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FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA


AMBIENTAL
‘‘BIODEGRADACION DE HIDROCARBUROS TOTALES DE PETROLEO
POR BACTERIAS NATIVAS SOMETIDAS A DISTINTAS CONDICIONES
DE CULTIVO APLICADOS EN AGUAS RESIDUALES, CALLAO – 2017’’

TESIS PARA OBTENER EL TITULO DE INVESTIGACION DE


INGENIERA AMBIENTAL

AUTORA:

LESLIE VICENTA YAYA CHILENO

ASESOR:

Mg. Rita Jaqueline Cabello Torres

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:

CONSERVACIÓN Y MANEJO DE LA BIODIVERSIDAD

LIMA-PERÚ

Año 2017

i
Página del Jurado

…………………………………………
Dr. Cesar Eduardo Jiménez Calderón
(Jurado N°1)

……………………………………………….
Dr. Ing. Elmer Alfaro Benítes
Ingeniero Químico
(Jurado N°2)

………………………...
Mg. Rita Jaqueline Cabello Torres
Magister en Química Ambiental
Y fundamental
(Jurado N°3)

ii
Dedicatoria
A Dios, por darme la fuerza y fortaleza de
seguir adelante día a día a pesar de las
adversidades, por darme la dicha de
ponerme en mi camino a personas
maravillosas durante el proceso de
mencionado estudio.
No obstante, agradecer a mis padres por a
verme apoyado; gracias a ellos soy todo lo
que soy hoy en día, en todo aspecto, por
su amor y apoyo incondicional.
A mi Asesora Mg. Rita Jaqueline Cabello
Torres por ser mi compañera y guía en
todo el proceso de la Investigación.
Gracias a ellos ha sido posible este trabajo.

iii
Agradecimientos
A la empresa “Camisea Combustibles
S.R.L.” por brindarme sus instalaciones
para la toma de muestras de mis análisis.

Asimismo agradezco al Área del


Laboratorio de Fisicoquímica de la
Universidad Privada Cesar Vallejo por
permitirme desarrollar mi tesis en sus
instalaciones, además del apoyo del
personal técnico Román.

Al Ing. De Petróleo José María Elmer


Huamán Jiménez por su guía en el estudio
y aprobación en la parte metodológica

iv
Declaración de autenticidad

Yo Leslie Vicenta Yaya Chileno con DNI Nº 70097615 a efecto de cumplir


con las disposiciones vigentes consideradas en el Reglamento de Grados y
Títulos de la Universidad César Vallejo, Facultad de Ingeniería, Escuela
Académica Profesional de Ingeniería Ambiental, declaro bajo juramento que
toda la documentación que acompaño es veraz y auténtica. Así mismo,
declaro también bajo juramento que todos los datos e información que se
presenta en la presente tesis son auténticos y veraces. En tal sentido asumo
la responsabilidad que corresponda ante cualquier falsedad, ocultamiento u
omisión tanto de los documentos como de información aportada por lo cual
me someto a lo dispuesto en las normas académicas de la Universidad
César Vallejo.

Lima, 01 de Julio del 2017.

…………………………………….
Leslie Vicenta Yaya Chileno
DNI: 70097615

v
Presentación

Estimados Señores miembros del Jurado: De acuerdo al Reglamento de


Grados y Títulos de la Universidad César Vallejo presento ante ustedes la
Tesis titulada ‘‘Eficiencia en la biodegradación de hidrocarburos
totales de petróleo en aguas residuales mediante bacterias nativas
sometidas a distintas condiciones de cultivo, callao - 2017’’ la misma
que someto a vuestra consideración y espero que cumpla con los requisitos
de aprobación para obtener el título Profesional de Ingeniera Ambiental.

La autora.

….………………………………
Leslie Vicenta Yaya Chileno
DNI: 70097615

vi
ÍNDICE

Pág.

Caratula…………………………………………………………………. i

Página del Jurado…………………………………………………….. ii

Dedicatoria ……………………………………………………………. iii

Agradecimiento...……………………………………………………... iv

Declaración de Autenticidad…………………………………………. v

Presentación ………………………………………………………….. vi

RESUMEN… ................................................................................. xii

ABSTRACT ................................................................................... xiv

I. INTRODUCCIÓN ................................................................ 1

1.1. Realidad problemática ............................................. 1

1.2. Trabajos previos ...................................................... 2

1.3. Teorías relacionadas al tema ................................... 11

1.4. Formulación del problema........................................ 19

1.5. Justificación del estudio ........................................... 20

1.6. Hipótesis .................................................................. 21

1.7. Objetivos .................................................................. 21

II. MÉTODO ............................................................................ 22

2.1. Diseño de investigación ........................................... 24

2.2. Variables, Operacionalizacion.................................. 24

2.3. Población y muestra ................................................ 25

2.4. Técnicas e instrumentos de recolección de datos… 26

2.5. Validez y Confiabilidad………………………………………...49

2.6. Métodos de análisis de datos ................................... 49

vii
2.7. Aspectos éticos ........................................................ 49

III. RESULTADOS ................................................................... 49

IV. DISCUCIÓN ....................................................................... 58

V. CONCLUSIÓN .................................................................... 59

VI. RECOMENDACIONES....................................................... 60

VII. REFERENCIAS .................................................................. 61

VIII. ANEXOS............................................................................. 70

8.1. Anexo 1 .................................................................... 70

8.2. Anexo 2 .................................................................... 71

8.3. Anexo 3 .................................................................... 71

8.4. Anexo 4 .................................................................... 72

8.5. Anexo 5 .................................................................... 73

8.6. Anexo 6 .................................................................... 74

8.7. Anexo 7 .................................................................... 74

8.8. Anexo 8 .................................................................... 74

8.9. Anexo 9 .................................................................... 74

8.10. Anexo 10 .................................................................. 76

8.11. Anexo 11 .................................................................. 78

8.12. Anexo 12 .................................................................. 80

viii
TABLAS

1. Propiedades Óptimas para bioremediación .................. 6

2. Requerimientos y factores para bioremediación ........... 12

3. Bacterias degradadoras de Hidrocarburos .................... 18

4. Diagrama Metodológico ................................................ 23

5. Operacionalizacion de Variables ................................... 24

6. Materiales e Insumos Químicos .................................... 27

7. Grado y Orden de Concentraciones .............................. 31

8. Monitoreo en el sistema de reactores ........................... 33

9. Nutrientes para el medio de cultivo ............................... 35

10. Cuadro de Monitoreo..................................................... 47

11. Diferencia entre Pseudomonas Auriginosas y nativas…50

12. Cuadro de Análisis de HTP con bacterias nativas ........ 51

13. Cuadro de Análisis de HTP con Pseudomonas ............ 52

14. Monitoreo en diferentes reactores ................................. 53

15. Cuadro de Tratamiento ................................................. 54

16. Cuadro de eficiencia de Bacterias nativas ................... 55

17. Cuadro de Eficiencia de Pseudomonas Auriginosas…..56

18. Cuadro de Comparación ............................................... 57

ix
FIGURAS

1. Ventajas de bioremediación bacteriana ........................ 9

2. Bioremediación del petróleo .......................................... 13

3. Pasos para el tratamiento ............................................. 23

4. Puesto de Salida del Tanque ........................................ 25

5. Materiales para el sistema del biorreactor………………28

6. Procedimiento para el diseño del reactor ...................... 29

7. Soluciones Nutritivas .................................................... 30

8. Preparación del extracto de carne ................................ 30

9. Adición de insumos al bioreactor .................................. 31

10. Instalación de los motores ............................................. 32

11. Cambios Organolépticos, día 17 .................................. 34

12. Cambios Organolépticos, día 18 .................................. 34

13. Cambios Organolépticos, día 19 .................................. 34

14. Muestra elegida, día 20 ................................................ 35

15. Medios de cultivo en el autoclave ................................ 36

16. Preparación del medio de cultivo ................................. 36

17. Muestras llevadas a la estufa ........................................ 37

18. Muestras en placa de Petri............................................ 37

19. Muestras llevadas a la incubadora ................................ 38

20. Muestras después de cinco días de incubación ............ 38

21. Vertimiento de bacterias nativas al bioreactor ............... 39

22. Procedimiento de las Soluciones Nutritivas .................. 40

23. Preparación del Agua peptonada ................................. 40

24. Vertimiento demuestra a los tubos de ensayo……….....41

25. Procedimiento dilución sucesiva ................................... 41

x
26. Preparación del medio de cultivo .................................. 42

27. Muestras terminadas y etiquetadas .............................. 43

28. Insumos para la caracterización Gram I ........................ 43

29. Procedimiento caracterización Gram II ......................... 44

30. Procedimiento caracterización Gram Vertimiento …......44

31. Observación de bacterias degradadoras de HB………..44

32. Caracterización de bacterias Micrococcus .................... 45

33. Caracterización de bacterias Rhodococcus .................. 45

34. Caracterización de bacterias Pseudomonas Auriginosas

……………………………………………………………………46

35. Estructura del tratamiento ............................................ 46

36. Tratamiento de aguas hidrocarbonadas …….……….....47

37. Retiro de muestra para ser analizadas ......................... 48

xi
RESUMEN

La presente investigación como fase exploratoria se buscó acondicionar bacterias


nativas provenientes de la muestra de agua a tratar mediante un Diseño de un
Sistema de biorreactores. Se trabajó con una población infinita puesto que estuvo
representada por el TQ1 (100 L. agua residual), la muestra fue aleatoria simple
representada por una muestra de ocho litros para el tratamiento.

Durante la fase experimental, para el crecimiento y reproducción de las bacterias


nativas se diseñó cinco reactores con las adiciones de Soluciones Nutritivas
(Sales Hidropónicas al 5% y 3% respectivamente), Biodiesel, Extracto de carne,
surfactantes y Dextrosa Anhidra.

Después de dos semanas se seleccionó la muestra N°2 mediante el aislamiento


por diluciones sucesivas y de manera directa. Se diseñó un sistema con 2
reactores: R1: Tratamiento de aguas residuales con Pseudomonas Auriginosas y
R2: Tratamiento de aguas residuales con Bacterias Nativas con el fin de evaluar
la diferencia del proceso de metabolización por doce dias. Se adicionaron 50 mL.
de Agar Nutritivo para ambos reactores. Se realizó la caracterización Gram, y
entre las bacterias nativas se encontraron (Pseudomonas Auriginosas,
Rhodococcus y Micrococcus). Se analizaron las fracciones de hidrocarburo (C5-
C10), (C10-C28), (C28-C40), antes y después del tratamiento, lo que permitió
analizar la eficiencia de dichas bacterias en la degradacion del Hidrocarburo.

En la fase concluyente, se evidencian una mejora significativa en la velocidad de


crecimiento, reproducción y estado microbiológico con las bacterias nativas. Los
resultados muestran que en la fracción de hidrocarburo (C5-C10) redujo a un
55.3%, mientras que en la fracción de hidrocarburos (C10-C289 y C28-C40)
redujo a un 65.3% lo que indica una disminución en la biodegradación de
hidrocarburos totales de petroleo.

Palabras claves:

Biodegradación: Transformación de una combinación orgánica llevado a cabo


por bacterias u Hongos.

xii
Cultivo: Método para la multiplicación de microorganismos, bacterias en el que
cual se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso del crecimiento,
proceso metabólico.

Eficiencia: Capacidad de alcanzar un objetivo fijado con anterioridad en el menor


tiempo posible y con el mínimo uso posible de los recursos.

Hidrocarburos Totales de Petroleo: Mezcla de productos químicos compuestos


principalmente de hidrógeno y carbono, divididos en grupos de hidrocarburos de
petróleo que se comportan en forma similar en el suelo o el agua. Estos grupos
se llaman fracciones de hidrocarburos de petróleo. Cada fracción contiene
muchos productos químicos individuales.

Reducción: Reaccion quimica que dismunuye cierto contenido de elementos o


quimicos.

xiii
ABSTRACT

The present investigation as an exploratory phase was to condition native bacteria


from the water sample to be treated by a Design of a Bioreactor System. We worked
with an infinite population since it was represented by TQ1 (100 L. residual water),
the sample was simple random represented by an eight liter sample for treatment.
During the experimental phase, five reactors were designed with the addition of
Nutrient Solutions (Hydroponic Salts at 5% and 3% respectively), Biodiesel, Meat
Extract, Surfactants and Anhydrous Dextrose.
After two weeks the sample No. 2 was selected by isolation successive and direct
dilutions. A system with two reactors was designed: R1: Wastewater treatment with
Pseudomonas Auriginosas and R2: Treatment of wastewater with Native Bacteria
in order to evaluate the difference of the process of metabolization by twelve days.
50 mL was added. Nutrient Agar for both reactors. The Gram characterization was
performed, and among the native bacteria were found (Pseudomonas Auriginosas,
Rhodococcus and Micrococcus). The hydrocarbon fractions (C5-C10), (C10-C28),
(C28-C40), before and after treatment, were analyzed, which allowed to analyze the
efficiency of said bacteria in the hydrocarbon degradation.
In the concluding phase, a significant improvement in the speed of growth,
reproduction and microbiological status with the native bacteria is evidenced. The
results show that in the hydrocarbon fraction (C5-C10) reduced to 55.3%, while in
the hydrocarbon fraction (C10-C289 and C28-C40) reduced to 65.3% indicating a
decrease in the biodegradation of Total oil hydrocarbons.

Keywords:
Biodegradation: Transformation of an organic combination carried out by bacteria
or fungi.
Culture: Method for the multiplication of microorganisms, bacteria in which an
optimal medium is prepared to favor the growth process, metabolic process.
Efficiency: Ability to reach a goal previously set in the shortest possible time and
with the least possible use of resources.

xiv
Total Petroleum Hydrocarbons: A mixture of chemicals composed mainly of
hydrogen and carbon, divided into groups of petroleum hydrocarbons that behave
similarly in soil or water. These groups are called petroleum hydrocarbon fractions.
Each fraction contains many individual chemicals.
Reduction: Chemical reaction that diminishes certain content of elements or
chemicals.

xv
I. INTRODUCCIÓN

1.1. Realidad problemática

La alteracion por hidrocarburos del petroleo es un problema amplio y de


carácter mundial, teniendo en cuenta que independiente de áreas
dañadas y contaminadas por procesos industriales, los contaminantes
(Hidrocarburo) tienen como destino final mares y ríos (Narváez,
Gómez y Martínez, 2008). En el agua, los hidrocarburos se esparcen de
manera considerable, debido a la diferencia de densidades entre ambos
líquidos.
Las actividades navales son responsables del 33% de los derrames de
petróleo, los accidentes de los buques petroleros son 12%, empresas
industriales y descargas urbanas del 37% (Cando, 2011).
Perú, es uno de los países que se ha visto afectado en los últimos
tiempos por la alteracion de hidrocarburos producto de los trabajos
industriales y marítimas. A su vez, por fases relacionados con la
utilizacion, traslado, manejo del petróleo y sus derivados. Así mismo,
solo reúsan el 5% aproximadamente de las aguas residuales
industriales por hidrocarburo de un volumen de vertimiento de
47,483,378.72 m3 /año (ANA, 2008).
Sin embargo, Perú es un país importador neto de hidrocarburos
derivados del petróleo donde influyen aspectos geopolíticos,
tecnológicos y especulativos, mas no el ámbito ambiental, por la falta de
una fiscalización oportuna y adecuada (Tamayo, Salvador y De La Cruz,
2015).
En la Provincia Constitucional del Callao , un 60% de la alteración
fisicoquímica del agua por hidrocarburos se da mediante operaciones
de empresas industriales, transporte, manejo de petroleo y derivados;
un 30% se basa en empresa informales en el cual el incumplimiento de
normas y la falta de fiscalizacion hacen de el problema mas critico .
En el presente trabajo de Investigación propone la aplicación de un
tratamiento biotecnológico con “bacterias nativas“, bacterias de una

1
mismo ecosistema y con las mismas similitudes para evaluar su
capacitad de degradación en aguas hidrocarbonadas; con el objetivo
que en un futuro puedan ser aplicadas como una herramienta
estratégica en la biorremediación de ecosistemas alterados por la
contaminacion.

1.2. Trabajos previos

Según MENDOZA, (2016) en su tesis: “Evaluación a la Aplicación de


la Tecnología Limpia con enzimas biocatalizadoras para el
tratamiento de aguas residuales industriales contaminadas por
hidrocarburos en la estación de servicio New Norean en Aguachica
– Cesar.” su estudio se basó en implementar una tecnología limpia con
enzimas biocatalizadoras, grupo de microorganismos, enzimas y
cofactores que se encargaron de rompen moléculas orgánicas mediante
la fermentación, acelerando la velocidad de descomposición de grasas
y aceites, materia orgánica, lodos e hidrocarburos actuando en
condiciones de pH y temperatura. Y por ende eliminando residuos,
disminuyendo olores y mejorando la calidad del agua. También se les
conoce como (Biowish Aqua Fog). Se trabajó en campo, con una
concentración de 1.5 g/l, en donde se tomaron cinco muestras de cinco
litros, se colocaron tapones para que no haya continuidad del agua,
durante 36 días.

No obstante, en el día diez las muestras fueron llevadas al laboratorio


se trabajó solo con recipientes de vidrio que fueron rotulados y sellados.
Se evaluaron parámetros fisicoquímicos y se analizó la calidad de las
aguas, comparando con la norma ambiental vigente. Finalmente se
demuestra que al trabajar con enzimas biocatalizadoras (producto
comercial Biowish Aqua Fog) mejora la calidad del efluente, los
parámetros de pH, DBO, DQO, grasas y aceites e Hidrocarburos
reflejados en el STARI como un sistema disminuyeron en sus cargas
durante la aplicación del producto. Se demostró en los parámetros
analizados la eficiencia de las enzimas biocatalizadoras en el efluente

2
como sistema.
Según (PINTO, Marcos, DE FRANCESCHI, Dejanira, SANTOS, Maria y
CONTRERO, Jonas 2008) en su tesis: “La comparación de la
biodegradabilidad de las relaciones comerciales y residuos
gasóleos” su investigacion se plasmo en la evaluación de la capacidad
de diferentes bacterias para degradar petróleo diésel en comparación
con un aceite diésel. La técnica principal que se utilizo fue el método
Redox (2,6 - indofenol diclorofenol).Se trabajaron con cultivos de
bacterias Staphylococcus hominis, Kocuria palustris, Pseudomonas
aeruginosa LBI, Ochrobactrum anthropi y Bacillus cereus, un inóculo
comercial y con familias microbianas que se consiguieron a partir de
suelos y aguas subterráneas contaminados con hidrocarburos y un
consorcio de un área no contaminada.

Con el método redox mostró que las familias microbianas


(Microorganismos Eficientes) fueron capaces de biodegradar el diésel
aun cuando se evaluó en un área no contaminada. Luego en 48 días, la
eliminación de la hidrocarburos totales de petróleo en los experimentos
respirométricos era 2,5 veces mayor cuando se utilizó el aceite diésel
comercial. En la preparación de inóculos; y el consorcio utilizaron células
bacterianas transferidas de los tubos de cultivo de almacenamiento y
rayado sobre la superficie de Petri platos que contienen agar nutriente,
se incubaron durante 24 horas a 35 ° C. Y las células se recogieron
usando agua estéril. Las bacterias y el consorcio L se añadieron a los
matraces experimentos de biodegradabilidad.
Los inóculos y la familia microbiana fueron separados a tubos de ensayo
(duplicados) que contenía-Hass Bushnell (BH) medio estéril (7,5 ml) y se
50 l de aceite diesel. Durante la oxidación microbiana de hidrocarburos,
los electrones son transferidos a aceptores de electrones tales como O2,
Nitratos y sulfatos, también se determinó la capacidad del
microorganismo para utilizar hidrocarburos sustrato mediante la
observación del cambio de color de DCPIP de azul (oxidado) a incoloro
(reducido). El diésel degradado tiene un color verde oscuro y un olor
diferente del diésel comercial rojizo. Cuando pasa el tiempo, los

3
colorantes en un producto libre liberado se deterioran, por lo tanto el color
del combustible puede cambiar. Y cuando la bioaumentación es
necesaria, el camino más viable sería la inyección de consorcios
bacterianos, para evitar circunstancias al momento de degradar los
hidrocarburos.

A su vez ANGELES, (2015), en su tesis “ Evaluación de la degradacion


de hidrocarburos en microcosmos de manglares utilizando la
técnica de bioestimulacion” evidencia que la bioestimulacion es
empleada como un método adecuado para contribuir a los procesos de
remoción de contaminantes por medio de consorcios microbianos
autóctonos en cuanto a la degradacion e hidrocarburos alifáticos en
manglares.
Se llevó a cabo seis procesos de tratamientos con adición de fertilizantes
inorgánicos, en un estudio de noventa días.
Durante los monitoreos se evidencio que la muestra donde habían
adicionado los fertilizantes, había sido eliminado los alcanos líquidos en
mayor proporción. En el microcosmo donde no se adiciono nada la
degradacion de alcanos fue en un 60%.
Donde, finalmente se comprueba que en la degradacion de hidrocarburos
con bioestimulacion es más efectiva con la muestra natural. Y que la
bioestimulacion en sedimento de manglar adicionando un nutriente es
más viable para degradar hidrocarburos alifáticos (n – alcanos).

Según DI MARINO, (2015) en su tesis doctoral titulado “Estudio de


bacterias del género Pseudomonas en la degradación de
hidrocarburos y síntesis de biosurfactantes: Análisis del efecto de
los polihidroxialcanoatos” tiene el objetivo de evidenciar que existen
bacterias capaces de sobrevivir y alimentarse de hidrocarburos ya sea
en suelo como en agua. La acumulación de polihidroxialcanoatos o PHA
(Poliésteres lineales producidos en la naturaleza por la acción de las
bacterias) mejora y ayuda a degrader la contaminacion mediante
metabolizacion.

4
Se analizaron consorcios microbianos capaces de acumular PHA
aislados de ambientes naturales: P. extremaustralis, aislada de la
Antartida; y Pseudomonas y Pseudomonas sp., separadas de ambientes
con existencia de elevadas concentraciones de hidrocarburos. Al estudiar
a la Pseudomona sp. Se obtiene que su capacidad de degradar
hidrocarburos monoaromáticos es alta, sintetiza compuestos
tensioactivos, las cepas tienen gran capacidad de captar metales
pesados como el cobre el cual puede coexistir en algunos sitios
contaminados con hidrocarburos.
Cuando un sistema natural es alterado por hidrocarburos, en las
comunidades microbianas indígenas estarán presentes,
probablemente, individuos pertenecientes a varios conjuntos
taxonómicos capaces de degradarlos.
En la biodegradación de hidrocarburos, están implicados organismos
tanto eucariotas y procariotas como los Nocardia, Pseudomonas,
Acinetobacter, Flavobacterium, Micrococcus, Arthrobacter,
Corynebacterium, Achromobacter, Rhodococcus, Alcaligenes,
Mycobacterium, Bacillus, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Penicillium,
Rhodotorula, Candida y Sporobolomyces.
En cuanto al Sistema, la bacteria cuenta con una microflora propia
adaptada a esas condiciones, con una significativa proporción de sus
componentes capaces de soportar y/o degradar los contaminantes.
En estos casos, diversas investigaciones han encontrado que un
adecuado balance de los nutrientes disponibles, basicamente N y P,
suficiente para lograr una efectiva actividad biológica hacen que reduzca
significativamente la presencia de HC. Se require que los factores
ambientales (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etc.) deben
también mantenerse dentro de los límites tolerados por las poblaciones
microbianas involucradas y que las técnicas basadas en mantener las
características físico-químicas del ambiente en parametros que ayuden
a la actividad de la microflora autóctona se refieren como técnicas de
bioestimulación.
Finalmente se comprobo que de los diferentes analisis con las

5
pseudomonas, la P. extremaustralis fue seleccionada por su capacidad
de crecer en ambientes extremos, y las Pseudomonas KA-08 y KB-08
fueron seleccionadas por su crecimiento en altas concentraciones de
hidrocarburos complejos.
Otra característica relevante en el momento de su elección fue que las
tres cepas eran capaces de sintetizar el polímero PHA. Para que exista
una buena degradación de compuestos hidrocarburos, se require
aislarlos en relacion a su capacidad degradativa.

No obstante DUQUE, (2015), en su tesis publicada con nombre:


“Revisión del potencial biológico de las bacterias sulfato
reductoras para la mitigación de metales pesados contaminantes
en aguas de uso industrial” su estudio se encargó de evaluar una
tecnología de bio – remediación para el proceso de aguas contaminadas
con bacterias sulfato- reductoras mediante precipitación, en
procedimientos in situ como ex situ.

Sin embargo, una presencia mínima de N y P ayudan la biodegradación


conjunto a los factores ambientales:

Tabla 1: Propiedades Óptimas para Biorremedación

FACTORES RANGO DEFINICION


AMBIENTALES
pH 6-8 Determina niveles de adsorción de iones
(Unidades) por las fracciones
Humedad 20% - 75% Trabaja como medio de transporte de N
y O2 a la célula que pertenece al
protoplasma bacteriano.
Temperatura 18° - 75 ° C Bacterias que trabajan a temperatura
Ambiente.
Microorganismos 106 - 108 Trabajan mediante acción bioquímica.
degradadores (UFC)

Fuente: Elaboración propia.

6
La bioremediación, tiene una amplia adaptacion en la recuperación de
lugares alterados por hidrocarburos del petróleo en el trópico puesto que
disminuye en grandes proporciones de hidrocarburos y su toxicidad.

Según ARAUJO, (2002) en su estudio: “Biorremediación de aguas


contaminadas con derivados de hidrocarburos utilizando cepas
bacterianas autóctonas” Tiene el objetivo de estudiar el proceso de
biorremediacion en el cual se encargaron de aislar y seleccionar la cepa
bacteriana de un agua contaminada con hidrocarburo y por otro lado,
prepararon un cultivo mixto con cepas seleccionadas. Se tomaron
muestras del lago de Maracaibo aislando 16 cepas bacterianas,
estudiaron el potencial para reducir hidrocarburos con una evaluacion
de factibilidad aplicando gasoil como única fuente de carbono. Se
utilizaron 07 de las cepas que lograron reducir entre 50 a 70% de los
hidrocarburos presentes en el gasoil.

En cuanto al cultivo mixto (Cinco meses de tratamiento), se


desarrollaron cepas previamente elegidas, se estudio el sistema para
reducir hidrocarburos mediante un analisis de biotratabilidad en tanques
plásticos de 25 L conteniendo: 2 L del cultivo mixto (10 % inóculo), un
aceite lubricante en una aglomeracion de 7000 mg/L y agua esterilizada
con el fin de obtener un contenido de 20 L. En 04 de los tanques se
instalaron sistemas de aireación estimulados de manera considerable,
tambien se estudio la incidencia del nitrógeno y fósforo (fecundación).
Los datos obtenidos manifestaron que en los tanques inoculados,
fertilizados y aireados se obtuvieron grandes remociones,yegando a un
89 % de los hidrocarburos totales y la transformación de la mayoria de
las fracciones presentes en el aceite, concluyendo la eficiencia del
cultivo bacteriano en la biorremediación de agua hidrocarbonada.
En todos los estudios la adición de N y P aporto a la reducción de las
fracciones de resinas, asfaltenos, saturados y aromáticos y la adicion de
fertilizante con aireación se tuvo valores más altos de remoción de los
hidrocarburos que sin aireación, lo que se tradujo en una amplia
disminución de todas las fracciones de hidrocarburos, logrando reducir

7
considerablemente las aguas hidrocarbonadas.

Según el artículo de la Revista (Seminario de Biotecnología, 2010) en el


artículo publicado con nombre: “REMEDIACION BACTERIANA DE
CONTAMINANTES INDUSTRIALES”, tuvo como finalidad definir el
proceso de transformación en las evoluciones biológicas como opciones
viables en la eliminación parcial o total de varios sistemas orgánicos.

Para la selección de las cepas bacterianas se utiliza las que tienen


mayor capacidad degradativa ya que, mayor será el espacio de digerirlo
y menor será el periodo de estancia en el ambiente.
Una transformación consiste en un fractura compleja de moléculas
orgánicas en sustancias inorgánicas como dióxido de carbono y agua,
proceso llamado mineralización. Si ocurre sólo una reduccion parcial de
compuestos secundarios, se conoce como biotransformación. La
adición de nutrientes en el área a tratar acelerar el proceso de
biodegradación, en cuanto al agregar oxígeno muchas veces no es
necesaria a menos que sea agua estancada sin movimiento. El viento
se encarga de adicionar las estipulaciones adecuadas para que el
oxígeno atmosférico ingrese en el deposito

8
Son
No produce usualment
efectos e
convertido Relativamente fáciles
adversos
de implementar
significativo sa
s productos
inocuos

Es el mas Son
Exime de barato destruidos,y
responsabilidad a eliminar no
largo plazo los residuos transferidos
riesgos. de difícil a otros
acceso ambientes

Cuenta
Elimina con la Resultados en el sitio
costos de aceptación de mínima
transporte pública perturbación.
positiva

Ofrece Es el mas
flexibilidad fiable
de los devido a su
sistemas y alta
aplicacion capacidad
es degradativa

Fuente: Elaboración propia, 2016.

Figura 1: Ventajas de Biorremedacion Bacteriana

Según el Articulo de la Revista (Investigación de Biotecnología


Internacional, 2011) en el artículo publicado con nombre: “LA
DEGRADACIÓN MICROBIANA DE LOS CONTAMINANTES DE
HIDROCARBUROS DE PETRÓLEO: UNA VISIÓN GENERAL”, Nos
dice que, las bacterias son los agentes más activos en la degradación
de petróleo, y trabajan como agentes de degradación primaria, se
alimentan exclusivamente de hidrocarburos. En el Acinetobacter sp. se
encontró la capacidad de utilizar n-alcanos de longitud de cadena C10-
C40 como única fuente de carbono.

Géneros de bacterias, a saber, Gordonia, Brevibacterium,


Aeromicrobium, Dietzia, Burkholderia, y Mycobacterium aislado de tierra

9
contaminada de petróleo resultaron ser los organismos potenciales para
la degradación de hidrocarburos.

Las adiciones de nutrientes son importantes para mejorar la


biodegradación de los contaminantes del aceite, Sin embargo, las
concentraciones de nutrientes excesivos también pueden inhibir la
actividad de biodegradación. En cuanto al mecanismo de degradación
de hidrocarburos de petróleo realizan en condiciones aerobias
El ataque intracelular inicial de contaminantes orgánicos es un proceso
oxidativo y la activación así como la incorporación de oxígeno es la
reacción enzimática catalizada por la clave oxigenasas y peroxidasas,
vías de degradación periféricos convierten paso de los contaminantes
orgánicos a paso en intermedios del metabolismo intermediario central,
por ejemplo, el ciclo del ácido tricarboxílico.Se analizó un consorcio
microbiano que consistio en dos cepas de Pseudomonas aeruginosa y
Rhodococcus erythropolis un aislado de tierra contaminada con lodo
aceitoso se utilizó en este estudio. El consorcio tubo la capacidad de
reducir el 90% de hidrocarburos en 6 semanas en cultivo líquido, se
probó en dos ensayos de campo independientes. Además, el efecto de
dos aditivos (una mezcla de nutrientes y una preparación biosurfactante
bruto sobre la eficiencia del proceso también se evaluó. El consorcio
degradado 91% del contenido de hidrocarburos de la tierra contaminada
con 1% (v / v), los lodos de petróleo crudo en 5 semanas. Se utilizó un
aditivo junto con el consorcio que provocó un agotamiento de 91 a 95%
del contenido de hidrocarburos en 4 semanas, con la preparación
biotensioactivo crudo.

Según GONZALES, (2012) en su tesis: “Las bacterias degradadoras


de hidrocarburos y la comunidad de respuesta bacteriana en el
Golfo de Mexico Beach Sands afectados por el derrame de petróleo
en aguas profundas Horizonte” Tiene por objetivo identificar y
caracterizar la taxonomia que degrada el petróleo predominante que se
puede utilizar como degradadores modelo de hidrocarburos o como
indicadores microbianos de la contaminación, se trabajó in situ un total

10
de 24 cepas bacterianas de 14 géneros fueron aisladas de arena de
playa aceitados y se confirma como microorganismos que degradan el
petróleo. Cepas bacterianas aisladas eran Gammaproteobacteria,
incluyendo representantes de los géneros con microorganismos
degradadores de petróleo conocidas (Alcanivora x, Marinobacter ,
Pseudomonas y Acinetobacter). Se mostraron una alta identidad de
secuencia (hasta 99%) para las secuencias de genes de rRNA de las
cepas bacterianas que degradan el petróleo. La abundancia de las
secuencias del gen fue 10 veces más altos que en aceitado. Llegamos
a la conclusión de que la contaminación por petróleo del derrame detuvo
un profundo impacto en la gran cantidad de la comunidad de bacterias
indígenas en la arena de playa del Golfo, y nuestras pruebas apuntan a
los miembros del Gammaproteobacteria (Alcanivorax , Marinobacter) y
Alphaproteobacteria (Rhodobacteraceae) como actores clave en la
degradación del aceite.

Por otro lado, La Revista (La Jornada, 2016) con el Tema “DESCUBRE
LA CAPACIDAD DE UNA BACTERIA PARA DEGRADAR
PETROLEO” Da a conocer a la bacteria Lysinibacillus sphaericus, con
carasteristicas similares a un caramelo esférico con palito, que son
cultivadas para eliminar la polución del crudo. Se estudió desde los años
1990 en el cual dicha bacteria se encarga de aglomerar hidrocarburos y
metales pesados puesto que tienen una capa protectora una proteína
con huevos, similar a un abrigo con huecos. Con enzimas especiales,
esta bacteria reduce la molecula del petróleo pese a que es muy
compleja.
Tiene una efectividad del 95% en un término de dos a tres meses.
A ello se suma que elabora toxinas mortales para las larvas de los
mosquitos Anopheles, Aedes y Culex.

1.3. Teorías relacionas al tema


I.3.1 Pruebas de Factibilidad
El estudio de factibilidad consiste en la caracterizacion de las
caracteristicas fisicoquimicas de la muestra, verificar el potencial

11
de bacterias que van a descomponer el hidrocarburo ( Adams,
Dominguez y Garcia, 1999).
Tabla 2: Requerimientos y factores para la biorremediacion

Factor Observaciones
https://www.researchgate.net/publication/273002971_Biodegradacion_de_petroleo_por_bacteria

Tipo de Pueden ser combustibles o petróleo crudo. Ya que aceite


hidrocarburo hidráulico, hidrocarburos muy viscosos,o hidrocarburos
mezclados son mas complejos.
Tipo de Mas factible con elementos de textura mediana, y
material elevados contenidos de materia orgánica.
pH Propicios en aguas con un pH de 6 a 8

Salinidad Si son areas bioticas toleranstes a las sales usar


bacterias nativas, ya que se adaptan a las condiciones.
Aireacion De vital importancia mantener condiciones aerobias ya
que que las tasas de biodegradación en condiciones
s_algunos_casos_de_estudio_en_el_Golfo_de_Mexico

anóxicas son 50 a 100 veces menores en el que se utiliza


un sistema de aireacion.
Lixiviados Instalar una estructura para almacenar los lixiviados de
una celda de “land farming”. Estos se pueden usar para
rehumedecer la celda, de manera que se conserva los
nutrientes y bacterias en ella.
Techo Es de vital importancia diseñar un techo sobre dichas
celdas ( land farming) en lugares tropicales (devido a las
lluvias).
Nutrientes Impresindible conservar las concentraciones de
nutrientes inorgánicos en el intervalo de100 ppm N, >10
ppm P, y >1 ppm K aproximadamente.
Temperatura Un proceso en el que se trabaja con microorganismos
(bacterias) trabaja en un intervalo de temperatura 30 a
35 grados, mas fiable para climas tropicales.
Bacterias Se trabaja de la mejor manera con bacterias nativas
Nativas puesto que dichas bacterias ya estan climatizadas y
adaptadas a las condiciones del ambiente.
Acondiciona Para un mejor avenamiento de humedad en la celda se
dores puede utilizar arena, paja, cáscara de nuez, etc.

12
Humedad Es viable conservar la humedad en el intervalo de 50 a
75 % de la capacidad de campo del material a tratar.
Fuente: Adams, Dominguez y Garcia, 1999.

I.3.2 Metabolismo microbiano para la descontaminación de aguas


La biorremediación es un sistema de biotecnología desde hace
decadas, en el que trabajan una serie de microorganismos con la
capacidad de degradar y reducir contaminantes y compuestos
xenobioticos.

Por consiguiente, se encuentran exparcidos por diversos lugares,


usualmente menos del 1% de la comunidad microbiana. El
mecanismo microbiano consiste en incitar a los contaminates, por
medio de la adicion de una serie de nutrientes, que favorecen un
elevado aumento del conjunto metabólico de interés hasta un 10% de
la comunidad microbiana, con lo cual las bacterian laboran de
inmediato en el proceso de descontaminacion. Según estudios
cientificos afirman que es viable la biorremediacion de hidrocarburos
emplenado determinadas cepas nativas del mismo lugar, en aguas
como en suelos, sociedades biotecnológicas aíslan los
microorganismos. Al laborar con bacterias nativas, el impacto
ambiental que conlleva es minimo lo cual diversos paises han
empleado dicha metodologia.

Pasado el procesos de degradacion, el conjunto de microorganismos


rregresan a su estado normal por la falta de sustrato para degradar.
En la mayoría de los procesos involucrados son aeróbicos (Fonturbel
e Ibañez, 2004).

13
http://dspace.ups.edu.ec/bitstream/12345
6789/1520/11/UPS-CT002143.pdf

Fuente: Determinación y análisis de un proceso de biorremediación


de suelos contaminados por hidrocarburos, 2011.

Figura 2: Biorremediación de petroleo

I.3.3 Biotransformación
Se define como un proceso en el que se va originar un cambio quimico
sobre algun contaminante, como por ejemplo: en el estado de
oxidacion o metilizacion. Dicha transformacion biologica en donde el
contaminante son toxicos son degradados gracias a sus enzimas
microbianas y donde pueden dar de resultado compuestos poco
solubles.
La bacteria Pseudomona aeruginosa reduce el cation Hg2+ a HgO (La
revista Quimica Viva, 2003).

I.3.4 Transformaciones por Microorganismos


La relación entre los microorganismos y los metales son componentes
fundamentales de los ciclos biogeoquímicos y son evaluados en el
ámbito de la biotecnología ambiental. Un microorganismo puede
realizar dos transformaciones posibles. Lixiviación Microbiana es el
camino de un estado insoluble inicial que pertenece a una fase sólida,
a un estado soluble final, en fase acuosa. El otro corresponde a la
inmovilización del metal, es decir el pasaje de un estado soluble inicial
en fase acuosa a uno insoluble final en fase sólida (Vullo, 2003).

14
I.3.5 Degradación de Hidrocarburos

La degradacion de Hidrocarburos consiste en captar contaminantes


mediante procesos biologicos. Los procesos de remediacion son in-
(el mismo lugar) o ex situ (separando proporcion contaminada).
Las faenas industriales expelen un gran contenido de contaminación
con metales pesados (Cu, Zn, Pb, Cd, Cr, Ni, Hg, Co, Ag, Au) asi como
tambien, radionuclidos (U, Th) en el medio ambiente.

A su vez dicha metodologia de solución no es aplicable en


procedimientos de remediación in situ, puesto que es dificil tratar un
metal determinado debido a la dispusta existente por la aparicion de
otros. El empleo de métodos de remediación positivos varia del
conocimiento de los factores hidrológicos y geológicos del sitio, la
solubilidad y especiación de los metales pesados, los pasos de
atenuación e inmovilización y la manera en que los metales puedan
exparcirse horizontal y verticalmente a medida que migran por el
suelo. No obstante, la utilización de métodos biológicos para remediar
un ambiente contaminado (biorremediación) ofrece una alta
delimitacion en la remoción de un contaminante de interés con
flexibilidad operacional, en tecnicas in situ como ex situ (Vullo, 2003).

I.3.6 Hidrocarburos de petroleo Totales


Los hidrocarburos son los principales componentes del petróleo sin
refinar, también conocido como petróleo crudo. Los cuales se
clasifican de acuerdo a su estructura en alifáticos y aromáticos, los
hidrocarburos alifáticos se subdividen en alcanos, alquenos, alquinos
y cicloalifáticos. Los aromáticos son los hidrocarburos no saturados,
son bioquímicamente activos y potencialmente carcinógenos. Los
alcanos debido a su baja polaridad son insolubles en agua e
incapaces de formar enlaces con el hidrógeno (Ángeles, 2015).

I.3.7 Finalidad de los factores ambientales sobre la biodegradación de


hidrocarburos

15
Diversos ambientes cercanos a ser contaminados como resultado del
manejo de aguas residuales Oleosas pueden considerarse ambientes
extremos, ya que se caracterizan por estar sometidos a condiciones
ambientales de bajas como tambien altas temperaturas, pH ácido o
alcalino, concentraciones salinas elevadas y elevadas presiones. Los
microorganismos climatizados a crecer bajo diversas condiciones en
su mayoria trabajan mejor a comparacion de otras bacterias en la
biorrecuperación de lugares contaminados.

I.3.7.1 Temperatura
Nivel termico de gran importancia en la biorremediación in
situ, puesto que tanto la biodisponibilidad como la
solubilidad de los derivados más hidrofóbicos dependen de
este parámetro. Un aumento de temperatura ocaciona un
descenso de la viscosidad y, por ende, afecta al grado de
dispersión y al aumento de las tasas de difusión de los
compuestos orgánicos. Por consiguiente, las bajas
temperaturas impiden la volatilización de alcanos de
cadena corta (< C10), por lo que aumenta su solubilidad en
la fase acuosa y su toxicidad, lo cual puede ralentizar el
proceso de degradación.
I.3.7.2 pH
La mineralización de hidrocarburos se ve favorecida a pHs
próximos a la neutralidad. Respecto a los microorganismos
alcalófilos, estudios manifiestan que producen una
continuidad de enzimas extracelulares interesantes desde
el punto de vista industrial, pero la información sobre su

capacidad de degradar hidrocarburos es limitada.

I.3.7.3 Salinidad
Hay una relación inversa entre salinidad y biodegradación
de hidrocarburos de petróleo. A concentraciones salinas
superiores al 2,4% (p/v) de NaCl, el efecto inhibidor es
mayor para la degradación de fracciones aromáticas y

16
polares que para la fracción saturada. Existen diversos
microorganismos capaces de oxidar hicrocarburos a una
concentración salina del 30%.
I.3.7.4 Oxígeno
La eficiencia de los procesos de biodegradación aeróbicos
dependerá de la temperatura, ya que la solubilidad del
oxígeno depende de ésta. Los pasos iniciales del
catabolismo de hidrocarburos alifáticos, cíclicos y
aromáticos por parte de bacterias u hongos implican la
oxidación del sustrato mediante oxigenasas, que requieren
oxígeno molecular, la importancia ecológica es limitada. Por
consiguiente, investigaciones nuevas han puesto de
manifiesto la trascendencia de los caminos catabólicas
anaeróbicas en la biorremediación.
I.3.7.5 Nutrientes
Cuando presentan una baja concentración de nutrientes
inorgánicos se suelen producir elevados cocientes C:N y/o
C:P, los cuales son desfavorables para el crecimiento
microbiano. Es bien conocido que la disponibilidad de N y P
limita la degradación microbiana de hidrocarburos. Por tal
motivo, el ajuste de estas proporciones mediante la adición
de los nutrientes en forma de fertilizantes oleofílicos
estimulará la biodegradación de manera considerable.

Por ende, el peritaje de la eficiencia de las diversas aproximaciones


de biorremediación ha puesto de manifiesto el vital merito de los
microorganismos degradadores ( bacterias nativas), ya que estos se
han mostrado más efectivos que los degradadores inoculados
(Martinez y Gaju, 2005).

I.3.8 Química de la Biodegradación


La mayoría de hidrocarburos son biodegradables. La susceptibilidad
a la biodegradación depende de la estructura molecular y el peso
molecular, si aumentara la cadena de alcanos aumentaría la

17
resistencia de biodegradación. No Obstante al ramificar las cadenas
reducirían la biodegradación.
La degradación natural por bacterias es eficiente debido al
metabolismo, producto de enzimas oxigenadas, las cuales agregan
varios átomos de oxígenos a las moléculas por degradar (Gurdian y
Johanning, 2002).
En el mecanismo de la degradación, los microorganismos al crecer
en un substrato carbonoso capta como su principal fuente de energía
y en donde su único alimento será el Hidrocarburo.

I.3.9 Capacidad Bacteriológica de Consorcios Microbianos


Restituyen el equilibrio microbiano que sostiene el ciclo anual de la
naturaleza, crea un ambiente de resonancia que ordena la materia y
regenera cualquier medio contaminado, elabora sustancias bioactivas
(enzimas, probióticos y vitaminas). Las bacterias fototrópicas
disminuyen sustancias perjudiciales y liberan antioxidantes. Las
bacterias productoras de ácido láctico, inutilizan los agentes
patógenos y descomponen la materia orgánica.
Los actinomicetos generan sustancias antimicrobianas que frenan a
los microbios nocivos. Y, los hongos y levaduras en proceso de
fermentación, producen las vitaminas del grupo B que nutren a las
plantas con fito-nutrientes, favoreciendo su crecimiento y anulando la
putrefacción y el mal olor. Al ser microorganismos regeneradores, su
idoneidad para la eliminación de patógenos ayuda a la rehabilitación
del equilibrio microbiano en cualquier medio u organismo enfermo o
contaminado.
Tiene gran eficiencia a la resonancia de ondas positivas, las cuales
impulsan la emanación de sustancias y de energía de alta frecuencia
(La idoneidad de los Microorganismos Eficientes, 2013).

I.3.10 Microorganismos que degradan Hidrocarburos

18
Existen indefinidos reportes de las bacterias que participan en la
degradación del petróleo tal y como se ve en la tabla Siguiente:

Tabla 3: Bacterias degradadoras de hidrocarburos

Bacterias degradadoras de hidrocarburos

Compuesto Bacteria Compuesto Bacteria

Alcanos Acinetobacter Mono- Ralstonia sp.


sp. aromaticos

Actinomycetes Rhodococcus sp.

Arthrobacter Pseudomonas sp.


https://www.researchgate.net/publication/27300297
1_Biodegradacion_de_petroleo_por_bacterias_alg
unos_casos_de_estudio_en_el_Golfo_de_Mexico

Bacilus sp. Poli- Alteromonas sp.


aromaticos

Micrococcus Arthrobacter sp.


sp.

Planococcus Bacilus sp.

Rhodococcus Mycobacterium

Pseudomonas Pseudomonas sp.


sp.

Fuente: Garcia y Aguire, 2014.

Las bacterias de nombre “Hidrocarbonoclastas” es un conjunto de


bacterias que se ha descubierto en los ultimos años, que tiene la
particularidad de ingerir hidrocarburos como alimento, lo utilizan como
única fuente de carbono y energía (García y Aguirre, 2014).

I.4 Formulación del problema

I.4.1 Problema General

19
¿ Existe biodegradacion de Hidrocarburos Totales de Petroleo en
aguas residuales aplicando bacterias nativas sometidas a optimas
condiciones de cultivo en el Callao -2017?

I.4.2 Problemas Específicos

1. ¿Cuáles son las condiciones de cultivo optimo de las bacterias


nativas en agua residual con contenido de hidrocarburos totales de
petroleo en el Callao - 2017?

2. ¿Existe biodegradacion de hidrocarburos Totales de Petroleo en


aguas residuales mediante bacterias nativas en optimas
condiciones de cultivo en el Callao - 2017?

I.5 Justificación del estudio


En la actualidad, el Perú enfrenta graves problemas ambientales que
sumados a los costos requeridos para darles solución sugeridos desde
los países desarrollados hacen necesario la generación de tecnologías
viables para nuestras condiciones económicas, sociales y ecológicas.
La presente investigacion esta basado en el ámbito de aguas ya que es
el principal recurso en nuestro entorno, donde se viene llevando una
polución debido a los efectos nocivos de una gran diversidad de
compuestos de hidrocarburos totales de petroleo. Por ello, a través de la
presente investigación se propone una metodología para resolver
problemas de contaminación específicos, con miras a desarrollar
propuestas de soluciones aplicables al caso del Perú, en el corto y
mediano plazo.
Por consiguiente, se presenta un estudio de bacterias nativas extraídos
de las aguas contaminadas del mismo tanque a tratar para formar
consorcios microbianos degradadores de Hidrocarburos totales de
petroleo y con ello poder degradar aguas hidrocarbonadas.
Se trabaja con bacterias nativas ya que es una comunidad bacteriana
que trabajan en conjunto por un fin.

20
Se realiza una investigacion con bacterias nativas propias de la misma
muestra por que es un método mas eficaz y sostenible en el que se
combinan microorganismos benéficos de similares similitudes y
condiciones atmosféricas que trabajan sinérgicamente. No obstante,
tiene la propiedad de abstener a los microorganismos patógenos,
producen vitaminas y enzimas lo cual es 100% más fiable que
tratamientos con una sola bacteria, elimina los olores fétidos y los
convierte en olores inodoros.

Finalmente, usamos una metodología óptima para poder re utilizar aguas


residuales de manera oportuna y sin adición alguna de aditivos químicos,
reduciendo significativamente su impacto en los cursos de agua donde
se vierten y en el ambiente en general.

I.6 Hipótesis
I.6.1 Hipótesis General

Los hidrocarburos totales de Petroleo en aguas residuales se


biodegradan aplicando bacterias nativas sometidas a optimas
condiciones de cultivo en el Callao -2017.

I.6.2 Hipótesis Especificas

1. Las condiciones de cultivo optimo de las bacterias nativas de


agua residual influye en la biodegradacion de Hidrocarburos
Totales de Petroleo en aguas residuales en el Callao – 2017.

2. Las bacterias Nativas en optimas condiciones de cultivo


aportan a la biodegradacion de Hidrocarburos Totales de
Petroleo en aguas residuales en el Callao - 2017.

I.7 Objetivos

I.7.1 Objetivos General

21
Biodegradar Hidrocarburos Totales de Petroleo en aguas
residuales aplicando bacterias nativas sometidas a optimas
condiciones de cultivo en el Callao -2017.

I.7.2 Objetivos Específicos

1. Determinar las condiciones de cultivo optimo de las bacterias


nativas en agua residual con contenido de hidrocarburos
totales de petroleo en el Callao -2017.

2. Biodegradar hidrocarburos Totales de Petroleo en aguas


residuales mediante bacterias nativas en optimas condiciones de
cultivo en el Callao - 2017.

II. MÉTODO
2.1. Diseño de investigación
El presente estudio de Investigación, se realizara mediante el diseño
experimental – Descriptivo, puesto que se quiere demostrar mediante el diseño
de un sistema de reactores el comportamiento y reproduccion de bacterias
nativas sometidas a distintas condiciones operativas de cultivo ( soluciones
nutritivas, extracto de carne como alimento, surfactantes, temperatura y
glucosa).
Se trabajara con bacterias provenientes de la misma muestra (agua
contaminada de Hidrocarburos de petroleo del Tanque TQ1), que seran
agregados al reactor diseñado para el proceso (Figura N°5), se aplicaran las
condiones de cultivo ( soluciones nutritivas, extracto de carne como alimento,
surfactantes, temperatura y glucosa), y se verificara el cambio y las
caracteristicas fisicas que se evidencia cuando existe bacterias en un sistema.
Una vez terminado el procedimiento; realizar el aislamiento e identificacion de
bacterias mediante el procedimiento de Diluciones Sucesivas que nos permitira
seleccionar las cepas bacterianas y apartir de ello tratabajar en el tratamiento
de las aguas residuales industriales. Finalmente mediante un intervalo de

22
analisis ( semanal y fin de mes ) estudiar la eficiencia en la biodegradacion de
dichas cepas bacterianas nativas.

Obtencion de cepas bacterianas


a partir distintas condiciones
operativas de cultivo en un
•Pre- Test
sistema de biorreactor
Comportamiento de las
bacterias nativas (Proceso de
biodegradacion de
Hidrocarburos de petroleo, F1 y
•Tratamiento
F2).

Analizar la biodegradacion
de hidrocarburos de
petroleo, en aguas •Post Test
residuales.

Fuente: Metodologías biológicas para bioremediación de hidrocarburos de


petroleo- UNALM.
Figura 3: Pasos para el tratamiento
Tabla 4: Diagrama Metodológico

23
Fuente: Elaboración propia, 2016

2.2. Variables, Operacionalización


2.2.1. Variables

Variables Independiente:
Condiciomes de cultivo de bacterias nativas

Variable Dependiente:
Biodegradación de hidrocarburos totales de petroleo en aguas
residuales.

2.2.2. Operacionalización
Tabla 5: Operacionalización de variables

MATRIZ DE OPERACIONALIZACION
DEFINICION DEFINICION ESCALA DE
VARIABLES DIMENSIONES INDICADORES
CONCEPTUAL OPERACIONAL MEDICION

Respuesta color Ordinal


Organoleptica olor Ordinal
Establecer condiciones
Conjunto de nutrientes y
operativas de cultivo Nutrientes Ordinal
condiciones
INDEPENDIENTE: con el fin de
fisicoquimicas que, en Oxigeno Ordinal
Condiciones de acondicionar a las
concentraciones optimas
cultivo de bacterias bacterias nativas en un Temperatura Ordinal
permiten el crecimiento Condiciones
nativas buen habitad para que
de bacterias nativas Fisicoquimicas Turbidez Ordinal
ejersan un trabajo
(DUQUE, 2015).
oportuno.
pH

Surfactante Ordinal

Contenido de
Capacidad de una Hidrocarburos totales
Obtencion de una Ordinal
tecnica biologica en el Contenido de
DEPENDIENTE: mejor respuesta en la de petroleo en Aguas
cual los hidrocarburos Hidrocarburos
Biodegradacion de biodegradacion de Residuales inicial
sirven de alimento (por totales de
Hidrocarburos Hidrocarburos totales de
su unica fuente de petroleo en Contenido de
Totales de Petroleo petroleo producto de las
carbono) para las Aguas Hidrocarburos totales
en aguas residuales condiciones del cultivo Ordinal
bacterias nativas Residuales de petroleo en Aguas
seleccionado.
(VULLO, 2003). Residuales final

Fuente: Elaboración propia, 2017.

2.3. Población y muestra


2.3.1. Unidad de Análisis
Un litro de agua oleosa.

24
2.3.2. Población
Se considera una poblacion Infinita ya que el universo
poblacional está conformado por el agua residual descargada
por la Empresa ‘‘Camisea Combustibles S.R.L.’’, que implica
un tanque con 100 litros de agua residual actualmente.

2.3.3. Muestra
Es una muestra aleatoria simple puesto que se tomara 01
muestra de 7 litros de agua residual aproximadamente, llevada
en un frasco ambar el cual servirá para evaluar el grado de
contaminacion y el resultado después del tratamiento con las
bacterias nativas.

2.3.4. Diseño Muestral


Las muestras seran extraidas del tanque principal ( puesto de
salida TQ1), en donde se llevara analizar las fracciones de
Hidrocarburos: F2 (C10 – C28) y F3 (C28 – C40) y la fraccion
F1 (C6 – C10) al incio como muestra inicial y despues del
tratamiento con las bacterias Nativas.

Fuente: Elaboración propia, 2017.

Figura 4: Puesto de Salida del tanque

El patrón de muestreo será con distribución uniforme de


acuerdo al tiempo a muestrear.

25
Cabe indicar que, el agua residual a tratar se recolectara
desde el taque de almacenamiento (TQ1) en donde pasara a
un sistema de biorreactor y con un sistema de aireacion para
ser tratado con las bacterias nativas.

2.4. Técnicas e instrumentos de recolección de datos, validez


y confiabilidad

Etapas Fuentes Tecnicas Instrumentos Resultados

Ficha de
Aguas
Analizar el area registro de
Residuales Ubicación del
de influencia y campo
provenientes de Observaciones punto de
ubicar el punto (Ubicación del
industrias en el muestreo
de muestreo punto de
Callao
muestreo)

Fichas de
condiciones
Analisis de las Resultados de
Laboratorio organolepticas
aguas los analisis de
Microbiologico Observaciones antes de
Residuales del los parametros
Privado inciciar el
Callao biologicos
proyecto de
investigacion
Laboratorio
Microbiologico
Determinacion Dterminar el
de la
de las tiempo y
Universidad Ficha de
condiciones selección de la
Cesar Vallejo resultados de
operativas de Observaciones y condicion de
los cambios y
cultivo para el Laboratorio Experimentacion cultivo
condiciones del
tratamiento de Fisicoquimico seleccionado en
proceso
las aguas de la el proceso de
residuales Universidad seleccion
Cesar Vallejo

Determinacion
Ficha de de la reduccion al
Biodegradacion resultados de la biodegradar
Muestra
de biodegradacion hidrocarburos
seleccionada
Hidrocarburos de los totales de
optima para el Observaciones
totales de parametros petroleo y la
tratamiento de
petroleo con las microbiologicos obtencion de las
las aguas
bacterias con las condiciones
residuales
nativas bacterias optimas de
nativas cultivo con las
bacterias nativas

26
Etapas de la Investigacion

I. Exploratoria - Diseño de un sistema de Biorreactores para la


obtencion de bacterias degradadoras de Hidrocarburos
Materiales para la estructura del Reactor de Última Generación

Tabla 6: Materiales e Insumos Químicos


Materiales
Botellas Ambar 3 Unidades
Papel Aluminio 2 Pliegos
Botellas de Agua Mineral ( 2 ½) 10 Unidades
Piedras Difusoras 5 Unidades
Mangueras de Pecera 5 – 6 metros
Tijera 1 Unidad
Cuchilla 1 Unidad
Encendedor 1 Unidad
Pegamento Triz 5 Unidades pequeñas
Carne Molida 250 grs.
Balanza 1 Unidad
Espátula 1 Unidad
Bomba de aire de pecera 3 Unidades
Insumos Químicos
Hexano Un frasco pequeño
Biodiesel ½ frasco pequeño
Dextrosa Anhidra 1 frasco Pequeño
Agar 1/2 L.

Solución Nutritiva (A y B) 550 gr. A y 10 gr. B

Fuente: Elaboración Propia


Para el diseño y selección de bacterias nativas se basó mediante el
Procedimiento de biorremediación de suelos y Evaluación del
producto según Guía del Doctorado en Ingeniería y Ciencias
Ambientales del curso de Biotecnología Ambiental y según el
procedimiento de Bioremediación de aguas oleosas según guía de la
Maestría en Ecología Aplicada. Ambos realizados en la Universidad
Nacional Agraria La Molina.

27
Para el diseño del reactor se estructuro cinco reactores con las
mejores condiciones operativas para favorecer el crecimiento de
microorganismos degradadores de hidrocarburos bajo condiciones
variadas de Oxigeno, Nutrientes, extracto de carne como alimento,
Biodiesel, Surfactantes y Glucosa; con la finalidad de obtener las
bacterias degradadoras de hidrocarburos totales de Petróleo dándole
las mejores condiciones operativas de cultivo.
Para el armado del biorreactor de Última Generación se inicia con las
botellas de plástico de agua mineral de 2 ½, limpias y esterilizadas.
En cuanto a las chapas realizar un agujero de 1 cm de diámetro (en
el medio) por ese agujero se ingresará una manguera de pecera para
bombearle aire.
Al final de la manguera introducirle un difusor de piedra y sellarlo.
(Dejarlo secar en el intervalo de dos a tres horas aproximadamente
para evitar derrames posteriores).
De otro frasco se le cortara la base hasta una altura de 10 cm
aproximadamente para asentar el biorreactor sobre este. Tal y como
se muestra en las siguientes figuras:

Fuente: Elaboración Propia

Figura 5: Materiales para el Sistema de Biorreactores

28
Fuente: Maestría en Ecología Aplicada y Doctorado en
Ciencia e Ingeniería Ambiental

Figura N6: Procedimiento para el diseño del reactor

Se prepararon cinco reactores, con las siguientes dosis Nutritivas:


a. Concentración de solución nutritiva
La solución nutritiva es preparada con solución hidropónica La
Molina la Solución “A” contiene: 210 ppm K, 190 ppm N, 50 ppm
*Ca+2+, 50 ppm *S+2, 45 ppm *Mg+2, 35 ppm P. Y la Solución “B”
contiene: 0.50 ppm Mn+2, 0.50 ppm *B, 0.15 ppm Zn, 0.10 ppm
Cu+2, 1.00 ppm Fe, 0.05 ppm Mo.
1 ppm (1 parte por millón) = 1 g/L
No existe una solución nutritiva exacta y óptima para todos los
cultivos, porque no todos tiene las mismas exigencias nutricionales,
principalmente en nitrógeno, fosforo y potasio. Existe un gran
número de soluciones nutritivas para distintos cultivos y en la
mayoría satisfacen las necesidades de las bacterias. Para el
crecimiento de microorganismos degradadores de hidrocarburos
se aplica la mitad de la dosis: 5 ml de la solución A y 2 ml de la
solución B por litro de agua.

Bolsa: 550 gr. Sol. A y 10 gr. Sol. B


Sol. A: Pesar 5.5 gr. Y en un vaso precipitado
esterilizado verter 50 ml. De Agua Potable.
Sol. B: Pesar 0.530 gr. De Sol. B y en un vaso
precipitado esterilizado verter 100 ml. De agua potable.

29
Fuente: Elaboración propia

Figura 7: Soluciones Nutritivas


b. Concentración del extracto de carne

El extracto de carne servirá de alimento para las bacterias,


para la dosis exacta se obtendrá mediante la Siguiente
Manera:

Para 250 gr. De Carne Molida


200 gr. –100 ml. Agua Potable
3 gr. – x ml. Agua potable
X= 1.5 gr.

Fuente: Elaboración propia


Figura 8: Preparación del extracto de carne

30
Una vez teniendo armado los reactores se procede a verter las
concentraciones de Sales, Extracto de carne, Glucosa y/o
Surfactantes de acuerdo al orden del cuadro.

Tabla 7: Grado y Orden de Concentraciones


Reactor 1 Reactor 2 Reactor 3 Reactor 4 Reactor 5
1L. Agua 1L. Agua 1L. Agua 1L. Agua 1L. Agua
Potable Potable Potable Potable Potable
5 ml. 5 ml. Solución 5 ml. 5 ml. 5 ml.
Solución A A Solución A Solución A Solución A
2 ml. 2 ml. Solución 2 ml. 2 ml. 2 ml.
Solución B B Solución B Solución B Solución B
10 ml. 10 ml. 05 ml. 10 ml. 05 ml.
Biodiesel Biodiesel Biodiesel Biodiesel Biodiesel
3 gr.
3 gr. extracto 3 gr. extracto 3 gr. extracto 3 gr. extracto
extracto de
de carne de carne de carne de carne
carne
200 ml.
200 ml. Agua 200 ml. Agua 200 ml. Agua 200 ml. Agua
Agua
Hidrocarbonad Hidrocarbona Hidrocarbona Hidrocarbona
Hidrocarbon
a da da da
ada
s/n s/n s/n 3 gr.surf. 3 gr.surf.
Surfactante Surfactante Surfactante (detergente) (detergente)
0.20 gr. 0.20 gr. 0.20 gr. 0.20 gr. 0.20 gr.
Dextrosa Dextrosa Dextrosa Dextrosa Dextrosa
Anhidra Anhidra Anhidra Anhidra Anhidra

Fuente: Elaboración Propia

31
Fuente: Elaboración propia
Figura 9: Adición de Insumos al biorreactor

Una vez colocado las dosis correspondientes a cada reactor, cerrar


con la tapa ya elaborada con los difusores de piedra, enumerar
cada reactor de acuerdo a los parámetros establecidos.
Seguidamente voltearlos pico abajo, y mientras se sujeta la
manguera para evitar derrames, realizar un agujero en la base de
la botella (de lo contrario, no podrá tener aireación el sistema).
Una colocado los reactores sobre las bases preparadas, las
manguera sujetadas insertarles a los motores ya conectados y
encender a máxima potencia, entonces empezara a burbujear cada
reactor.

Fuente: Elaboración propia


Figura 10: Instalación de los motores

32
II. Experimental – Crecimiento, Selección y Tratamiento de
bacterias degradadoras de Hidrocarburos en aguas residuales
a. Crecimiento de las Bacterias Nativas: Una vez armado el sistema,
se llevó a cabo un monitoreo diario del proceso y metabolismo de
las bacterias nativas en cada reactor, según las distintas
condiciones operativas de cultivo que se dio a cada biorreactor. Y
por consiguiente, el que más trabajo de manera oportuna fue el
reactor N° 02 debido a la visibilidad de coágulos y sedimentación
de residuos en el reactor, aglomeración de burbujas es la
apariencia de bacterias nativas que se encuentran trabajando y
alimentándose del hidrocarburo.

Tabla 8. Monitoreo en el Sistema de reactores


Observaciones Reactor 1 Reactor 2 Reactor 3 Reactor 4 Reactor 5
11-05-17
Colocacion del
Sistema del
reactor de Ultima
Generacion

12-05-17
Cambio de
Motores

16-05-17 Cambio de No hay


Aparicion No hay Presencia
Se observo los color, busbujeo,
de presencia de
cambios fisicos residuos color de
coagulos de burbujeos
de cada reactor existentes agua
de HB coagulos en la pared
en la pared opaco
17-05-17 Separacion
Sedimenta
Monitoreo y De color Aparicion Separacion de Hb y
cion en la
propiedades amarillo de de Hb y agua en
parte
fisicas oscurol coagulos agual mayor
superior
cantidad
Agua Presencia
Agua Reactor
18-05-17 turbia, no Residuos de
moderada con nivel
Cambios Físicos hay pegados coagulos
mente de
en los reactores presencia en la pared en la parte
oscura y suciedad a
de de reactor superior
turbia 80%.
coágulos del reactor
Color Oscuro, Agua 40%
Presencia
19-05-17 blanco sucio, olor El más limpia,
de
Percepción de turbio, no fétido y sucio, poca
residuos
olores, presencia hay residuos presencia presencia
oleosos en
de sedimentación presencia pegados de de
todo el
de en la pared coágulos sedimento
reactor
coágulos del reactor s

Fuente: Elaboración propia


Durante el monitoreo del Sistema de los biorreactores se evidencio
que hay presencia de microorganismos degradadores de
Hidrocarburos, según estudios se establecio que mientras un

33
reactor este mas sucio, y con altos contenidos de residuos de
sedimentacion hay mas presencias de organismos microbiologicos
(bacterias).

Sistema del
bioreactor en el
primer día de
instalación

Fuente: Elaboracion Propia

Figura N° 11 Cambios Organolepticos, dia 17

Se evidencia
cambios físicos en el
sistema del
bioreactor después
de una semana

Fuente: Elaboracion Propia

Figura N° 12 Cambios Organolepticos, dia 18

Sistema de reactor
en el último día de
ser tratado, y llevado
luego a preparación
del cultivo

Fuente: Elaboracion Propia


Figura N° 13 Cambios Organolepticos, dia 19

34
b. Selección de la Muestra para el Aislamiento y Selección de Bacterias
Nativas: En una semana se evidencio que el Reactor N° 02 trabajo
de manera mas oportuna, se diviso espumas y coagulos de residuos,
donde se eligio dicho reactor para sacar la muestra y trabajar el
cultivo de bacterias.

Fuente: Elaboracion Propia

Figura N° 14. Muestra elegida, dia 20

Para la preparacion de cultivo se realizo mediante el Sistema de


preparacion directa y mediante el Sistema de diluciones sucesivas.

Tabla 9. Nutrientes para el medio de cultivo

Agar Cantidad Fecha a trabajar Color característico


Mac conkey
agar 5.5 gr. 19/05/2017 purpura

Nutrient agar 2.8 gr. 19/05/2017 Amarillo oscuro


Fuente: Elaboracion Propia

En la PREPARACION DIRECTA se trabaja con el Agar MAC


CONKEY. Se Pesa 5.5 gr. Del Agar Mac Conkey y vierte al
erlenmeyer previamente esterilizado con agua destilada a 100ml y se
sella con un tapon de algodón.
Disolverlo hasta que la dosis este completamente homogenea, luego
pasar a una hornilla hasta que de el primer herbor y retirarlo y enfriarlo
por 10 minutos. Finalmente llevarlo a un autoclave a 15 mimutos por

35
45° C.

Fuente: Elaboracion Propia


Figura 15. Medios de Cultivo en el autoclave

Para la segunda preparacion con el agar NUTRIENT AGAR: Pesar


2.8 gr. Del Agar Nutrient Agar y verter a otro erlenmeyer previamente
esterilizado con agua destilada a 100ml y taparlo con un tapon de
algodón.

Fuente: Elaboracion Propia


Figura 16. Preparacion del Medio de Cultivo

Disolverlo hasta que la dosis este completamente homogenea,


luego pasar a una hornilla hasta que debe el primer herbor y
retirarlo hasta que enfrie por 10 minutos.

36
Fuente: Elaboracion Propia
Figura 17. Muestras llevadas a la estufa

Finalmente llevarlo a un autoclave a 15 mimutos por 121° C. Se


trabajo dos replicas por cada reactor.
Una vez con las muestras esten frias proseguir a plaquear.
Cuidadosamente verter en las placas de petri, esterilizar por cada
procedimiento y taparlo de inmediato.

Fuente: Elaboracion Propia


Figura 18. Muestras en Placa de Petri

Las placas de Petri previamente selladas y enumeradas con algún


código, fueron llevadas a la incubadora a 37° C. con el fin de crear un
ambiente cálido y oscuro para que las bacterias puedan desarrollarse

37
sin perturbaciones, en un periodo de cinco a seis días. Almacenarlas
boca abajo, para evitar que las gotas de agua interrumpan el
crecimiento de las bacterias.

Fuente: Elaboracion Propia


Figura 19. Muestras llevadas a la incubadora

Despues del intervalo de fecha estudiada, se observó una variedad


notoria de bacterias, creciendo dentro de cada placa de Petri.

Fuente: Elaboracion Propia


Figura 20. Muestras despues de cinco dias de incubacion

Cuando se retira de la incubadora dejar enfriar de dos a tres horas


aproximadamente. Para continuar con el sembrado de muestras;
esterilizar el aza de col con un mechero y llevarlo por un augujero del
biorreactor y retirar una muestra (especialmente la zona donde este
mas sentimentado). Retirarlo cuidadosamente y en forma de zig zaj
colocarlo en la placa de petri, cerrarlo y sellarlo con el papel craft .

38
Realizar el procedimiento para los cinco reactores.

Fuente: Elaboracion Propia


Figura 21. Vertimiento de bacterias nativas al bioreactor

Guardarlo de cabeza y embolverlos con el papel craft por 24 horas


para analizar si hay evidencia de colonias.

Para un sistema de DILUCIONES SUCESIVA (dilucion en serie


logaritmica), usando un factor de dilucion de diez, la formula general
para calcular los volumenes que se transfieren es:

Volumen= Vol transferido precargado


Factor de dilucion -1

Para el procedimiento, preparar un set de 9 tubos de ensayo, el


primero sirve para obtener la muestra en una proporción de 1 ml de
solución de cultivo de biorreactor en 9 mL de agua peptonada al 0.1%.

39
Fuente: Protocolo de Aislamiento de bacterias
Figura 22. Procedimiento de las Soluciones nutritivas

1. En un vaso precipitado adicionar 100 mL de agua potable con 0.1


gr. de Agar Mac Conkey, disolverlo y realizar el agregado del 0.1 gr.
de la solución A y 0.25 gr. De solución B, a este medio se le conoce
como agua peptonada (medio utilizado como diluyente y para el
enriquecimiento bacteriano).

Fuente: Protocolo de Aislamiento de bacterias

Figura 23. Preparacion del Agua peptonada

40
2. Tomar el Agua potable peptonada y verter 9 mL. de medio a cada
tubo de ensayo.

Fuente: Protocolo de Aislamiento de bacterias


Figura 24. Vertimiento de muestra a los tubos de enayos

3. Medir 1 mL de solución de cultivo del biorreactor °02 y llevarlo al


primer tubo de ensayo al cual previamente se le ha añadido 9 mL de
solución de agua potable peptonada y homogenizar. Dicha muestra
extraer 1 mL y añadir a un segundo tubo que contiene 9 mL de agua
peptonada, a partir del segundo tubo tomar 1 mL de muestra y pasarlo
al tercer tubo que contiene 9 mL de agua peptonada y así seguir el
procedimiento sucesivamente hasta llegar al décimo tubo.

Fuente: Protocolo de Aislamiento de bacterias


Figura 25. Procedimiento dilucion sucesiva

41
4. A partir del tubo del 10% de dilución (tubo N°10) tomar 1 mL y
seguidamente verter a la placa Petri (previamente esterilizada).
Plaquear desde cada tubo preparado.

5. De otro lado, en un Erlenmeyer se tiene preparado el medio de


cultivo seleccionar una mezcla de agar y de diésel de acuerdo al
siguiente detalle:
-100 ml de agua potable
-Agar- Agar al 2.5%
-0,25 mL de solución A
-0.1 mL de solución B
-Diésel de petróleo al 5%

Fuente: Protocolo de Aislamiento de bacterias


Figura 26. Preparacion del medio de cultivo

Esta preparación se hace adicionado 5 ml de diésel en 100 mL de


agua con el agar y las sales. La temperatura de la solución debe
ser aproximadamente de 40oC. De esta manera a cada dilución que
reposa en la placa se le adiciona de manera inmediata unos 12 –
15 ml de este medio de cultivo se mueve cada placa para lograr la
distribución homogénea del medio en ella, siendo la única fuente
de alimento hidrocarbonado, si se desarrolla las colonias es debido
a su alimentación con este contaminante.

42
Fuente: Protocolo de Aislamiento de bacterias
Figura 27. Muestras terminadas y etiquetadas

c. Tratamiento de Aguas Residuales con bacterias nativas


seleccionadas Una vez dejado de dos a tres días aproximadamente,
se realiza la caracterización con Tinción Gram; para la verificación
de aparición de colonias, Gram positivas y Gram negativas.
Para el procedimiento, se trabajara con la preparación cristal, lugol,
Alcohol y Safranina de manera ordenada como se ve en la imagen:

Fuente: Protocolo de Caracterizacion de Bacterias


degradadoras de hidrocarburos
Figura 28. Insumos para la caracterizacion Gram

Se prepara frotis fijos a partir de cada uno de los cultivos bacterianos,


luego agregar sobre la preparación cristal violeta durante 30
segundos.

43
Fuente: Protocolo de Caracterizacion de Bacterias
degradadoras de hidrocarburos.
Figura 29. Procedimiento Caracterizacion Gram
Lavar con agua destilada y agregar el lugol durante 30 segundos. A
su vez, lavar con agua destilada y decolorar con alcohol-cetona por
5 a 10 segundos. Nuevamente Lavar con agua destilada y agregar
safranina durante treinta segundos.

Fuente: Protocolo de Caracterizacion de Bacterias


degradadoras de hidrocarburos.
Figura 30. Procedimiento Caracterizacion Gram II

Finalmente lavar, secar y observar al microscopio con aceite de


inmersión y con el objetivo de 100X.

Fuente: Protocolo de Caracterizacion de Bacterias degradadoras

44
de hidrocarburos.
Figura 31. Observacion de bacterias degradadoras de
Hidrocarburos.

Micrococcus, genero
de Actinobacteria,
son versátiles, con la
habilidad de utilizar un
extenso rango de
substratos inusuales,
tales como piridina,
bifenilos,policlorados y p
etróleo. Realizan la
detoxificación o
biodegradación de
contaminantes
ambientales.

Figura 32. Caracterizacion de bacterias


Micrococcus.

Género Rhodococcus son


Gram positivas, aerobios.
Presentan una amplia
diversidad con el carbón y
petróleo (Finnerty, 1992).
Posee la capacidad de
degradar una gran
cantidad de compuestos
orgánicos.

Figura 33. Caracterizacion de bacterias Rhodococcus.

45
Pseudomonas
Auriginosas, son
biodegradadoras,particip
an en el ciclo del C,
degradan miles de
contaminantes organicos,
poseen persatilidad
metabolica.

Figura 34. Caracterizacion de bacterias Pseudomonas


Auriginosas

Teniendo las bacterias degradadoras de cultivo, proceder con


verter solo bacterias Pseudomonas Auriginosas al reactor N° 01
con 50 mL de Agar Mac Conkey y las bacterias nativas
degradadoras de Hidrocarburos al reactor N°02 con 50 mL de Agar
Mac Conkey, ambos con el sistema de aireación para el estudio
correspondiente.

R1 R2

R1: Instalacion del reactor con Bacterias Pseudomonas


Auriginosas.
R2: Instalacion del reactor con Bacterias Nativas
Fuente: Elaboracion Propia
Figura 35. Estructura del Tratamiento

46
III. Concluyente – Evaluacion de la Eficiencia en la biodegradacion
de Hidrocarburos totales de Petroleo
Se evidencio durante la semana , cambios de color (mas claro), el
agua mas transparente, evidencia de sedimentacion de residuos,
alta capacidad de degradacion con bacterias nativas en el reactor
N° 02 y con bacterias Pseudomonas Auriginosas en el reactor N° 01.

R1 R2

R1: Muestra tratada con Bacterias Pseudomonas


Auriginosas.
R2: Muestra tratada con Bacterias Nativas
Fuente: Elaboracion Propia
Figura 36. Tratamiento de Aguas Hidrocarbonadas

Luego de la etapa de tratamiento; se llevo analizar la muestra con las


fechas Siguientes:

Tabla 10. Cuadro de Monitoreo

N° Reactor Tipo de Bacterias Fecha de Instalacion Fecha de Termino Observaciones

Bacterias Pseudomonas
Bacterias Pseudomonas Auriginosas degradan mas
N° 01 26 – 05 – 17 08 – 06 – 17
Auriginosas rapido el hidrocarburo que
las bacterias nativas
Bacterias Nativas
Bacterias Nativas degradan
(Micrococcus,
mas lento el hidrocarburo;
N° 02 Rhodococcus, 04 – 06 – 17 13 – 06 – 17
sin embargo son eficientes
Pseudomonas
por su metabolismo
Auriginosas)

47
Fuente: Elaboracion Propia

Fuente: Elaboracion Propia


Figura 37. Retiro de muestra para ser analizados

2.5. Validez y confiabilidad


Se presentara el proyecto con la tabla de validación de instrumentos a
los expertos, los instrumentos son: ficha de muestreo establecido en la
guía del minam, registro de parámetros físicos y químicos, y ficha
resumen de resultados, cada uno bajo criterio del trabajo; protocolo
sobre: Aislamiento de microorganismos degradadores de
hidrocarburos del petroleo y Biorremediación de suelos y evaluación
del producto de biodegradación del Doctorado en Ingeniería y
Ciencias Ambientales (UNALM).

2.6. Métodos de análisis de datos

48
Los datos obtenidos serán analizados a través del programa Microsoft
Excel 2013: Se utilizará este programa para tener análisis más fiables,
para elaborar tablas de comparación según los Estándares de Calidad
Ambiental (ECA) para Agua D.S. N° -MINAM. No obstante, se utiliza
los analisis de laboratorio donde se emplearan los datos obtenidos de
la investigacion en conjunto con las normas establecidas.

2.7. Aspectos éticos


La presente investigación mostrará resultados fehacientes, en el cual
se podrán corroborar dado que la metodología, procedimientos y
resultados de la experimentación serán expuestos al público para su
libre consulta y corroboración según sea el caso.
A su vez, la metodología ha sido revisada y validada por tres expertos
en el tema; uno de ellos mi Asesora; los análisis de las muestras se
realizaran en un Laboratorio Acreditado y Autorizado por el INACAL.
La investigacion tiene como base estudios anteriores, Protocolos de
Maestrias con la relacion a la biodegradacion.
La mayor parte de las investigaciones extraen bacterias de otras zonas
y/o las compran, lo cual es completamente diferente en cuanto a ese
procedimiento ya que se seleccionara las bacterias nativas de la misma
muestra contaminada, tambien se trata de mejorar aguas con
caracteristicas biologicas y con las condiciones operativas optimas de
cultivo.
Todo aporte de investigaciones como antecedentes en la presente
investigacion esta debidamente citado respetando las propiedades del
autor.

III. RESULTADOS

3.1. Analisis en la disminucion de Hidrocarburos Totales de Petroleo


F1 (C5-C10), F2 (C10-C28), F3 (C28-C40) en aguas residuales
mediante Bacterias Nativas.

49
Tabla 11. Diferencia entre la disminucion de Hidrocarburos Totales
de Petroleo con Bacterias Pseudomonas Auriginosas y Bacterias
Nativas(Microcoocus, Rhodocoocus, Pseudomonas Auriginosas)

Tipo de Bacterias Analisis Inicial Analisis Final
Reactor
(C5-C10): 136, 5 mg/L (C5-C10): 11,0 mg/L
Bacterias Pseudomonas
N° 01 (C10-C28): 453,0 mg/L (C10-C28): 63 mg/L
Auriginosas
(C28-C40): 453,0 mg/L (C28-C40): 63 mg/L

Bacterias Nativas (C5-C10): 136, 5 mg/L (C5-C10): 60,99 mg/L


(Micrococcus,
N° 02 Rhodococcus, (C10-C28): 453,0 mg/L (C10-C28):157,1 mg/L
Pseudomonas
Auriginosas) (C28-C40): 453,0 mg/L (C28-C40):157,1 mg/L
R2: Reactor a tratar (con bacterias Nativas)
Fuente: Elaboracion Propia

Según los datos obtenidos, se evidencia una disminucion de


Hidrocarburos Totales de Petroleo con las Bacterias Nativas A traotar
(Reactor N° 2) asi como en las Bacterias Pseudomonas Auriginosas.

Tabla 12. Cuadro de Analisis de Hidrocarburos Totales de Petroleo


con bacterias Nativas

N° Reactor Tipo de Bacterias Analisis Inicial Analisis Final

Bacterias Nativas (C5-C10): 136, 5 mg/L (C5-C10): 60,99 mg/L


(Micrococcus,
N° 02 Rhodococcus, (C10-C28): 453,0 mg/L (C10-C28):157,1 mg/L
Pseudomonas
Auriginosas) (C28-C40): 453,0 mg/L (C28-C40):157,1 mg/L

Fuente: Elaboracion Propia

Se constata de una reduccion para todas las fracciones que se llevaron


analizar.
Con respecto a la fraccion de Hidrocarburo (C5-C10) se obtuvo un valor
de 136,1 mg/L antes del tratamiento y un 60,99 mg/L despues del
tratamiento, lo que indica una reduccion en un 55,3%.

50
En cuanto a las fracciones de Hidrocarburos (C10 – C28) y (C28 – C40)
se obtuvo igual resultado con un valor de de 453 mg/L antes del
tratamiento y un valor de 157,1 mg/L despues del tratamiento, lo que
resalta una reduccion en un 65,3%.

Grafico Nº 01. Biodegradacion de Hidrocarburos Totales de Petroleo


con Bacterias Nativas

F1: Fraccion de Hidrocarburos (C5-C10)


F2: Fraccion de Hidrocarburos (C10-C28)
F3: Fraccion de Hidrocarburos (C28-C40)
Nota: Datos en mg/L
Fuente: Elaboracion Propia

En el Grafico N° 01 se evidencia una notable degradacion de


Hidrocarburos Totales de Petroleo con las Bacterias Nativas, lo que hace
fehaciente las Hipotesis General.
Su metabolismo es lento, sin embargo, muestra notable trabajo por parte
de dichos microrganimos.

51
Tabla 13. Cuadro de Aalisis de Hidrocarburos Totales de Petroleo on
Pseudomonas Auriginosas.

N° Reactor Tipo de Bacterias Analisis Inicial Analisis Final

(C5-C10): 136, 5 mg/L (C5-C10): 11,0 mg/L


Bacterias Pseudomonas
N° 01 (C10-C28): 453,0 mg/L (C10-C28): 63 mg/L
Auriginosas
(C28-C40): 453,0 mg/L (C28-C40): 63 mg/L
Fuente: Elaboracion Propia

Con respecto a la fraccion de Hidrocarburo (C6-C10) hubo una reduccion


a 11,0 mg/L, en cuanto a las fracciones de Hidrocarburos (C10 – C28) y
(C28 – C40) marcan el mismo valor con un valor de 63 mg/L.
Grafico Nº 02. Reduccion de Hidrocarburos Totales de Petroleo con
Pseudomonas Auriginosas.

F1: Fraccion de Hidrocarburos (C5-C10)


F2: Fraccion de Hidrocarburos (C10-C28)
F3: Fraccion de Hidrocarburos (C28-C40)
Nota: Datos en mg/L
Fuente: Elaboracion Propia

52
En el Grafico N° 02 nos muestra un grado considerable de biodegradacion
de Hidrocarburos Rotales del petroleo durante el periodo de doce dias
evaluados apartir de la instalacion del Sistema del Biorreactor.
Cabe indicar que se diseño dicho reactor para realizar una comparacion
en cuanto a capacidad de degradacion de las Bacterias Nativas con las
Bacterias Pseudomonoas Auriginosas.

3.2. Comportamiento de las bacterias nativas para la biodegradacion


de los Hidrocarburos Totales de Petroleo en aguas residuales

Tabla 14: Monitoreo en los diferentes reactores

CAMBIOS
REACTOR CAMBIOS FISICOS
ORGANOLEPTICOS
R1 20% 20%
R2 80% 80%
R3 50% 50%
R4 40% 40%
R5 30% 30%
Fuente: Elaboracion Propia

Grafico Nº 03. Comportamiento de las bacterias nativas en las distintos


reactores

53
Fuente: Elaboracion Propia

En el Grafico N° 03 nos muestra que mas cambios se dio en el Reactor 02


por su comportaiento según las condiciones operativas que se dio, los
cambios organolepticos y fisicos eviencio mayor poder de degradacion .

3.3. Tratamiento de Aguas Residuales con las condiciones de cultivo


seleccionado

Tabla 15: Cuadro del Tratamiento de Aguas Residuales con diferente


capacidad de degradacion

Capacidad de
n° reactor Bacterias
degradacion
Pseudomonas
R1 Rapida
Auriginosas
R2 Bacterias Nativas Lenta y Eficiente

Fuente: Elaboracion Propia

Durante el Tratamiento de las Aguas Residuales se comprobo que las


Bacterias Nativas son lentas en su proceso de degradacion, sin
embargo, aportan de manera optima, según los analisis adquiridos luego
del Tratamiento.

3.4. Eficiencia en la Biodegradacion de Hidrocarburos Totales de


Petroleo en aguas residuales mediante bacterias Nativas

Tabla N°16. Cuadro de Eficiencia de Bacterias Nativas


HTP M (INICIAL) M (FINAL) %

(C5-C10) 136,5 60,99 55,3

(C10-C28) – 453 157,1 65,3


(C28-C40)
F1: Fraccion de Hidrocarburos (C5-C10)
F2: Fraccion de Hidrocarburos (C10-C28)
F3: Fraccion de Hidrocarburos (C28-C40)
Nota: Datos en mg/L

54
Fuente: Elaboracion Propia

La Tabla N° 12 nos muestra una eficiencia a un 55.3% con respecto a la


fraccion del Hidrocarburo (C5-C10) y un 65.3% con respecto a la fraccion
de Hidrocarburo (C10-C28) y (C28-C40).

Grafico Nº 04. Eficiencia en % Reactor Nº 01

F1: Fraccion de Hidrocarburos (C5-C10)


F2: Fraccion de Hidrocarburos (C10-C28)
F3: Fraccion de Hidrocarburos (C28-C40)
Nota: Datos en mg/L
Fuente: Elaboracion Propia

En el Grafico N° 04 no muestra el Porcentaje obtenido durante el proceso


de degradacion con las Bacterias Nativas, lo ue evidencia reduccion en
todas las fracciones de Hidrocarburo.

Tabla 17. Cuadro de Eficiencia de Pseudomonas Auriginosas


HTP M (INICIAL) M (FINAL) %
(C5-C10) 136,5 11 91.9
(C10-C28) 453 63 86.1
(C28.C40)
Fuente: Elaboracion Propia

55
Hallamos una eficiencia de 91.9% para la fraccion de Hidrocarburos (C5-
C10) y un 86.1% para las fracciones de Hidrocarburo (C10-C28) y (C28-
C40) del proceso de biodegradacion de los Hidrocarburos Totales de
Petroleo mediante Pseudomonas Auriginosas como dato adicional.

Grafico Nº 05. Eficiencia en % Reactor Nº 01

F1: Fraccion de Hidrocarburos (C5-C10)


F2: Fraccion de Hidrocarburos (C10-C28)
F3: Fraccion de Hidrocarburos (C28-C40)
Nota: Datos en mg/L
Fuente: Elaboracion Propia

En el reactor Nº 05 trabajados con bacterias Pseudomonas Auriginosas


se observa una eficiencia del 91.9% para la fraccion de Hidrocarburo (C5-
C10), mientras que un 86.1% para las fracciones de Hidrocarburo (C10-
C28) y (C28-C40). (Como muestra adicional).
Tabla 18. Cuadro de Comparacion

Bacterias (C5-C10) (C10-C28) – (C28-


C40)
Pseudomonas 91.9 86.1
Auriginosas

56
Bacterias Nativas 55.3 65.3

Fuente: Elaboracion Propia

Se elaboro un cuadro de comparacion entre la Biodegradacion con


Bacterias Pseudomonas Auriginosas y con Bacterias Nativas; con el fin
de estudiar el mecansmo que tiene cada bacteria.

Grafico Nº 06. Graficos de Comparacion

F1: Fraccion de Hidrocarburos (C5-C10)


F2: Fraccion de Hidrocarburos (C10-C28)
F3: Fraccion de Hidrocarburos (C28-C40)
Nota: Datos en mg/L
Fuente: Elaboracion Propia

En el Grafico N° 06 nos muestra una compracion entre el reactor N°02


con las Bacterias Nativas trabajadas y el reactor N°01 con Bacterias
Pseudomonas Auriginosas. Ambas se consideran Bacterias
degradadoras de Hidrocarburos Totales de Petroleo sin embargo Las
bactrias Nativas tienes un metabolismo mas lento que las
Pseudomonas Auriginosas.

57
IV. DISCUSION

 Se establecio las condidiones operativas de cultivo (Habitad de las


Bacterias), según los antecedentes presentados en la investigacion
(Protocolo en bioremediación y evaluación del producto de
biodegradación del Doctorado en ingeniería y ciencias ambientales).
 Se comprueba que las bacterias nativas degradan de manera eficiente
los hidrocarburos totales de petroleo siempre y cuando se les dea las
condiciones exactas, y en el que el contaminante se adecue y sirva de
fuente de alimento de las bacterias tal y como se establece en los
antecedentes (tesis realizadas).
 En el crecimiento de las bacterias Nativas con los medios de cultivo se
trabajo con un procedimiento directo y con Diluciones Sucesivas según
potocolos de maestrias realizadas en el Peru. No onstante, por sus
caracteristicas se identificaron bacterias gram negativas, de forma
rectangular ovalada.
 Por ende se confirma con los antecedentes que el sistema de
biodegradacion es eficiente y mediante los analisis de Laboratorio se
establece la teoria de disminucion de hidrocarburos totales de petroleo
mediante bacterias nativas.
 El empleo de metodos de remediacion positivos varia del conocimiento
de lo factores hidrologicos y especiacion de las fracciones de
hidrocarburos.
 Según antecedentes la temperatura en el tratamiento de aguas
residuales mediante bacterias nativas varia ya que los microorganismos
se adaptan a las condiciones en la que este. No obstante, en un curso
de Maestria en Ecologia Aplicada se establece que la mejor condicion
de cultivo es la temeratura ambiente para los microorganismos
degradadores de hidrocarburos. Por ende en la investigacion se trabajo
a temperatura ambiente.

58
CONCLUSION

 Evidencia de disminucion de Hidrocarburos totales de petroleo en


aguas residuales en un 55.3% para la fraccion de Hidrocarburo (C5-
C10), mientras un 65.3% en las fracciones (C10-C28) y (C28-C40).
 Los resultados de las condiciones operativas de cultivo mas propicias
fueron soluciones Nutritivas (Sales Hidroponicas A y Sales
Hidroponicas B), temperatura ambiente, sistema de aireacion a base de
piedras difusoras, detergente como surfactante, dextrosa anhidra como
glucosa y extracto de carne molida como alimento de bacterias).
 Se concluye que para el tratamiento de aguas residuales con bacterias
Nativas, las condiciones de cultivo seleccionado fue: Solucion
Hidroponica A y B, Biodiesel, extracto de carne, y Dextrosa Anhidra.
 Se concluye que las bacterias nativas aportan a la eficiencia en la
biodegradacion de hidrocarburos totales de petroleo en aguas
residuales en el Callao.
 El mecanismo de degradacion de las Bacterias Nativas son lentas, pero
eficientes de acuerdo a las condiciones operativas que se le dea;
mientras que el mecanismo de degradacion con Bacterias
Pseudomonas Aurigonosas son mas rapidas.

59
V. RECOMENDACIONES

 Se recomienda utilizar el diseño empleado (Sistema de bioreactores)


para dar una adecuada condicion de cultivo cuando se trabaje con
Bacterias Nativas degradadoras de Hidrocarburo.
 La metodologia como fase exploratoria, experimental y concluyente
empleada en la investigacion implica “eficiencia”, por ello se
recomienda trabajar con dicha metodologia para la biodegradacion de
Hidrocarburos Totales de Petroleo.
 Se plantea adicionar alguna variedad de insectos en las aguas tratadas
con bacterias nativas con el fin de estudiar supervivencia de especie en
dichas aguas.
 Se recomienda seguir los estandares de trabajo durante un proceso
microbiologico, ya que un mal procedimiento puede originar el contagio
de enfermedades.
 Se recomienda llevar un monitoreo diario en el tratamiento de aguas
residuales mediante bacterias nativas con el fin de analizar cambios
fisicos y procesos microbiologicos, ya que las condiciones operativas
son inumerables y la reaccion puede ser de manera optima como
tambien puede involucrar desperfectos.
 Trabajar con bacterias nativas en la biorremediacion de aguas
residuales industriales es una alternativa viable y de bajo costo, puesto
que estudios reafirman la eficiencia que existe en el tratamiento
biologico con bacterias.
 Las bacterias pueden acumular hidrocarburos y metales pesados
gracias a su cubierta , en forma de capa en el cual contienen con
agujeros. Con enzimas especiales, los microorganismos degradadores
de Hidrocarbuos pueden reducir la molecula de petroleo, en el que se
considera muy compleja de degradar.
 No obstante, se recomienda realizar proyectos con tratamientos
biologicos puesto que, no se necesita uso de insumos quimicos para el
tratamiento, ya que todo el trabajo lo realizan las Bacterias Nativas.

60
VI. REFERENCIAS BIBILIOGRAFICAS

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etales_pesados_una_interaccion_en_beneficio_del_medio_ambiente

67
ANEXOS

ANEXO N°01: Registro de ingreso a Laboratorio (Universidad Cesar Vallejo)

ANEXO N°02: Censo de Aguas Residuales Industriales descargadas

ANEXO N°03: Demanda Hídrica en el Perú.

ANEXO N°04: Mapa del área de estudio de la muestra

ANEXO N°05: Matriz de Consistencia

ANEXO N°06: Estudios Preliminares

ANEXO N°07: Preparación del Medio de Cultivo

ANEXO N°08: Procedimiento de esterilización del asa de col

ANEXO N°09: Rotulado y Sellado de la muestra

ANEXO N°10: Análisis de Laboratorio inicial - 2016

ANEXO N°11: Análisis de Laboratorio Pre-Tratamiento


(Pseudomonas Auriginosas)

ANEXO N°12: Análisis de Laboratorio Post-Tratamiento


(Bacterias Nativas)

68
ANEXOS N° 01. Registro de Ingreso a Laboratorio - UCV

69
ANEXO N° 2. Aguas Residuales Industriales descargadas

Fuente: OEFA, 2014.

ANEXO N° 3. Demanda Hidrica en el Peru

Fuente: ANA, 2015.

70
ANEXO 4: Mapa del Area de estudio de la muestra

Fuente: Plano de Ubicación – Camisea Combustibles S.R.L, 2014.

71
ANEXO N° 5. Matriz de Consistencia

‘‘BIODEGRADACION DE HIDROCARBUROS TOTALES DE PETROLEO POR BACTERIAS NATIVAS SOMETIDAS A DISTINTAS CONDICIONES DE CULTIVO APLICADOS EN AGUAS RESIDUALES, CALLAO –
2017’’
DIMENSIONE ESCALA DE
TIPO PROBLEMA OBJETIVO HIPOTESIS VARIABLES INDICADORES
S MEDICION

¿Existe biodegradacion de Biodegradar Hidrocarburos


Los hidrocarburos totales de
Hidrocarburos Totales de Totales de Petroleo en Color Ordinal
Petroleo en aguas residuales
Petroleo en aguas residuales aguas residuales aplicando Respuesta
se biodegradan aplicando
GENERAL aplicando bacterias nativas bacterias nativas
bacterias nativas sometidas a Organoleptica
sometidas a optimas sometidas a optimas
optimas condiciones de
condiciones de cultivo en el condiciones de cultivo en el olor Ordinal
cultivo en el Callao -2017.
Callao -2017? Callao -2017.
VARIABLE
INTEPENDIENTE: Nutrientes Ordinal
Las condiciones de cultivo Bacteria Nativa
¿Cuáles son las condiciones Determinar las condiciones Oxigeno Ordinal
optimo de las bacterias
de cultivo optimo de las de cultivo optimo de las
nativas de agua residual Condiciones Temperatura Ordinal
bacterias nativas en agua bacterias nativas en agua
influye en la biodegradacion de Cultivo
residual con contenido de residual con contenido de Turbidez Ordinal
de Hidrocarburos Totales de
hidrocarburos totales de hidrocarburos totales de
Petroleo en aguas residuales
petroleo en el Callao - 2017? petroleo en el Callao -2017. pH Ordinal
en el Callao - 2017
Surfactante Ordinal
ESPECIFICO Concentracion de
Hidrocarburos totales
Ordinal
Las bacterias Nativas en VARIABLE
¿ Existe biodegradacion de Biodegradar hidrocarburos Reduccion de de petroleo antes de la
optimas condiciones de DEPENDIENTE: biodegradacion
hidrocarburos Totales de Totales de Petroleo en Hidrocarburos
cultivo aportan a la Eficiencia en la
Petroleo en aguas residuales aguas residuales mediante totales de
biodegradacion de biodegradacion de
mediante bacterias nativas en bacterias nativas en Petroleo en
Hidrocarburos Totales de Hidrocarburos Concentracion de
optimas condiciones de optimas condiciones de aguas
Petroleo en aguas residuales Totales de Petroleo Hidrocarburos totales
cultivo en el Callao - 2017? cultivo en el Callao - 2017. residuales Ordinal
en el Callao - 2017. en aguas residuales de Petroleo despues
de la biodegradacion

Fuente: Elaboracion propia, 2017

73
ANEXO N° 6. Estudios Preliminares - Preparacion del inoculo en el
laboratorio de Biologia UNALM.

Fuente: Curso de Biorremediacion – Maestria en Ecologia Aplicada, 2016.

ANEXO N° 7. Preparacion del Medio de Cultivo – Laboratorio de Quimica UCV

Fuente: Elaboracion Propia, 2017.

74
ANEXO N°8. Procedimiento Esterilizacion del Asa de col

Fuente: Elaboracion Propia

ANEXO N°9. Rotulado y Sellado de Muestra

Fuente: Elaboracion Propia

75
ANEXO N°10. Analisis de Laboratorio inicial – 2016

Fuente: Analisis de aguas residuales de la Empresa Camisea Combustibles


S.R.L. 2016.

76
77
ANEXO N°11. Analisis de Laboratorio Pre-Tratamiento

78
ANEXO N°12. Analisis de Laboratorio Post Tratamiento (Pseudomonas
Auriginosas)

79
ANEXO N°14. Analisis de Laboratorio Post- Tratamiento(Bacterias Nativas)

80
81