Southern blot

Ir a la navegaci�nIr a la b�squeda
Southern blot, hibridaci�n Southern o, simplemente, Southern es un m�todo de
biolog�a molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN
concreta en una mezcla compleja de este �cido nucleico. Para ello, emplea la
t�cnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de
ADN de acuerdo a su longitud y, despu�s, una transferencia a una membrana en la
cual se efect�a la hibridaci�n de la sonda.1? Su nombre procede del apellido de su
inventor, un bi�logo ingl�s llamado Edwin Southern.2?

Se muestra la dotaci�n gen�tica (azul) de un individuo homocigoto (A) y uno

heterocigoto (B) para un marcador; tras hibridarse con una sonda espec�fica (rosa)
se observa el resultado del Southern a la derecha.

�ndice
1 Pasos de Southern blot
2 Diagn�stico molecular de enfermedades
3 V�ase tambi�n
4 Referencias
Pasos de Southern blot
1. Extracci�n del ADN

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN
en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una v�ctima muerta,
c�lulas del fol�culo capilar y saliva. El ADN extra�do de las pruebas del delito
("indicios" o "vestigios" biol�gicos) se compara con el extra�do de muestras de
referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.

2. Digesti�n del ADN con una endonucleasa de restricci�n

El ADN extra�do de la muestra se trata con una endonucleasa de restricci�n, que es

una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia
caracter�stica. La enzima que se usa m�s frecuentemente para el an�lisis legal es
HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.

3. Electroforesis en gel de agarosa

Tras la digesti�n del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan seg�n su
tama�o mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las
mol�culas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al
avanzar las mol�culas de ADN, su velocidad de migraci�n se ve reducida por la
matriz del gel de agarosa. Las mol�culas menores se mueven m�s deprisa a trav�s de
los poros del gel que las de mayor tama�o. Como resultado, se produce una
separaci�n continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tama�o, de modo que
los fragmentos m�s peque�os avanzan la mayor distancia con referencia al origen o
punto de aplicaci�n de la muestra.

4. Preparaci�n de un ensayo de Southern ("Southern blot")

Tras la electroforesis, las mol�culas de ADN separadas se desnaturalizan mientras

permanecen en el gel de agarosa, impregnando �ste con una disoluci�n alcalina. Tras
la neutralizaci�n de �sta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la
superficie de una membrana de nailon, realizando as� una copia o "calco" (la
traducci�n m�s literal del ingl�s blot, conservando este sentido, es "secante").
Este proceso de desnaturalizaci�n y transferencia se conoce como m�todo de Southern
en recuerdo de quien lo invent�, Edward Southern. Al igual que la aplicaci�n de un
secante a un papel con la tinta h�meda transfiere una r�plica de la imagen del
papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la
distribuci�n espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado
de la electroforesis.

5. Hibridaci�n con sonda radioactiva

Una sonda de locus �nico es una mol�cula peque�a de ADN o ARN capaz de hibridar (es
decir, de formar un d�plex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de
restricci�n concreto en el ensayo de Southern. La formaci�n de la mol�cula
dicatenaria (d�plex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las
secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus �nico
se marcan habitualmente con un is�topo radiactivo para facilitar su detecci�n, y se
eligen para que detecten un locus gen�tico polim�rfico en un solo cromosoma humano.
El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disoluci�n que
contiene una sonda radiactiva de locus �nico, bajo condiciones de temperatura y
concentraci�n de sales que favorezcan la hibridaci�n. Tras producirse �sta, se lava
el exceso de sonda no unido, de modo que la �nica radiactividad que quede en la
membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

6. Detecci�n de los RFLPs mediante autorradiograf�a

Las posiciones de hibridaci�n de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo

de Southern se detectan mediante autorradiograf�a. En esta t�cnica, la membrana de
nailon se coloca, una vez lavada, junto a una pel�cula de rayos X dentro de una
caja que las a�sle de la luz. La pel�cula registra las posiciones donde hay
desintegraci�n radiactiva. Tras su exposici�n y el revelado fotogr�fico, el
registro resultante de la hibridaci�n de Southern se conoce como autorradiograf�a

7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

En un an�lisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios

cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiograf�a para la primera
sonda, se puede lavar la radiactividad con una disoluci�n a elevada temperatura,
que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se
una a un locus diferente. Se repiten as� las etapas 5-7, detectando cada vez un
locus diferente. El grupo de autorradiograf�as de una misma transferencia de
Southern se conoce como un "perfil de ADN"

Diagn�stico molecular de enfermedades

El Southern Blot es una t�cnica que puede proveer informaci�n que puede ser usada
para el diagn�stico molecular de algunas enfermedades g�nicas, ejemplo de ellas
ser�an el S�ndrome de Angelman, S�ndrome de Prader-Willi y S�ndrome X fr�gil. Esta
t�cnica resulta ser la m�s sensible para el diagn�stico de algunas patolog�as como
es el caso del S�ndrome Angelman y el S�ndrome de Prader-Willi.3?
https://www.aeped.es/sites/default/files/anales/48-6-3.pdf4?
http://www.cureangelman.org/FASTFaqs/Testing101.pdf El diagn�stico consiste en la
realizaci�n de un test de metilaci�n mediante PCR por tratamiento con bisulfito,
bas�ndose en el ADN por medio del estudio de la metilaci�n del locus PW71. Otra
enfermedad que tambi�n puede ser diagnosticada por el Southern Blot es el S�ndrome
de X fr�gil, el uso de esta t�cnica para esta enfermedad permitir� cuantificar el
n�mero exacto de repeticiones y metilaciones, causantes de la enfermedad.5?
http://www.aeped.es/sites/default/files/documentos/sindrome_de_x_fragil.pdf