 2 mL de éter y filtrar
cada una de las muestras empleando dos capas de gasa o papel filtro. Observar
los residuos sólidos generados (jabones). Conservar los sobrenadantes o
residuos líquidos filtrados (fracciones no saponificables).

3. Prueba para fosfatos (Muestras a analizar: fracciones no saponificables de M2,
M3 y del patrón de lecitina): en tres tubos de ensayo adicionar 1 mL de cada
muestra y agregar 10 gotas de ácido molíbdico, mezclar y dejar en reposo por 3
minutos. Adicionar 10 gotas de ácido ascórbico, mezclar e incubar en baño
maría por 5 minutos. Observar las coloraciones generadas.

56
RESULTADOS

1. Explicar la función que ejercen los reactivos o los solventes empleados para la
separación y obtención de las muestras M1, M2 y M3. Explique qué tipo de
lípidos contiene cada una de estas muestras.

2. Completar la siguiente tabla de datos para el reconocimiento de lípidos y
concluir si las pruebas son positivas o negativas:

Datos obtenidos para el análisis de lípidos.
Prueba Muestras
M2
Salkowski
Patrón de colesterol
M2
Saponificación M3
Patrón de lecitina
Fracción no

saponificable de M2
Fracción no

Fosfatos saponificable de M3
Fracción no
saponificable del
Patrón de lecitina

CUESTIONARIO


2. ¿Qué requisitos químicos debe satisfacer un lípido saponificable? Explique.

3. ¿Cómo se identifican los lípidos no saponificables? Mencione 3 ejemplos de
pruebas de identificación.

4. ¿Qué función cumple el etanol:éter (2:1) y la acetona en el protocolo de
extracción de lípidos?

57
REFERENCIAS

Garret RH, Grisham, CM. Biochemistry. 4th edition. Brooks/Cole, Cengage Learning.
2010. Boston, MA, USA. Capítulo 24

Sadava D, Hillis DM, Heller HC, Berenbaum MY. Life. The Science of Biology. 10th
edition. Sinauer Associates, Inc. 2014. MA, USA. Capítulo 3

58
EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS
Separar la yema, retirar su membrana

y tomar 1 mL en un tubo Falcon
Adicionar 5 mL de agua
destilada y agitar
Centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos

3000
PRECIPITADO SOBRENADANTE
Disolver en 5 mL de Marcar como “M1” y

etanol:éter (2:1) almacenar a -20ºC
Componentes hidrosolubles:
carbohidratos, proteínas y
Adicionar 2 mL de vitaminas
acetona y mezclar
Centrifugar a 5000 rpm

3000
por 5 minutos
PRECIPITADO SOBRENADANTE
Disolver en 2 mL de Marcar como

etanol:éter (2:1) “M2”
Otros lípidos
Marcar como
“M3”
Lecitinas
59
PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS
1. Prueba de Salkowski
Patrón
M2 colesterol
Tubos 1 1
secos mL mL
Adicionar 1 mL de cloroformo
Adicionar 20 gotas de ácido sulfúrico concentrado
Observar coloración
2. SaponiMicación
Patrón
M2 M3
lecitina
1 1 1
mL mL mL
Adicionar 3 mL de NaOH 15% (P/V)
Tapar tubos y poner en reMlujo en baño maría por 20 minutos
Enfriar y agregar 2 mL de éter
Filtrar y observar jabones. Conservar los residuos líquidos Miltrados
M2 M3 Patrón

60
PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS
3. Prueba para fosfatos

Residuos líquidos no saponiMicables de:
Patrón
M2 M3
lecitina
1 1 1
mL mL mL
Adicionar 10 gotas ácido molíbdico 20 mM
Mezclar y reposar por 3 minutos
Adicionar 10 gotas ácido ascórbico 1 mg/mL
Mezclar y observar coloración
Incubar en baño maría por 5 minutos y observar coloración
61
PRÁCTICA 6

PROTEÍNAS

OBJETIVO

Analizar cualitativamente la presencia de proteínas en el huevo, utilizando reacciones
específicas.

FUNDAMENTO TEÓRICO

La diversidad e importancia biológica de las proteínas, ha impulsado el desarrollo de
campos de investigación para dilucidar su estructura y comprender los mecanismos
moleculares de su funcionamiento. Generalmente, el estudio bioquímico de las proteínas
implica su aislamiento y caracterización (determinación de su composición, estructura y
función).

El aislamiento de proteínas a partir de una fuente biológica, se basa en las propiedades
físicas y químicas de dichas biomoléculas. Por ejemplo, la solubilidad de las proteínas en
diferentes soluciones, es una propiedad fundamental que se aprovecha para lograr su
separación. En este sentido, las globulinas presentes en una muestra precipitan por la
adición de sulfato de amonio hasta el 50% de saturación (salting out).

Como fuente de proteínas, el huevo es una excelente muestra de partida. La ovoalbúmina,
es la principal proteína de la clara y constituye entre 50-60% del peso de la misma. Otras
proteínas presentes son: ovotransferrina, ovomucoide, ovomucinas, lisozimas y
globulinas.

Históricamente, las proteínas del huevo han sido fundamentales para el desarrollo de la
Bioquímica. En 1937 se obtuvieron los primeros cristales de la lisozima, cuya estructura
tridimensional se determinó en 1965 mediante cristalografía de rayos X, siendo la
primera enzima en ser resuelta estructuralmente. La obtención de la estructura de esta
proteína, también contribuyó a develar el primer mecanismo de reacción enzimática.

Una vez aisladas, las proteínas pueden ser reconocidas mediante reacciones específicas,
las cuales se aplicarán en la presente práctica:

62
Prueba de Biuret:
Permite detectar la presencia de enlaces peptídicos, debido a la formación de
complejos de coordinación entre los nitrógenos de dichos enlaces y los iones cúpricos
(Cu2+) del reactivo de Biuret en medio alcalino. La generación de una coloración lila se
considera positiva para la prueba.

Prueba de Millon:
Es específica para el grupo fenólico, lo cual permite reconocer aminoácidos como la
tirosina presente en las proteínas. El primer paso de la reacción consiste en la
nitrosación del anillo aromático de la tirosina por el ácido nítrico del reactivo,
reacción que es activada por el grupo OH del aminoácido. Luego, éste nitroso derivado
forma complejos con los iones mercurioso (Hg+) y mercúrico (Hg2+) del reactivo
generando un precipitado rojo.

Prueba de la ninhidrina:
Permite reconocer los grupos α-amino de los aminoácidos y los grupos amino
terminales y laterales de las proteínas. La ninhidrina es una molécula que promueve la
desaminación oxidativa de los aminoácidos, generando el aldehído correspondiente a
expensas de su reducción (hidridantina). La reacción libera amoniaco y gas carbónico.
Luego, la hidridantina se condensa con otra molécula de ninhidrina a través del
amoniaco, produciendo una estructura denominada púrpura de Ruhemann.

Reacción Xantoproteica:
Permite detectar compuestos aromáticos como los aminoácidos fenilalanina, tirosina
y triptófano. La reacción se basa en la nitración del anillo bencénico por acción del
ácido nítrico concentrado, generando derivados amarillos de nitrobenceno. Para
nitrar la fenilalanina se requiere ácido sulfúrico como catalizador. El color amarillo
resultante se transforma en naranja por la adición de hidróxido de amonio (NH4OH).
El nombre de la reacción se deriva del griego xantos, que significa amarillo, color
característico de la reacción positiva.

REACTIVOS

• 1 Huevo (lo deben traer los estudiantes)
• Ácido nítrico (HNO3) concentrado
• Ácido acético 1 M
• Agua destilada
• Hidróxido de sodio (NaOH) 50% (P/V) y 10% (P/V)
• Ninhidrina 0.2% (P/V) en etanol
• Patrón de albúmina 5 mg/mL
63
• Patrón de glicina 5 mg/mL
• Patrón de tirosina 5 mg/mL
• Reactivo de Biuret
• Reactivo de Millon
• Sulfato de amonio macerado

PROCEDIMIENTO

Obtención de proteínas:

Adicionar en un tubo de ensayo 4 mL de clara de huevo, agregar 30 gotas de ácido
acético 1 M y agitar suavemente. Filtrar la mezcla obtenida con 2 capas de gasa y
medir el volumen del filtrado obtenido. A este filtrado, adicionar LENTAMENTE Y
CON AGITACIÓN SUAVE, sulfato de amonio macerado previamente hasta una
porcentaje de saturación del 50% (Utilice el Anexo 1 de la guía para calcular la
cantidad de sal a adicionar). Disolver completamente el sulfato de amonio e incubar
en baño de hielo por 15 minutos. Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos y separar el
sobrenadante del precipitado. Adicionar 2 mL de agua destilada al sobrenadante y
marcar como M2. Disolver el precipitado en 5 mL de NaCl 1% (P/V) y marcar como
M3.

Recuerde que en la práctica anterior se obtuvo la muestra M1, la cual se debe
descongelar y analizar en la presente práctica.

PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO

1. Prueba de Biuret (Muestras a analizar: M1, M2, M3, patrón de albúmina, agua
destilada): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo y
adicionar 1 mL del reactivo de Biuret. Mezclar, dejar reposar 5 minutos y
observar las coloraciones generadas.

2. Prueba de Millon (Muestras a analizar: M1, M2, M3, patrones de albúmina y
tirosina): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo y
adicionar 5 gotas del reactivo de Millon. Mezclar e incubar en baño maría por 5
minutos. Observar las coloraciones de los precipitados generados.

3. Prueba de la ninhidrina (Muestras a analizar: M1, M2, M3, patrones de
albúmina y glicina): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de
ensayo y adicionar 1 mL de ninhidrina 0.2% (P/V). Al tubo correspondiente al
64
patrón de glicina adicionar 5 gotas de NaOH 10% (P/V). Mezclar e incubar en
baño maría por 10 minutos. Observar las coloraciones generadas.

4. Reacción xantoproteica (Muestras a analizar: M1, M2, M3, patrones de
albúmina y tirosina): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de
ensayo y adicionar CUIDADOSAMENTE 20 gotas de ácido nítrico concentrado.
Mezclar e incubar en baño maría por 5 minutos. Observar las coloraciones
generadas. Agregar CUIDADOSAMENTE 20 gotas de hidróxido de sodio 50%
(P/V) y observar las coloraciones generadas.

RESULTADOS

1. Explicar la función que ejercen los reactivos empleados para obtener M2 y M3.

2. Completar la siguiente tabla de datos para el reconocimiento de proteínas y
concluir si las pruebas son positivas o negativas:

Datos obtenidos para el análisis de proteínas.
Prueba Muestras
M1
M2
Biuret M3
Patrón de albúmina
Agua destilada
M1
M2
Millon M3
Patrón de tirosina
M1
M2
Ninhidrina M3
Patrón de glicina
M1
M2
Xantoproteica M3
Patrón de tirosina

65
CUESTIONARIO


2. En la precipitación de globulinas con sulfato de amonio, ¿por qué debe
incubarse la muestra en baño de hielo?

3. ¿Qué tipo de proteínas se encuentran en la muestra M1?

REFERENCIAS

Abeyrathne, E. D. N. S., Lee, H. Y. & Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential
use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents. Poultry
Science. 2013; 92: 3292–3299

Vázquez-Jorge, Y. et al. Caracterización físicoquímica y contenido de proteínas de
extractos fluidos del ostión de mangle (Crassostrea rizophorae). Revista Cubana
de Química. 2014; 26 (1): 66-74

66
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
Tomar 4 mL de clara de huevo en

un tubo de ensayo
Adicionar 30 gotas de ácido acético 1 M

y agitar suavemente
Filtrar a través de 2 capas de gasa
Residuo sólido Filtrado
Medir volumen y adicionar, LENTAMENTE Y

Descartar
AGITANDO, sulfato de amonio macerado
hasta 50% de saturación.
¡ Disolver por completo !
Incubar sobre hielo por 15 minutos
Precipitado Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos
Disolver en 5 mL de Sobrenadante
NaCl 1% (P/V)
Adicionar 2 mL de agua destilada

Marcar como “M3”
Globulinas Marcar como “M2”
Albúminas

67
PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
1. Prueba de Biuret
Patrón Agua
M1 M2 M3 albúmina destilada
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL mL mL mL mL
Adicionar 1 mL del reactivo de Biuret
Mezclar, dejar reposar 5 minutos

y observar coloración
2. Prueba de Millon
Patrón Patrón
M1 M2 M3 albúmina tirosina
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL mL mL mL mL
Adicionar 5 gotas del reactivo de Millon
Agitar e incubar en baño maría

por 5 minutos

68
PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
3. Prueba de la ninhidrina
Patrón Patrón
M1 M2 M3
albúmina glicina
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL mL mL mL mL
Adicionar 1 mL de ninhidrina 0.2% (P/V)
Al tubo del patrón de glicina adicionar 5 gotas de NaOH 10% (P/V)
Agitar e incubar en baño maría

por 10 minutos
4. Reacción xantoproteica
Patrón Patrón
M1 M2 M3
albúmina tirosina
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL mL mL mL mL
Adicionar CUIDADOSAMENTE 20 gotas de ácido nítrico concentrado
Agitar e incubar en baño maría por 5 minutos
Adicionar CUIDADOSAMENTE 20 gotas de NaOH 50% (P/V)

69
PRÁCTICA 7.1

PURIFICACIÓN DE LA FAVINA: EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

OBJETIVO

Obtener un extracto de proteínas a partir de harina de haba (Vicia faba).

FUNDAMENTO TEÓRICO

Las investigaciones bioquímicas, generalmente, requieren la purificación parcial o
completa de las biomoléculas bajo estudio. Dado que las fuentes biológicas (células y
tejidos) contienen numerosos componentes (ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos,
proteínas), el proceso de purificación resulta complejo y requiere de gran trabajo. Por
otra parte, la biomolécula de interés puede ser inestable y degradarse fácilmente o
encontrarse en bajas concentraciones, dificultando su aislamiento.

El primer paso para aislar una proteína consiste en la ruptura o lisis celular, para
posteriormente extraerla con un amortiguador adecuado. Los métodos de ruptura
celular se clasifican de acuerdo a principios físico-químicos y su aplicación depende de
las características estructurales de las muestras de partida. Estos métodos incluyen:

MÉTODOS FÍSICOS
Choque osmótico: consiste en suspender las células en una solución hipotónica con
respecto al interior celular. Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior
de la célula, causando su hinchamiento y ruptura. Método útil para lisar células sin
pared celular como las células animales.
Maceración, molienda y presión: métodos mecánicos de lisis celular que emplean
morteros, molinos y prensas francesas (instrumentos que pasan las células a gran
velocidad a través de un pequeño orificio), respectivamente. Resultan útiles para lisar
células vegetales, bacterias y levaduras.
Termólisis: se fundamenta en someter las células a cambios abruptos de
temperatura, aplicando ciclos de congelamiento con nitrógeno líquido (-196°C) y
descongelamiento a temperatura entre 25-37°C. La formación de cristales de agua al
interior celular explica el fenómeno de crio-ruptura que se presenta en este método.
Ultrasonido o sonicación: las células se resuspenden en una solución
amortiguadora en la cual se sumerge una punta de metal conectada a un dispositivo
que genera ondas de ultrasonido, estableciendo el fenómeno de cavitación
(formación de pequeñas burbujas que estallan violentamente lisando las células).
70
MÉTODOS QUÍMICOS
Álcalis: las paredes celulares de bacterias y plantas pueden ser degradadas por
compuestos alcalinos (pH 10-12), desestabilizando la integridad celular de este tipo
de muestras. Posteriormente, es necesario neutralizar el pH de las muestras con el
propósito de estabilizar las biomoléculas extraídas.
Detergentes: se utilizan ampliamente para extraer proteínas y lípidos de las
membranas celulares, liberando el contenido citoplasmático. Los detergentes más
comunes son el dodecil sulfato de sodio (SDS) y el Tritón X-100.
Solventes orgánicos: el tratamiento con acetona, dimetil sulfóxido, tolueno y ciertos
alcoholes, permiten extraer los lípidos de las membranas celulares, contribuyendo a
la extracción de componentes intracelulares. Sin embargo, la desnaturalización de
proteínas es la principal desventaja del método.

MÉTODOS ENZIMÁTICOS
Lisozimas: favorecen la ruptura de las paredes celulares bacterianas al catalizar la
hidrólisis de los enlaces glucosídicos entre el ácido N-acetilmurámico y la N-acetil-D-
glucosamina del peptidoglicano, componente principal de la pared celular de
bacterias Gram-positivas.
Glucanasas: hidrolasas empleadas para debilitar las paredes celulares de hongos al
degradar el glucano (polisacáridos de D-glucosa) presente en las mismas.
Otras enzimas empleadas en los protocolos de lisis celular incluyen celulasas,
manasas, quitinasas y xilanasas.

Es importante mencionar que en los protocolos de ruptura celular se pueden
combinar varios de los métodos recién expuestos para mejorar la extracción de los
componentes de interés. Para el caso de las proteínas, una vez que ésta se ha extraído
de su entorno natural, queda expuesta a factores que pueden degradarla como
cambios bruscos de pH, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas
que hidrolizan los enlaces peptídicos). Para evitar o minimizar la degradación de las
proteínas, durante los procesos de extracción y purificación se utilizan
amortiguadores e inhibidores de proteasas, conservando las muestras a bajas
temperaturas (4°C) y procediendo de manera rápida.

El resultado de los métodos de lisis celular es un extracto crudo que contiene una
mezcla de biomoléculas, membranas y restos celulares. El extracto crudo se somete a
centrifugación para eliminar los restos celulares y demás componentes insolubles. El
propósito de la centrifugación es obtener un sobrenadante que contenga la
biomolécula de interés. No obstante, en algunas ocasiones la molécula bajo estudio
permanece en la fracción insoluble, requiriendo la utilización de detergentes o
agentes caotrópicos que permitan su resuspensión.
71
LECTINAS

Diversas familias vegetales, especialmente las leguminosas (Fabaceae), contienen en
sus semillas proteínas denominadas lectinas, las cuales se organizan como dímeros o
tetrámeros, dependiendo del pH. El peso molecular de estas proteínas varía entre 20 –
400 kDa, caracterizándose por su propiedad de unirse a carbohidratos, participando
en procesos de reconocimiento celular. Las bacterias, algunos peces e invertebrados,
también presentan lectinas. Ciertas lectinas, como la riproximina aislada desde la
planta Ximenia americana, ejercen actividad anti-proliferativa en líneas celulares de
leucemia y cáncer de próstata.

En la presente práctica se preparará un extracto de proteínas partiendo de harina
obtenida de semillas de haba (Vicia faba), para utilizarlo en la purificación de la favina,
lectina específica de esta planta.

PROCEDIMIENTO

Extracción de proteínas:

Colocar 10 g de harina de haba en un erlenmeyer o vaso de precipitados, adicionar 30
mL de NaCl 1% (P/V) y agitar vigorosamente por lo menos 1 hora con agitador
magnético. Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos y separar el sobrenadante del
precipitado. Ajustar el pH del extracto a 4,65 y medir el volumen total obtenido.
Marcar como Extracto Crudo, mantener sobre hielo y guardar 1 mL para pruebas
posteriores (cuantificación de proteínas y electroforesis). Este extracto crudo contiene
albúminas y globulinas.

Separación de albúminas y globulinas:

Colocar 5 mL del Extracto Crudo en un tubo Falcon, adicionar LENTAMENTE Y CON
AGITACIÓN SUAVE, sulfato de amonio macerado previamente hasta una porcentaje
de saturación del 50% (Utilice el Anexo 1 de la guía para calcular la cantidad de sal a
adicionar). Disolver completamente el sulfato de amonio e incubar en baño de hielo
por 15 minutos. Centrifugar a 4000 rpm por 5 minutos y separar el sobrenadante del
precipitado. El sobrenadante y el precipitado contienen albúminas y globulinas,
respectivamente.

Medir el volumen del sobrenadante, marcar como ALBÚMINAS y guardar para
pruebas posteriores (cuantificación de proteínas y electroforesis).
72
Resuspender el precipitado en NaCl 1% (P/V) y completar en balón volumétrico a 25
mL. Marcar como GLOBULINAS y guardar para pruebas posteriores (cuantificación de
proteínas, purificación de favina y electroforesis).

Cuantificación de proteínas por absorción en el ultravioleta:

a. Construir una curva de calibración, utilizando como patrón una solución de
caseína de 5 mg/mL y medir su absorbancia a 280 nm:

PATRONES
REACTIVOS (mL) BLANCO
P1 P2 P3 P4 P5 P6
Patrón de proteína 5 mg/mL - 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
NaCl 1% (P/V) 2,5 2,3 2,1 1,9 1,7 1,5 1,3

b. Graficar: Absorbancia 280 nm VS Concentración de proteína (mg/mL).
Determinar la ecuación de la recta resultante y el valor del coeficiente de
regresión (R2).

c. Calcular la concentración de proteína en las muestras (Extracto Crudo,
Albúminas y Globulinas), interpolando en la curva de calibración su
absorbancia corregida y usando la ecuación de la recta. Se deben diluir las
albúminas y globulinas 1:250 y 1:50 en NaCl 1% (P/V), respectivamente.

RESULTADOS

1. Completar la siguiente tabla de datos:

Volumen Factor de Absorbancia Concentración
Muestra
(mL) dilución 280 nm (mg/mL)
Extracto Crudo
Albúminas
Globulinas

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es y cómo funciona un pH-metro?

2. ¿Cuál es la función de ajustar el pH del Extracto Crudo a 4,65?

3. ¿Qué funciones biológicas desempeña la favina?
73
REFERENCIAS

de Martinez, C.A., Anzola D.G. & de Gómez, V.M. Efecto de hidrólisis enzimática
sobre la actividad fitohemoaglutinante de la favina. Revista Colombiana de
Química. 1990; 19(1): 11-18

Harrison, S.T. L. Cell disruption. En: Moo-Young, M (Editor in Chief). Comprehensive
Biotechnology. 2nd Edition. Oxford-Elsevier. 2011. (Páginas 619–639)
Roche. Lab FAQs. Find a Quick Solution. 4th Edition. Roche Diagnostics GmbH. 2011.
Mannheim, Germany. Capítulo 3 (Página 99)
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
Pesar 10 g de
harina de haba
Adicionar 30 mL de
NaCl 1% (P/V)
Agitar 1 hora y centrifugar

a 4000 rpm por 10 minutos
Tomar el sobrenadante y ajustar pH a 4,65
Medir volumen y marcar como

M1: “Extracto Crudo”
Guardar 1 mL para pruebas posteriores

74
SEPARACIÓN DE ALBÚMINAS Y GLOBULINAS
Tomar 5 mL del “Extracto Crudo”
Adicionar LENTAMENTE Y CON AGITACIÓN SUAVE

sulfato de amonio hasta 50% de saturación
Disolver COMPLETAMENTE el sulfato de amonio e incubar

sobre hielo por 15 minutos
Centrifugar a 4000 rpm por 15 minutos
Sobrenadante Precipitado
Medir volumen, marcar como Resuspender en NaCl 1% (P/V)

“Albúminas” y guardar hasta completar 25 mL y
para posteriores pruebas marcar como “Globulinas”
(cuantiWicación y electroforesis)
Guardar para pruebas posteriores

(cuantiWicación, puriWicación y electroforesis)

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR ABSORCIÓN

EN EL ULTRAVIOLETA
•  Patrón de albúmina o caseína 5 mg/mL

REACTIVOS •  NaCl 1% (P/V)
PATRONES
B 1 2 3 4 5 6
MARCAR
TUBOS
Patrón de proteína 5 mg/mL (mL) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
NaCl 1% (P/V) (mL) 2,5 2,3 2,1 1,9 1,7 1,5 1,3
Agitar y leer absorbancia a 280 nm
Preparar diluciones de las muestras a cuantificar y leer

absorbancia a 280 nm.

Se recomiendan diluciones de albúminas y globulinas
1:250 y 1:50 en NaCl 1% (P/V), respectivamente.

75
PRÁCTICA 7.2

PURIFICACIÓN DE LA FAVINA: CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

OBJETIVO

Purificar la favina presente en un extracto de globulinas de harina de haba (Vicia faba),
mediante cromatografía de afinidad.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los métodos de purificación de proteínas aprovechan distintas propiedades físico-
químicas de éstas para lograr su aislamiento. Las propiedades en mención incluyen
tamaño, carga, afinidad e hidrofobicidad de la proteína de interés. Uno de los métodos
más utilizados para separar proteínas es la cromatografía en columna.

Las columnas cromatográficas contienen rellenos de material sólido con
características químicas específicas y que constituyen la fase estacionaria. A través
de la columna fluye una solución amortiguadora denominada fase móvil, la cual
permite la entrada del extracto crudo a la columna. Cada proteína migrará a distinta
velocidad a través de la fase estacionaria, según el grado de interacción con dicha fase.

Generalmente, los protocolos cromatográficos se realizan de forma semiautomática,
en la cual la fase móvil se hace pasar a través de la columna por acción de una bomba
peristáltica, mientras que un detector y un colector de fracciones irán analizando y
recogiendo las muestras que salen de la columna. Los detectores permiten monitorear
las muestras en el rango ultravioleta, a 210 y/o 280 nm para el enlace peptídico y los
aminoácidos aromáticos, respectivamente.

Los tipos de cromatografía utilizados para la purificación de proteínas son:

1. Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular: la fase estacionaria
está constituida por partículas de polímeros de diferente porosidad, en cuyo tamaño
reside el principio de separación. Así, las proteínas grandes no pueden penetrar los
poros de las partículas de la fase estacionaria y son eluidas rápidamente de la columna.
En este caso se dice que dichas proteínas son excluidas de la matriz. Por su parte, las
proteínas pequeñas penetran por los poros, recorriendo un camino más largo y siendo
eluidas posteriormente. El tamaño de los poros internos depende de la naturaleza del
polímero que constituye la fase estacionaria.
76
2. Cromatografía de intercambio iónico: la fase estacionaria está constituida por
soportes con cargas positivas o negativas, las cuales son neutralizadas por los iones
presentes en la fase móvil. Cuando el extracto de proteínas ingresa a la columna,
aquellas proteínas con más tendencia a unirse al soporte reemplazan reversiblemente
los iones de la fase móvil, uniéndose al soporte. En este caso, las proteínas se han
intercambiado por los iones que neutralizaban el soporte. Las proteínas más cargadas
se unirán fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. La
afinidad con la que una proteína se une a un intercambiador depende de la fuerza
iónica del medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la proteína y
los iones de la fase móvil. Por lo tanto, la elución de las proteínas retenidas se logra
aumentando gradualmente la fuerza iónica de la fase móvil. De esta forma, eluirán
inicialmente las proteínas débilmente retenidas, mientras que las proteínas más
cargadas eluirán cuando la fuerza iónica sea superior.

Cuando el soporte presenta cargas positivas, estará neutralizado por iones de carga
negativa (aniones) de la fase móvil, los cuales se intercambiarán por proteínas cuya
carga neta también es negativa. En este caso la cromatografía se denomina de
intercambio aniónico. Por el contrario, cuando el soporte presenta cargas negativas,
éste intercambiará cationes, denominándose cromatografía de intercambio
catiónico.

3. Cromatografía hidrofóbica: la fase estacionaria es apolar (hidrofóbica), razón por
la cual las proteínas se unirán al soporte mediante sus residuos de aminoácidos
apolares. Por lo tanto, cuanto más residuos apolares exhiba la proteína en su
superficie, será, retenida más fuertemente en la columna. En este caso la elución de la
proteína se logra aumentando la apolaridad de la fase móvil.

4. Cromatografía de afinidad: numerosas proteínas tienen la capacidad de unirse
específicamente a ciertas moléculas, mediante uniones fuertes no covalentes. En esta
técnica la molécula que se une a la proteína se denomina ligando, el cual se enlaza
covalentemente a una matriz o soporte inerte. Cuando el extracto con la mezcla de
proteínas se aplica a la columna, la proteína afín por el ligando se unirá a éste,
mientras que las demás proteínas saldrán de la columna con la fase móvil. La elución
de la muestra se realiza estableciendo un fenómeno de competencia, al aumentar la
concentración del ligando en la fase móvil. Por ejemplo, cuando una fase estacionaria
está constituida por carbohidratos como la glucosa, las proteínas afines a los mismos
serán retenidas y eluirán posteriormente al pasar en la fase móvil altas
concentraciones de glucosa. En este caso la fase estacionaria y la glucosa de la fase
móvil compiten por la proteína de interés.

77
Los sistemas cromatográficos pueden automatizarse, utilizando bombas de alta
presión (100-400 bares) y columnas con mayor poder de retención. Estos sistemas
reducen notablemente los tiempos de operación e incrementan los porcentajes y
rendimiento de las purificaciones. El FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) es el
sistema actualmente más empleado para tal fin.
En la presente práctica se realizará un protocolo de cromatografía de afinidad,

empleando la fase estacionaria Sephadex G75, un soporte compuesto por dextrano
(polisacárido de glucosa), el cual permitirá purificar la favina, aprovechando su
afinidad por los carbohidratos.
PROCEDIMIENTO

Cromatografía de afinidad:

A cada grupo se le entregará una columna empacada con Sephadex G-75, la cual se
encontrará equilibrada en NaCl 1% (P/V). Este soporte tradicionalmente se usa para
cromatografía de filtración en gel, sin embargo, en esta ocasión se aprovechará su
estructura química para realizar cromatografía de afinidad.

Aplicación del extracto de globulinas:

Retirar la solución de NaCl 1% (P/V) que se encuentra sobre la superficie de la fase
estacionaria de la columna, mediante la apertura de la llave de paso de la columna.
EVITAR QUE EL SOPORTE SE SEQUE. Por esta razón, durante TODO el protocolo
debe mantener un remanente de fase móvil sobre la fase estacionaria.

Adicionar con pipeta pasteur, LENTAMENTE Y POR LAS PAREDES DE LA COLUMNA,
5 mL del extracto de globulinas. EVITAR PERTURBAR LA SUPERFICIE DE LA FASE
ESTACIONARIA. Luego, permitir que la muestra ingrese en el soporte, mediante la
apertura de la llave de paso.

Elución de proteínas no retenidas:

Una vez la muestra haya ingresado en su totalidad al soporte, eluir la muestra al
adicionar NaCl 1% (P/V) en la parte superior de la columna y recoger fracciones de 3
mL en tubos de ensayo. Continuar adicionando NaCl 1% (P/V) sobre la fase
estacionaria hasta observar la elución completa de la fracción de proteínas que no
interactuó con el soporte (proteínas no retenidas). Para esto, determinar la presencia
78
de proteínas en cada una de las fracciones recogidas, monitoreando su absorbancia a
280 nm. Utilizar como blanco NaCl 1% (P/V).

Conservar la fracción de mayor absorbancia para pruebas posteriores (electroforesis).

Elución de la favina:

Una vez eluidas las proteínas no retenidas (absorbancia≈ 0), iniciar la elución de la
favina retenida. Para esto, adicionar solución de glucosa 5% (P/V) preparada en NaCl
1% (P/V), recoger fracciones de 2 mL y monitorear su absorbancia a 280 nm. Utilizar
como blanco NaCl 1% (P/V).

Conservar la fracción de mayor absorbancia para pruebas posteriores (electroforesis).

RESULTADOS

1. Utilizar la curva de calibración construida en la Práctica 7.1 para completar la
siguiente tabla de datos:

Eluidos de mayor Volumen del Factor de Absorbancia Concentración
absorbancia de: eluido (mL) dilución 280 nm estimada (mg/mL)
Proteínas no

retenidas
Favina -

2. Graficar el perfil de elución de la cromatografía de afinidad: Absorbancia 280
nm VS Volumen de elución (ml).

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué se utiliza NaCl 1% (P/V) como fase móvil en la práctica? Explique.

2. Para purificar la favina, un grupo de trabajo utilizó una columna Sephadex G-75
equilibrada con glucosa 5% (P/V)-NaCl 1% (P/V). Graficar el perfil de elución
esperado una vez finalizado el protocolo de purificación.

3. ¿Cuál es el objetivo de monitorear la absorbancia a 280 nm de las diferentes
fracciones recogidas durante el protocolo de purificación?

79
REFERENCIAS

Asensio, E. Estudio comparativo de la actividad hemaglutinante de algunas
leguminosas colombianas. Purificación y caracterización de la hemaglutinina
del haba (Vicia faba). Tesis de grado en Química. Universidad Nacional de Colombia.
Bogotá. 1975

80
PURIFICACIÓN DE FAVINA POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
•  Columna Sephadex G-75

MATERIALES &
•  NaCl 1% (P/V)
REACTIVOS
•  Glucosa 5% (P/V) en NaCl 1% (P/V)
1 4 Glucosa-NaCl
Extracto de
globulinas
Eluir con
Adicionar 5 mL glucosa 5% (P/V)-
de muestra NaCl 1% (P/V)
Recoger fracciones
de 1 mL c/u
Comenzar a recoger
fracciones de
3 mL c/u
2 NaCl 1% (P/V) 5 Monitorear Abs 280 nm

hasta obtener línea base (≈ 0)
Blanco: NaCl 1% (P/V)
Lavar con NaCl

1% (P/V)
Continuar recogiendo
6 Almacenar fracción
fracciones de de mayor absorbancia
3 mL c/u
Almacenar fracciones
Abs. 280 nm
de mayor absorbancia
3 Monitorear Abs 280 nm

hasta obtener línea base (≈ 0). Volumen (mL)
Blanco: NaCl 1% (P/V)
Utilizar las muestras almacenadas para

posterior análisis por electroforesis
81
PRÁCTICA 7.3

PURIFICACIÓN DE LA FAVINA: ELECTROFORESIS

OBJETIVO

Analizar las fracciones recogidas en el protocolo de purificación de la favina, por
electroforesis, bajo condiciones desnaturalizantes.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Electroforesis:

La electroforesis es una técnica simple, rápida y sensible que permite separar
moléculas cargadas, bajo la influencia de un campo eléctrico. El principio de la técnica
se basa en el siguiente fenómeno: al aplicar un campo eléctrico, las moléculas
cargadas migran hacia los electrodos de polaridad opuesta. Esta técnica analítica se
utiliza principalmente para el estudio de ácidos nucleicos y proteínas.

La velocidad de migración de las moléculas (v) es directamente proporcional al
producto de su carga efectiva (q) por la intensidad del campo eléctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente de fricción (F), el cual es relativo al radio (r)
de la molécula y a la viscosidad del medio de separación(η), veamos:

v= qE/F

Asumiendo que la molécula es esférica y aplicando la ley de Stokes, la cual se refiere a
la fuerza de fricción experimentada por objetos esféricos en un medio viscoso, como
los soportes electroforéticos, se tiene que:

F= 6πηr

A partir de estas ecuaciones, la velocidad de la molécula será:

v = qE/6πηr

Por consiguiente, la velocidad de migración de las moléculas en la electroforesis
depende de su carga efectiva, la intensidad del campo eléctrico, el tamaño de la
molécula y la viscosidad del medio.
82
La carga de las moléculas depende principalmente de los grupos ionizables presentes
en su superficie, cuyo signo y magnitud depende a su vez del pH y la fuerza iónica del
medio. En consecuencia, la separación óptima de las moléculas mediante
electroforesis puede efectuarse seleccionando las condiciones apropiadas de pH y
fuerza iónica.

La mayor diferencia entre métodos electroforéticos es el tipo de soporte, el cual puede
ser de agarosa, almidón, celulosa o poliacrilamida. La celulosa es usada como soporte
para separar moléculas de bajo peso molecular como aminoácidos y carbohidratos.
Por su parte, los geles de poliacrilamida y agarosa son ampliamente usados para
macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos.

Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE):

Los geles de acrilamida presentan las siguientes características:

1. Alto poder de resolución para proteínas y ácidos nucleicos.
2. Interacciones mínimas entre la matriz y las moléculas migrantes.
3. Estabilidad física de la matriz.
4. Alta sensibilidad.
La electroforesis en gel de poliacrilamida permite mejorar la resolución de separación

de los componentes de una muestra dado que la separación se basa no solo en la
movilidad electroforética sino también en la acción de tamizado molecular. El gel es
comparable con un tamiz molecular donde las moléculas grandes no se moverán
fácilmente y la velocidad de migración de las moléculas pequeñas será mayor.

Los geles de poliacrilamida son preparados por la polimerización de radicales libres
de acrilamida y su entrecruzamiento con N,N´-metilen-bis-acrilamida. La
polimerización química está controlada por el persulfato de amonio y la N,N,N,N´,-
tetraetilendiamina (TEMED), que actúan como iniciador y catalizador,
respectivamente.

El poder de resolución y el intervalo de tamaño molecular a separar dependen de la
concentración de acrilamida y bis-acrilamida. Bajas concentraciones de acrilamida
(2.5%) producen geles de resolución con poros grandes que permiten el análisis de
biomoléculas de alto peso molecular. Por el contrario, altas concentraciones de
acrilamida (8 – 12%) producen geles con poros pequeños que permiten el análisis de
biomoléculas de menor tamaño (proteínas).
83
El tamaño del poro puede controlarse con exactitud y en forma reproducible, por la
concentración total de acrilamida (T) y el grado de entrecruzamiento (C):

𝒂 + 𝒃 𝒙𝟏𝟎𝟎
%𝑻 =
𝑽 a= masa de acrilamida en gramos
b= masa de N,N´-metilen-bis-acrilamida en gramos
𝒃𝒙𝟏𝟎𝟎 V= volumen en mL
%𝑪 =
(𝒂 + 𝒃)

Electroforesis en gel discontinuo:

En esta técnica hay dos zonas diferentes en la placa del gel, una superior o gel de
concentración y otra inferior o gel de separación. Las diferencias entre ambas zonas
radica en el pH y el %T. El gel de concentración, cuyo pH es 6,8, presenta poros de
gran tamaño (%T= 3,9). Por su parte, el gel de separación, cuyo pH es 8.8, presenta
poros de menor tamaño (%T= 8 – 12)

Estas diferencias promueven la formación de bandas concentradas de los
componentes de la muestra en el gel de concentración y una mejor resolución en el gel
de separación. Por tanto, la electroforesis en gel discontinuo permite excelente
resolución y es el método de elección para el análisis de proteínas porque las bandas
con contenidos pequeños de proteína (1 – 2 µg) pueden ser detectadas fácilmente al
teñir el gel después de la corrida electroforética.

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE):

Técnica que permite determinar el peso molecular (PM) de las proteínas analizadas, al
ser separadas por electroforesis en presencia de un detergente aniónico como el
dodecil sulfato de sodio (SDS) y de un agente reductor como el β-mercaptoetanol. El
SDS rompe la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas,
generando cadenas polipeptídicas lineales cubiertas con SDS, cargándolas
negativamente. El SDS se une de manera proporcional al tamaño de la cadena (1
molécula SDS/2 residuos de aminoácidos). El β- mercaptoetanol desnaturaliza la
proteína por reducción de los puentes disulfuro.

En consecuencia, la movilidad del complejo proteína-SDS dependerá del tamaño de la
molécula, donde las de mayor tamaño serán retardadas por el efecto de tamiz
molecular del gel, mientras que las moléculas de menor tamaño tendrán una mayor
movilidad.
84
Para determinar el PM de una proteína, la cual ha sido tratada con SDS 1% (P/V), β-
mercaptoetanol 0.1 M y sometida a ebullición por 5 minutos, se corre
simultáneamente con una mezcla de proteínas de PM conocido (marcadores de PM).
Una vez corrida la electroforesis y teñido el gel, se miden las movilidades
electroforéticas de los marcadores de PM para construir una curva de calibración (Log
PM vs. Movilidad relativa). Utilizando la ecuación de la recta resultante, se determina
el PM de la proteína objeto de estudio.

REACTIVOS

• Buffer concentrador 4X: Tris 0.5 M pH 6.8/SDS 0.4% (P/V)
• Buffer de carga 6X: azul de bromofenol 0,01% (P/V)/buffer concentrador 4X
35% (P/V)/SDS 10% (P/V)/glicerol 30% (P/V)/β-mercaptoetanol 33% (V/V)
• Buffer de corrida de electroforesis 5X: Tris 1.5% (P/V)/glicina 7.2%
(P/V)/SDS 0.5% (P/V)
• Buffer separador 4X: Tris 1.5 M pH 8.8/SDS 0.4% (P/V)
• Etanol absoluto o 75% (V/V)
• Marcadores de peso molecular
• Persulfato de amonio 10% (P/V)
• Solución de monómeros: acrilamida 29.2% (P/V)/bisacrilamida 0.8% (P/V).
Toxica. Evite contacto con la piel
• Solución de tinción: ácido acético 12.5% (P/V)/azul de Coomassie R-250
0.05% (P/V)/isopropanol 25% (P/V). Sensibilidad: 0.1 - 0.5 μg/banda.
• TEMED

PROCEDIMIENTO

1. Preparación del gel:

Armar el casete del gel, el cual consiste de dos vidrios separados por espaciadores
adecuados, que permiten generar geles de espesor uniforme entre 0.5 – 2 mm.
Insertar el casete en el dispositivo de polimerización y verificar que no haya fuga,
utilizando agua destilada para tal fin. Retirar el agua y proseguir.

Preparar la siguiente mezcla para el gel separador (%T= 12) y verter entre los dos
vidrios del casete:

La mezcla resultante es suficiente para preparar dos geles separadores.

85
Componente Volumen
Agua destilada 5 mL
Buffer separador 4X 3,8 mL
Solución de monómeros 6 mL
Persulfato de amonio 100 μL
*TEMED 10 μL

* Se agrega al final y sólo en el momento de aplicar la solución entre los vidrios.

Adicionar 200 μL de etanol entre los vidrios para asegurar una superficie plana y sin
burbujas en el borde superior de la mezcla.

Esperar hasta la polimerización completa de la mezcla (aprox. 20 minutos). Retirar el
etanol y lavar con agua destilada.

Preparar la siguiente mezcla para el gel concentrador (%T= 3.9), verter entre los dos
vidrios del casete e insertar el peine de plástico en la parte superior del sistema para
formar los pozos donde se sembrarán las muestras:

La mezcla resultante es suficiente para preparar dos geles concentradores.

Componente Volumen
Agua destilada 3 mL
Buffer concentrador 4X 1,3 mL
Solución de monómeros 0,64 mL
Persulfato de amonio 50 μL
*TEMED 10 μL

* Se agrega al final y sólo en el momento de aplicar la solución entre los vidrios.

Esperar hasta la polimerización completa de la mezcla (aprox. 10 minutos). Retirar el
peine y lavar con agua destilada para eliminar sales y residuos de acrilamida no
polimerizada.

Colocar el casete al interior de la cámara de electroforesis y adicionar buffer de
corrida 1X en los tanques interior y exterior del sistema, asegurando que los
filamentos de la cámara queden sumergidos en el buffer .

86
2. Preparación de la muestra:

Las muestras deben contener aproximadamente 1 mg de proteína/mL. Mezclar en un
tubo eppendorf 100 μl de muestra y 20 μl del buffer de carga 6X, de tal manera que
éste quede 1X. Hervir por 5 minutos a 92ºC.

3. Condiciones de corrida y tinción del gel:

Sembrar en cada pozo, entre 10 – 20 μL de muestra. Conectar la cámara a la fuente de
poder, ajustar a 80 voltios y correr la electroforesis hasta que el frente de corrida
(banda azul) alcance la parte superior del gel de separación. Aumentar el voltaje a 120
voltios hasta que el frente de corrida alcance el borde inferior del gel. Remover el gel e
incubarlo por lo menos una hora en la solución de tinción. Retirar y guardar la
solución de tinción. Lavar el gel con agua caliente. Realizar al menos 3 lavados.
Alternativamente, lavar el gel con ácido acético 7% (V/V) hasta su decoloración.

RESULTADOS

1. Foto-documentar (adquirir un registro fotográfico) el SDS-PAGE teñido e
indicar los marcadores de PM y el orden de siembra de las distintas muestras.

2. Interpretar los perfiles proteicos observados en los distintos carriles del SDS-
PAGE, teniendo en cuenta los pasos experimentales realizados en las prácticas
7.1 – 7.3.

3. Medir la movilidad relativa de los marcadores de PM respecto a la longitud
total del gel separador y graficar la curva de calibración de PM (Log PM vs.
Movilidad relativa), indicando la ecuación de la recta obtenida.

4. Medir la movilidad relativa de la favina presente en los eluidos de la
cromatografía de afinidad y determinar su PM, utilizando la ecuación de la
recta obtenida.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es y cuáles son las utilidades de una electroforesis nativa de proteínas?

2. ¿Cuál es la función del pH en los geles de concentración y separación?

3. ¿Cuál es la función de la glicina utilizada en el buffer de corrida?
87
4. Una proteína hipotética se compone de dos cadenas polipeptídicas de 23 y 38
kDa cada una. Dichas cadenas establecen heterodímeros mediante puentes
disulfuro. Dibuje el perfil electroforético de la proteína cuando es analizada
mediante SDS-PAGE en presencia y ausencia de β-mercaptoetanol.
REFERENCIAS
García Perez HM. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,

actualidad e importancia. Universo Diagnóstico. 2000; 1(2): 31-4

88

Precipitación con sulfato de amonio

Ammonium sulfate precipitation
Cantidades de sulfato de amonio (g/L de solución) necesarias para aumentar la concentración
Amounts of ammonium sulfate (in g/l solution) to change the concentration of a solution from an
de una solución desde un porcentaje inicial de saturación hasta un porcentaje deseado de saturación:
initial percentage of saturation to a desired target percentage saturation at 0°C:
% Deseado de saturación
Target Percentage Saturation
% Inicial de saturación
Initial Percentage Saturation 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697
5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662
10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627
15 26 54 82 111 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592
20 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557
25 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 395 436 478 522
30 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 488
35 28 57 87 118 151 184 218 254 291 329 369 410 453
40 29 58 89 120 153 187 222 258 296 335 376 418
45 29 59 90 123 156 190 226 263 302 342 383
50 30 60 92 125 159 194 230 268 308 348
55 30 61 93 127 161 197 235 273 313
60 31 62 95 129 164 201 239 279
65 31 63 97 132 168 205 244
70 32 65 99 134 171 209
75 32 66 101 137 174
80 33 67 103 139
85 34 68 105
90 34 70
95 35
Add – step by step – small portions of the required amount of ammonium sulfate, allowing each portion to dissolve before the next
El sulfato de amonio debe adicionarse LENTAMENTE, permitiendo su disolución completa antes
portion is added. This will prevent accumulation of undesirable high local salt concentrations.
de agregar cantidades adicionales a la solución.
3 Working with Proteins 98
89
3730 LabFAQs.indb 203 04.10.2011 17:44:21

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Ácido ascórbico Ácido dehidroascórbico

A menudo, la transmitancia se expresa como porcentaje:

Aplicando logaritmo decimal: ∆t

Filtrar el zumo a través de 2 capas

ORDEN MARCAR TUBOS B1 B2 1 2 3 4 5 6 M1 M2 M3 M4

ADICIONAR LOS SIGUIENTES

AGITAR HASTA OBSERVAR DECOLORACIÓN

MEZCLAR E INCUBAR 5 MINUTOS A

AGITAR Y MEDIR ABSORBANCIA A 540 nm

En términos de estructura cuaternaria, se han reportado oligómeros de dos, cuatro y

Macerar en frío con 10 mL

Centrifugar el extracto coloreado a

Tomar el sobrenadante y adicionar

Marcar como Conservar

Agitar e incubar la reacción sobre hielo durante 5 minutos

H2SO4 (mL) 2 2 2 2 2 2,5

Para cada uno de los 6 tubos, realizar el siguiente procedimiento :

1. Transferir 2. Titular 3. Punto Uinal

10 9,5 9 8,5 8 10,5

Agitar e incubar la reacción sobre hielo durante 5 minutos

Para cada uno de los 6 tubos, realizar el siguiente procedimiento :

1. Transferir 2. Titular 3. Punto Vinal

11,5 11 10,5 10 9,5 10

H2O2 (mL) 0,5 1 1,5 2 2,5 2,5

Agitar e incubar la reacción sobre hielo durante 5 minutos

Para cada uno de los 6 tubos, realizar el siguiente procedimiento :

1. Transferir 2. Titular 3. Punto Xinal

9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 10,5

Para cada uno de los 6 tubos, realizar el siguiente procedimiento :

1. Transferir 2. Titular 3. Punto final

Aminoácidos Hoja β Hélice α Hojas β

Agitar en Vortex por 10 minutos y centrifugar

Tomar el sobrenadante y completar volumen

Marcar como Método de Biuret

1. DIGESTIÓN Realizar en cabina de extracción

100 mg de mezcla catalizadora

BALÓN DE INCUBAR SOBRE INCUBAR HASTA

3. TITULACIÓN HCl Punto

Patrón de proteína 5 mg/mL (mL) - 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 - -

Extracto Proteico (mL) - - - - - - 0,5 1,0

Agitar e incubar durante 10 minutos a 37ºC

Leer absorbancia a 540 nm

Filtrar y eliminar el residuo

Decantar el Filtrado por

Eliminar el sobrenadante y resuspender

Macerar 0,5 g de levadura en

Adicionar 8 mL de buffer de extracción frío

Trasvasar a tubo Falcon, adicionar 0,5 mL

Incubar a 65ºC por 10 minutos

Adicionar 3 mL de acetato de potasio 5 M y agitar

Incubar en baño de hielo por 10 minutos

Adicionar 0,3 mL del sobrenadante a un

Incubar en baño de hielo por 15 minutos

Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado

Muestra M1 Patrón almidón Patrón glucosa

0,5 0,5 0,5

Prueba de Prueba de Prueba de Prueba de

Observar Enfriar y adicionar Adicionar con cuidado Incubar en baño

PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Medidas Efecto Prueba para

Utilizar como Medir absorbancia Mezclar y dejar

Acilgliceroles Fosfoglicéridos Es9ingolípidos Ceras Terpenos Esteroides Eicosanoides

•  Patrón de albúmina o caseína 5 mg/mL

•  Columna Sephadex G-75