Western blot

Ir a la navegaci�nIr a la b�squeda

Resultado del Western blot: una membrana con las prote�nas separadas en la
electroforesis unidas, de las que s�lo se disciernen aquellas contra las se ha
a�adido un anticuerpo.
El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una t�cnica anal�tica usada
en biolog�a celular y molecular para identificar prote�nas espec�ficas en una
mezcla compleja de prote�nas, tal como la que se presenta en extractos celulares o
de tejidos. La t�cnica utiliza tres etapas para lograr esto: separaci�n por tama�o,
transferencia a un soporte s�lido y, finalmente, visualizaci�n mediante la
marcaci�n de prote�nas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios
apropiados.1?

Esta t�cnica es hoy en d�a imprescindible en varios campos de la biolog�a, como la

biolog�a molecular, la bioqu�mica, la biotecnolog�a o la inmunolog�a.

Mediante una electroforesis en gel se separan las prote�nas atendiendo al criterio

que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas
posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una
membrana adsorbente (t�picamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la
prote�na de inter�s con anticuerpos espec�ficos contra ella. Finalmente, se detecta
la uni�n ant�geno-anticuerpo por actividad enzim�tica o fluorescencia, entre otros
m�todos. De esta misma forma se puede estudiar la presencia de la prote�na en el
extracto y analizar su cantidad relativa respecto a las otras prote�nas.2?3?

La t�cnica �Western blot� fue desarrollada en la Universidad de Stanford. El nombre

(Western, occidental en ingl�s) le fue dado por W. Neal Burnette, y consiste en un
juego de palabras con una t�cnica an�loga pero que usa DNA, el Southern (sure�o en
ingl�s) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern.
Otras t�cnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern
(norte�o en ingl�s) (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern (oriental en
ingl�s) blot y el Southwestern (del suroeste en ingl�s) blot.2?4?

�ndice
1 Pasos del Western blot
1.1 Preparaci�n de la muestra
1.2 Electroforesis en gel
1.3 Transferencia
1.3.1 Difusi�n simple
1.3.2 Transferencia al vac�o
1.3.3 Electrotransferencia
1.4 Bloqueo
1.5 Detecci�n
1.5.1 M�todo en dos pasos
1.5.1.1 Anticuerpo primario
1.5.1.2 Anticuerpo secundario
1.5.1.2.1 Radiactividad
1.5.1.2.2 Anticuerpo unido a una enzima
1.5.1.2.3 Marcaje fluorescente
1.5.1.2.4 Sistema avidina/estreptavidina
1.5.1.2.5 Detecci�n con oro
1.5.2 M�todo en un paso
1.6 An�lisis
1.6.1 Detecci�n colorim�trica
1.6.2 Detecci�n quimioluminiscente
1.6.3 Detecci�n radioactiva
1.6.4 Detecci�n fluorescente
1.7 Exploraciones secundarias
2 Aplicaciones
2.1 Investigaci�n
2.2 Diagn�stico
3 Protocolos
4 V�ase tambi�n
5 Referencias
6 Enlaces externos
Pasos del Western blot
Preparaci�n de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

Una peque�a cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracci�n. Despu�s se

procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes vol�menes de
muestra), con un homogenizador (para muestras peque�as) o por sonicaci�n. Por
�ltimo se centrifuga para obtener las prote�nas en el sobrenadante, la fracci�n no
precipitada.5?
Las c�lulas pueden lisarse por uno de esos m�todos mec�nicos. Tambi�n pueden usarse
detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las prote�nas.
Este proceso debe realizarse a baja temperatura (~4 �C) para evitar la
desnaturalizaci�n proteica y con la adici�n de inhibidores de proteasas y
fosfatasas para evitar la digesti�n de las prote�nas y de las fosfoprote�nas por
las enzimas celulares. Para separar prote�nas de compartimentos y org�nulos
celulares es preciso combinar t�cnicas mec�nicas - como filtraciones y
centrifugaciones - y bioqu�micas.1?6?
SDS-PAGE sample.png
Electroforesis en gel
Art�culo principal: Electroforesis en gel
Las prote�nas de la muestra ser�n separadas mediante una electroforesis en gel en
funci�n de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios:
punto isoel�ctrico, peso molecular y carga el�ctrica. La naturaleza de la
separaci�n depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.

La electroforesis en gel m�s frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de
poliacrilamida y de tamp�n con dodecilsulfato (SDS). En esta t�cnica las prote�nas
sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la p�rdida de las
estructuras secundaria y terciaria y mantiene los polip�ptidos en este estado
desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las prote�nas no
influye en la electroforesis, y pueden separarse �nicamente en funci�n del tama�o.

SDS-PAGE Electrophoresis.png
Transferencia
Para que las prote�nas sean accesibles a la detecci�n por anticuerpos, se las
transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de
PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusi�n, por vac�o o por acci�n de
un campo el�ctrico (electrotransferencia).

Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de

unir prote�nas de forma inespec�fica (es decir, se adhieren a todas las prote�nas
con id�ntica afinidad):

las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de

las interacciones membrana - prote�na, se sabe con cierta seguridad que se trata de
interacciones no covalentes de naturaleza hidr�foba.
en las membranas de PVDF, la uni�n est� basada en interacciones hidrof�bicas y de
dipolos entre la membrana y las prote�nas. Como particularidad, deben ser
humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a
su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Las membranas de nitrocelulosa son m�s baratas que las de PVDF, aunque son tambi�n
m�s fr�giles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser
sometidas a varias pruebas consecutivas.7?

Tambi�n pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel
activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.

Difusi�n simple
En la transferencia por difusi�n simple se ponen en contacto las superficies del
gel electrofor�tico y de la membrana y, sobre �sta, se dispone un taco de papeles
de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de
vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tamp�n, que ascender�
por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las prote�nas. Al
llegar a la membrana, quedar�n retenidas en ella.

Este protocolo no est� muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de

prote�na transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la
electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una
modificaci�n que permite obtener m�ltiples transferencias de un mismo gel,
permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente
id�nticos. Esta modificaci�n es viable cuando no es necesaria una transferencia
cuantitativa de prote�na.8?7?

Transferencia al vac�o
En esta t�cnica, se a�ade el poder de succi�n de una bomba conectada a un sistema
de secado de planchas de gel, el cual lleva las prote�nas desde el gel hasta la
superficie de la membrana de nitrocelulosa. Este m�todo es v�lido tanto para
prote�nas de alto como de bajo peso molecular.9?7?

Electrotransferencia
Este m�todo se basa en una corriente el�ctrica y un tamp�n de transferencia para
llevar las prote�nas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el
orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o c�todo al positivo o
�nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia,
gel, membrana, m�s papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje,
llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se
aplica una corriente el�ctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al
tiempo disponible,... Las prote�nas del gel se desplazan hacia el polo positivo y
quedan atrapadas por la membrana.3?

Western blot transfer.png

Tras la transferencia, se suele proceder a la tinci�n del gel con Azul de Coomassie
(un colorante de prote�nas) para comprobar que en efecto una parte importante del
material proteico ha pasado a la membrana.

La electrotransferencia es hoy en d�a la t�cnica de transferencia m�s usada gracias

a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de prote�na que se transfiere
(especialmente en comparaci�n con las otras t�cnicas).

Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse a las prote�nas de forma
inespec�fica, es preciso bloquear los lugares de uni�n que han quedado libres tras
la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica)
empleado en la detecci�n puede unirse a ellos, dificultando la distinci�n del
complejo ant�geno-anticuerpo que se forma con la prote�na que se busca.

En el bloqueo se incuba la membrana con una soluci�n de prote�nas, t�picamente de

alb�mina de suero bovino o ASB (m�s conocida por sus siglas en ingl�s, BSA), leche
en polvo o case�na, con una diminuta fracci�n de detergente, como Tween 20 o Trit�n
X-100. Las prote�nas en soluci�n se unir�n a todos aquellos lugares de uni�n de la
membrana que no est�n ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo,
el anticuerpo s�lo podr� unirse a su ant�geno espec�fico, reduciendo as� el ruido
de fondo y los falsos positivos.

Detecci�n
En la detecci�n se comprueba la presencia en la membrana de una determinada
prote�na. Para ello se emplea un anticuerpo espec�fico contra ella unido a enzima
que, en presencia de su sustrato, catalice una reacci�n colorim�trica (produce
color). De esta forma, se hace patente la uni�n con el ant�geno, la prote�na, as�
como su localizaci�n.

El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible

la detecci�n en un �nico paso, lo cual es �til en ciertos campos.

M�todo en dos pasos

Los dos pasos de los que consta este m�todo de detecci�n son la uni�n del
anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario.

Western Blot binding.png

Anticuerpo primario
El primer paso es permitir la uni�n de un anticuerpo primario contra la prote�na
buscada. �ste se consigue inoculando dicha prote�na o uno de sus ep�topos (regiones
capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una
cabra) o a un cultivo celular. Adem�s, como la prote�na se ha desnaturalizado
durante la electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca
espec�ficamente la prote�na desnaturalizada. La presencia del elemento extra�o
deber�a desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la producci�n del
anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la prote�na.

As� pues, tras el bloqueo se incuba en agitaci�n moderada la membrana con una
disoluci�n de anticuerpo primario (0,5 - 5 �g/ml). La disoluci�n consiste en un
tamp�n salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la
neutralidad, una peque�a fracci�n de detergente y, en ocasiones, prote�nas
disueltas, como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disoluci�n pueden
ser introducidas en una peque�a bolsa de pl�stico. Esta incubaci�n puede durar
desde 30 minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es
igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones m�s
espec�ficas.[cita requerida]

Anticuerpo secundario
Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se
expone al anticuerpo secundario. �ste reconoce de forma espec�fica una regi�n
concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (uni�n
a biotina, a una enzima reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del
r�bano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unir�n a cada anticuerpo
primario, amplificando la se�al.

Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de

origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-rat�n" es aquel capaz de
reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay
anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas:
econ�micas, por permitir a un laboratorio compartir una �nica fuente de anticuerpos
secundarios; y dan resultados mucho m�s consistentes.

Tambi�n pueden emplearse prote�nas no anticuerpos, como las prote�nas A y G.

Radiactividad

Uni�n del anticuerpo primario a la prote�na de inter�s. A este se une la prote�na A

o la prote�na G para ser detectada.
Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en prote�nas de
uni�n a anticuerpos marcadas radiactivamente. Esta prote�na puede ser, por ejemplo,
la prote�na A de Staphylococcus aureus4? o la prote�na G10? marcadas con 125I (un
is�topo radiactivo de yodo). Las prote�nas mencionadas tienen la capacidad de
unirse a anticuerpos de forma inespec�fica, por lo que se unir�n al primario.

Este m�todo apenas se usa actualmente, por ser significativamente m�s caro,
peligroso y lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible,
da bandas que permiten una precisa cuantificaci�n; y la imagen autoradiogr�fica
puede ser reproducida f�cilmente y con gran precisi�n para su publicaci�n.7?

Anticuerpo unido a una enzima

Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de r�bano, de modo que puede catalizar

la reacci�n quimioluminiscente.
Un mecanismo de detecci�n simple y r�pido consiste en unir al anticuerpo secundario
enzimas que catalicen la transformaci�n de un sustrato soluble en un producto
insoluble. De esta forma, en el posterior an�lisis quedar� una mancha all� donde
est� la prote�na de inter�s. Enzimas como la peroxidasa de r�bano (HRP) o una
fosfatasa alcalina son v�lidas para este mecanismo.7? Por ejemplo, la peroxidasa
puede catalizar la oxidaci�n del 4-cloronaftol en presencia de un 1% de per�xido de
hidr�geno. El resultado es que el primero forma una mancha de precipitado
oscura.11? Otras t�cnicas, como ELISA o ELISPOT, tambi�n emplean este m�todo de
detecci�n.

Otro m�todo m�s sofisticado consiste en la uni�n de una enzima que catalice una
reacci�n quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambi�n son v�lidas
en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. En el
caso de la peroxidasa, cataliza la oxidaci�n del luminol en presencia de per�xido
de hidr�geno. La fosfatasa alcalina cataliza la defosforilaci�n del adamantil-1-2-
dioxetano fosfato, reacci�n que genera luz. Si se coloca una pel�cula fotogr�fica
sobre la membrana, la exposici�n a la luz que se desprende en la reacci�n permite
detectar la actividad enzim�tica.

Marcaje fluorescente
Otro m�todo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos
del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona
(MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante
(estado est�tico) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una detecci�n
muy precisa y una cuantificaci�n del ant�geno m�s exacta que la de la
quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado din�mico.

El rojo Nilo no puede usarse para te�ir bandas en membranas de PVDF; sin embargo es
posible realizar la tinci�n en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana
de PVDF. Esto �ltimo presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una
tinci�n del gel para comprobar la transferencia proteica.12?

Sistema avidina/estreptavidina
Otra opci�n es emplear un anticuerpo primario unido covalentemente a mol�culas de
biotina. Despu�s la detecci�n se llevar� a cabo con una prote�na de uni�n a la
misma, como la estreptavidina o la avidina.

Detecci�n con oro

Otra t�cnica, conocida como Golden blot, consiste en la detecci�n de los
anticuerpos primarios con prote�na A unida a part�culas de oro. El resultado es una
membrana con manchas rojas, causadas por el oro, all� donde est� la prote�na.13? La
sensibilidad del m�todo puede incrementarse con una tinci�n fotoqu�mica de plata:
el oro cataliza la reducci�n de los iones plata a plata met�lica en presencia de
otro agente reductor, como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas
manchas visibles bajo microscopio �ptico. Se consigue as� una sensibilidad
comparable a la de las t�cnicas radiactivas.7?14?

M�todo en un paso
Hist�ricamente la detecci�n se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad
que supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto
ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se
refiere, y a�ade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la
llegada de los an�lisis de prote�nas de alto rendimiento y los menores l�mites de
detecci�n ha crecido el inter�s por desarrollar sistemas de detecci�n en un solo
paso que aumentar�an la rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles.
Esto requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la prote�na de inter�s y
una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del
proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar
directamente.

An�lisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detecci�n de
aquellas que s� se han unido a la prote�na de inter�s.

Detecci�n colorim�trica
La detecci�n colorim�trica depende de la incubaci�n del Western blot con un
sustrato que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo)
unida al anticuerpo secundario. Pasa as� de ser un compuesto soluble a una forma
insoluble de otro color que precipita cerca de la enzima ti�endo as� la membrana.
Se procede despu�s a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La
cuantificaci�n proteica se eval�a por densitometr�a (cuan intensa es la mancha) o
por espectrometr�a.

Detecci�n quimioluminiscente
La detecci�n quimioluminiscente requieren la incubaci�n de la membrana con un
sustrato, que emitir� luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el
anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una pel�cula fotogr�fica o,
m�s recientemente, por c�maras CCD, que toman una imagen digital del Western blot.
Se analiza la imagen por densitometr�a para evaluar la cantidad relativa de mancha
y cuantifica el resultado en t�rminos de densidad �ptica. Actualmente hay programas
que permiten realizar an�lisis m�s profundos si se aplican ciertos est�ndares, como
la obtenci�n del peso molecular.

Western blot chemiluminescent detection.png

Detecci�n radioactiva
Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzim�ticos; en su lugar se
coloca una pel�cula fotogr�fica contra el Western blot y la actividad radiactiva
del marcador provoca la aparici�n en ella de regiones oscuras. Estas se
corresponder�n con las bandas de las prote�nas de inter�s. Su alto precio y su
riesgo para la salud y la seguridad han provocado su desuso en los �ltimos tiempos.

Detecci�n fluorescente
En la detecci�n con marcadores fluorescentes se procede a la excitaci�n lum�nica de
�stos que les provoca una excitaci�n. �sta es detectable por un fotosensor, como
una c�mara CCD equipado con los filtros de emisi�n apropiados. Se consigue as� una
imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso
molecular o la cuantificaci�n proteica. La fluorescencia es considerada uno de los
m�todos de an�lisis m�s sensibles.

Exploraciones secundarias
Una caracter�stica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de
nitrocelulosa, es su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la
membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo
en membranas de nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminaci�n
de los anticuerpos, permitiendo una mayor reutilizaci�n antes de que el ruido de
fondo sea tan grande que impida continuar con los experimentos. Otra diferencia es
que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe ser empapado en etanol,
isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Adem�s, las membranas de PVDF
tienden a ser m�s delgadas y m�s resistentes a los da�os durante su uso.